Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Christopher und Dana Reeve Foundation, dem Medical Research Council, der European Research Council ECMneuro und der Cambridge NHMRC Biomedical Research Center unterstützt. Wir möchten unsere tiefste Dankbarkeit ‚zu Heleen Merel van während der Dreharbeiten t Spijker und Justyna Barratt für ihre technische Unterstützung zum Ausdruck bringen. Wir möchten, dass Dr. Elizabeth Moloney und Professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) zur Unterstützung bei AAV-Produktion danken.

Alle folgenden Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Vereinigten Königreich Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt Falls Sie nicht wissen mit diesen Verfahren, überprüfen Sie bitte mit den lokalen / nationalen Vorschriften und Veterinär Rat einholen, bevor das Protokoll zu starten. 1. Die Wahl eines geeigneten Stammes von Tiere Hinweis: Eine dorsale Wurzel Quetschverletzungen führt zum Verlust der Empfindung und Pfote Deafferentation. Häufige Nebenwirkungen von forepaw Deafferentation können, gehören Über Grooming, Selbstverstümmelung und Pfote autotomy. <ol><li> Erhalten Tiere für das Verfahren. HINWEIS: Bei Ratten, die aktiveren Stämme wie Lister-Hooded Wistar und haben eine höhere Inzidenz von Paw autotomy nach Deafferentation den fügsamen Stämmen verglichen, wie Lewis und Sprague-Dawley. Wenn möglich, die fügsam Stamm, Lewis, sollte immer an erster Stelle in Betracht gezogen werden. Sollte eine besonders aktive Belastung für das Experiment notwendig sein, durch genetischen mNDERUNG oder spezifische Verhaltensbeurteilung Anforderungen soll Veterinärbehandlung vorhanden sein, schädliche Wirkungen zu begegnen erwartet. </li></ol> 2. Vorbereitung des Virus für die Injektion ACHTUNG: Behandeln Sie alle Viren in Übereinstimmung mit biologischen und Laborsicherheitsbestimmungen. <ol><li> Verdünnen oder das Virus zu einem Titer von 2 x 10 12 Genomkopie (GC) konzentrieren / mL folgende einzelne Virusverpackung Protokollen 9. HINWEIS: Hier wurde das Virus in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) mit 5% Saccharose verdünnt. Der Titer kann optimiert werden, abhängig von der Art des Virus-Promotor, konstruiert Größe sowie gezielter Zelltyp. </li><li> Optional: 1% farbigen Farbstoff (zB Fast Green) an die Virus - Lösung für die einfache Visualisierung der Injektion später. Mischen Sie die Lösung sehr sanft. </li><li> Halten Sie die Lösung auf Eis für den sofortigen Einsatz (innerhalb von 4 h) oder in einem -80 ° C-Gefrierschrank für die LangZeitlagerung. </li></ol> 3. Durchführung der präoperativen Vorbereitung des Tier HINWEIS: Aufgrund der extremen Invasivität der Operation sollten aseptische Techniken jederzeit verwendet werden. <ol><li> Vorbereiten und Sterilisieren alle chirurgischen Instrumente und das Rücken Stereotaxierahmen vor der Operation zu beginnen. Beispielsweise sterilisieren, die Werkzeuge in einem Autoklaven bei 134 ° C. Verwenden Sie einen frischen Satz von sterilisierten Werkzeugen für jedes Tier. </li><li> Betäuben das Tier. Bestätigen Sie die richtige anesthetization durch die Pfote Kneifen für den Rückzug Reflex zu testen oder durch die Hornhaut für die Lidschlussreflex berühren. <ol><li> Für erwachsene Ratten Inhalationsanästhesie wie Isofluran arbeiten, verwenden 4% Isofluran in 2,0 l / min Sauerstoff für die Induktion. Für Wartung während der Operation