Bu çalışma, Johns Hopkins Üniversitesi (GB) fon tarafından desteklenmiştir. Biz onların teknik destek için Tıp Mikroskop Tesisi Johns Hopkins Okulu teşekkür ederim. Biz tekniğin geliştirilmesi için Erik Jorgensen ve Christian Rosenmund ve laboratuarlar üyelerine teşekkür. Biz ilk cihazın tasarımı için M. Wayne Davis teşekkür ederim. Biz onların teknik yardım için Paul Wurzinger, Cveta Tomova ve Delgermaa Luvsanjav teşekkür ederim. Ayrıca yazının eleştirel okuma Natalie R. Hamilton ve Grant F. Kusick teşekkür ederim.

Deneylerin tamamı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kural ve hayvan kullanımının yönetmeliklere göre yapılmıştır. protokol Johns Hopkins Tıp Fakültesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. İzolasyon ve Kültür Fare hipokampalinden <ol><li> Bir doğum sonrası gün 0 korteks teşrih - gün 2 (P0 - 2) fare beyni 18. korteks astrositler izole edin. NOT: Fare beyni dekapitasyon sonra izole edildi. Astrositler hipokampal nöronlar için bir besleyici tabaka olarak görev yapar. </li><li> astrositler ayırmak için 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA, 800 uL korteks tedavi edin. </li><li> Kültür,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 0.2 penisilin-streptomisin bir hafta 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 içeren DMEM 13 mL bir T-75 balon jojesi içerisinde astrositler. </li><li> Bir asitle yıkanmış ve steril 18 mm cam lamel pe yerleştirin12 kuyucuklu bir plakanın R de. </li><li> Kısaca,% 70 etanol içinde iki adet 6 mm karbon kaplı safir diskleri yıkayın ve her bir cam lamel üzerine yerleştirin. </li><li> fare kuyruk kolajeni ile 1 mL PDL 1 mL (1 mg / ml) ile 17 nM, asetik asit, 3 mL karıştırılarak Poly-D-Lisin (PDL) çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca safir diskler ve cam lameller PDL çözeltisi 200 uL uygulanır. </li><li> PDL çözüm ve hava kuru çıkarın. ultraviyole ışığı altında, 30 dakika boyunca 1.6 - kullanmak adımda 1.4 de hazırlanan plaka sterilize etmek için önce. </li><li> 1.6 - adımda 1.4 de hazırlanan plaka / oyuk 5x10 4 hücre yoğunluğunda DMEM 2 mL adım 1.3 astrositler tohum. Bir hafta boyunca CO2 37 ° C&#39;de büyüyebilir ve% 5. </li><li> nöronlar kültür önce en az birkaç saat boyunca her bir oyuğa (80 uM son konsantrasyon), floro-deoksiüridin 20 uL ekleyin. NOT: Floro-deoksiüridin astrosit bölümü durur. </li><li> nöronal bas 1.5 mL ortam değiştirme% 1 L-alanil-L-glutamin (Malzemelerin Tablo), nöronal hücrelerin% 2 serumsuz ek (Malzemelerin Tablo) ve% 0.2 penisilin-streptomisin içeren arkadaşları ortamı (Malzemelerin Tabloya bakınız) . </li><li> Enzim çözeltisi, 5 mL (1.65 mM sistein, 1 mM CaCl2, ve DMEM içinde 0.5 mM EDTA) içinde papain 20 adet ilave edilerek papain çözeltisi hazırlayın. 20 dakika boyunca CO2 gazı geçirilerek çözelti asitlenir. 0.22 um bir filtre ile filtre-sterilize edin. </li><li> 2 fareyi 18 - Bir P0 gelen beyin Hasat. Hemen buz soğukluğunda Hanks&#39;-dengeli tuz çözeltisi (HBSS) beyin aktarın. HBSS batırılmış doku tutarak, bir stereo mikroskop altında hippocampi teşrih. </li><li> Adım 1.11 hazırlanan papain çözeltisi 1 mL, iki Hippocampi yerleştirin. 37 ° C&#39;de ve 750 rpm&#39;de bir termomikserinde 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> ihtiva eden çözelti inaktive 1 mL papain yerinetripsin inhibitörü olarak 2.5 mg ila DMEM mL&#39;si başına albümin 0,5 mg. 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir. inaktive çözümü kapalı aspire. </li><li> İzole hipokampusa nöronal bazal ortam (Malzemelerin Tabloya bakınız), 200 uL ekleyin. hücreleri ayırmak için 200 uL bir pipet kullanarak toz haline getirin. ayrışmamış hücreler dibinde biriken kadar bekleyin. Dikkatle üstten hücrelerle aracını çıkartın. </li><li> Adımı tekrarlayın 1.15 3x. Havuz yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne bütün ayrılmış hücreleri. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Plaka 6.