Mikrokoşa diziler, Nanofaze Malzeme Bilimleri Merkezi Kullanıcı Tesisleri Bölümü, Temel Enerji Bilimleri Ofisi, ABD Enerji Bakanlığı tarafından imal edildi ve karakterize edildi. Bu çalışma için maddi destek Oak Ridge Ulusal Laboratuar Direktörü Araştırma ve Geliştirme Fonu aracılığıyla sağlandı. Yazarlar ayrıca, bu araştırmalarda kullanılan P. aeruginosa suşlarının temini için J. Mougous Laboratuvarına (Washington Üniversitesi, Seattle, WA) teşekkür etmek istiyorlar .

<ol>
	<li>Zhou, J., Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity,+succession,+and+environmental+perturbations+in+a+fluidic+ecosystem.">Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem.</a> Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).</li><li>Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+analysis+of+microbial+community+organization+through+combinatorial+labeling+and+spectral+imaging.">Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).</li><li>Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layered+structure+of+bacterial+and+archaeal+communities+and+their+in+situ+activities+in+anaerobic+granules.">Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).</li><li>Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+spatial+structure+stabilizes+a+synthetic+multispecies+bacterial+community.">Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).</li><li>Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+bacterial+communities+and+their+relationships+with+the+micro-architecture+of+soil.">Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil.</a> FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).</li><li>Grundmann, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+scales+of+soil+bacterial+diversity+-+The+size+of+a+clone.">Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone.</a> FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).</li><li>Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Bacterial+Communities+Emerging+from+Different+Sources+under+Identical+Conditions.">Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).</li><li>Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+Scales+in+Gastrointestinal+Microbial+Ecology.">Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).</li><li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+regulation+of+biofilm+formation.">Physicochemical regulation of biofilm formation.</a> MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).</li><li>Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+local:+technologies+for+exploring+bacterial+microenvironments.">Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).</li><li>Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogeography+of+polymicrobial+infection.">The biogeography of polymicrobial infection.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).</li><li>Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+block+copolymer+surfaces+for+control+of+microbe+adhesion+and+aggregation.">Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation.</a> Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).</li><li>Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-functionalized+poly(glycidyl+methacrylate)-+block+-poly(vinyldimethyl+azlactone)+surface+scaffolds+for+high+avidity+microbial+capture.">Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture.</a> Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).</li><li>Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstencils+to+generate+defined,+multi-species+patterns+of+bacteria.">Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria.</a> Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).</li><li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes.">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).</li><li>Zhang, Q., Lambert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+Emergence+of+Bacterial+Antibiotic+Resistance+in+Connected+Microenvironments.">Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments.</a> Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).</li><li>Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+flagella+explore+microscale+hummocks+and+hollows+to+increase+adhesion.">Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).</li><li>Zhou, J., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Assembly+Leads+to+Alternative+Communities+with+Distinct+Functions+in+a+Bioreactor+Microbial+Community.">Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community.