NIH Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsünden bir Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA), P20GM103506 aracılığıyla New Hampshire-INBRE tarafından desteklenen araştırma.

Not: Her tahlil için zaman faktörleri ayrı ortam hazırlıkları için farklı zaman gerektirdiğinden yapılmalıdır. Örneğin, katı agar plakası ortamının yeterince soğumasına ve kurumasına (1-2 gün) izin verilmelidir. Ek zaman faktörleri ( yani, tek koloni ve gece boyunca kültür büyümesi) her protokol altında belirtilmiş ve Tablo 2&#39;de bulunmuştur. 1. Medyanın Hazırlanması <ol><li> 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) <ol><li> 4.0 g NaCI, 0.1 g KCI, 0.72 g Na2HP04 ve 0.12 g KH2PO4 tartın. Bileşenleri 1 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde birleştirin, hacmi deiyonize su ile 500 mL&#39;ye ayarlayın, bir pH metre kullanarak pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın ve çözeltiye damla damla HC1 ilave edin ve 0.22 μm&#39;lik bir filtre kullanarak otoklav veya filtre sterilize edin. 1x PBS süresiz olarak oda sıcaklığında saklanabilir. DİKKAT: HC1 konsantre bir asittir ve buna göreKurumsal, yerel, eyalet ve federal yönetmeliklere. Uygun taşıma talimatları için, üretici tarafından sağlanan güvenlik bilgi formuna bakın. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Broth <ol><li> 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü ve 2.5 g NaCI&#39;yi tartın. Bileşenleri 1 L&#39;lik bir şişede birleştirin, hacmi deiyonize su, otoklav ile 500 mL&#39;ye ayarlayın ve 6 aya kadar oda sıcaklığında saklayın. Klasik biyotip virulence indükleme koşulları için, otoklavlamadan önce HC1 kullanarak pH&#39;ı 6.5&#39;e ayarlayın. </li></ol></li><li> % 0.03 (a / h) NaHC03 içeren AKI Ortamı <ol><li> Bileşen 1 için (AKI ortamı): 7.5 g pepton, 2.0 g maya ekstraktı ve 2.5 g NaCl tartılır. Bileşenleri 1 L&#39;lik bir şişede birleştirin, deiyonize su ve otoklav ile hacmi 450 mL&#39;ye ayarlayın. AKI ortamı oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir. </li><li> Bileşen 2 için (NaHC03): 1.5 g NaHC03 tartılır ve hacim ayarlanırSteril bir vezikülde deiyonize su ile 50 mL&#39;ye kadar soğutulur. Filtre, 0.22 um&#39;lik bir filtre kullanarak NaHCO 3&#39;ü sterilize edin. NaHCO 3 , kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır. </li><li> Kullanmadan önce Bileşen 2&#39;yi Bileşen 1&#39;e filtreleyerek iki bileşeni aseptik olarak birleştirerek 1:10 oranını oluşturun. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Ağar Pleytleri <ol><li> 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü, 2.5 g NaCl ve 7.5 g agardan tartılır. Bileşenleri 1 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde birleştirin, hacmi, deiyonize su, otoklav ile 500 mL&#39;ye ayarlayın ve standart boyutlu 100 mm x 15 mm steril Petri kaplarında hazırlayın. Kaplamalı ortam, kapak tarafı 4 ° C&#39;de 6 aya kadar plastik içinde saklanabilir. </li></ol></li><li> Polimiksin B ile Tamamlanan LB Agar Plakaları <ol><li> Bileşen 1 (LB agar) için: 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü, 2.5 g NaCl ve 7.5 g agar tartılır. Bileşenleri 1 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde birleştirin, hacmi 500 mL&#39;ye ayarlayın.Deiyonize edilmiş su ve otoklav. </li><li> Bileşen 2 (polimiksin B) için: polimiksin B&#39;yi steril 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 50.000 IU / μL konsantrasyona kadar deiyonize su içinde eritin ve 0.22 μm filtre kullanarak sterilize edin. </li><li> Bileşen 1 dokunulduğunda serin, ancak katılaşmadıktan sonra, 50 μM / μL&#39;lik bir nihai konsantrasyon oluşturarak Bileşen 1&#39;e aseptik olarak 500 μL Bileşen 2 ekleyin ve iyice karıştırın. Petri kaplarına karışık agar medyum dökerek standart boyutlu 100 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. Kaplamalı ortam, plastik kaplı olarak 3 aya kadar, kapak tarafı da 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> Minimal Sitrat Orta Agar Tabakları <ol><li> Bileşen 1 için (bromotiol mavisi olan agar): 7.5 g agar ve 0.02 g bromotimol mavi ağırlığındadır. Bileşenleri 1 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde birleştirin, deiyonize su ile hacmi 450 mL&#39;ye ayarlayın ve karışımı otoklavlayın. </li><li> Bileşen 2 için (10x VBMM): 1 tartın0,0 g MgS04 7H20, 10,0 g sitrik asit H2O, 50,0 g susuz K2HPO4 ve 17,5 g NaNH4HP04 4H20. Bileşikleri 1 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişe içerisinde birleştirin, hacmi 500 mL&#39;ye ayarlayın Deiyonize su ve otoklav ile veya 0.22 um&#39;lik bir filtre kullanarak filtre sterilize edin. 10x VBMM oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir. </li><li> Bileşen 1&#39;e 50 mL Bileşen 2 ekleyin ve Petri kaplarına karışık agar medyum dökerek standart boyutlu 100 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. Kaplamalı ortam, kapak tarafı 4 ° C&#39;de 6 aya kadar plastik içinde saklanabilir. </li></ol></li><li> Süt Agar Tabakları <ol><li> Parça 1 (süt) için: 1 litrelik bir Erlenmeyer şişe içinde kuru gıdadan 8.0 g ağırlığında, deiyonize su ve otoklav ile hacmi 200 mL&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bileşen 2 (beyin-kalp infüzyonlu agar) için: 3.68 g beyin-kalp infüzyonu ve 6.0 g agar ağırlığındadır. Konuyu birleştir500 mL&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde çözündürülür, hacmi deiyonize su ve otoklav ile 200 mL&#39;ye ayarlayın. </li><li> İki bileşeni, otoklavdan sonra Bileşen 1&#39;e dökerek birleştirin ve iyice karıştırın. 150 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. Süt plakaları plastik kaplı, kapak tarafı 4 ° C&#39;de bir hafta kadar saklanabilir. Karışık agar medya Petri yemekleri dökerek 150 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. </li></ol></li><li> Hareketlilik Agar Tabakları <ol><li> Bileşen 1 (LB agar) için: 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü, 2.5 g NaCl ve 2.0 g agar tartılır. Kurucu maddeleri 1 L&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde birleştirin, hacmi deiyonize su ve otoklav ile 500 mL&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bileşen 2 için (% 1 (a / a) trifeniltetrazolyum klorür; TTC): 0,25 g TTC ağırlığında. Steril vezikül içinde deiyonize su ile hacmi 25 mL&#39;ye ayarlayın ve 0.22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin. Oda sıcaklığında sarılı 6 aya kadar saklayınIşık maruziyetini en aza indirgemek için folyo halinde. </li><li> Otoklavlı medyaya 2.5 mL% 1 (w / v) steril TTC ekleyin. </li><li> Ortamı olabildiğince kalın (≥50 mL / plaka) büyük 150 mm x 15 mm steril Petri kaplarına koyun. Kaplamalı ortam, kapak tarafı 4 ° C&#39;ye kadar bir hafta kadar plastik saklanabilir. Karışık agar medya Petri yemekleri dökerek 150 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Bileşen 1 için (Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP): 500 mL&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 1.7 g MR-VP ortamı tartın, hacmi deiyonize su ve otoklav ile 100 mL&#39;ye ayarlayın. Steril MR-VP suyu oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir. </li><li> Bileşen 2 için (% 5 (a / a) alfa (α) naftol): 1.0 g α-naftolü steril bir vezikül içinde tartın ve hacmi,% 95 etanol ile 20 mL&#39;ye ayarlayın. Α-naftol oda sıcaklığında 1 hafta boyunca depolanabilir ve ışık exp değerini en aza indirgemek için folyoyla sarılabilir.osure. </li><li> Bileşen 3 için (% 40 (w / v) potasyum hidroksit; KOH) steril vezikül içinde 20.0 g KOH tartın, steril deiyonize su ile hacmi 50 mL&#39;ye ayarlayın. KOH, plastik bir kapta oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir. </li></ol></li></ol> 2. V. Bakım ve Büyüme. Kolera suşları <ol><li> Dondurulmuş Stok Kültürlerinin Hazırlanması ve Kullanımı <ol><li> Steril 2 mL lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüj (≥8,600 xg) ile 2 dakika boyunca sıvı gece boyunca kültürde 1.8 mL peletleyin, süpernatantı alın ve pipetleme ile taze LB suyu 900 μL&#39;de hücre peletini tekrar askıya alın. </li><li> Kültürü steril% 60 (v / v) gliserol 900 mcL ekleyin ve vorteksleme ile karıştırın. </li><li> Karışımı steril 2 mL&#39;lik kriyojenik bir tüpe aktarın ve -80 ° C&#39;de süresiz olarak saklayın. </li><li> Kullanmak için, steril bir inokülasyon halkası kullanarak küçük miktarda dondurulmuş stok çıkarın ve LB ag üzerinde tek koloniler çizinAr levhaları. Kültürlerin tamamen çözülmesini önlemek için donduktan hemen sonra -80 ° C&#39;ye getirin. Plakaları kapak tarafı aşağıya 37 ° C&#39;de 12 ila 16 saat inkübe edin. </li></ol></li><li> Sıvı Ortamda Gecelik Kültürlerin Büyümesi <ol><li> Donmuş stoktan LB agar plakalarına tek koloniler için (2.1.4&#39;e göre) çizgiler. Plakaları kapak tarafı aşağıya 37 ° C&#39;de 12 ila 16 saat inkübe edin. </li><li> Steril bir aplikatör çubuğu ile tekli koloni yüzeyine dokunarak ve sıvı suyu içine koloni aktararak, tek bir koloni ile steril 10 mL kültür tüp 4 ml sıvı LB suyu inoküle edin. </li><li> 37 ° C&#39;de 12 ila 16 saat 225 rpm&#39;de çalkalayıcı inkübatörde havalandırma ile inkübe edin. </li></ol></li><li> Büyüme Eğrisi <ol><li> Daha önce protokol 2.2&#39;de belirtildiği gibi, sıvı LB suyu içinde gece kültür hazırlayın. </li><li> Gece kültürünün 1: 100 seyreltmesini 250 μL gece kültürü 2&#39;ye aktararak yapın5 mL taze LB suyu, steril 250 mL&#39;lik Erlenmeyer şişesi içerisinde. </li><li> Sıvı kültürlerin optik yoğunluğunu 600 nm&#39;de (OD 600 ) her saat başı inokülasyon (T 0 ) zamanında ölçün. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar 30 saate kadar 225 rpm&#39;de çalkalayıcı inkübatöründe havalandırma ile gece kültürü 1: 100 oranında seyreltin veya kültür maksimum yoğunluğa erişene kadar inkübe edin. </li><li> OD 600&#39;ün Zamanına grafiği çizin ve her suş için yaklaşık katlama süresini belirlemek için doğrusal regresyonu kullanın. </li></ol></li><li> El Tor Biotip Virulans İndükleme Koşulları <ol><li> Donmuş stoktan LB agar plakalarına tek koloniler çizin. Plakaları kapak tarafı aşağıya inkübe edin, 12-16 saat boyunca 37 ° C&#39;de. </li><li> Tek bir koloni ile% 0.03 (w / v) NaHC03 içeren 10 mL AKI ortamı inoküle edin. </li><li> 37 ° C&#39;de havalandırma olmadan kültürü 3.5 saat inkübe edin. </li><li> 7 mL kültür çıkarın ve kalan 3 mL kültürü inkübe edinBir çalkalayıcı inkübatöre havalandırma ile 225 rpm&#39;de ilave bir 4 saat tekrar uygulayın. </li></ol></li><li> Klasik Biyotip Virulans İndükleme Koşulları <ol><li> Donmuş stoktan LB agar plakalarına tek koloniler çizin. Plakaları kapak tarafı aşağıya 37 ° C&#39;de 12 ila 16 saat inkübe edin. </li><li> Tek bir koloni ile 4 mL sıvı LB suyu (pH 6.5) aşılayın. </li><li> 30 ° C&#39;de 12 ila 16 saat 225 rpm&#39;de çalkalayıcı inkübatöründe havalandırma ile inkübe edin. </li></ol></li><li> 1x PBS&#39;de Hücre Peletini Yıkama <ol><li> Steril 2 mL lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüje (≥8,600 xg) ile 2 dakika boyunca gece boyunca kültür 1.8 mL peletleyin ve bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın. Pipetleme ile 1.8 mL 1x PBS içinde hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın. </li><li> Yıkama prosedürünü üç kez tekrarlayın, ardından 1.8 mL 1x PBS içinde nihai bir yeniden süspansiyon uygulayın. </li></ol></li></ol> 3. V karakterizasyonu. Kolera biyotipleri <ol><li> PCtxB ve tcpA&#39;yi kullanarak CR tabanlı Genetik Ekranlar <ol><li> Sırasıyla ctxB ve tcpA&#39;nın translasyonel başlangıç ​​ve durma yerlerinin yaklaşık 50-70 bp yukarı akış ve aşağı akış hızlarına sahip bir dizi primer dizayn edin. </li><li> Daha önce protokol 2.2&#39;de belirtildiği gibi, sıvı LB suyu içinde gece kültür hazırlayın. </li><li> Kromozomal DNA&#39;yı, Gram negatif bakteriler için tasarlanmış piyasada bulunan bir kit kullanarak izole edin. Saflaştırılmış kromozomal DNA -20 ° C&#39;de süresiz olarak saklanabilir. Ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak kromozomal DNA izolasyonu genellikle yaklaşık 4 saat sürer. </li><li> Kromozomal DNA örneğinin yüksek kalitede olmasını sağlamak için bir mikro-hacim spektrofotometre kullanın (A 260/280 &gt; 1.8). </li><li> Her bir kromozom DNA izolatı için, steril 200 μL PCR tüpü içerisinde buz üzerine polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) hazırlayın ve standart PCR bileşenleri kullanılarak ctxB ve tcpA bölgelerini çoğaltın: Taq polimeraz ve buFfer (veya eşdeğerleri), dNTP çözeltisi ve ileri / geri primerler. Standart PCR parametrelerini kullanın (~ 3 saat). Örneğin, aşağıdaki protokolü kullanın: <ol><li> İlk denatürasyon 95 ° C&#39;de 120 sn. </li><li> 95 ° C&#39;de 60 saniye boyunca denature edin. </li><li> Anneal astarları 60 ° C&#39;de 45 saniye süreyle. </li><li> 90 ° C&#39;de 72 ° C&#39;de genleşin. </li><li> 34 devir için 3.1.5.2 ile 3.1.5.4 arasındaki adımları tekrarlayın. </li><li> Son uzantı 72 ° C 600 s. </li><li> Sonsuz 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol></li><li> Standart bir 6x DNA jel yükleme boyası kullanarak ilgili PCR ürünlerinin 5 μl&#39;ini boyayın ve 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) içerisinde% 1 agaroz jel üzerine yaklaşık 10 mcL 1 kb merdiven ve 10 uL PCR ürünü yükleyin. tampon. </li><li> Jel elektroforezi 130 V&#39;da boya önü jelin sonuna gelene kadar (yaklaşık 90 dakika) çalıştırın. Voltaj ve çalışma süreleri ekipmana bağlı olarak değişebileceğinden, sabit izleme önerilir. </li><li> Doğrulama üzerineBeklenen büyüklükte başarılı PCR amplifikasyonu, kalan 45 μL PCR ürününü ticari olarak mevcut bir DNA temiz ve konsantratör kiti kullanarak arındırın. </li><li> Sıra, PCR amplifikasyonu için kullanılan aynı primerler kullanılarak PCR ürün (lerini) temizledi ve yerel sıralama düzeni talimatlarına göre hazırlandı. </li><li> Her bir izolattan gelen gen dizilerinin FASTA biçimini, NCBI web sitesinde (http://www.ncbi.nlm.nihm.gov/gene/) bulunan yayınlanmış diziyle karşılaştırarak, arama sorgu kutusundaki aşağıdaki erişim numaralarını arayın. </li><li> CtxB : (klasik) VC0395_A1059 ile VC0395_A1060 (El Tor) arasında VC_1456 </li><li> TcpA : (klasik) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Spotting yoluyla biyotip sınıflandırması için fenotipik tahliller <ol><li> Daha önce protokol 2.2&#39;de belirtildiği gibi, sıvı LB suyu içinde gece kültür hazırlayın. </li><li> Hücre pelet (ler) i protokol 2.6&#39;da belirtildiği şekilde yıkayın. </li><li> Bir pipetleİlgili ortamda 1 μL yıkanmış küf kültürleyin. Orta seçim ve inkübasyon spesifikasyonları için Tablo 2&#39;ye bakın. </li></ol></li><li> Hareket Testi <ol><li> Daha önce protokol 2.2&#39;de belirtildiği gibi gece boyunca kültür (leri) sıvı LB suyu içinde hazırlayın. </li><li> Hücre pelet (ler) i protokol 2.6&#39;da belirtildiği şekilde yıkayın. </li><li> Yıkanan sıvı kültür içine inokülasyon bıçağı takarak motilite agar plakalarını aşılayın ve medyaya dikey olarak &quot;bıçakla&quot; sokun. Her inokülasyon sırasında, bir boğaz yakıcı kullanarak tel bıçağını sterilize edin ve ağarı bıçaklandığında, sonuçların değişmesi için inokulasyon bıçağının bükülmediğinden emin olun. </li><li> Plakaları kapak tarafını 14 ila 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. 14 saat sonra, hareketlilik plakalarını yakından izleyerek kültürlerin aşırı büyümesini önleyin. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) Testi <ol><li> Daha önce protokol 2.2&#39;de belirtildiği gibi gece boyunca kültür (leri) sıvı LB suyu içinde hazırlayın. </li><li> İnoküle et 4ML metil kırmızı Voges-Proskauer veya MR-VP besiyeri ile önceden hazırlanmış 10 ul&#39;lik bir gece kültürü, steril bir kültür tüpünde 4 mL MR-VP suyu içine pipetle konur ve 12 ila 16&#39;lık 225 rpm&#39;de bir çalkalayıcı kuluçka havası ile inkübe edilir Saat 37 ° C&#39;de. </li><li> Sırasıyla steril kültür tüpleri içinde 1 mL&#39;lik MR-VP gece kültürü kısımlarına 150 uL% 5 (a / a) a-naftol ve 50 μL% 40 (a / a) KOH ilave edin. </li><li> Kısaca vorteks ve renk değişikliği gelişene kadar oda sıcaklığında 4 saate kadar bekletin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shimada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+serotyping+scheme+for+Vibrio+cholerae.">Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae.</a> Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).</li><li>Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+serogroups+of+Vibrio+cholerae+non-O1+non-O139+with+specific+reference+to+their+ability+to+produce+cholera+toxin,+and+addition+of+novel+serogroups.">Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups.</a> Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).</li><li>Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sixth+and+seventh+cholera+pandemics+are+due+to+independent+clones+separately+derived+from+environmental,+nontoxigenic,+non-O1+Vibrio+cholerae.">The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae.</a> J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).</li><li>Albert, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+epidemic+of+cholera-like+disease+in+Bangladesh+caused+by+Vibrio+cholerae+O139+synonym+Bengal.">Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal.</a> Lancet. 342 (8868), 387 (1993).</li><li>Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+Cholera.">History of Cholera.</a> Cholera. , 1-36 (1992).</li><li>Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Genetics+of+Vibrio+cholerae.">Population Genetics of Vibrio cholerae.</a> Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).</li><li>Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonality+of+classical+and+El+Tor+cholera+in+Dhaka,+Bangladesh:+17-year+trends.">Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).</li><li>Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Vibrio+cholerae+O1+El+Tor+biotype+variant+clinical+isolates+from+Bangladesh+and+Haiti,+including+a+molecular+genetic+analysis+of+virulence+genes.">Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).</li><li>Ghosh-Banerjee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+production+by+the+El+Tor+variant+of+Vibrio+cholerae+O1+compared+to+prototype+El+Tor+and+classical+biotypes.">Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).</li><li>Ansaruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+in+Mozambique,+variant+of+Vibrio+cholerae.">Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae.</a> Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).</li><li>Ansaruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+El+Tor+strains+of+Vibrio+cholerae+O1+with+hybrid+traits+isolated+from+Bangladesh+and+Mozambique.">Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).</li><li>Lan, R., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+spread+of+cholera:+genetic+diversity+and+relationships+within+the+seventh+pandemic+clone+of+Vibrio+cholerae+determined+by+amplified+fragment+length+polymorphism.">Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism.</a> J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).</li><li>Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+variants+of+Vibrio+cholerae+O1+biotype+El+Tor+with+attributes+of+the+classical+biotype+from+hospitalized+patients+with+acute+diarrhea+in+Bangladesh.">New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh.</a> J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).</li><li>Nair, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+cholerae+O1+strains+similar+to+pre-seventh+pandemic+El+Tor+strains+during+an+outbreak+of+gastrointestinal+disease+in+an+island+resort+in+Fiji.">Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji.</a> J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).</li><li>Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+hybrid+variants+of+Vibrio+cholerae+O1.">Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1.</a> Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).</li><li>Safa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+characteristics+of+Matlab+variants+of+Vibrio+cholerae+O1+that+are+hybrids+between+classical+and+El+Tor+biotypes.">Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes.</a> J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).</li><li>Nusrin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+CTX+phages+among+toxigenic+Vibrio+cholerae+O1+and+O139+strains+isolated+between+1994+and+2002+in+an+area+where+cholera+is+endemic.">Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic.</a> J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).</li><li>Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphisms+in+regulator-encoding+genes+have+an+additive+effect+on+virulence+gene+expression+in+a+Vibrio+cholerae+clinical+isolate.">Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate.</a> mSphere. 1 (5), e00253 (2016).</li><li>Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+for+stimulating+cholera+toxin+production+by+Vibrio+cholerae+O1+El+Tor.">Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor.</a> Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).</li><li>DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+cascade+controls+virulence+in+Vibrio+cholerae.">Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).</li><li>Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duel+regulation+of+genes+involved+in+acetoin+biosynthesis+and+motility/biofilm+formation+by+the+virulence+activator+AphA+and+the+acetate-responsive+Lys-R+type+regulator+AlsR+in+Vibrio+cholerae.">Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae.</a> Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).</li><li>Vogel, H. J., Bonner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylornithinase+of+Escherechia+coli:+partial+purification+and+some+properties.">Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties.</a> J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).</li><li>Son, M. S., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+biochemical+assays+to+characterize+Vibrio+cholerae+O1+biotypes:+classical+and+El+Tor.">Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).</li><li>Kovacikova, G., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+virulence+gene+expression+in+Vibrio+cholerae+by+quorum+sensing:+HapR+functions+at+the+aphA+promoter.">Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter.</a> Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+functional+quorum-sensing+systems+in+recently+emerged+Vibrio+cholerae+toxigenic+strains.">The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques.">Aseptic laboratory techniques.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).</li><li>Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+laboratory+maintenance+of+Vibrio+cholerae.">Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae.</a> Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Belirlenen 200&#39;den fazla V. Kolera serogrupları, sadece O1 ve O139 epidemik potansiyele sahiptir. O1 serogrup iki biyotipe ayrılabilir: klasik ve El Tor. Bununla birlikte, El Tor&#39;un 13 ve 17 tipi olarak adlandırılan melez soyları, El Tor&#39;un biyotip arka planına sahip ve 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 klasik özelliklere sahip oldukları ortaya çıkmıştır. Bu el yazmasında anlatılan protokoller, V. cholerae&#39;nin çeşitli klinik ve klinik dışı izolatlarını karakterize etme ve / veya ayırt etme ile ilgilenen araştırmacılara güvenilirÇoklu tahlil tanımlama sistemi. Alternatif olarak güvenilir bir çoklu tahlil tanımlama sisteminin kullanılması, daha önce kurulmuş olan tek deney tanımlama sistemlerine ve emek yoğun genetik ekranlara kıyasla bir gelişmedir. Tüm genotipik ve fenotipik analizler karşılaştırma için WT klasik O395 suşu ve WT El Tor suşları C6706 ve N16961 içermelidir ( Tablo 1 ). Klasik ve El Tor biyotip türleri referans olarak dahil edilmekle birlikte, çalışmalarımıza dahil olan MQ1795 ve BAA-2163 gibi izolatlar, biyotipten fenotipik profiller ( Şekil 2 , Şekil 3 , Şekil 4 , Şekil 5 , Şekil 6 , Şekil 7 , Tablo 2 ), güvenilir karakterizasyon için birden fazla genotipik ve fenotipik özellik analizi gerekliliğini göstermektedir. Tüm protokoller aseptik yapılmalıdır.Aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında kurutulmuştur. V. Kolera, ölümcül gastrointestinal hastalık kolerasının etiyolojik ajanı olan bir Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) patojendir; Tüm materyallerin ve atık ürünlerin düzgün bir şekilde elleçlenmesi ve bertaraf edilmesi, kurumsal, yerel, eyalet ve federal yönetmeliklere göre uygulanmalıdır. Tüm ortamların ve reaktiflerin hazırlanması, minimum 18 MΩ-cm hassasiyetine kadar deiyonize analitik dereceli reaktifler ve saf su ile gerçekleştirilmelidir. İşlemden önce, ortam hazırlanmalı ve yeterince kurumaya bırakılmalıdır (1-2 gün); Agar yüzeyinde kalıntı sıvı bulunmadığında tabaklar yeterince kuru kabul edilir. Hareket yelpazesi ve bakteriyel büyümeyi çevreleyen açıklık bölgelerinden dolayı, motilite ve süt plakaları plaka başına 50 mL&#39;ye kadar büyük Petri kaplarında (150 mm x 15 mm) hazırlanmalı ve 1 hafta kadar plastik içinde sarılabilmelidir , LiD-tarafı aşağı 4ºC&#39;de. Ek olarak, hareketlilik plakalarının agar konsantrasyonu, motiliteyi yavaşlatmak için ayarlanabilir; Bununla birlikte, 500 mL&#39;lik çözelti başına 3 g&#39;ı geçen agarın aşılması önerilmez, zira genel hareketliliği önemli ölçüde azaltacak ve böylece farklılıklar gözlemlenemeyecektir. Diğer tüm plaka ortamları, standart ebatlı Petri kaplarında (100 mm x 15 mm) plaka başına yaklaşık 25 mL&#39;ye hazırlanmalı ve kapak tarafı 4 ºC&#39;de plastik altına sarılı altı aya kadar saklanmalıdır. Polimiksin B plakalarının hazırlanması için, polimiksin B eklenmeden önce otoklavdan sonra erimiş ortamın soğumasına izin verilmesi önemlidir, çünkü aşırı sıcaklık antibiyotikleri bozabilir. Polimiksin B plakaları, plastik kaplı, kapak altı, 4ºC&#39;de 3 aya kadar depolanabilir. Bu yazıda tartışılan tahliller, tek koloni büyümesi için bir gün (12-16 saat), geceleme kültürlerinin büyümesi için ek bir gün (12-16 saat) ve genotipik (kromozomal DN için ~ 4 saat) için üçüncü bir gün gerektirirPCR için bir izolasyon ve ~ 3 saat) veya fenotipik deneyler (18-48 saat, Tablo 2 ). Bu el yazmasında anlatılan fenotipik analizlerin biyokimyasal analizi öncesinde, kültürler sonuçların çarpılmaması için kalan kültür ortamının taşınmasını önlemek için 1x PBS&#39;de yıkanmalıdır. Ek olarak, polimiksin B, sitrat, proteaz aktivitesi, hemoliz ve hareketlilik testleri aynı anda tek bir yıkanmış gece boyunca kültür kullanılarak inoküle edilebilir. Kaplamalı ortamı tespit ederken, kültürlerin sıçraması meydana gelebilir ve suşlar arasında çapraz kontaminasyona neden olabilir. Sıçramayı önlemek için, kültürü pipetten tamamen çıkarmaktan kaçının, bunun yerine kültürü pipetin ilk durağında bırakmayı bırakın. Ayrıca, lekelerin kuluçka öncesi agar yüzeyine tam olarak emdirilmesine izin verin ve sonuçları etkileyebilecek agarın delinmemesi için özen gösterin. Fenotipik analizler, boşluk bölgelerine neden olur ( Şekil 4 ; Şekil 5 ; Tablo 2) Ve / veya hareketliliği ( Şekil 6 , Tablo 2 ) karşılaştırma analizi için ilgili çapların ölçülebileceği açıklık veya büyüme alanlarının birleştirilmesini önlemek için maksimum aralıklarla yerleştirilmelidir. İnkübasyon sürelerinden sonra, izotatlar biyotip referans suşlarına göre (WT klasik O395, WT El Tor C6706 ve WT El Tor N16961) imgelendirilebilir ve analiz edilebilir. Bu yazıda özetlenen sıralama vasıtasıyla PCR&#39;ye dayalı genetik ekranlar, başlangıç ​​PCR amplifikasyonunu takiben izolatın biyotip arka planını ctxB ve tcpA&#39;ya göre tanımlamak için kullanılabilir. Standart sıralama kuralları, amplifiye bölgenin boyutuna (ctxB için 580 bp ve tcpA için 1420 bp) bağlı olarak belirli bir miktarda PCR ürünü gerektirir ve reaksiyonları ayarlamak için kurulan protokoller takip edilebilir. Kısaca, bireysel ileri ve rTers dizi reaksiyonları, 3-5 pmol primer / reaksiyon ile hazırlanmalı ve hacim, 1.5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpünde steril ultra saf su ile 20 ul&#39;ye ayarlanmalıdır. Hem PCR amplifikasyonu hem de dizilim için primer tasarımında yardım için, NCBI primer tasarım aracı http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ kullanılabilir. Başarılı bir yükseltme ve ctxB ve TCPA sekanslanması, aşağıdaki primerler kullanılarak gerçekleştirilebilir (5 &#39;→ 3&#39;): ctxB- ileri GGGAATGCTCCAAGATCATCGATGAGTAATAC, ctxB -reverse CATCATCGAACCACAAAAAAGCTTACTGAGG, TCPA -İlet CCGCACCAGATCCACGTAGGTGGG, TCPA -reverse GTCGGTACATCACCTGCTGTGGGGGCAG. CtxB&#39;nin kodlama bölgesinin tamamının , 115 ve 203 nolu baz pozisyonları (El Tor&#39;daki klasik ve timidin her ikisinde de sitozin hariç) her iki biyotip boyunca muhafaza edildiğine dikkat edilmelidir. Buna ek olarak, tcpA&#39;da , biyotipler arasında çoklu taban değişiklikleri korunmaktadır;Biyotipler arasında ayrım yapmaya yardımcı olmak için kullanılabilen iki biyotip arasında ( Tablo 1 ) iffer. V model organizmayı içeren birçok laboratuar çalışmasında. Kolera, uygun bakım ve kültür teknikleri önemlidir 27 . Yaygın olarak kullanılan V büyüme oranları. WT klasik suş O395 ve WT El Tor suşu N16961 gibi kolera biyotip referans suşları, El Tor varyant izolatlarının karakterizasyonu hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir ( Şekil 1 , Tablo 2 ). V boyunca değişen büyüme oranları nedeniyle. Kolera izolatları, kültürler geç sabit fazda maksimum bulanıklığa ulaşana kadar her saat spektrofotometre emilim okumaları yapmak önemlidir. Fazla hücre öküsüyle sonuçlanan bulanıklık platosu nedeniyle orta-geç ölüm fazı görselleştirilemeyebilir. Steril L&#39;ye 1: 4 oranında seyreltik kültür<html> Absorbans okumaları bir OD 600 ≈ 1.0&#39;da zirveye ulaştığından tam bir büyüme eğrisi elde etmek ve enstrümanın hassaslığını korumak için B broth yapılmalıdır. Çoklu suşlar üzerinde büyüme eğrileri yaparken, absorbans okumaları, okumalar arasındaki tutarlılığı sağlamak için her suş için yaklaşık 5 dakika aralıklarla zamanlanmalıdır. V&#39;yi anlama. Kolera biyotipi büyüme oranları, virülans gen ekspresyon çalışmaları, metabolik aktivitelerin analizi ve uygun kültürleme ve saklama koşulları gibi birçok araştırmada kritik önem taşır. Sonraki analizler için, geceleme kültürleri geç büyümedeki (12-16 saat) sabit büyüme evresine kadar işleme tabi tutulmalı ve hücre çoğalmasını maksimize edip hücresel bütünlüğü muhafaza etmelidir. Bununla birlikte, klasik ve El Tor biyotip türleri için kültür koşulları, V&#39;deki virulans gen ekspresyonunun benzeridir. Kolera, biyotipe spesifik virülans indükleyici koşullar gerektirirRef &quot;&gt; 19. CT ve TCP&#39;nin iki önemli virülans faktörü ana regülatör ToxT tarafından kontrol edilir ve spesifik büyüme koşulları altında optimal şekilde ifade edilir, örneğin El Tor virülans indükleyici koşullar altında ToxT tam hücre özütünün işlenmesi ile analiz edilebilir ( WCE) veya hücre peletini 3.5 saatte bulurken, CT ve TCP ekspresyonu, sırasıyla, 7.5 saatte hücre serbest süpernatanı ve WCE&#39;yi işleyerek analiz edilebilir.8,20 Bu el yazması boyunca gösterilen değişken genotipik ve fenotipik özellikler, Çeşitli V. Kolera biyotipleri, daha önce kullanılan tekli tahlil biyotip karakterizasyonuna alternatif olabiliyor ve bunun için gerekli olanı gösterebilir.