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda nöronlar / göz ile ilgili adımları 1.1 hazırlanan astrosit tabakasının üst - 1.10. </li><li> Lentivirüs DIV 3 (in vitro 3 d) 18 channelrhodopsin ifade ile nöronların Infect. </li><li> adımlarda 2.1 açıklandığı gibi, DIV 14 flaşı-ve-donma gerçekleştirin - 2.5 aşağıda. </li></ol> 2. Flash birD-Freeze <ol><li> Sabitleme Hazırlanması <ol><li> glutaraldehit 2.5 mL (aseton içindeki% 10 stok), ozmiyum tetroksit 0.25 g, su, 0.25 mL, ve susuz aseton 22.25 mL: kimyasal bir başlık altında, fiksatif hazırlamak için bir konik tüp aşağıdaki maddeleri ekleyin. Not: her bir bileşenin son konsantrasyonunun aseton içinde% 1 olmalıdır. Glutaraldehit dondurularak ikame sırasında protein yapılarını korumak için ilave edilir. DİKKAT: osmiyum tetroksit akut toksisite yüksektir. dumanlara maruz kalmak gözün kornea zarar verebilir. Sadece sertifikalı kimyasal kaputu ele alınmalıdır. </li><li> Kısım sayılı kriyojenik şişeler (2 mL) içine sabitleyici 1 mL. kullanılana kadar sıvı nitrojen içinde dondurulmuş fiksatif tutun. Not: Osmiyum tetroksit ve glutaraldehit çapraz reaksiyona girmekte ve çökeltilmesi; Bu şekilde, bir defa tüpler kap ve fiksatif dondurmak için sıvı azot içinde kriyotüplere daldırın hemen kısım karıştırılır. kriyo numaraya bir kalem kullanıntanımlanan gen şişeler, çünkü aseton işaretçileri yıkayın olabilir. </li></ol></li><li> Fizyolojik Saline hazırlanması <ol><li> Hepes (10 mM, pH 7.5), NaCl (140 mM), KCI (2.4 mM) ve glükoz (10 mM) ile muamele edilmiştir, fizyolojik tuzlu su çözeltisi olun. NOT: Bu değerler nihai konsantrasyonları vardır. Kriyo-koruyucu maddeler tek tabaka kültürleri için kullanılmamaktadır. Bununla birlikte, uygun bir kriyo-koruyucu 5 um&#39;den daha kalın numuneler için gereklidir. % 20 BSA kullanımı genellikle tavsiye edilir. Maya yapıştırın ve E. coli OP50 da sinek larvaları ya da C. elegans için kriyo-koruyucu olarak kullanılabilir. </li><li> 1 mM nihai konsantrasyonlarda, 4 mM MgCl2 ve de CaCl2 ekleyin. Not: Örneğin CaCI2 ve MgCl2 içerikli konsantrasyonları deneyler bağlı olarak değişir. Ekzositik ara-yakalanmasını sağlamak için, 4 mM kalsiyum veziküllerin 18 salınım olasılığını arttırmak için bu özel deneyler için kullanılır. </li><li> kontrolBir osmometresi kullanılarak ozmolarite. 300 ± 5 mOsm olduğundan emin olun. </li><li> 30 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde 3 uM ve GABA alıcı antagonisti (bicuculline) bir son konsantrasyona kadar, AMPA reseptör antagonisti (NBQX) ekleyin. NOT: Nörotransmitter reseptör antagonistleri nöronal uyarım 18 aşağıdaki tekrarlayan ağ etkinliğini engellemek için eklenir. </li><li> kullanım için, 37 ° C&#39;ye kadar, fizyolojik tuzlu su ısıtın. </li></ol></li><li> Uzmanlaşmış Yüksek basınç Dondurucu ve bir Otomatik Freeze değişikliği Birimi hazırlanması <ol><li> Yüksek basınçlı Dondurma öncesinde sıvı azotla tankının -90 ° C&#39;ye kadar otomatik bir dondurularak ikame ünitesini soğutmak. </li><li> numune odasının içine yerleştirerek ° -90 küçük bir kap içinde aseton soğutun. </li><li> Sıvı nitro ile yüksek-basınç dondurucu sıvı azot devar ve depolama devar (Malzemelerin Tablo) doldurungen. </li><li> Dokunmatik ekranlı monitörü kullanarak ışık uyarım protokolünü ayarlayın. <ol><li> Hafif stimülasyon penceresinde yanındaki &quot;Program adı&quot; için &quot;Düzenle&quot; tıklayarak programı adı. Başka bir pencere açılacaktır. </li><li> &quot;Pulse&quot; in &quot;15,000 ms&quot; &quot;karanlık faz&quot;, &quot;100 ms süre&quot; içerisinde &quot;&quot; &quot;10 ms&quot; yazarak bir program ayarlama ve &quot;1&quot; 10, tek bir uyarıcı &quot;zaman sayısı&quot; olarak MS. Hücreler 90 ms sonra (Şekil 1C) dondurun. NOT: &quot;Karanlık faz&quot; hücreler numune yükleme sırasında ışığa maruz kalmaktan kurtarmak için izin verir. &quot;Süre&quot; uyarım frekansı belirler. uyaran 20 Hz uygulanmalıdır Örneğin, bu sütun, 50 ms olarak ayarlanmalıdır. &quot;Pulse&quot; hafif uyarıcı süresini tanımlar. Son olarak, &quot;dönemlerin sayısının&quot; uygulanan uyarıcıya sayısını tanımlar. Yüksek frekanslı stimülasyonu kurma için lütfen <strong&gt; Şekil 1E. </li></ol></li><li> ışığında &quot;hayır uyarım&quot; kontrol, tip &quot;15&quot; s &quot;karanlık faz&quot;, &quot;zaman sayısı&quot; in &quot;0 dönemi&quot; &quot;MS&quot;, &quot;1 ms&quot; &quot;darbe&quot; ve &quot;0&quot; için, stimülasyon ayar penceresi olarak aşama 2.3.4 tarif edilmiştir. NOT: Varsayılan olarak, en az 1 ms olmalıdır &quot;darbe&quot;. </li><li> Ana ekranda, ışık uyarımı için kutusunun işaretli olduğundan emin olun. </li><li> Ana ekranda &quot;Numune Depolama&quot; tıklayarak depolama protokolünü ayarlayın. Tıklayın &quot;Düzenle&quot;. &quot;-,&quot; (toplam 3 kanalları), her bir kanal 2 disk saklamak için &quot;2&quot; seçmek için aşağıdaki penceresinde, &quot;+&quot; ya da kullanım. Kontrol &quot;Depolama LN2 sağladı.