</a> MBio. 4 (2), 1-8 (2013).</li><li>van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+chemical+interactions+and+culture+history+on+the+colonization+of+structured+habitats+by+competing+bacterial+populations.">The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations.</a> BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).</li><li>Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+Nanoculture+as+an+Artificial+Microniche.">Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche.</a> Sci Rep. 6, 30578 (2016).</li><li>Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Assembly+of+Bacteria+in+Microwell+Arrays+Reveals+the+Importance+of+Confinement+in+Community+Development.">Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development.</a> PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).</li><li>Hood, R. D., Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Type+VI+Secretion+System+of+Pseudomonas+aeruginosa+Targets+a+Toxin+to+Bacteria.">A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).</li><li>LeRoux, M., Ja De Leon, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+single-cell+characterization+of+bacterial+interactions+reveals+type+VI+secretion+is+a+double-edged+sword.">Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).</li><li>Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+distinct+pathways+guide+effector+export+through+the+type+VI+secretion+system.">Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system.</a> Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).</li><li>Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+Single-Cell+Kinetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions.">Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+Bacterial+Growth+Curve.">Modeling of the Bacterial Growth Curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities.">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu makale, bakteri topluluğunun gelişiminin yüksek verimli ve yüksek içerikli canlı hücre görüntüleme tabanlı analizini mümkün kılmak için tasarlanmış bir mikrodalkaralı dizi cihazı ve deney protokollerini sundu. Buradaki gösterinin odağı, temas yoluyla aracılık edilen Tip VI sekresyonun topluluk gelişimine etkilerini incelemek iken, diziler esnek olacak şekilde tasarlandı ve geniş bir mikrobik topluluklar mikrobik-mikrop etkileşimleri çalışmasına uyacak şekilde tasarlandı. Buradaki çalışma, yalnızca üyelik bolluğunun ve konumunun kolaylıkla izlenebilmesi için flüoresan belirteçlerini oluşturan bakterilerin kullanımına odaklanmaktadır. Bununla birlikte, kimyasal çevreyi değiştirerek büyümeyi veya pertürbasyonu takiben bireysel kuyulardan biyolojik materyali örnekleme imkânları, topluluk kompozisyonunu ve gen ifadesini belirlemek için esas olarak kullanılabilir. Her bir silikon cihaz, çeşitli kuyucuklara sahip mikrowell içeren düzinelerce dizi içerirÇapları 2x, 3x veya 4x çapında düzenlenmiş ve 3 ve 3.5 μm arasında derinliğe kadar kazınmış. Besin maddeleri ve ikincil metabolitler agaroz kapağı boyunca ve boyunca serbestçe dağılabilir, çünkü mikrowelller arasındaki sinyalizasyonun veya yerel besin maddesinin tükenmesinin topluluk gelişimini nasıl etkilediğinin incelenmesine izin vermek için farklı adım alt dizileri dahil edilmiştir. Bu gösteri, büyüme ve toplum gelişimi, dizilerdeki mikro alan aralığı veya konumundan etkilenmiş gibi görünmedi. Sığ derinlik, görüntü analizini basitleştirmek, tüm mikrobik büyümeyi ve gelişimini tek bir görüntü düzlemine sınırlandırmak için seçildi. Bununla birlikte, daha derin kuyular (20 μm derin) daha önce kullanılmıştır ve silikon aşındırma işleminin süresini değiştirerek kolayca derinlemesine modüle edilebilir. Kuyuların en-boy oranının arttırılması, esas itibariyle, kuyuların iç hücrelerinde yaşanan sınırlamayı değiştirerek toplam kuyu hacminin oranını etkili bir şekilde değiştirirBesinlerin kuyunun tepesine dağıldığı bölgeye. Bu çeşit dizi konfigürasyonları iyi veya kuyu içi sinyalizasyon etkilerini incelemek için kullanılabilir. Mikrodalgaları imal etmek için silikon kullanmanın bir sınırlaması, görünür ışığa karşı opaktır. Sonuç olarak, ışığın iletilmesine dayanan rutin analizler ( örneğin, parlak alan, faz veya diferansiyel interferans kontrast görüntüleme) büyümeyi izlemek için kullanılamaz. Grubumuzda devam eden araştırma ve geliştirme, bu silikon mikrodon konfigürasyonunu ve şeffaf dizilerle çalışılacak deneysel protokolü, daha yüksek çözünürlüklü flüoresan ve parlak görüntü görüntüleme ve kantifikasyon