verwenden, 2 - 3% Isofluran in 1,5 l / min Sauerstoff, Variieren die Isofluran-Konzentration nach dem Atemmuster des Tieres Über- oder Unterdosierung zu vermeiden. </li></ol></li><li> Aufce das Tier zunächst betäubt ist, notieren Sie die präoperative Gewicht des Tieres. </li><li> Für die zervikale DRG Injektion, scheren das Fell auf dem Hals zwischen den Ohren gerade distal des scapulae ab. Desinfizieren Sie die rasierte Fläche mit einem Antiseptikum Produkt. </li><li> Einzuzuspritzen 2 ml Kochsalzlösung subkutan in der Flanke des Tieres, zusammen mit einer geeigneten Dosis des Analgetikums (beispielsweise 5 mg / kg Carprofen) und Antibiotika (beispielsweise 5 mg / kg Enrofloxacin). </li><li> Bewerben Augensalbe sowohl für die Augen Hornhauttrocknung während des Verfahrens zu verhindern. </li><li> Weiter zur Operation an einem Wirbelsäulen Stereotaxierahmen mit einem Heizkissen bei 37 ° C unterhalb des Tieres platziert. </li></ol> 4. Injizieren DRG und Durchführen einer Hinterwurzel Quetschverletzungen HINWEIS: Dies ist eine äußerst heikle Operation. Es ist ratsam, ein paar tote Tiere üben zunächst mit der Anatomie vertraut zu machen, bevor fortTierChirurgie zu leben. <ol><li> Locate die prominenten C2 und T2 Dornfortsätze über die Haut. Führe einen Hautschnitt zwischen den C2 und T2 Dornfortsätzen mit einer No.10 Skalpellklinge (einmal die Haut geöffnet wird, ein weißes, faseriges Gewebe-Mittellinie auf der ersten Schicht des Muskels sichtbar sein soll, wobei die erste Schicht von Muskel hat eine &quot; geleeartige“Textur). </li><li> Machen Sie einen ähnlich großen Einschnitt auf der ersten Schicht des Muskels entlang der weißen Mittellinie ein Skalpell. Gehen Sie nicht über den prominenten T2 spinous Prozess, da es einen großen arteriellen Zweig von der absteigenden Aorta ist dort in der Nähe befindet. HINWEIS: Starke Blutungen ab überall von diesem Schritt erfolgen können. Halten Sie immer die Blutung und entfernen Sie das Blut durch die Verwendung sterilisierten Wattestäbchen oder chirurgische resorbierbaren Schwämme klare Visualisierung jederzeit zu ermöglichen. Fortschreiten mit dem Verfahren „blind“ zu unerwünschten Schäden führen kann später an das Rückenmark, DRG, oder dorsal root, was zu unerwarteten Nebenwirkungen bei dem Tiere. </li><li> einfahren dieerste Schicht von Muskel zwei Retraktoren unter Verwendung einer platziert rostral und eine caudal; die zweite Schicht von Muskeln, mit einem quergestreifter Aussehen, sollte sichtbar sein. </li><li> Lokalisieren der Mittellinie der zweiten Schicht des Muskels (wo zwei Längsmuskeln können durch ein dünnes, membranartigen Gewebe verbunden beobachtet werden). Seziert das membranöse Gewebe ein Paar von Mikroschere mit den beiden Längsmuskeln zu trennen. Vermeiden Sie ein Skalpell, wenn möglich, da dies zu unnötigen Muskelschäden und Blutungen führen kann. </li><li> Stellen Sie die Retraktoren dementsprechend die dritte Schicht aus dünnem Muskel zu, die Wirbelsäule bedecken. Die Dornfortsätze können mit einer Zange über die dritte Schicht des Muskels durch leichtes Berühren fühlbar. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der dritten Schicht von Muskel Mikroscheren mit und sanft abzukratzen den Muskel vom Knochen einer Kürette oder Skalpell in einer Seitwärts Weise mit deutlich die Wirbel aus. Bei Bedarf wegschneiden einige der Muskeln oder Sehnen, um die Lami zu machennectomy einfacher. </li><li> Zu belichten des linksen C5 - C8 DRGs, führt eine linke hemi-Laminektomie auf dem C4 - Wirbel T1 durch vorsichtiges Teil der Lamina entfernt und Pedikel ein Paar von feinen Rongeurs verwenden. Die DRG ist nahe der Quer Foramen des Wirbels angeordnet. HINWEIS: C3 - C7 Wirbel nicht einen prominenten spinous Prozess. Die DRG C5 zwischen C4 und C5 Wirbeln befindet, ist die C6 DRG zwischen C5 und C6 Wirbel, und so weiter, während die C8 DRG zwischen C7 und T1 Wirbeln ist. Es gibt keinen C8 Wirbel, trotz der Gegenwart eines C8 DRG und eine Rückenmarksegment C8. </li><li> Sobald genug von der DRG wird zur Injektion freigelegt worden ist, bereitet die Spritze durch die Virus gefüllte Mikroliterspritze mit einem Maße, 33-Gauge-Nadel stumpf auf den stereotaxische Spritzenhalter angebracht platzieren. Vor der Injektion verwenden, um eine 30-Gauge-Nadel eine abgeschrägte kleinen oberflächlichen Öffnung auf jede der gezielten DRG zu machen mit dem Einstechen der Injektionsnadel zu unterstützen. </li><li> Legen Sie die 33-gAuge entfernt Nadel in der Mitte der DRG daß die Knöpfe gedreht sanft die stereotaxische Koordinaten einzustellen. Nicht über-die Nadel, da diese Flüssigkeit aus der Bauchseite des DRG austreten verursachen kann. Bei Leckage die Position der Nadel sofort auftreten, anzupassen. HINWEIS: Die numerischen Stereotaxierahmen Koordinaten nicht verwendet werden; jedoch ist es hilfreich, um den Rahmen zu nutzen, um die Nadel für die Injektion zu halten. </li><li> Einzuspritzen 1 ul des Virus in jedem DRG bei 0,2 &amp; mgr; l / min, eine Infusionsspritzenpumpe. Warten für weitere drei Minuten, bevor die Nadel zurückzuziehen. Während der Injektion wird die DRG langsam Farbe ändern, wenn die Viruslösung einen Farbstoff enthält. </li><li> Um eine gleichzeitige C5 auszuführen - C8 dorsal root Quetschverletzung, zerquetschen jeder Wurzel dreimal 10 s jeweils unter Verwendung eines Paar von feiner bestückte Zange (Bonn Micro), gegenüberliegenden Enden der Zange vollständig; eine weiße Linie in dem Gewebe an der Quetschstelle erscheinen soll. Gehen Sie nicht tiefer als bei der forc erforderlicheps, da dies kann zu Schäden an der ventralen Wurzel führen. </li><li> Im Anschluss an die Injektion und / oder zu vernichten, stellen Sie sicher, dass es keine Blutungen oder kleine Stücke von Knochenfragmenten an der Einschnittstelle vor dem Schließen bis das Tier nach links ist. Wenn bevorzugt wird, stellt ein kleines Stück chirurgischer resorbierbaren Schwamms auf der Oberseite des freiliegenden Rückenmark und DRG. </li><li> Lassen Sie die dritte Schicht des Muskels natürlich auf die Wirbelsäule, ohne Vernähung zurückzuziehen zurück. Lose Naht die beiden auf der zweiten Schicht Längsmuskeln mit resorbierbaren Nahtmaterial 6-0 (≈ 3 Fäden unterbrochen). Vernähen die erste Schicht des Muskels (≈ 5 unterbrochen Nähte) mit resorbierbaren Nahtmaterial 6-0. </li><li> Vernähen die Haut mit resorbierbaren 5-0 Nahtmaterial (≈ 10 unterbrochen Nähte). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Nähte nicht zu eng sind. Vorwölbung der Haut ist ein Zeichen von Überdrehen und können Beschwerden an das Tier verursachen. </li><li> Wenn schwere Blutungen während der Operation aufgetreten ist, injiziert subkutan 1 bis 2ml Kochsalzlösung, den Verlust von Flüssigkeit aus dem Tiere wieder aufzufüllen, wie unter lokalen Regelungen zulässig. </li><li> Vorzusehen eßbaren hydratisierende Gel und ermöglicht es dem Tier zu gewinnen zum regelmäßigen Überwachung der Durchführung mindestens 1 h vollständig von der Anästhesie, bevor das Tier zurück zu dem Haltebereich zurückkehrt. </li><li> Halten Sie das Tier für mindestens 3 Wochen für eine optimale Transgen-Expression auf sensorische Axonregeneration zu bewerten. </li></ol> 5.es Durchführen von Postoperative Pflege des Tieres <ol><li> Geben Sie Lebensmittel Maische und weiche Baumwollbettwäsche für das Tier während der ersten Woche nach der Operation. Bei Bedarf verabreicht zusätzliche Dosen von analgetischen und Antibiotikum mit der Erholung im Einklang mit den lokalen / nationalen Vorschriften und Veterinär Beratung zu unterstützen. </li><li> Entfernen Sie die Nähte auf der Haut nach 7 - 10 Tagen. HINWEIS: Häufige Nebenwirkungen der Operation umfassen die Bildung von seroma oder Hämatom an der Einschnittstelle, Kratzspuren auf der Haut aufgrund der Juckreiz verursacht durchdie inneren resorbierbaren Fäden, subtile sensorische oder Bewegungsdefiziten und Anzeichen von Selbstverstümmelung auf der deafferentierten Pfote nach der Quetschverletzungen dorsalen Wurzel. Für alle Schutzfragen, die wesentlich schwerer sind als erwartet, suchen Sie sofort ein Tierarzt. </li></ol> 6. Durchführen einer Anterograde CTB Injection für Axonal Tracing HINWEIS: Es wird empfohlen, Choleratoxin B-Untereinheit (CTB) axonalen Tracing in der Woche vor der Gewebesammlung durchzuführen. <ol><li> Bereiten Sie 1% CTB Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Optional: 1% gefärbten Farbstoff zu der Lösung für die einfache Visualisierung der Injektion später. Mischen Sie die Lösung sehr sanft. </li><li> Anesthetize das Tier (siehe Schritt 3.2.1) und Stabilisierung der linken Vorderpfote durch das Glied zum Tisch Taping. </li><li> Manuell und 1 ul 1% CTB langsam subkutan in die Mitte des glabrous Fußballen und vier Ziffern unter Verwendung einer Mikroliterspritze versehen wi injizierenth eine maßgefertigte, 33-Gauge-Nadel kurz. Hinweis: Vor der Injektion, hilft es, zunächst eine 30-Gauge-Nadel verwenden, um eine abgeschrägte kleine oberflächliche Öffnung an der Haut zu machen, die mit dem Einführen der Injektionsnadel unterstützt. </li><li> Lassen Sie das Tier vollständig aus der Narkose erholen, bevor das Tier zu dem Haltebereich zurückkehrt. </li></ol> 7. Sammeln Tissue <ol><li> Um das Virus injiziert DRG und Rückenmark für die Immunhistochemie zu sammeln, eine Überdosis Anästhetikum administrieren und transkardial perfundiert das Tier mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von kaltem 4% Paraformaldehyd. Vorsichtig führen Sie eine vollständige Laminektomie auf dem Rücken der festen Gewebe unter dem Mikroskop zu sammeln. Weiter mit Gewebepräparation, Sektionierung, und die Verarbeitung , wie für die Analyse erforderliche 4, 5, 6. HINWEIS: Die zurückgewonnene Inzisionsstelle sollte offensichtlich sein, wie durch die Anwesenheit von s beobachtetAuto Gewebe. </li><li> Alternativ kann das Virus injiziert DRG für in - vitro - Kultur zu sammeln, um das Tier opfern artgerecht mit einem genehmigten Verfahren, wie beispielsweise eine ansteigende Konzentration an Kohlendioxid. Sorgfältig seziert die DRG unter einem Mikroskop, aseptische Bedingungen, wann immer möglich zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Gewebekultur nach Wunsch 4, 5, 6, 10. </li></ol>