&quot; </li></ol></li><li> Numune Yükleme ve Yüksek basınç Dondurucu içinde dondurulması NOT: Tüm örnek montaj ve yükleme aşamaları bir 7.5-60X büyütme aralığına sahip bir stereo mikroskop altında yapılır. bir tweezörnekleri işlemek için 2.4.4 - er adımlarla 2.4.1 kullanılmaktadır. Deneyler fizyolojik sıcaklıkta gerçekleştirilmelidir. <ol><li> Hücre tarafı siyah, orta plaka (Şekil 1B) oyuk içinde, yukarı bakacak şekilde, bir safir diski yerleştirin. </li><li> Safir disk (Şekil 1B) üzerinde 100 nm&#39;lik bir ara halka yerleştirin. </li><li> Adım 2.2 önceden ısıtılmış tuzlu su çözeltisi içinde diskinin bir tarafı daldırma sonra ara halka (Şekil 1B) üzerinde boş bir safir diski yerleştirin. hava kabarcığı iki safir diskler arasında sıkışıp emin olun. </li><li> Başka bir 100 um ara halka ve bir 400 mikron ara halkası (Şekil 1B) yerleştirin. Filtre kağıdı kullanarak ekstra sıvıyı çıkarın. </li><li> Iki saydam yarı silindir (Şekil 1A) arasındaki aşama 2.4.3 aksamı yerleştirin. donma sürecini başlatmak için üst kırmızı kapağını kapatın. NOT: Kapak kapatıldıktan sonra önceden ayarlanmış protokol otomatik olarak çalışır. Numune dondurma bölmesinin aynı yönlenmede kalır, ve hafif bir flaş örnek tertibatının üstten uygulanır. kırmızı kapak yukarı otomatik dondurma işlemi tamamlandıktan sonra geri çıkar. </li><li> Depolama Termostaki numune saklayın. Not: Dondurma işleminden sonra numune otomatik sıvı nitrojen ile dolu bir depolama termos içine damlatılır ve daha sonra işlenene kadar orada saklanır. Depolama termos üç odacığa sahiptir, ve her bir bölmenin en fazla 3 örneğe kadar tutabilir. Tipik olarak, iki numune, aynı uyarım koşulları altında dondurulur ve yüksek basınç dondurucu aynı hücre içerisinde depolamak için programlanır. </li><li> Her örnek için 2.4.6 - Tekrar 2.4.1 adımları tekrarlayın. </li><li> Tüm odaları dolu bir kere 2.5 adıma geçin. NOT: Cihaz bir seferde depolama Termostaki 6 adet numune kadar saklamak için kuruldu. Bu nedenle, her 6. örnek sonra, aşama 2,5 gerçekleştirilmelidir. 2.4.6 - yüksüz kez tekrarlayın 2.4.1 adımları. </li></ol></li><li> Örnek Toplama ve bir Otomatik Freeze-ikame Birimine transfer <ol><li> yüksek basınçlı dondurucunun masanın altında bulunan depolama Dewar, kapıyı açın. Depolama devar çıkarın ve masa üstü yerleştirin. </li><li> eller kullanılarak, Dewar numune odası çıkarın ve sıvı azot ile doldurulan özel örnek tepsiye aktarılır. Numune kabı serbest bırakmak için düğmeyi açın. </li><li> sıvı nitrojen ile cımbız ipuçları önceden soğutulduktan sonra bir çift cımbız ile numune fincan saydam yarım silindir çıkarın (~ -196 ° C). Dikkatle sıvı azot ihtiva eden bir küçük bardağa orta siyah plaka aktarın. Not: cımbız uçları sıvı azot sıcaklığına soğutulmuş olması gerekir. Numune buz kristal oluşumunu önlemek için her zaman sıvı azot altında tutulmalıdır. </li></ol></li></ol> Au 3. dondur Değişikliktomated Freeze-ikame Birimi <ol><li> (~ -196 ° C&#39;de ipuçları) soğutulmuş cımbız kullanarak, hızlı bir şekilde önceden soğutulmuş aseton adım 2.5.3 gelen orta plaka transfer (-90 ° C). </li><li> hafifçe sallayarak veya dokunarak orta plakadan safir diski ayırın. NOT: Bazen, orta plakadan safir diski ayırmak zor olabilir. Böyle bir durumda, önceden soğutulmuş aseton içinde orta plakayı terk (-90 ° C) bir kaç dakika. cımbız ile yumuşak vuruş da orta plakadan safir ayırmak için yardımcı olur. </li><li> ikame ünitesinin bir numune bölmesi içindeki fiksatif (aşama 2.1) ihtiva eden bir kriyojenik şişe yerleştirin. kriyojenik şişeye safir diski aktarın ve şişenin üzerine bir kapak yerleştirin. </li><li> - 30 saat, (ii) -90 - -20 ° C, 14 saat (5 ° C / saat) &#39;de, (iii), -20 ° C (i) -90 için 5 ° C aşağıdaki gibi donma ikame programı ayarlama 20 ° C &#39;de 4 saat (10 ° C / saat) - 12 saat, ve (iv), -20 ° C sıcaklıkta. NOT: du-90 ° C de ilk aşamanın oranı değiştirilebilir. dondurularak ikame toplam süresi, sonraki aşamaların gündüz gerçekleştirilebilir, böylece programı 8 am sabah (~ 1.5 d postexperiment) &#39;de sona erer şekilde ayarlanır. </li></ol> Epoksi reçine ile 4. Sızma ve plastik gömülmesi <ol><li> Program sona erdikten sonra, bir kimyasal kaput ikame ünitesinin numune haznesinden safir diskleri içeren kriyojenik şişeler aktarmak için eldivenli ellerini kullanın. </li><li> Bir