için görüntülemeye izin vermek için adapte etmeye odaklanmıştır 27 . Bir cam lamel üzerinde SU-8 epoksi gibi üretim için şeffaf malzemeler kullanarak, kısa çalışma mesafelerinde çalışan objektiflerle parlak ve floresan görüntüler elde etmek mümkündür.Bu, silikon dizilerde olduğu gibi bir agar tabakası yoluyla görüntülemenin zorlaması olmaksızın, ≥40X büyütme oranına sahip suya daldırma veya yağ hedefleri ile elde edilecek daha optimum çözünürlüğü elde etmeyi sağlar. Önceki çalışmamızda anlatıldığı gibi ekim koşulları ve iyi geometri, hücrelerin kuyu dizileri içine ekilmesini etkiler. Düşük ekim yoğunluklarında veya küçük kuyularda, bireysel kuyulara yüklenen hücre sayı ve türlerinde yüksek düzeyde değişimler, deneysel parametre alanının geniş ve hızlı bir araştırılmasına olanak tanır. Yüksek ekim yoğunlukları ve / veya daha büyük oyuklar görüntüleme, çok sayıda deneysel kopyanın analizine imkan tanıyan, hücre tiplerinin ve toplam inokülum seviyelerinin daha tutarlı oranları verir. Büyümenin en erken evrelerinde görüntülere hızlı bir şekilde bakmak, hücrelerin öncelikle kuyuların kenarlarına eklenip büyümesine işaret eder ( Şekil 5a ). Bunun, s ile ilgili bir eser olup olmadığı belli değildir.Tohumlama işlemi sırasında ome buharlaşarak kurutulması veya çoklu kenara hücre bağlanması için bir tercih önerir. Kasıtlı olarak kuyuların topografyasını veya yüzey kimyasını deterministik bir şekilde değiştirerek, hangi faktörlerin hücre bağlanması ve biyofilm oluşumu üzerinde en fazla etkiye sahip olduğunu ortaya çıkarabilir. Bu kuyulardaki bakterilerin gelişimi, R2A ortamı verilen bir agaroz jel kaplı cam lamel kullanılarak desteklenmektedir. Bu agaroz kaplı lamel oluşturmak için açıklanan yöntemler, görüntünün tamamı boyunca eşit bir kalınlık ve çok sayıda sabit silikon çipi eşzamanlı olarak görüntüleme imkânı sağlayan oldukça sabit bir z konumu sağlar. Jelleştirici ajan olarak ultra saf agarozun kullanılması ve komple bir madde olmaktan ziyade bir minimal ortam kullanılması, daha temiz, daha az otofloresan bir arka plana neden olur ve genel sinyal / gürültü oranını arttırır. Mikrobiyal toplulukların kantitatif izlenmesi için flüorüre dayanıyorsa, imagi&#39;yi korumak esastırKoşulların tutarlı olması ve otofloresans, fotoblokaj ve düzgün olmayan aydınlatmadan kaynaklanan katkıların keskin bir şekilde farkında olması. Buna ek olarak, uzun süre atlamalı görüntü elde etmeyi gerektiren deneyler için, burada kullanılan gibi kalın bir agaroz tabakası arzu edilmektedir. Daha yüksek büyütme görüntülemeyi sağlamak için daha ince katmanlar (~ 100 μm kalınlıkta) yapılabilir. Bununla birlikte, bu ince tabakanın kurumasını önleyecek kadar düzgün nemli tutmanın zordur. Büyüme parametrelerinin ve ilk inokülum düzeylerinin ilk analizi henüz burada açıklanan basit sistem için önemli bir korelasyon ortaya çıkarmamış olsa da, gösterilen protokoller ve veriler, zaman içinde topluluk gelişiminin görüntülerinden çıkarılan bilginin derinliğini vurguluyor. Kuyulardaki mekânsal organizasyon tek tür koloniler &quot;çekirdekleşme&quot; alanlarından genişlediği için gelişir. Böylece, ilk bağlanma yoğunluğu ile ilişkili faktörler ( yani bitki sıklığıPs daha iyi bir yüzey için bir başka türden daha fazla tercih) veya bireysel yamaların büyüme oranı dramatik topluluk gelişimi etkileyebilir. Büyüme sürecinin çok ilerisinde kurulan türler (yamalar) arasındaki temasın arabulucuğu gibi sunum yapan etkileşimler, görüntü verilerinin daha ayrıntılı analiz edilmesini gerektirebilir. Burada sunulan mikrowell dizilimi platformu ve protokolü, mikrobik toplum gelişimi ve mikrobik-mikrop etkileşimlerinin hızlı bir şekilde bir araya getirilmesi ve yüksek içerik analizi yapılmasını kolaylaştırır. Yerel kimyasal çevrenin kontrol edilmesine, agar kapağındaki ortam bileşiminin değiştirilmesine veya entegre mikroakışkanlar yoluyla doğrudan modüle edilerek örneklenmeye olanak tanıyan gelecekteki çalışmalar, doğal sınırlandırmayı taklit eden ve niş boyutunu taklit eden deney protokollerine izin vermelidir Doğada bulunanlara benzer dinamik olarak değişen çevrelerin etkisini keşfedebilirsiniz. Gelecekteki iş artacakYerel kimyasal ortamı dinamik olarak modüle etmek ve bireysel kuyulardan sıvı örneklemek için kullanılabilen entegre mikroakışkanlı dizilim tasarımı. Topluluk büyümesinin daha yüksek çözünürlüklü ve parlak alan takibi için kullanılabilecek optik olarak açık mikrodalga dizilerinin geliştirilmesine ilişkin ek çalışmalar, başka yerlerde 27 açıklanmıştır.