Kolera kirlenmiş yiyeceklerin veya sudaki Gram-negatif bakteri Vibrio cholerae&#39;nin bulunduğu suyun tüketiminden kaynaklanan distal ince bağırsağın bir hastalığıdır. Kolera semptomları, kusma ve kontrol edilemeyen sulanmış ishale neden olur ve ciddi şekilde dehidrasyona yol açar ve düzgün tedavi edilmezse ölümle sonuçlanacaktır. V. Kolera, hücre yüzeyi lipopolisakarid O-antijeninin yapısına dayanan 200&#39;den fazla serogrupa bölünebilir. Bununla birlikte, sadece 2 serogrup, O1 ve O139, epidemik veya pandemik potansiyel 1 , 2 göstermiştir. Dahası, serogrup O139, öncelikle Güneydoğu Asya 3 , 4 için izole edilirken, O1 serogrup dünya çapında dağıtılır. Ayrıca, O1 serogrup 2 ana biyotipe ayrılabilir: klasik ve El Tor. Klasik biyotip, ilk 6 kolera salgından sorumluyduS devam ediyor. Yürürlükteki yedinci pandemi, klasik biyotipi 5 , 6 , 7 ortamında küresel olarak değiştiren El Tor biyotipinin bir sonucudur. Son zamanlarda, klasik ve El Tor biyotiplerinin 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 ayırıcı özelliklerini içeren ve bu tarihten itibaren El Tor varyantları 13 , 17 olarak adlandırılan suşlar ortaya çıkmıştır. Bazı El Tor varyantları, daha önce gözlemlenenden daha hızlı ve şiddetli hastalığın ilerlemesi ile artan virülans yetenekleri gösterdiğini vurguluyorAjan tanımlama ve hastalık önleme ve tedavisine yönelik daha kapsamlı bir yaklaşım gereği 8 , 9 , 18 . Biyotip tanımlaması tedaviyi derhal belirtmezken, aşı geliştirmede ilerlemeler ve gelecekteki terapötik ajanlar biyotip ayrımından yararlanabilir. Burada listelenen protokollerin ilk serisi, araştırmacıların V&#39;yi düzgün bir şekilde muhafaza etmelerini sağlayacaktır. Kolera atıkları laboratuar ortamında. Tutarlılık ve müteakip analiz, stokların hazırlanmasını ve izolatların büyümesini gerektirir; bu, biyotipe bağımlı değildir. Bununla birlikte, virülans gen ekspresyonunu optimal olarak teşvik etmek için, bağımsız biotipe özgü kültürleme teknikleri gereklidir 19 . Ayrıca, bu yazıda çeşitli genetik ve biyokimyasal tahliller için hazırlıklar özetlenmiştir. Kolera toksini (BT) ve toksin birlikteGulated pilus (TCP), V&#39;nin her iki biyotipinde ana düzenleyici ToxT tarafından kontrol edilen iki ana virülans faktördür. Kolera O1 serogrup 20 . CT, beş CtxB&#39;den oluşan iki parçalı bir toksindir Tek bir CtxA altbirimini çevreleyen alt birimlerdir ve kolera ile ilişkili hızlı elektrolit kaybından sorumludur. TCP, tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ) tarafından kodlanan bir tip IV pilus olup, distal ince bağırsağın tutunması ve kolonizasyonu ile ilgilidir. TcpA , pilusun yapımı için gerekli olan tek tek pilin alt birimlerini kodlayan tcp operonunun ilk genidir 8 . CtxA için gen dizisi, klasik ve El Tor biyotipleri arasında tamamen korunurken, ctxB ve tcpA iki biyotip arasında farklılık gösterir, ancak her biyotip 8&#39;de korunmaktadır. CtxB , iki taban pozisyondan başka biotipler arasında tamamen korunmuştur(115 ve 203). El Tor biyotipinde, timin 115 ve 203 baz pozisyonlarında bulunurken, klasik biyotip bu bazlarda sitozin içerir. TcpA her biyotip içinde tamamen korunur, ancak biyotipler arasındaki çoklu bazlarda farklılık gösterir. Bu genetik farklılıklar birincil biyotip tanımlama markörleri olarak görev yapar ve bu siteleri de içeren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon ürününün diziliminden sonra, izotop dizileri, biyotip arka planını belirlemek için vahşi tip (WT) klasik O395 veya WT El Tor N16961 ile karşılaştırılabilir Belirli bir V. cholerae izolatında BT ve TCP&#39;nin sırasıyla. Klasik ve El Tor biyotipleri 21 , 22 , 23 arasındaki fenotipik ayrımları karakterize etmek için çok sayıda protokol geliştirildi. Polimiksin B, Gram negatif bakta dış hücre zarı bütünlüğünü tehlikeye atan bir peptid antibiyotiktirTeria ve polimiksin B direnci, polimiksin B direnci tahlili ile görselleştirilebilir 21 . Sitrat Kreb döngüsünün birincil alt tabakasıdır ve sitratın tek bir karbon kaynağı olarak metabolize olabilme özelliği, sitrat metabolizması tahlili 22 kullanılarak saptanabilir. HapR , çeşitli promotör bölgelerine bağlanan ve gen ve operon ifadesini düzenleyen, global bir düzenleyiciyi ve ana çekirdeği algılayan düzenleyiciyi kodlar V. cholerae, HapR&#39;de kodlar 24 . V. cholerae&#39;nin bazı patojenik suşları, hapR geninde, virülans gen ekspresyonunun yoğunluğa bağlı düzenlenmesinin 24 , 25 yaşında kaybolmasına neden olan doğal olarak meydana gelen bir çerçeve kayması mutasyonuna sahiptir. Süt agar medyumu kullanarak HapR ile düzenlenmiş proteaz aktivitesinin ölçülmesi, araştırmacıya belirli bir izolatın işlevsel bir HapR 23 içerdiğini belirlemesine izin verir.Hemoliz testi, bir suşun kırmızı kan hücrelerini parçalayan hemolitik enzimleri salgılama kabiliyeti için test eder; Hemoliz derecesi kan agar plakalarında 23 görülebilir. Hareket genellikle V. cholerae virulence ile ilişkilidir ve motilite agar plakaları 23 kullanılarak analiz edilebilir. Voges-Proskauer tahlili, bir suşun tek bir karbon kaynağı olarak glikozu fermente etme ve yan ürün asetoin 21 üretme kabiliyeti için test eder. El Tor değişkenlerinin ortaya çıkmasıyla, geniş genotipik tarama yapılmadan ve V&#39;nin biyotip arka planını çıkarmadan önce, herhangi bir fenotipik analizin sonuçlarını tahmin etmek zordur. Kolera izolatları için, bu tahlillerin 23 bir araya getirilmesinin ve sonuçların Tablo 2&#39;deki gibi referans suşlarla karşılaştırılması önerilir. Burada, toplu olarak bahsedilenleri kullanan bir seri protokol geliştirdik.V genini karakterize eden daha kapsamlı bir yaklaşım için genotipik ve fenotipik testler. Kolera biyotipleri. Ayrıca, bilinen V genotipik ve fenotipik ayrımlarını tanımladık. Kolera El Tor değişkenleri (MQ1795 ve BAA-2163), yaygın olarak kullanılan biyotip referans suşlarına kıyasla (WT klasik O395, WT El Tor C6706 ve WT El Tor N16961, Tablo 1 ) karşılaştırılmıştır. El Tor varyantlarının ortaya çıkışı, daha önce kullanılan tekli tahlil biyotip karakterizasyon protokollerinin güvenilirliğine meydan okuyor; Bununla birlikte, bu çoklu tahlil tanımlama sistemi, klinik ve çevresel V&#39;nin daha güvenilir tanımlanmasına olanak tanır. Kolera izolatları.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1403">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:183px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:171px;">N3232S</td>
			<td style="width:683px;">https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60% Glycerol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>356352</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>214030</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar with brain-heart infusion</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>237500</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>732-2789</td>
			<td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&#38;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&#38;_dynSessConf=1766917479792147141&#38;targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&#38;lastLanguage=en&#38;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&#38;_D%3AcurrentLanguage=+&#38;currentLanguage=en&#38;_D%3AlastLanguage=+&#38;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anhydrous K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P288-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P288500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood Agar Plates</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C;&#160; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&#38;searchTerm=A73500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromothymol Blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B388-10</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&#38;searchTerm=B38810&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cirtric acid &#183;H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S72836-3</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C;&#160; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S311500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Clean &#38; Concentrator&#8482; -25 Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4007</td>
			<td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GelGreen Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41005</td>
			<td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>840-208100</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158567</td>
			<td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>Corrosive;&#160; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&#38;searchTerm=A144212&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P217500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P285500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&#38;searchTerm=P250500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Le Loop</td>
			<td>Decon Labs Inc.</td>
			<td>MP190-25</td>
			<td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Le Stab</td>
			<td>Decon Labs Inc.</td>
			<td>MP186-5</td>
			<td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&#38;searchTerm=M63500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>Bio Rad Labs</td>
			<td>1704406</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&#38;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&#38;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MR-VP Broth</td>
			<td>Difco</td>
			<td>216300</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S374500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&#38;searchTerm=S27110&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S233500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaNH4HPO4&#183;4H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S218-500</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&#38;searchTerm=S218500&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoDrop Lite Spectrophtometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-LITE-PR</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dry milk</td>
			<td>Nestle Carnation</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>211677</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (100 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (150 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&#38;searchTerm=FB0875714&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polymyxin B sulfate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1004-10MU</td>
			<td>Store at 2-4 &#176;C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td>Store at -20 &#176;C;&#160; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch&#8482;&#160;</td>
			<td>Bio Rad Labs</td>
			<td>1840148</td>
			<td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&#38;_pageLabel=search_page&#38;sfMode=search&#38;sfStartNumber=1&#38;clearQR=true&#38;js=1&#38;searchString=1840148&#38;database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&#38;tabName=DIVISIONNAME</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triphenyltetrazolium chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10870</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&#38;searchTerm=BP1521&#38;searchType=RAPID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#8729;HCl</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9310</td>
			<td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride---CAS-1185-53-1---Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>211705</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Becto, Dickinson and Co.</td>
			<td>212750</td>
			<td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&#38;parentCategory=&#38;parentCategoryName=&#38;categoryId=&#38;categoryName=&#38;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-napthol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>204189</td>
			<td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory techniques used to maintain and differentiate biotypes of vibrio cholerae clinical and environmental isolates