pipet kullanarak, her bir kriyojenik bir şişeye, aseton ile (oda ısısı) ekleyin ve her bir safir diski 4 yıkayın - 2 saat - 1 6x. </li><li> İlave kontrast gerekirse isteğe bağlı olarak, 1 saat boyunca% 0.1 uranil asetat içinde örnekleri inkübe edin. 4 yıkayın - 2 saat - 1 üzerinde aseton ile 6x. Not: DİKKAT: üst solunum yolu tahriş uranil asetat, teneffüs aşağıdaki dahili maruz kalma ile ilişkili bir risk vardır. Yüksek maruziyet tellerine hasar olabilire kan hücreleri. uranil asetat ile yapılan çalışma emmeli havalandırma altında yapılmalıdır. Koruyucu giysi önerilmektedir. </li><li> gliserol poliglisidil eter, 6.2 g, bisfenol-A epoksi reçinesi, 4.4 g, ve dodesenil süksinik anhidrit (DDSA) 12.2 g ağırlığında sıvı epoksi reçine orta hazırlayın. İyice karıştırın ve karıştırma sırasında benzil dimetilamin (BDMA) 800 mcL ekleyin. 10 dakika süre ile de gaz. </li><li> Adım 4.4&#39;te hazırlanan% 100 epoksi reçine, aseton içinde, 30, 70, ve% 90 epoksi reçine hazırlanması. </li><li> safir diskleri içeren kriyojenik şişelere% 30 epoksi reçine ilave edin ve 2 için inkübe - 120 rpm&#39;de bir orbital çalkalayıcı içinde oda sıcaklığında 3 saat. </li><li> pipetle% 70 epoksi reçine ile% 30 epoksi reçine yerine ve 3 için inkübe - orbital çalkalayıcı içinde oda sıcaklığında 4 saat. </li><li> cımbız kullanarak, bir gömme kapsül kapağı, her safir disk, hücre tarafı yukarıya aktarın. kapağa% 90 epoksi reçine ekleyin. 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Sonraki gün, Aşama 4&#39;te olduğu gibi, taze epoksi reçinesi maddesi hazırlamak0,4. </li><li> Bir gömme kapsül kap, yukarı bakan her safir disk hücre tarafı aktarın. taze hazırlanmış% 100 epoksi reçinesi ile kapağı doldurun. Üç defa tekrar taze% 100 epoksi reçineye her 2 saatte bir değiştirin. </li><li> 48 saat polimerize etmek için bir 60 ° C fırına yerleştirin. </li></ol> 5. Montaj Örnekler <ol><li> Safir, disk reçine bloğun üst kısmında yer alır, böylece stereomikroskop ile ilgili örnek baş aşağı yerleştirin. bir jilet ile kazıyarak üstten epoksi reçinesinin ince bir tabaka çıkarın. </li><li> Bir traş makinesi bıçak kullanarak, safir diskin kenarı boyunca sığ bir kesme hattı; Bu hat adım 5.3 epoksi reçineden safir diski ayırmak için yardımcı olur. </li><li> Yaklaşık 10 saniye için sıvı azot içine daldırma ile epoksi reçineden safir diski ayırın. NOT: Hücreler epoksi reçine kalacak. </li><li> safir diski ayrılmasından sonra, (hücreler ile bir alan bulmak için kesici bir alan kullanımı4-10X büyütme). bir tıraş makinesi bıçağı kullanılarak ilgi bölgesi (~ 2 x 2 mm) yaklaşık kesim (çift kenarlı). Numune mikroskop yüzeyine bantlanmış ise yerinde numune tutmak için, bu adımı gerçekleştirin. </li><li> epoksi reçineden yapılmış bir silindirik sözde blok ile etil siyanoakrilat içeren bir yapıştırıcı kullanarak hücreleri içeren plastik küçük bir parça (~ 2 x 2 x 5 mm) monte edin. 1 saat boyunca 60 ° C &#39;de blok inkübe edin. </li></ol> 6. Kesit <ol><li> bölümüne bir ultramikrotom örnek kullanın. <ol><li> 3 mm / s&#39;lik bir hızla 200 nm / bölümünün bir kalınlıkta cam bıçakla plastik gömülmüş numunesinin yüzeyini kesin. astrositler bulunduğu yüzeyden 5 bölümleri - 4 kesin. </li><li> 0.8 mm / s&#39;lik bir hızda, 40 nm / bölümünün bir kalınlıkta bir elmas bıçak ve kesit geçin. 25 bölümden - 20 kesin. </li></ol></li><li> % 0.7 polivinil asetat ile kaplanmış tek girişli bakır ızgaralar bölümlere kurdeleler toplayın (bkzMalzemelerin tablo). </li></ol> bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak 7. Görüntüleme <ol><li> , Görüntüleme TEM 5 dakika boyunca metanol içerisinde% 2.5 uranil asetat ile bölüm leke önce. </li><li> % 50 metanol içinde ızgara 15x yıkayın. Daha sonra, 30 saniye süren her yıkama ile, ultra saf su 15x yıkayın. </li><li> Kısaca bölümüne hava kurutmak ve TEM bir numune tutucu içine kılavuz getirin. </li><li> 93,000X büyütmede görüntüsü. </li><li> görüntüler elde. NOT: Görüntüleme tipik zaman noktaları veya genotiplere kör yapılır ve genellikle ~ 200 resim / zaman noktası toplanır. </li></ol> 8. Resim Analizi <ol><li> Özel bir makro (yayınlanmamış Watanabe, Davis ve Jorgensen,) ile bir yazılım (örn ImageJ) kullanarak görüntüleri analiz edin. Not: X / Y koordinatları veziküllerden kaydedilir, plazma membranı, aktif bölgesi, membran ve sinapslarda diğer zara bağlı organeller. metin filbilgileri içeren es başka yazılımlar (örneğin Matlab) ihraç edilmektedir. Veri ayrıca özel programları kullanılarak analiz edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), aab3500 (2015).