Mikrobiyal topluluklar, hem hücre ölümü, bölünme, protein konsantrasyonu, organel sayısı ve mutasyon 1 ile ilişkili olan ortamın yapısı ve stokastik süreçler gibi belirleyici faktörler tarafından şekillendirilir 1 . Doğal ortamda, bu etkilerin toplumdaki bileşimi ve etkinliği üzerindeki bireysel etkisini çözümlemek neredeyse imkansız olabilir. Doğal yapılar tarafından örtülmüş ve kimyasal ve biyolojik bir ortamda gömülmüş, topluluk üyelerinin tanımlanması ve doğal çevre içerisinde zaman-zaman dağılımının daha da çözülmesi son derece zorlu bir konudur. Bununla birlikte, son zamanlardaki çabalar, mekânsal organizasyonun topluluk işlevi üzerindeki önemini vurgulamış ve devam eden çalışmalarda hem üye bolluğunu hem de örgütlenmeyi hesaba katma ihtiyacına işaret etmektedir 2 , 3 , 4 . O, Yerel kimyasal çevrenin (besin maddelerinin ve sekonder metabolitlerin mevcudiyeti), fiziksel yapının ( örneğin toprak yapısı, bitki kökleri, okyanus parçacıkları veya bağırsak mikrovillikleri), oksijenin varlığı veya yokluğunun ve Patojenik türlerin hepsi mikrobiyal toplulukların kompozisyonu, mimarisi ve fonksiyonunu etkiler 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Bununla birlikte, kültürler için bu faktörleri yakalamayı ihmal eden geleneksel teknikler hakim olmaya devam etmektedir. Topluluk bileşimi ( örneğin birlikte bağımlı türlerin varlığı), fiziksel bağlanma, sinyal molekül konsantrasyonu ve direkt hücre-hücre teması, mikrobiyal bir topluluğun şekillenmesi için önemli faktörlerdir ve cÖnceki kültür koşulları. Bu özelliklerin bir toplu sıvı kültüründe veya bir agar plakasında kopyalanması zordur. Bununla birlikte, doğal ortamların önemli fiziksel ve kimyasal özelliklerinin çoğaltılmasına izin veren mikroakışkan, mikro-modelleme ve nanofabrikasyon teknikleri, birçok araştırmacıya, 12 , 13 , 14 arasındaki etkileşimleri incelemek için bakteriyel topluluklar inşa ettirdi ve Doğal koşulları 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20&#39;yi taklit edin. Bu protokol, bir mikrodellek dizilimi cihazı imal etmek için bir yöntem açıklamaktadır ve bu yöntemin işlevselleştirilmesi için kullanılabilecek ayrıntılı deneysel prosedürler sağlamaktadır.Hem kuyuları hem de tek tür kolonileri olarak ve çok üyeli topluluklarda bakteri yetiştirmek için kullanıldı. Bu çalışma aynı zamanda, floresan muhabir proteinleri üretmek üzere modifiye edilen bakterilerin, zaman içinde kuyu içerisindeki bakterilerin büyümesini izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Benzer bir dizi daha önce sunulmuş ve mikrowelllerde Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) tek tür kolonilerin büyümesini izlemek mümkün olduğunu göstermiştir. Kuyu boyutu ve ekim yoğunluğunu modüle ederek, binlerce büyüme deneyinin başlangıç ​​koşulları, ilk inokülasyon koşullarının bakterilerin yetişme yeteneğini nasıl etkilediğini belirlemek için paralel olarak değiştirilebilir. Mevcut çalışma, çoklu dizilerin eşzamanlı karşılaştırılmasını sağlayarak ve daha sağlam bir deney protokolü kullanarak önceki çalışmaya dayanan mikrodevre dizisinin biraz değiştirilmiş bir sürümünü kullanıyor. Bu çalışmada kullanılan dizi, çoklu alt sıralar veya dizi ensem içerirÇapları 15 - 100 μm arasında değişen, üç farklı aralıklarla ( yani , kuyu çapında 2x, 3x ve 4x) düzenlenmiş farklı boyutlarda oyuklar içeren oyuklar. Diziler silikona kazınır ve silikon dizilerde tohumlanan bakterilerin büyümesi, orta-enfüze bir agaroz jeli ile kaplanmış bir lamel ile dizileri sızdırmaz hale getirerek etkinleştirilir. Bu demonstrasyonda Tip VI sekresyon sistemini incelemek üzere tasarlanmış P. aeruginosa mutantları kullanılır. Burada sunulan sonuçlar, mikrowell dizilerdeki çok elemanlı toplulukların analizinin nihai hedefine doğru inşa ederek, araştırmacıların kimyasal çevrenin kontrol edilmesi ve araştırılması sırasında yerinde bakterilerin bolluğunu ve organizasyonunu izlemesini sağlıyor. Bu, nihayetinde topluluk gelişimini ve halefiyetini yöneten &quot;kurallar&quot; hakkında fikir verir.