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James Fawcett is a paid consultant for Acorda Therapeutics and Novartis.

In diesem Artikel stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung eine DRG Injektion und dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark eines erwachsenen Ratte durchzuführen. Da dies eine sehr invasive und empfindliche Operation ist, empfehlen wir dringend, dass alle potentielle Anwender vor vorrückenden ausreichende Ausbildung und Praxis erhalten Tierchirurgie zu leben. Der Anwender sollte nicht nur mit Rückenmark Anatomie, sondern auch mit der umgebenden Muskelgewebe, Wirbelknochenstruktur und Gefäße vertraut sein. Idealerweise sollte ein Benutzer zuständigen Lage sein, das Verfahren mit minimalen Schäden an dem umgebenden Gewebe durchzuführen, wobei eine saubere Laminektomie Durchführung durch, ohne einen Teil der Wirbelsäule zu entfernen, um Schäden am Rückenmark zu induzieren. Wie aus einer Rückenmarksverletzung, kann eine kleine Läsion im Rückenmark eine weit verbreitete schädliche Wirkung auf das gesamte Nervensystem. Darüber hinaus Tiere, die eine „saubere“ Operation unterzogen worden sind weniger wahrscheinlich von unerwarteten post- leidenoperative Komplikationen und Schutzfragen und sind daher weniger wahrscheinlich, dass vor dem gewünschten experimentellen Zeitpunkt geopfert werden zu lassen. Um Virus in das Nervensystem gibt es einige mögliche Verabreichungswege zu verabreichen: 15 intravenös, intraperitoneal 16, intrathekale 17 oder direkte Injektion in das Ziel - 4, 8. Obwohl die intravenöse und intraperitoneale Injektionen relativ nicht-invasive sind, kann die Überquerung der Blut-Hirn - Schranke sein ein Problem 18, und diese Wege führen in unspezifischer Übertragung, die in einem spezialisierten Axonregeneration Studie nicht sinnvoll wäre. In ähnlicher Weise für die intrathekale Injektion in den Subarachnoidalraum, ein invasiven administrativen Weg, viele neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen im ZNS können transduziert werden, was möglicherweise zu erzeugen unspezifischer oder off-target-Effekte. Somit ist die direkte Injektion von Virus in die DRG eine günstige Option und wahrscheinlich in einer viel höheren Transduktionswirksamkeit als andere Methoden führen. Der größte Nachteil dieser Option ist jedoch die Invasivität des chirurgischen Eingriffs, die spezielle Ausbildung erfordert. Sobald Benutzer die erforderlichen chirurgischen Fähigkeiten beherrschen, bietet dieses Protokoll eine große Menge an Flexibilität. In einer Axonregeneration Studie Tiere können in Kombination mit anderen Techniken, wie beispielsweise in - vivo - Elektrophysiologie und sensomotorischen Verhaltenstests untersucht werden, während die gesammelten Gewebe können für anatomische Analyse oder Gewebekultur - 4 verwendet werden. Eine Kombination dieser Techniken mit unterschiedlichen experimentellen Zeitpunkt, zum Beispiel, kann verwendet werden , um den Fortschritt der Degeneration oder Regeneration von verschiedener Faser Subtypen zu untersuchen, wie NF200, CGRP und IB4 nach Quetschverletzung 4. Je nach Versuch requirements, ​​die eine oder andere der vorgestellten Verfahren können alleine durchgeführt werden. Zum Beispiel DRG Injektion allein kann für axonalen Tracing Experimente verwendet werden, während dorsale Wurzel Crush allein Verletzung in allen Studien verwendet werden kann, wo forepaw Deafferentation erforderlich ist. Darüber hinaus können Benutzer auch die Art des Virus und Transgenproduktes zur Injektion variieren können, um die genaue DRG injiziert werden, und die genaue Hinterwurzel für Verletzungen. Gegebenenfalls Zelltransplantation oder pharmakologische Verabreichung in die DRG kann auch mit diesem Protokoll durchgeführt werden. Aufbauend auf erworbene chirurgischen Fähigkeiten, kann ein erfahrener Benutzer zu anderen Techniken, wie DRG - Injektion in der Lendengegend gehen - 19 oder dorsale Säule Quetschverletzungen (zB in L3 L5 bis hindlimb Funktion beurteilen), zum weiteren Rückenmark - Funktion 5 zu studieren. Abschließend glauben wir, die DRG-Injektion und dorsalen Wurzel Quetschverletzungen ein nützliches Modell sein reg zu studieren sensorischen Axoneneration. Trotz der Forderung nach Fachausbildung des invasive chirurgische Verfahren durchzuführen, ist das Protokoll, flexibel und potenzieller Anwender viele Teile ändern kann ihre experimentellen Anforderungen gerecht zu werden. Diese Verfahren können als Grundlage für die auf der Suche nach einem geeigneten Tiermodell dienen für die sensorischen Axonregeneration Studien.