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+microscopy+and+electron+microscopy.">Correlated light microscopy and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).</li><li>Redemann, S., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+for+the+analysis+of+cell+division.">Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division.</a> Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+reshaping+during+endocytosis+is+revealed+by+time-resolved+electron+tomography.">Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography.</a> Cell. 150 (3), 508-520 (2012).</li><li>Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+correlative+light-electron+microscopy+to+observe+molecular+dynamics+in+high+resolution.">Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution.</a> Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).</li><li>Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+rate+of+fixative+diffusion.">Reassessment of the rate of fixative diffusion.</a> J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).</li><li>M&#252;ller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+of+Early+Caenorhabditis+elegans+Embryos+in+Mitosis.">Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis.</a> Cellular Electron Microscopy. 79, 101-119 (2007).</li><li>Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+virus-cell+interactions.">Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions.</a> FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).</li><li>Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage+of+freeze-dried+cryosections+of+cells:+Investigations+by+EFTEM+and+cryo-CLEM.">Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM.</a> Micron. 88, 77-83 (2016).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae.">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+after+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+Caenorhabditis+elegans+neuromuscular+junctions.">Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions.</a> eLife. 2, e00723 (2013).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-and-Freeze:+Coordinating+Optogenetic+Stimulation+with+Rapid+Freezing+to+Visualize+Membrane+Dynamics+at+Synapses+with+Millisecond+Resolution.">Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution.</a> Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).</li><li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , (1987).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells.">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li><li>Weitzman, M., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+approaches+to+cell+migration+and+beyond.">Optogenetic approaches to cell migration and beyond.</a> Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).</li><li>Niu, J., Ben Johny, ., Dick, M., E, I., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+Optogenetic+Dimerizers+and+Quantitative+Prospects.">Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects.</a> Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).</li><li>van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+organelle+transport+and+positioning.">Optogenetic control of organelle transport and positioning.</a> Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).</li><li>Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+phosphoinositide+metabolism.">Optogenetic control of phosphoinositide metabolism.</a> Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).</li><li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity.">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).</li><li>Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Control+of+Lipid+Rafts+with+Photoswitchable+Ceramides.">Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides.</a> J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).</li><li>Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+probability+of+glutamate+release+at+a+hippocampal+synapse.">Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse.</a> Science. 262 (5134), 754-757 (1993).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li></ol>

Bu yazının Açık Erişim yayın Leica Mikrosysteme GmbH tarafından sponsor oldu.