<table><tbody><tr><td>Parylene N</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>CAS NO.:1633-22-3</td><td></td></tr><tr><td>Parylene coater</td><td>Specialty Coating Systems</td><td>Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>WRS Materials</td><td>100mm diameter, 500-550&amp;mu;m thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos&amp;lt;100&gt;,</td><td></td></tr><tr><td>adhesion promoter</td><td>Shin-Etsu Microsci</td><td>MicroPrime P20 adhesion promoter</td><td></td></tr><tr><td>postive tone photoresist</td><td>Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow)</td><td>Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)</td><td></td></tr><tr><td>Quintel Contact Aligner</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Mask Aligner</td><td></td></tr><tr><td>Reactive Ion Etching Tool</td><td>Oxford Instruments</td><td>Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher</td><td></td></tr><tr><td>R2A Broth</td><td>TEKnova</td><td>R0005</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>Enspire, 2300-0000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Automated Stage</td><td>Prior</td><td>ProScan III</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top environmental control chamber</td><td>In Vivo Scientific</td><td>STEV ECU-HOC</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm No. 1.5 coverslip</td><td>Nexterion</td><td>High performance #1.5H coverslips</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Reference Slides</td><td>Ted Pella</td><td>2273</td><td></td></tr><tr><td>Physical Stylus Profilometer</td><td>KLA Tencor</td><td>P-6</td><td></td></tr><tr><td>lab wipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155</td><td></td></tr><tr><td>commercial software</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filter cubes</td><td>Nikon</td><td>Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)</td><td></td></tr></tbody></table>

assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, topluluk üyelerinin mekansal dağılımını ve faaliyetlerini önemli ölçüde değiştirebilen karmaşık deterministik ve stokastik faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Binlerce bakteri topluluğunu paralel olarak hızlı bir şekilde bir araya getirmek ve izlemek için kullanılabilecek bir mikro kollu dizi platformu geliştirdik. Bu protokol, platformun kullanımını vurgular ve platform içindeki dizilerin bir topluluğunda basit, iki üyeli toplulukların gelişimini optik olarak izlemek için kullanımını açıklar. Bu gösteri, Tip VI salgı patojenisitesini incelemek üzere geliştirilen bir dizi mutantın bir parçası olan Pseudomonas aeruginosa&#39;nın iki mutantını kullanıyor. MCherry veya GFP genlerinin kromozomal girdileri, her bir mikrowell içindeki topluluk üyelerinin bolluğunu ve konumunu izlemek için kullanılabilen farklı emisyon dalga boylarına sahip floresan proteinlerin yapılı ifadesini kolaylaştırır. Bu protokol ayrıntılı bir metodu açıklamaktadır.D, bakteri karışımlarını dizinin kuyularına monte etmek ve zaman içindeki tüm üye popülasyonun göreli büyümesini ölçmek için zaman atlamalı floresans görüntüleme ve niceliksel görüntü analizi kullanmak için kullanılmıştır. Mikro platformun tohumlanması ve montajı, dizi içindeki mikrobik toplulukların kantitatif analizi için gerekli görüntüleme prosedürleri ve mikrobik tür alanları arasındaki etkileşimleri ortaya çıkarmak için kullanılabilecek yöntemlerin hepsi tartışılmıştır.