Sucul Gram-negatif bakteri Vibrio cholerae , bulaşıcı gastrointestinal hastalık kolera&#39;sının etyolojik ajanıdır. Bu hastalığın yaygınlığı ve şiddeti nedeniyle, V. Kolera, uygun bakım ve kültür teknikleri gerektiren çevresel ve laboratuvar ortamlarında kapsamlı olarak incelenmiştir. Klasik ve El Tor, V&#39;yi oluşturan iki ana biyotiptir. Kolera O1 serogrup, her biri biyotip karakterizasyonu için güvenilir mekanizmalar sağlayan benzersiz genotipik ve fenotipik özellikler gösterir ve kültürel koşulları uyandıran virülans gerektirir. Herhangi bir enfeksiyon ya da salgın için nedensel suşun biyotipinden bağımsız olarak, hastalık için standart tedavi rehidrasyon terapisini antibiyotik rejimi ile takviye edilmesini içerir. Bununla birlikte, biyotip sınıflandırması laboratuar çalışmaları için gerekebilir ve biyomedikal alanda daha geniş etkilere sahip olabilir.2000&#39;lerin başında hem klasik hem de El Tor biyotiplerinden genotipik ve fenotipik özellikler sergileyen klinik izolatlar tespit edildi. El Tor varyantları olarak adlandırılan yeni tanımlanan melezler, klinik ve çevresel izolat biyotip tanımlamasının önceki geleneksel tek deney tanımlama protokollerinden daha karmaşık hale gelmesine neden oldu. V&#39;yi tanımlamanın yanı sıra. Kolera genel bakım ve kültür teknikleriyle, bu el yazması PCR temelli genetik ekranlar ve fenotipik tahliller (polimiksin B direnci, sitrat metabolizması, proteolitik aktivite, hemolitik aktivite, motilite ve glikoz metabolizması ile Voges- Proskauer tahlili), klasik ve El Tor biyotiplerini tanımlamak ve / veya ayırmak için topluca kullanılır. Bu analizler birlikte, alternatif olarak veya buna ek olarak pahalı, yoğun emek yoğun deneyler için etkili bir sistematik yaklaşım sağlamaktadır.V. Kolera klinik (ve çevresel) izolatlar.