&quot;Flaş ve dondurma&quot; yaklaşımı optogenetics ile belirli bir hücre etkinliği uyararak ve stimülasyon 19 sonra belirli zaman hücreler dondurma ile membran dinamikleri görselleştirir. Bu gösteri, nöronlar teşvik etmek için, channelrhodopsin, ışığa duyarlı bir katyon kanal için ve sinaptik terminallerindeki füzyon ve sinaptik veziküllerin kurtarma ele. Son yıllarda, birçok Optogenetic araçları flaş-and-dondurma ile uyumlu olan, her biri 22, 23, geliştirilmiştir. Örneğin, organel trafik Kriptokrom&#39;un ve CIB1 24 ışık kaynaklı heterodimerizasyonu kullanılarak indüklenebilir. Benzer bir şekilde, plazma membran lipid kompozisyonu, plazma membranı 25 fosfoinositid fosfatazların ışık kaynaklı translokasyonu ile değiştirilebilir. Bundan başka, azobenzen ch gibi küçük, ışığa duyarlı bileşiklerinaydınlatma dalga boylarında bağlı ange konformasyon. Bu konformasyonal değişiklik ligand kapılı kanalları etkinleştirmek veya zar 26, 27 lipid kompozisyonu değiştirmek için kullanılabilir. Kafesli bileşimler de hücresel aktiviteyi artırdığı için kullanılabilir. Bununla birlikte, mevcut kurulumunda kullanılan LED uncaging için yeterli bir enerji oluşturacak olmayabilir; Bu şekilde, sistemin daha iyi duruma muhtemelen gereklidir. Bununla birlikte, bu ışık ile aktive edilebilen araçları uygulamaları esnek birçok hücresel olaylar bir flaş ışığına karşı indüklenebilir bulunmaktadır. &quot;Flash ve dondurma&quot; Ortaya çıkan zar dinamiklerini yakalayabilir. &quot;Flash ve dondurma&quot; yöntemine iki ana sınırlamalar vardır. Birincisi, farklı hücrelerden belirli bir olayın &quot;anlık&quot; yakalar. Başka bir deyişle, belirli bir süre boyunca tek hücrede membran dinamikleri takip etmek mümkün değildir. Bu durumda, herhangi bir hücresel rekonstrüksiyonu için bilet, alınan ve her bir örnekten ve her bir zaman noktasında bir görüntü sayıda analiz gerekir. Fare hipokampal nöronlar 18, 28 sinapsların% 30 - sinaptik veziküllerin füzyon sadece 20 içinde yer alır Bundan başka, nöronlarda, görüntülerin daha da büyük bir sayı, gereklidir. Böyle büyük bir veri kümesi analizi zaman büyük miktarda gerektirir. Gelecekte, görüntü toplama ve analiz 29, 30 yaklaşım daha verimli kılmak için otomatik gerekmektedir. İkinci bir kısıtlama yüksek basınçlı dondurma tekniği doğası tarafından uygulanır. Hücreler donduğunda hücresel suyun donma hızı 100 K / s 21 altında ise buz kristalleri meydana getirmek üzere yeniden düzenlenir. Bu buz kristalleri zarlarına nüfuz ya da membran yırtılması ile sonuçlanır yerel ozmotik basıncı değiştirmek için çözünmüş konsantre olabilir. Buz kristalleri önlemek için, HIGh basıncı (~ 2.000 atm) numuneler uygulanır. Nedeniyle, süper-soğutma etkisi, 100 K / s&#39;lik bir dondurma oranı, bu basınç 21 buz kristallerinin oluşturulması su önlemek için yeterlidir. Teorik olarak, 500 um buz kristalleri olmadan dondurulabilir ancak buz küp şeklindeki formları kalın dokuda oluşturma eğiliminde olarak yaklaşık 200 um morfolojisi ödün, muhtemelen pratik sınırı kadar kalın ve numune. işlem daha kalın 5 um ve numune zaman, BSA gibi uygun bir kriyo-koruyucu maddenin kullanımı gereklidir. Bununla birlikte, BSA çözeltisi ozmolaritesini değişecek ve hücrelerin fizyolojik yanıtı etkileyebilir. Bu nedenle, geniş bir kontrol deneyleri özel sistemler BSA kullanımını geçerli kılmak için gerekmektedir. Numuneler kazara sıvı azot banyosu kaldırılır ise buz kristalleri yüksek basınç dondurulmasından sonra meydana gelebilir. Bu nedenle, her zaman sıvı azot içinde örnekleri tutmak için ve önceden soğutulmuş forseps kullanımı kritiktirOnları manipüle. deneyler planlarken, aşağıdaki üç puan düşünülmelidir. 8,0 mW / mm2 - İlk olarak, ışığın maksimum yoğunluğu (460 nm hattı) 5.5. Bu yoğunluk aktiviteyi teşvik etmek için yeterli olup olmadığı flash ve dondurucu deneyler öncesinde bir floresan mikroskop üzerinde canlı hücre görüntüleme ile doğrulanması gerekir. İkinci olarak, deneyler, fizyolojik sıcaklıkta gerçekleştirilmelidir. Yüksek basınçlı dondurucunun aşamada fare hipokampal nöronlar 31 deney boyunca 37 ° C &#39;ye kadar ısıtılır. Son olarak, zaman noktaları dikkatle membran dinamiklerini yakalamak için seçilmelidir. İlk çalışmalar endositoz uyarımı 100 ms sonra tam olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, üç ek zaman noktaları (15, 30, 50 ms) aynı zamanda membran dinamikleri 17, 18 takip etmek için incelenmiştir. Bu zaman noktaları membran kaçakçılığı olayı görselleştirmek için gerekliydisinaptik iletimi sırasında s. Ancak, zaman noktalarının sayısı için gereksinim her hücresel olay farklıdır. Bu nedenle, birkaç zaman noktaları büyük veri kümesi koleksiyonunu başlamadan önce örneklenmiş edilmelidir.