Burada sunulan deney platformu, bakteri topluluklarının yüksek verimli ve yüksek içerikli çalışmaları için tasarlanmıştır. Tasarım, çeşitli büyüklükteki kuyulardan büyüyen binlerce topluluğun aynı anda analiz edilmesini sağlıyor. Bu mikrodellek dizilimi tasarımı ile, nihai topluluk bileşiminin ilk ekim yoğunlukları, iyi boyut ve kimyasal çevre üzerindeki bağımlılığı belirlenebilir. Bu çalışma, mikrodalgalı dizide iki üyeli bir toplumun büyümesini ve topluluk yapısını ve organizasyonunu analiz etmeye yönelik yöntemleri ortaya koyuyor. Burada kullanılan model sistemi Mugg laboratuvarında P. aeruginosa&#39;da Tip VI salgılarını incelemek üzere tasarlandı . Sistem, GFP veya mCherry flüoresan gazetecileri içeren birkaç mutant suştan oluşur. Bu çalışmada 2 farklı suş kullanılmıştır. Birincisi, GFP etiketli bir ΔretS mutantını oluşturanY, Tip VI salgı ile ilişkili zehirli efektör proteinlerini ifade eder ve duyarlı hücrelerde daha yüksek seviyelerde hücre ölümüne neden olur. İkincisi, altı bilinen efektör proteini eksik olan bir silme mutantı olan RFP etiketli bir ΔretSΔtse / i1-6 suşudur ve Tip VI patojenez 22 , 23 , 24&#39;e karşı daha duyarlı olduğu gösterilmiştir. Her türün büyüme yörüngeleri tek tek ve iki üye toplumda ( yani , dizi platformu içindeki ortak kültür) izlendi. ΔretS ve ΔretSΔtse / i1-6 mutantları her biri ayrı olarak üç diziye ekildi ve aynı zamanda 1: 2 oranında karıştırıldı ve her 30 dakikada 20 saat boyunca görüntülendi. Kuyulardaki bakteri gelişimi postseedasyondan 6-12 saat sonra kesildi. Floresan görüntü verisinin örnekleri Şekil 2 ve 3&#39;te gösterilmektedir. Şekil 2 , 45 um çaplı kuyularda ΔretS ve ΔretSΔtse / i1-6 suşlarının zaman içindeki büyümesini gösterirken Şekil 3 , aynı ebattaki çeşitli kuyularda yaklaşık 6 saat sonra aynı iki üyeli toplulukların durumunu göstermektedir. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig2.jpg" /> Şekil 2: Bir zaman-ders ortak kültür Büyüme Deneyinden Örnek Resimler. MCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (kırmızı) veya GFP (ΔretS) (yeşil) ifade eden P. aeruginosa&#39;nın iki mutantı, mikrowell dizilerinde 2: 1 mCherry: GFP oranında tohumlanır. Buradaki resim, 45 um çaplı kuyularda postseed edilerek 3 farklı zamanta alınan kompozit görüntülerdir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55701/55701fig2large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir versiyonu görmek için lütfen tıklayınız.</a>Bu rakamın% <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig3.jpg" /> Şekil 3: Mikro Işık Dizi Cihazında Bulunan Kuyu Çaplarının Aralığı. İki üyeli toplulukların temsilcilik imgeleri 8 saatlik büyümeyle yakalandı. Genellikle, mCherry (ΔretSΔtse / i1-6) (kırmızı) veya GFP (ΔretS) (yeşil) kolonileri, mikrodalgadaki farklı alanlar içinde kalan, en az kolokalizasyonu gösterir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55701/55701fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Ölçümlerin edinilmesinden önce, kayan bir parabaloid arka arkaya çıkarma gerçekleştirildi. Bir aydınlatma düzeltme basamağı, belirli bir deneyde görüntülendiği her bir mikrowellin sinyalinin nicel olarak karşılaştırılabilmesi için kullanıldı. Bu yöntemler pDolandırıcılıkla tanımlanan 25 . ImageJ&#39;deki mikrodizil eklentisini kullanarak, düzeltilmiş görüntülerde kırmızı ve yeşil bakterilerin ortalama yoğunluğu, yerel arka plan sinyaliyle birlikte ölçülmüştür. Yerel arkaplan sinyali kuyu sinyalinden çıkarıldı ve GFP sinyali, P. aeruginosa ortak kültürlerinin otofluoresansı için düzeltilecek şekilde ayarlandı (otofloresans, mCherry ΔretSΔtse / i1-6-yalnızca dizilerden belirlendi) . Bütün bu düzeltmeler yapıldıktan sonra mCherry ve GFP ifade eden bakterilerin niceliksel büyüme yörüngeleri çizilebilirdi. 20 ve 50 um çaplı kuyulardan örnek büyüme yörüngeleri Şekil 4&#39;te gösterilmektedir. <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig4.jpg" /> Şekil 4: P. aeruginosa Tip VI Salgılama Mutantlannın Mono- ve Ko- kültürlerinin Büyüme Eğrileri.( A ve d ) sırasıyla 20 um ve 50 um um kuyularda GFP-ΔretS monokültür büyüme eğrileri. ( B ve e ) sırasıyla 20 ve 50 um kuyularda mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 monokültür büyüme eğrileri. (C ve f) 1: 2 oranında GFP (yeşil) ve mCherry (kırmızı) P. aeruginosa suşlarının birlikte-kültürü . Büyüme eğrileri, görüntü yakalama başladığında, yaklaşık 2 saat sonra postseed (hps) olarak çizilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55701/55701fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> P. aeruginosa suşlarının tekli ve birlikte kültürüne ait büyüme yörüngeleri, büyümenin kuyudan kuyuya doğru bir çeşitlilik gösterdiğini ve bu değişkenliğin küçük boyutların kuyularında arttığını göstermektedir. Bununla birlikte, ortalama yoğunluk, kuyu kuyularından önemli ölçüde etkilenmemektedirze. ΔretS suşu mevcut olduğunda duyarlı suşun (ΔretSΔtse / i1-6) büyümesi üzerinde dramatik veya belirgin bir negatif etki olduğu görülmemektedir. Her bir suş için toplam yoğunluk azaldı, fakat toplam OD, deneyler arasında tutarlıydı, her suşun bireysel OD&#39;u değil, oyuklardaki her suşun başlangıç ​​konsantrasyonu daha düşüktü. Bununla birlikte, bu