Herhangi bir bakteri suşunun uygun şekilde bakım ve kullanımı için, ilgili suşların katlanma zamanını bilmek tavsiye edilir. Burada, yaygın olarak kullanılan V&#39;nin değişen büyüme oranları. Kolera suşları bir büyüme eğrisi vasıtasıyla gösterildi ve yaklaşık çiftleme süreleri doğrusal regresyon kullanılarak hesaplandı. WT El Tor N16961 ve El Tor varyantı MQ1795, WT klasik O395&#39;e (~ 2 saat) kıyasla daha kısa katlanma süreleri (sırasıyla ~ 1 saat ve ~ 1 saat) göstermiştir ( Şekil 1 ; Tablo 2 ). V. cholerae genetik manipülasyonu ve müteakip analiz çoğunlukla biyotipler arasında doğru bir şekilde ayırma kabiliyetine dayanır. PCR tabanlı genetik ekranlar ve fenotipik analizler, V&#39;nin biyotip arka planlarını ayırt etmek için güvenilir bir sistem olarak topluca uygulanmıştır. Kolera klinik ve çevreselsolates; Temsil için, biyotip referans suşları (WT klasik O395, WT El Tor C6706 ve WT El Tor N16961) ve temsili El Tor türevleri (MQ1795 ve BAA-2163) dahil edildi ( Tablo 1 ). WT klasik O395, klasik ctxB ve tcpA sekanslarını gösterdi. Tersine, WT El Tor suşları N16961 ve C6706, El Tor ctxB ve tcpA sekanslarını göstermiştir. İlginçtir, MQ1795 ve BAA-2163, klasik biyotip ctxB altbirimini O395&#39;e kıyasla içeriyordu, ancak her iki El Tor varyantı da El Tor biyotip arka planını gösteren tcpA içeriyordu ( Tablo 1 ). WT klasik biyotip türü O395 polimiksin B&#39;ye karşı duyarlılık gösterirken, WT El Tor biyotip türleri (C6706 ve N16961), polimiksin B ile takviye edilmiş LB agar plakalarında direnç göstermiş ve büyüme göstermiştir. Temsili El Tor varyant suşları (MQ1795 ve BAA-2163) WT El Tor biyotip straine göre antibiyotik benzer dirençIns (C6706 ve N16961) ( Şekil 2 , Tablo 2 ). WT klasik biyotip türü O395, minimal sitrat ortamında büyümedi; WT El Tor suşları (C6706 ve N16961) sitratın bir karbon kaynağı olarak kullanılabildiğini ve minimal sitrat medyasında büyüme sergilediğini ortaya koydu. Temsilci El Tor değişken biyotip türleri (MQ1795 ve BAA-2163), WT El Tor biyotip türlerine (C6706 ve N16961) kıyasla büyümüştür ( Şekil 3 , Tablo 2 ). WT klasik O395 suşu ve WT El Tor suşu N16961, fonksiyonel olmayan bir HapR&#39;ye sahiptir ve bu nedenle HapR ile düzenlenmiş proteaz aktivitesi göstermez; WT El Tor suşu C6706 ve temsili El Tor türevleri (MQ1795 ve BAA-2163), aşılama noktasından çıkan bir boşluk bölgesi olarak hapR-pozitif olarak görselleştirilmiştir ( Şekil 4 , Tablo 2 ). WT klasik suş O395, hemolitik enzimleri salgılar ve dolayısıylaE γ-hemolitik iken, WT El Tor biyotip türleri (C6706 ve N16961) ve temsil eden El Tor değişken suşları (MQ1795 ve BAA-2163), aşılama noktasını çevreleyen kırmızı kan hücrelerini tamamen çözen ve β-hemoliz izleyen hemolitik enzimleri salgılar ( Şekil 5 ; Tablo 2 ). Motilite, biyotip türleri arasında ve içinde değişir; Bununla birlikte, WT El Tor suşu N16961 ve El Tor varyantları (MQ1795 ve BAA-2163), nispeten daha az hareketli WT klasik O395 ve WT El Tor suşu C6706&#39;ya kıyasla hiper motilite göstermiştir ( Şekil 6 , Tablo 2 ). WT klasik O395 suşu ve temsilcisi El Tor türevleri, asetoin üretmek için glukozu metabolize etmedi, WT El Tor biyotip türleri, Voges-Proskauer tahlili sırasında derin kırmızı bir renk oluşmasıyla gösterildiği gibi, glikoz fermentasyonunun bir yan ürünü olarak asetoin üretti ( Şekil 7 Tablo 2 ). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Gerginlik </td><td colspan="3"> CtxB geni </td><td> TCPA&#39;yı </td><td rowspan="2"> Referans </td></tr><tr><td> Taban 115 </td><td> Taban 203 </td><td> biyotip </td><td> biyotip </td></tr><tr><td> O395 </td><td> C </td><td> C </td><td> klasik </td><td> klasik </td><td> 8 </td></tr><tr><td> C6706 </td><td> T </td><td> T </td><td> El Tor </td><td> El Tor </td><td> 8 </td></tr><tr><td> N16961 </td><td> T </td><td> T </td><td> El Tor </td><td> El Tor </td><td> 8 </td></tr><tr><td> MQ1795 </td><td> C </td><td> C </td><td> klasik </td><td> El Tor </td><td> 13 </td></tr><tr><td> BAA-2163 </td><td> C </td><td> C </td><td> klasik </td><td> El Tor </td><td> 8 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Vibrio cholerae Referans Suşlarının Biyotipli Bağımlı Genetik Farklılıkları . Bu tabloda, ctxB ve tcpA genlerinde bulunan DNA taban değişiklikleri ve göreli konumları gösterilmektedir . WT klasik O395 ve WT El Tor suşları N16961 ve C6706 yaygın olarak kullanılan biyotip referans suşlarıdır. MQ1795 ve BAA-2163, El Tor değişkenleri olarak bilinir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> tahlil </td><td rowspan="2"> Uygulama </td><td rowspan="2"> Orta Seçim </td><td rowspan="2"> Kuluçka </td><td colspan="5"> Beklenen sonuçlar </td></tr><tr><td> O395 </td><td> C6706 </strong&gt; </td><td> N16961 </td><td> MQ1795 </td><td> BAA-2163 </td></tr><tr><td> 2.3) Büyüme Eğrisi 27 </td><td> Çeşitli V. cholerae suşlarının çoğalma zamanlarını belirler. </td><td> 1.2) Sıvı LB Çözeltisi </td><td> 30 saate kadar (havalandırmayla 37 ° C) </td><td> ~ 2 saat </td><td> ND * </td><td> ~ 1 saat </td><td> ~ 1 saat </td><td> ND * </td></tr><tr><td rowspan="2"> 3.1) ctxB ve tcpA 8 kullanarak PCR Tabanlı Genetik Ekran </td><td> CtxB&#39;nin klasik ve El Tor biyotip arka planlarını ayırt eder </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> klasik </td><td> El Tor </td><td> El Tor </td><td> klasik </td><td> klasik </td></tr><tr><td> TcpA&#39;nın klasik ve El Tor biyotip arka planlarını ayırt eder </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> klasik </td><td> El Tor </td><td> El Tor </td><td> El Tor </td><td> El Tor </td></tr><tr><td> 3.2) Polimiksin B Direnci 21 </td><td> Polimiksin B antibiyotiğine duyarlılık </td><td> 1.5) polimiksin B ile takviye edilmiş LB agar plakaları </td><td> 18 saat (37 ° C) </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 3.2) Sitrat Metabolizması 22 </td><td> Sitratın tek karbon kaynağı olarak metabolize olabilme becerisi </td><td> 1.6) Minimal sitrat orta agar plakaları </td><td> 24 saat (37 ° C) </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 3.2) Kazein Hidrolizi 23 </td><td> HapR ile düzenlenmiş proteaz aktivitesi </td><td> 1.7) Süt agar plakaları </td><td> 18 saat (37 ° C) </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 3.2) Hemoliz 23 </td><td> Hemolitik aktiviteyi ölçer </td><td> Kan agar plakaları </td><td> 48 saat (37 ° C) </td&gt; <td> Gama </td><td> Beta </td><td> Beta </td><td> Beta </td><td> Beta </td></tr><tr><td> 3.3) Hareketlilik 23 </td><td> Hareket derecesini ölçer </td><td> 1.8) Hareketlilik agar plakaları </td><td> 14-24 saat (37 ° C) </td><td> 10 mm </td><td> 15 mm </td><td> 21 mm </td><td> 25 mm </td><td> 29 mm </td></tr><tr><td> 3.4) Voges-Proskauer 21 </td><td> Glokozu fermente etme ve yan ürün olarak asetoin üretme becerisini ölçer </td><td> 1.9) Sıvı Voges-Proskauer ortamı </td><td> 4 saate kadar (oda sıcaklığı) </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td colspan="9"> Not: &quot;ND *&quot; belirlenmediğini gösterir; &quot;+&quot; Olumlu bir sonuca işaret eder; &quot;-&quot; negatif bir sonucu gösterir </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Genetik ve Fenotipik Tahliller Özeti </stRong&gt; Vibrio cholerae Biotype Distinction. Bu tablo, bu çalışmada kullanılan klasik ve El Tor biyotipleri arasında ayrım yapmak için toplu olarak kullanılan çeşitli genetik ve fenotipik testleri, uygulamaları ve beklenen sonuçları özetlemektedir. Protokol numaraları ve spesifik protokollere yapılan referanslar Test sütununda belirtilmiştir. &quot;ND *&quot; Belirlenmediğini gösterir ; &quot;+&quot; Olumlu bir sonuca işaret eder; &quot;-&quot; negatif bir sonuca işaret eder. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55760/55760fig1.jpg" /> Şekil 1: V. WT Klasik O395, WT El Tor N16961 ve El Tor Variant MQ1795&#39;in kolerae Büyüme Eğrisi. 37 ° C havalandırma ile LB suyu içinde yetiştirilen biyotip referans suşlarının (WT klasik O395 ve WT El Tor N16961) büyüme oranları ve temsilci El Tor Variant MQ1795, OD 600 e&#39;nin ölçülmesiyle analiz edildiÇok saat başında T 0&#39;dan başlar. Büyüme eğrileri, her bir deneme için bağımsız bir kültür olayını temsil eden her replikasyonla birlikte, 8 bağımsız deneysel kopyada gerçekleştirildi. WT El Tor türü N16961 ve El Tor varyantı MQ1795, daha uzun bir katlama zamanı ile gözlemlendiği gibi WT klasik O395 suşuna (~ 2 saat) kıyasla daha kısa katlanma süreleri (sırasıyla ~ 1 saat ve ~ 1 saat) göstermiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55760/55760fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55760/55760fig2.jpg" /> Şekil 2: Polimiksin B İle Tamamlanan LB Agar Kullanılarak Polimiksin B Direncinin Belirlenmesi B. Polimiksin B peptit antibiyotiğine direnç, 50 IU / μL polimiksin B ile takviye edilmiş LB agar üzerinde büyüme kabiliyeti ile belirlendi. WT klasik soy O395, agar üzerinde herhangi bir büyüme göstermedi. Özel SayıPolimiksin B ile ortaya çıkmış ve antibiyotik duyarlı olduğu düşünülmüştür. WT El Tor suşları (C6706 ve N16961) ve temsili El Tor türevleri (MQ1795 ve BAA-2163), antibiyotik varlığında büyüme sergilerken, polimiksin B&#39;ye dirençli sayılırlar. Plakalar, 37 ° C&#39;de 18 saat inkübe edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55760/55760fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55760/55760fig3.jpg" /> Şekil 3: Minimal Sitrat Ortamını Kullanarak Sitrat Metabolizmasının Ölçülmesi. Sitratın tek bir karbon kaynağı olarak kullanılması, izolatın minimal sitrat ortamda büyüme kabiliyeti ile belirlenmiştir. WT klasik soy O395, minimal sitrat ortamında büyümedi (negatif). Büyüme, tüm WT El Tor suşları (C6706 ve N16961) ve temsilci ElTor türevi (MQ1795 ve BAA-2163), sitratın tek bir karbon kaynağı (pozitif) olarak kullanılabilme yeteneğini göstermiştir. Plakalar, 37 ° C&#39;de 18 saat inkübe edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55760/55760fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55760/55760fig4.jpg" /> Şekil 4: Süt Ağarı Ortamını Kullanarak HapR ile düzenlenen Proteolitik Kazein Hidrolizinin Ölçülmesi. HapR ile düzenlenen proteaz aktivitesi yoluyla kazein hidrolizi, süt agarında aşılanma noktasını çevreleyen bir boşluk görsel bölgesi ile tespit edildi. WT klasik O395 suşu ve WT El Tor suşu N16961 gibi fonksiyonel olmayan bir HapR içeren suşlar, aşılama noktasını çevreleyen bir boşluk bölgesi ( hapR- negatif) üretmedi . WT El Tor suşu C6706 ve temsili El Tor varyantları (MQ1795 ve BAA-2163), farklı boyutlardaki boşluk alanları ( hapR- pozitif) olarak görselleştirilebilen işlevsel bir HapR&#39;yi içerir. Plakalar, 37 ° C&#39;de 18 saat inkübe edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55760/55760fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55760/55760fig5.jpg" /> Şekil 5: Kan Agar Media Kullanılarak Hemolitik Aktivitesi Ölçülmesi. Hemolitik aktivite, koyun kanı ile desteklenmiş agar plakaları kullanılarak ölçüldü. WT klasik suşu O395, kırmızı kan hücrelerini çözen enzimleri (γ-hemolitik) salgılamaz. WT El Tor suşları (N16961 ve C6706) ve temsilcisi El Tor türevleri (MQ1795 ve BAA-2163), hemolitik enzimler salgılar ve aşılanma noktasını çevreleyen yarı saydam bir bölge (β-hemolitik) ile sonuçlanır. Plakalar, 37 ° C&#39;de° C 48 saat boyunca. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55760/55760fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55760/55760fig6.jpg" /> Şekil 6: Motiliteli Agar Plakalarını Kullanarak Motiliteyi Belirleme. Motilite bölgesi, TTC tuzunun görsel bir renk değişikliği ile gösterildi ve TTC, metabolizma yapıldığında berraktan kırmızıya dönüşerek bakterilerin nereye hareket ettiğini gösterdi. El Tor Seri N16961 (21 mm) ve temsili El Tor varyantları (MQ1795 (25 mm) ve BAA-2163 (29 mm)) WT klasik O395 suşu (10 mm) ve WT El Tor suşu C6706&#39;nın (15 mm) ) O395 ve C6706&#39;ya göre hiper-motilite göstermiştir. Plakalar, 37 ° C&#39;de 18 saat inkübe edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55760/55760fig6large.jpg" target="_blank">lütfen tıklayın</a>Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55760/55760fig7.jpg" /> Şekil 7: Voges-Proskauer Testi. Glukoz fermantasyonu yoluyla asetoin üretimi, Voges-Proskauer tahlili kullanılarak belirlendi. WT klasik O395 suşu ve temsili El Tor türevleri (MQ1795 ve BAA-2163) glukoz fermantasyonu sonucu (negatif) asetoin üretmedi. WT El Tor suşları (N16961 ve C6706) yan ürün asetoin üretti ve derin kırmızı renk değişikliği (pozitif) ile görselleştirilebilir. Tüpler, oda sıcaklığında 4 saat inkübe edildi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55760/55760fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates at JoVE.com