bir hücre içinde membran ve protein dinamikleri görselleştirme belirli işlemlerin hücre biyolojisi anlama yolunda önemli bir adımdır. Dinamik trafik olayları açık veya floresan mikroskobu kullanarak yakalanabilir. Hücre alt yapıları tamamen boyalar veya floresan prob tarafından &quot;boyalı&quot; ve mekansal olarak çözümlenmiş ve spektral olarak 1, 2 edilemez Ancak, hücre altı bağlam büyük ölçüde bu tür görüntülerde eksik. elektron mikroskobu en ince ayrıntısına kadar hücre altı mimarisini tasvir edebilir ederken örnekler görüntüleme öncesi düzeltilmesi gerekir çünkü Öte yandan, bu, hücresel dinamiklerini yakalamak olamaz. Böylece, tamamen tek bir görüntüleme tarzı kullanılarak hücresel dinamiklerini anlamak için genellikle yeterli değildir. ışık ve elektron mikroskobu sınırlamaları aşmak için, bağıntılı mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir. Korelatif Işık ve Elektron Mikroskopi(CLEM) ışık mikroskopisi ve elektron mikroskopi ile altta yatan hücre içi yapıları kullanılarak hücre içi dinamikleri görselleştirir. Clem, bu tür sitokinez ve endositoz 3, 4, 5, 6 gibi çeşitli işlemlerle, yapan hücrelerin, canlı görüntülenmiş ve daha sonra, elektron mikroskopi için işlemden geçirilir. CLEM hücre içi dinamikleri bazı yönlerini yakalar, bu yaklaşımın faydasını sınırlamak dört faktör vardır. Min nedeniyle yavaş difüzyonu ve fiksatifler 7 reaksiyona - İlk olarak, zamansal çözünürlüğe hücreleri tipik s alır, immobilize edilebilir ne kadar hızlı ile sınırlıdır. İkinci olarak, hücre içi mimari görülmektedir post facto 8; Böylece, dinamik morfolojik değişiklikler bu yaklaşımı kullanılarak çekilen edilemez. Üçüncü olarak, floresans ve elektron mikrografları tam doku sh nedeniyle nmayabilirElektron mikroskobu 9, 10, örnek hazırlama sırasında dehidrasyon neden rinkage. Dördüncüsü, sitokinez ve endositoz gibi olaylar her hücrede 5, 11 aynı anda yer almayan ve bu nedenle, olayın yapan belirli bir hücre hücrelerinin büyük bir nüfustan tanımlanmalıdır. Bu süreç genellikle zahmetli bir iştir. Bu durumda, yeni bir yöntem, her hücrede belirli olayların uyarılmasına ve belirlenen zaman noktalarında hücrelerin hızlı immobilizasyon ile elde edilen selüler dinamiklerini gereklidir. Son zamanlarda, çeşitli araçlar ışık (optogenetics) kullanılarak belirli hücresel dinamikleri ikna etmek geliştirilmiştir. Channelrhodopsin 13, 12 reinhardtii Chlamydomonas izole edilen bir ışığa duyarlı, seçici olmayan bir katyon kanaldır. channelrhodopsin Neurona eksprese edildiğindelitre membran, bir ışık kısa flaş nöronlara sodyum iyonlarının akışını indükler ve 14, 15, potansiyel bir işlem tetikler. Aksiyon potansiyeli daha sonra sinaptik veziküllerin 18 Bu nedenle, channelrhodopsin nöronal aktivitenin neden milisaniye 16, 17 içinde sigorta sinaptik terminallerinden içine yayar. sinaptik terminallerindeki membran dinamikleri takip etmek için, nöronların ms hassasiyetle stimülasyon sonrasında belirli zaman aralıklarıyla hareketsiz olmalıdır. Nöronal aktiviteyi uyaran sonra membran dinamikleri elde etmek için, yüksek basınç 17, 18, 19 ve donan hafif uyarılması bağlanmıştır. Yüksek basınçlı dondurma düşük bir buz kristali oluşumu 20 olan hücrelerin neredeyse anlık immobilizasyon için izin verir. Buz kristalleri can zarları ve hücre altı mimariyi 21 bozabilir. uyarılması ve dondurma arasındaki zaman aralıklarını değiştirerek, sinaptik terminallerinden içinde membran trafik aksiyon potansiyelinin indüksiyonundan sonra yakalandı. Burada, bu çiftler, yüksek basınçlı dondurma hafif bir uyarım ms zamansal kontrol bir ticari yüksek basınçlı dondurucu kullanılarak, deneysel prosedürler göstermektedir. Işık uyarılması ve donma kontrolü için bir dış aygıt gerektiren diğer araçlar farklı olarak, ışık uyarımı bu sistemde tam entegre ve MS hassas 19 ile uygulanabilir. Bu süreç birden adımdan oluşur. 1) fare hipokampal nöronlar safir diskler üzerinde kültüre ve lentivirüs channelrhodopsin 18 için bir ifade vektörünü taşıyan bulaştırılır. 2) Nöronlar uyarılır ve stimülasyon sonrasında belirli zaman aralıklarıyla dondurulur. 3) vitrifiye su yerine geçerorganik bir çözücü ile d, lipitler ve proteinler ise hücreler arası mimari korumak için fiksatif tarafından çapraz bağlanmalıdır. 4) Numuneleri infiltre ve epoksi reçine içine gömülü olan. 5) ince kesitler ultramikrotom kullanılarak toplanır. 6) ince kesitler bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülenmiş. 7) Görüntü edinimi ve analiz süresi noktaları veya genotipler ile ilgili körlemesine gerçekleştirilmiştir. Hücresel dinamikleri zaman çözümlemeli görüntülerin 17, 18 yeniden inşası yoluyla belirlenebilir. Bir hafta gerektirir, ancak daha sonraki görüntü analizi bir yıl aylar gerektirir - Numune Hazırlama (yukarıdaki 5 2. adımları).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System&#160; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome UC7</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Blue M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT19132</td>
			<td>Toxic, open only under certified chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>391340-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special embedding (BEEM) capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC12H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>170497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Themo scientific</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10569-044</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S175223</td>
			<td>Should be acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Technotrade</td>
			<td>616-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraum free supplement&#160; (B-27)&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Active Unit should be calculated for each batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>03-731-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicculine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>01-091-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman I filter paper</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips CM20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

Hücreler sürekli zar mimarisini ve protein dağılımı değiştirmek, ancak sırasıyla ms ve nm sipariş üzerine zamansal ve uzamsal çözünürlükte bu olayları görselleştirmek için son derece zordur. Biz optogenetics ile hücresel olayları neden ve stimülasyon sonrasında belirli zaman aralıklarıyla hücrelerini dondurarak çıkan zar dinamiklerini görselleştiren bir zaman çözümlü elektron mikroskobu tekniği, &quot;flaş-and-donması&quot; geliştirdik. Bu teknik göstermek için, fare hipokampal nöronlar channelrhodopsin, ışığa duyarlı bir katyon kanalı olarak ifade edilmiştir. Bir ışık flaş nöronal etkinliği artırır ve sinaptik veziküllerin füzyon yoluyla sinaptik terminallerinden nörotransmitter salımını indükler. nöronların Optogenetic uyarılması sinaptik iletim sırasındaki morfolojik değişiklikleri takip etmek için yüksek basınçlı dondurma ile birleştirilir. Ticari bir enstrüman kullanarak, sinaptik veziküllerin füzyon ve Syna kurtarılmasını yakalananptic vezikül membranı. olaylar dizisi görselleştirmek için, büyük veri setleri üretilmiş ve morfolojik değişiklikler, zaman içinde farklı hücrelerde takip edildi çünkü, kör analiz edilmiştir. Bununla birlikte, flash ve dondurma msn zamansal çözünürlüğe sahip elektron mikrografiklerinde membran dinamikleri görselleştirme sağlar.