kuyulardaki bakterilerin büyümesini anlamak için yalnızca hangi faktörlerin en önemli olduğunu belirlemek, yalnızca büyüme yörüngelerine bakmak suretiyle belirlenememektedir. Dolayısıyla, her yörünge, değiştirilmiş bir lojistik fonksiyon 26&#39;ya ( Şekil 5a ) uygundu, böylece ilgili parametreler çıkartılabilir ve bakteri büyüme verilerini analiz etmek için kullanılabilir. Her yörünge, sinyalin doğal kaydını başlangıç ​​sinyaline bölünerek dönüştürdü. Modifiye lojistik fonksiyonu, maksimum sinyale (A), maksimumaHızı (μ) ve gecikme zamanı (τ), her yörüngeye uymak için kullanılmıştır. GFP-ΔretS ve mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 suşları arasındaki bilinen etkileşim göz önüne alındığında, mCherry suşunun büyümesinin GFP-ΔretS suşu 22 , 24 ile birlikte kültürlerde inhibe edileceğini varsayabiliriz. Ayıklanan parametreleri kullanarak, GFP ve mCherry yörüngelerinden çıkarılan parametreler arasında pozitif veya negatif korelasyon aramak mümkündür. İlk parametre analizi, bu türlerin ortak kültürünün genel büyüme üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahip olduğunu düşündürdü. Büyüme eğrilerinde görülen değişkenlik büyük olasılıkla daha küçük kuyu çaplarında daha değişken hale gelen başlangıç ​​tohumlama yoğunluğu gibi çevresel faktörlere bağlıdır ( Şekil 5b ). MCherry suşu üzerindeki olumsuz etkileri<html> GFP-ΔretS gözlemlenmedi. Örneğin, maksimum mCherry sinyalini ilk GFP-RFP oranına göre çizerken, kuyularda yüksek GFP-ΔretS oranı olduğu zaman mCherry ekspresyonunda herhangi bir azalma bulunmadı. <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig5.jpg" /> Şekil 5: Floresan Büyüme Yörüngeleri Modifiye Lojistik Denklemine Uymaktadır. ( A ) Örnek eğri normalize edilmiş ve daha sonra üç parametre, maksimum yoğunluk (A), maksimum hız (μ) ve gecikme zamanı (τ) ayarlanarak değiştirilmiş bir lojistik denklem ile uydurulmuştur. ( B ) Çeşitli çaplarda bireysel kuyularda başlangıç ​​GFP sinyaline karşı başlangıç ​​mCherry sinyali. ( C ) Maksimum mCherry muhabiri sinyali, GFP ifade eden bakterilerin başlangıç ​​yoğunluğuna kıyasla RFP&#39;yi ifade eden bakteriler oranına göre çizilmiştir.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu şekli daha geniş bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız. Mougous laboratuardaki daha önceki çalışmalar, Tip VI salgılamanın etkilerinin salgılar ve duyarlı hücreler arasında direkt hücre-hücre teması gerektirdiğini ve daha uzun bir temas periyodunun daha fazla hücre eritilmesine neden olduğunu belirtti. Bu nedenle, bu dizilerde, iki mutantın üssel büyümesinin, bu model sistemdeki kontakt aracılı patojenik etkileri aştığına inanıyoruz. Bununla birlikte, her ölçekteki kuyularda, GFP ve mCherry&#39;yi ifade eden bakteriler farklı yamalarda büyür ( Şekil 2 ve 3 ). Bu nedenle, büyüme oranlarına odaklanmak yerine, kontak aracılı patojenik aktörler içeren bakteri toplulukları mekansal analizler kullanılarak daha iyi incelenebilir. Örneğin, focusi yerineBir kuyudaki kırmızı veya yeşil hücrenin toplam sayısını temsil eden entegre yoğunluk üzerine, bu mikro odun biçimi kırmızı ve / veya yeşil piksellerin sayısının ve konumunun sayılmasına izin verir. Kırmızı ve yeşil sinyallerin çakıştığı sınırlara odaklanarak, bu kuyularda bireysel kolonilerin veya yamaların büyümesini analiz etmek mümkündür ( Şekil 6a ). Daha sonra ortak yerelleştirme olaylarının ve en yakın komşu analizlerinin nicelendirilmesi, yama boyutu, yama büyüme oranı ve bireysel kuyularda yama örtüşmesi gibi özelliklere daha yakından bakmak için uygulanabilir. Mekansal analizler daha yüksek büyütmeli görüntüleme ve konfokal mikroskopi ile desteklenecektir ( Şekil 6b ). <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55701/55701fig6.jpg" /> Şekil 6: Epifloresan ve Konfokal Mikroskopi kullanılarak Farklı Türlerin Mekansal Organizasyonu Analiz Edilebilir. ( <stRong&gt; a) 20X büyütme ve 0.8 NA&#39;lık bir konfokal mikroskop kullanarak elde edilen 100 μm&#39;lik bir görüntü dizisi. Beyaz oklar, kırmızı ve yeşil kolonilerin çakıştığı veya karışık olduğu sarı bölgelere işaret eder. Kolonilerin bu bölgelerde nasıl büyüdüklerini incelemek, temasa dayalı patogenezi incelemek için ilginç olacaktır. ( B ve c ) 15 μm çapında, ~ 7.5 μm derin kuyucukların konfokal görüntüleri (20X büyütme, NA = 0.8). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55701/55701fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform at JoVE.com

Mikro Kuyu Dizisi Platformunda Mikrobiyal Topluluk Gelişiminin Birleştirilmesi ve Takibi | Biyomühendislik | Video

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

assembly-tracking-microbial-community-development-within-microwell

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Ecology

Population and Community Ecology

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Görüntüleme.  Oak Ridge National Laboratory.  Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir. 

Video: Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Biyomühendislik

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Mühendislik

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Biyoloji

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...