Axon Erreichen Regeneration nach Schädigung des Nervensystems ist eine anspruchsvolle Aufgabe 1. Um den Ausfall von Axonregeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) zu untersuchen, haben die Forscher eine Vielzahl von Nervenverletzungen Modelle verwendet. Als Regionen des ZNS unterscheiden, ist es wichtig, ein anatomisch geeignetes Modell zu studieren Axonregeneration zu verwenden. Durch das entsprechende Modell verwenden, können die Forscher eine spezifische Behandlung formulieren von der Schwere der Verletzung basiert, der neuronalen Zelltyp von Interesse und den gewünschten Rücken-Darm-Trakt Regeneration für die Beurteilung, im Gegensatz zu einer „One-for-all“ Behandlungsstrategie. In Verletzung des Rückenmarks, zum Beispiel stammen die meisten schwächenden Symptome der Verlust der Empfindung und Fortbewegung. Verlust der Empfindung wird durch Schäden an den aufsteigenden sensorischen Bahnen verursacht, während der Verlust der Fortbewegung durch Schäden an den absteigenden motorischen Bahnen verursacht wird. Aufgrund zellulären und anatomischen Unterschiede zwischen diesen two Wege konzentrieren sich viele gezielte Axonregeneration Studien nur auf den einen oder anderen Weg, mit der Begründung, dass eine erfolgreiche Erholung der entweder von enormem Nutzen für die Patienten sein würde. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll, das eine direkte Spinalganglien (DRG) Injektion mit einem viralen Vektor und einer gleichzeitigen dorsal root Quetschverletzung im unteren Halsrückenmark einer erwachsenen Ratte als Modell Regeneration zu studieren sensorische Axonen verwendet. DRG sensorisch Neuronen sind verantwortlich für die sensorischen Informationen, wie taktile Empfindung und Schmerzweiterleitung, von der Peripherie zum ZNS. Die langen axonale Projektionen von sensorischen Neuronen im Rückenmark dienen als ein gutes Modell Fern Axonregeneration zu studieren. Darüber hinaus, wie Nager eine sensorische Bahn Läsion wie ein dorsale Wurzel Quetschverletzungen mit minimalen Wohlergehen Komplikationen überleben können, können die Forscher CNS Axonregeneration studieren, ohne die Notwendigkeit vollständig in das Rückenmark zur Läsion. A Quadruple C5 - C8 (zervikale level 5 bis 8) dorsale Wurzel Quetschverletzungen wurde ein nützliches Modell für forepaw Deafferentation 2 gezeigt werden. Darüber hinaus bietet ein dorsales Wurzel Quetschverletzungen ein „sauberes“ Modell Axonregeneration als eine direkte Verletzung des Rückenmarks zu studieren, weil sie durch andere Faktoren wie Glia Narbenbildung unkompliziert. Die Verwendung von viralen Gentherapie Neuronen in einem regenerativen Zustand neu zu programmieren zunehmend als vielversprechende Behandlungsstrategie für viele neurologische Erkrankungen 3 angesehen. Studien haben die Anwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV) Vektor trägt das Transgen eines wachstumsförderndes Protein gezeigt , mit Verhaltensbesserung 4, 5, 6 robust Axonregeneration erzielen. Die scheinbare niedrige Pathogenität von AAV in Hervorrufen einer Immunantwort und die Fähigkeit, sich nicht teilende Zellen transduzieren, wie Neuronen, machenes der optimale Vektor für die Gentherapie. Zusätzlich wird die rekombinante AAV Form zur Therapie verwendet. In dieser Form ist er unfähig , seine viralen Genoms in das Wirtsgenom zu integrieren , 7, um das Risiko von Insertionsmutagenese zu reduzieren , im Vergleich zu anderen viralen Vektoren, wie Lentivirus. Dies macht AAV eine sichere Wahl für gentherapeutische Anwendungen. Als DRG die Zellkörper von sensorischen Neuronen enthält, ist es das am besten geeignete anatomische Ziel für die Verabreichung des Virus für die Gentherapie zu untersuchen und / oder sensorische Axonregeneration zu fördern. In einer Studie wurde verschiedene AAV - Serotypen und Lentivirus, AAV - Serotyp 5 (AAV5) Vergleichen gezeigt in DRG - Neuronen transduzieren über einen Zeitverlauf von mindestens 12 Wochen die effizienteste, wenn 8 direkt in den DRG injiziert. Zusätzlich kann AAV mehr als 40% Transduktionseffizienz erreichen, alle DRG neuronalen Subtypen Umwandlungs, wie mit dem großen Durchmesser Neurofilament 200 kDa(NF200) -positiven Neuronen und der kleine Durchmesser Calcitonin gene-related peptide (CGRP) - oder isolectin b4 (IB4) -positiven Neuronen 4, 8. Da das chirurgische Verfahren der DRG-Injektion und Quetschverletzungen dorsalen Wurzel extrem invasiv und empfindlich ist, sind wir der Meinung, dass dieser Artikel neue Benutzer helfen wird, das Verfahren auf eine sehr effiziente Art und Weise zu lernen. In diesem Artikel zeigen wir repräsentative Ergebnisse von erwachsenen Ratten vier Wochen nach der Injektion eines Kontrollvirus AAV5-GFP (green fluorescent protein) in C6 - C7 DRGs mit einem gleichzeitigen C5 - C8 dorsaler Wurzel Zu. Dieses Modell eignet sich besonders für Forscher, die die Verwendung von viralen Gentherapie untersuchen zu sensorischen Axonregeneration zu fördern.