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, fare hipokampal nöronlar &quot;flash ve dondurma&quot; deneyleri channelrhodopsin ifade seslendirdi. Bu nöronlar, 15 ms ya da hafif başlangıcından sonra 100 ms ya donduruldu. Daha önce sinaptik veziküllerin ekzositozu endositoz sinaptik 15 ms&#39;de terminali ve 100 ms zaman noktalarında, sırasıyla 18 meydana göstermiştir. Bu olaylar, başarılı bir şekilde (Malzemelerin Tablo) flaş-ve-dondurularak yapılan deneyler seçilen özel bir yüksek basınçlı dondurucu gerçekleştirilebilir öne uygun zamanlarda (Şekil 2) ele geçirildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> Yüksek basınç Dondurucu Şekil 1. Örnek Yükleme ve Programlama. Yüksek p A) Örnek yükleme tablasıressure dondurucu. Yapısal detay için ust ilavesinde gösterilen orta plaka, örnek yükleme için bir CLEM muhafaza içine yerleştirilir. yarı silindir bir numune yükleme tablonun alt kısmında yerleştirilmiştir ve diğer üst kapak için bir klip ile takılır. Numune yüklendikten sonra, orta plaka alt yarım silindir ileri itilir ve kapak dondurma başlatmak için kapatılır. B) Örnek tertibatı. nöron içeren safir, disk, hücre tarafı yukarı gelecek şekilde, orta plaka oyuğuna yerleştirilir. 100 um halkanın doğrudan kuyu içine safir disk üzerine yerleştirilir. Daha sonra, fizyolojik tuzlu su içinde daldırma boş safir diski aşağı çözelti tarafına yerleştirilir. Hava kabarcıkları kaçınılmalıdır. Son olarak, bir 100 um halkası ve bir 400 mikron halka sıkıca üzerine yerleştirilmiştir. İlave bir sıvı filtre kağıdı ile çıkarılır. C) epoksi reçine içine daldırılmış safir diski ile birlikte bir gömme kapsülün bir enine kesitini göstermektedir. sappişe Disk hücre tarafı yukarı gelecek şekilde, kapsül altına yerleştirilir ve infiltrasyonu ve yerleştirilmesi için epoksi reçinesi ile kaplıdır. Tek bir 10 ms uyarıcı için yüksek basınçlı dondurucu Programlama D). Örnekler ışık darbesinden sonra 90 ms dondurulur. E) 20 Hz&#39;de 10 uyaranlara için yüksek basınçlı dondurucu Programlama. Numuneler son ışık darbesinin ardından 5 ms donmuş. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> Fare Hipokampal Nöronlar ekzositozu ve endositoz 2. Görselleştirme Şekil. Hipokampal nöronlar bir kez uyarılır ve belirtilen sürelerde donmuş. Elektron mikroskobu, bir sinaptik vezikül A ekzositoz) ve ultrahızlı endositoz göstermek <strong&gt; B). PSD, post-sinaptik yoğunluğu. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Biz msn zamansal çözünürlüğe sahip membran dinamiklerinin görüntülenmesini sağlayarak elektron mikroskobu, &quot;flaş-and-donması&quot; içinde yeni bir teknik geliştirdi. Bu teknik, yüksek basınçlı dondurma nöron Optogenetic uyarılmasını birleştirir. Burada, prosedürleri göstermek ve ayrıntılı protokolleri açıklar.

Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

flash-freeze-novel-technique-to-capture-membrane-dynamics-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Görüntüleme.  Johns Hopkins School of Medicine.  Biz msn zamansal çözünürlüğe sahip membran dinamiklerinin görüntülenmesini sağlayarak elektron mikroskobu, "flaş-and-donması" içinde yeni bir teknik geliştirdi. Bu teknik, yüksek basınçlı dondurma nöron Optogenetic uyarılmasını birleştirir. Burada, prosedürleri göstermek ve ayrıntılı protokolleri açıklar. 

Video: Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biyoloji

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...