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Bu el yazması, klinik ve çevresel V arasındaki hızlı ve güvenilir diferansiyasyon için topluca kullanılan bir dizi biyokimyasal tahlilin yanı sıra, uygun Vibrio kolera bakımı tekniklerini tanımlamaktadır. Bir laboratuar ortamında kolera biyotipleri.

Biyotiplerin Bakımında ve Türevinde Kullanılan Laboratuvar Teknikleri<emVibrio cholerae</em&gt; Klinik ve Çevresel İzolatlar

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

laboratory-techniques-used-to-maintain-differentiate-biotypes-vibrio

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

10.8K Görüntüleme.  Plymouth State University.  Bu el yazması, klinik ve çevresel V arasındaki hızlı ve güvenilir diferansiyasyon için topluca kullanılan bir dizi biyokimyasal tahlilin yanı sıra, uygun Vibrio kolera bakımı tekniklerini tanımlamaktadır. Bir laboratuar ortamında kolera biyotipleri. 

Video: Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Genetiği değiştirmek için bir yöntem<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Doğal Dönüşüm ve FLP-rekombinasyon sonucu

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

This protocol describes the use of a tangential flow hollow-fiber ultrafiltration sample concentration system and a heat dissociation as alternative steps for the detection of waterborne Cryptosporidium and Giardia species using EPA Method 1623.

Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Ve<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 1. Biyogüvenlik Seviye 4 Suit Laboratuvar Suite Giriş ve Çıkış İşlemleri

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Tespiti için daha duyarlı ve özgül Chromogenic Agar Orta Gelişimi<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Ve Diğer<em&gt; Vibrio</em&gt; Türler

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for quantitative analysis of cell surface proteins on immune cells, but it provides no information on the localization and migration patterns of these cells within the lung. Similarly,&#160;chemotaxis assays can be performed to study the potential of cells to respond to chemotactic factors in vitro, but these assays do not reproduce the complex environment of the intact lung. In contrast to these aforementioned techniques, the location of individual cell types within the lung can be readily visualized by generating Precision-cut Lung Slices (PCLS), staining them with commercially available, fluorescently tagged antibodies, and visualizing the sections by confocal microscopy. PCLS can be used for both live and fixed lung tissue, and the slices can encompass areas as large as a cross section of an entire lobe. We have used this protocol to successfully visualize the location of a wide variety of cell types in the lung, including distinct types of dendritic cells, macrophages, neutrophils, T cells and B cells, as well as structural cells such as lymphatic, endothelial, and epithelial cells. The ability to visualize cellular interactions, such as those between dendritic cells and T cells, in live, three-dimensional lung tissue, can reveal how cells move within the lung and interact with one another at steady state and during inflammation. Thus, when used in combination with other procedures, such as flow cytometry and quantitative PCR, PCLS can contribute to a comprehensive understanding of cellular events that underlie allergic and inflammatory diseases of the lung.

We describe a method for generating Precision-cut Lung Slices (PCLS) and immunostaining them to visualize the localization of various immune cell types in the lung. Our protocol can be extended to visualize the location and function of many different cell types under a variety of conditions.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...