<table><tbody><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1%</td></tr><tr><td>Cholera Toxin B subunit</td><td>List Biological Laboratories</td><td>104</td><td>For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1%</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td>Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane)</td></tr><tr><td>Baytril 2.5% injectable</td><td>Bayer</td><td>05032756093017</td><td>Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer&#039;s recommended dosage: 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Carprieve 5.0% w/v</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td>Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer&#039;s recommended dosage: 4 mg/kg</td></tr><tr><td>Lacri-Lube</td><td>Allergan</td><td>PL 00426/0041</td><td>Eye ointment</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12502-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Micro Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11083-07</td><td>For performing dorsal root crush injury</td></tr><tr><td>Tissue Separating Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Goldstein Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 17003-03</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors (straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 15018-10</td><td></td></tr><tr><td>SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>For bleeding control</td></tr><tr><td>Microliter Syringe RN701 (10 &amp;mu;L)</td><td>Hamilton</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made Removable Needle (for DRG injection)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 38 mm, point style 3</td></tr><tr><td>Custom-made Removable Needle (for CTB injection)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 10 mm, point style 3</td></tr><tr><td>UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr></tbody></table>

dorsal root ganglion injection and dorsal root crush injury as a model for sensory axon regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

Als Darstellung ist eine quer verlaufende Rückenmark Abschnitt mit dem daran befestigten DRG präsentiert die Wirksamkeit dieses Protokoll zeigen DRG Neurone in transduzierende und sensorischen Axonen im Rückenmark von vier Wochen nach einer Kontrollvirus, AAV5-GFP, direkt in die C7 Verfolgungs Injizieren DRG ohne dorsale Wurzel Quetschverletzungen (Abbildung 1A). Axone in sowohl der dorsalen Säule und dem Hinterhorn des Rückenmarks GFP exprimieren (1B) sowie die Zellkörper und Axone innerhalb des injizierten DRG (1C). Zusätzliche anatomische Analyse des Nucleus Cuneatus, die sensorische Axonendigung im Hirnstamm, offenbart positive anterograde CTB Tracing (1D). Wenn die DRG-Injektion wird mit einer vollständigen C5-C8 dorsal root Quetschverletzung, keine GFP-positiven Axone im Rückenmark oder CTB-positiven Anschluss gleichzeitig durchgeführts in der Nucleus Cuneatus beobachtet (2A). Jedoch ist es erwähnenswert, dass axotomisierten sensorische Axonen noch in einer vollständig zerdrückt dorsalen Wurzel zu der dorsalen Wurzeleintrittszone regenerieren können, die eine PNS - Umgebung ist, aber nicht darüber hinaus in das Rückenmark 4, 5 (Figur 2A). Für den Fall , dass das injizierte Virus das Transgen eines potentiellen wachstumsförderndes Proteins enthält, kann das Vorhandensein von markiertem Axone im Rückenmark repräsentiert entweder Regeneration oder eine unvollständige dorsal root Quetschverletzung (2B). Zu unterscheiden, sollte zwischen diesen beiden Ergebnissen, CTB axonalen Verfolgung im Nucleus Cuneatus analysiert werden. Das Vorhandensein von CTB-positiven Klemmen im Nucleus Cuneatus hebt die Wahrscheinlichkeit einer unvollständigen Verletzung (Figur 2C), während die Abwesenheit von CTB-positiven Anschlüssen teilweise Regeneration in das Rückenmark schon sagt, als regenerierte Axonewahrscheinlich nicht in der Lage ist , die gesamte Strecke wachsen , um den cuneate Kern (2D) zu erreichen. Bis heute erfolgreich sensorische Axonregeneration zum Nucleus Cuneatus hat meist in Fällen mit hohen zervikaler Verletzung 11, 12 oder mit der Anwendung von Neurotrophinen 13, 14 berichtet. Jegliche Tiere Anzeichen einer unvollständigen Verletzung zeigen sollten aus Axonregeneration Studien ausgeschlossen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55535/55535fig1.jpg" /> Abbildung 1: DRG Injektion ohne eine Quetschverletzung Dorsal Kennziffern. (AC) Spinal Kordabschnitt GFP-positive Axone im Rückenmark (A) zeigt, einschließlich der dorsalen Säule und dorsal horn (B) und der Zellkörper in der DRG (C) vier Wochen nach der Injektion von AAV5-GFP. &lt;strong&gt; (D) CTB-positive sensorische Axonenden im cuneate Kern eine Woche nach CTB Injektion. Der Maßstab beträgt 650 &amp; mgr; m (AC) und 250 &amp; mgr; m (D). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55535/55535fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55535/55535fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55535/55535fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beurteilung der dorsalen Wurzelschäden und Axonregeneration Crush. (A) eine vollständige dorsal root Quetschverletzung führt zu keinem markierten Axone im Rückenmark oder CTB-positiven Axonterminalen im Nucleus Cuneatus. Axotomisierten sensorischen Axonen kann bis zur dorsalen Wurzeleintrittszone, aber nicht darüber hinaus in das Rückenmark regenerieren. (BD) , um das Vorhandensein von markiertem Axone im Rückenmark repräsentiert entweder unvollständig Verletzung oder regeneratiauf (B). Mit zusätzlicher Analyse die Anwesenheit von CTB-positiven Klemmen im Nucleus Cuneatus schlägt unvollständige Schädigung (C), während ihre Abwesenheit vollständige Schädigung schlägt und möglicherweise teilweise Regeneration in das Rückenmark (D). Der Maßstab beträgt 250 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55535/55535fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55535/55535fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.7K Aufrufe.  University of Cambridge. This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Serie: Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Biotechnik

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of communication with the brain. One of the goals of our research is to promote axon regeneration to restore connectivity across the lesion site. To accomplish this we developed a peripheral nerve (PN) grafting technique where segments of sciatic nerve are either placed directly between the damaged ends of the spinal cord or are used to form a bridge across the lesion. There are several advantages to this approach compared to transplantation of other neural tissues; regenerating axons can be directed towards a specific target area, the number and source of regenerating axons is easily determined by tracing techniques, the graft can be used for electrophysiological experiments to measure functional recovery associated with axons in the graft, and it is possible to use an autologous nerve to reduce the possibility of graft rejection. In our lab we have performed both autologous (donor and recipient are the same animal) and heterologous (donor and recipient are different animals) grafts with comparable results. This approach has been used successfully in both acute and chronic injury situations. Regenerated axons that reach the distal end of the PN graft often fail to extend back into the spinal cord, so we use microinjections of chondroitinase to degrade inhibitory molecules associated with the scar tissue surrounding the area of SCI. At the same time we have found that providing exogenous growth and trophic molecules encourages longer distance axonal regrowth into the spinal cord. Several months after transplantation we perform a variety of anatomical, behavioral and electrophysiological tests to evaluate the recovery of function in our spinal cord injured animals. This experimental approach has been used successfully in several spinal cord injury models, at different levels of injury and in different species (mouse, rat and cat). Importantly, the peripheral nerve grafting approach is effective in promoting regeneration by acute and chronically injured neurons.

Traumatic injury to the spinal cord disrupts communication with the brain. To restore lost connectivity we utilize a peripheral nerve graft to provide a substratum for regenerating fibers in combination with neurotrophic factors and matrix-modulating enzymes to remove inhibitory molecules to promote long distance growth.

Die Kombination Peripheral Nerve Grafting und Matrix Modulation der Verletzte Rat Spinal Cord Repair

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of ...

Biologie

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medizin

Sheath-Preserving Optic Nerve Transection in Rats to Assess Axon Regeneration and Interventions Targeting the Retinal Ganglion Cell Axon

Retinal ganglion cell (RGC) axons converge at the optic nerve head to convey visual information from the retina to the brain. Pathologies such as glaucoma, trauma, and ischemic optic neuropathies injure RGC axons, disrupt transmission of visual stimuli, and cause vision loss. Animal models simulating RGC axon injury include optic nerve crush and transection paradigms. Each of these models has inherent advantages and disadvantages. An optic nerve crush is generally less severe than a transection and can be used to assay axon regeneration across the lesion site. However, differences in crush force and duration can affect tissue responses, resulting in variable reproducibility and lesion completeness. With optic nerve transection, there is a severe and reproducible injury that completely lesions all axons. However, transecting the optic nerve dramatically alters the blood brain barrier by violating the optic nerve sheath, exposing the optic nerve to the peripheral environment. Moreover, regeneration beyond a transection site cannot be assessed without reapposing the cut nerve ends. Furthermore, distinct degenerative changes and cellular pathways are activated by either a crush or transection injury.
The method described here incorporates the advantages of both optic nerve crush and transection models while mitigating the disadvantages. Hydrostatic pressure delivered into the optic nerve by microinjection completely transects the optic nerve while maintaining the integrity of the optic nerve sheath. The transected optic nerve ends are reapposed to allow for axon regeneration assays. A potential limitation of this method is the inability to visualize the complete transection, a potential source of variability. However, visual confirmation that the visible portion of the optic nerve has been transected is indicative of a complete optic nerve transection with 90-95% success. This method could be applied to assess axon regeneration promoting strategies in a transection model or investigate interventions that target the axonal compartments.

This protocol describes an optic nerve transection that preserves the optic nerve sheath in rats. Hydrostatic pressure from microinjections into the optic nerve generate a complete transection, allowing for sutureless reapposition of the transected optic nerve ends and direct targeting of the axonal compartment in a transection model.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Zusammenfassung

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