Yazarların onayları yok.

Tüm deneysel prosedürler Tokyo Büyükşehir Belediyesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Hayvanlar, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca muhafaza edildi ve işlendi . Japonya&#39;nın Tokyo Büyükşehir Belediyesi Sınır Sağlık Bilimleri Bölümü Fonksiyonel Morfoloji Laboratuvarı&#39;nda yetiştirilen ve bakımını sürdürdükleri hayvanları kullandık. 1. Hayvan Bakımı ve Konut <ol><li> Kapalı yetiştirme kolonisinden 7 S. murinus (3 kadın ve 70-90 g ağırlığında 4 erkek) elde edin. </li><li> S. murinus&#39;u, kağıt şeritleri içeren ahşap yuva kutusuna sahip plastik kafeslerde sütten kesildikten (doğumdan 20 gün sonra) ayrı ayrı tutun. Onları geleneksel şartlara sahip bir hayvan odasında tutun: 23-27 ° C, nem kontrolü yok ve 12:12 saatlik ışık: karanlık döngü. Ticari olarak tedarikAlabalık topakları ve su ad libitum. </li></ol> 2. Doku Hazırlama <ol><li> % 4 (w / v) paraformaldehid (PFA) hazırlamak için, 40 mL PFA&#39;nın 1,000 mL 0.01 M Fosfat Tamponlu Tuzu içinde (PBS, pH 7.4) çözündürülmesi. Duman kabininde, solüsyon berrak oluncaya kadar bir girdap kullanarak karıştırın. 4% PFA O / N&#39;yi 4 ° C&#39;de saklayın. Dikkat: PFA kullanırken uygun Kişisel Koruyucu Ekipmanları (PPE) giyin. </li><li> Hayvanı perfüze ile tamir etmek için eteri anesteziyle eter ile inceltin ve daha sonra intraperitoneal bir somnopentil enjeksiyonu yapın (pentobarbital sodyum, 0.6 mL / kg vücut ağırlığı). </li><li> Hayvan tamamen uyuşturulduktan sonra, 3 cm uzunluğunda bir orta hat abdominal insizyon oluşturarak bisturi ile karın boşluğunu açın. İnferior vena kava çıkartılarak inceltilirken, bu arterin bifurkasyonunun hemen üzerindeki iliyak arterlerin hemen üstündeki seviyede abdominal aorta retrograd olarak bir kateter takın. </li><li> Somnopentil enjekte edin (pentobarbital yaniDium, 1.0 mL / kg vücut ağırlığı). Ötenazi sona erdikten sonra, bir duman dolabında 0.01 M PBS (pH 7.4) ve daha sonra% 4 PFA ile seyreltin. </li><li> Perfüzyondan sonra, kan damarlarını etiketlemek için 2-3 mL beyaz neopren lateks (distile Su (DW) ile seyreltik beyaz neopren lateks 3: 2) enjekte edin. </li><li> Karaciğer, safra kesesi, safra kanalları, duodenum ve pankreas en blokları dahil olmak üzere karın organlarını ilgili sinir ve damarlarla çıkarın. </li><li> Safra kesesine yaklaşık 0.1 mL mavi neopren lateks (mavi mürekkeple 10 mL inceltilmiş beyaz neopren lateks ekleyin) enjekte ederek safra sistemi etiketleyin. </li><li> Tam monte immün boyama için 4 ° C&#39;de% 4&#39;lük PFA ile gece boyunca düzeltme yapın. Dikkat: PFA toksiktir. PFA&#39;yı doğrudan kullanmaktan kaçının. PFA, duman kabininde kullanılmalıdır. </li></ol> 3. Bütün montaj immünohistokimyası Not: Yıkama, antikor inkübasyonu ve renklendirme de dahil olmak üzere protokol boyuncaE numune besleyici üzerinde kalmalı, nazikçe oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de salınmalıdır . <ol><li> Gün 1: Enzimatik tedavi ve potansiyel endojen peroksidazın inaktivasyonu <ol><li> Hazırlanan örneği DW 4x ile uygun bir boyutta cam flakon içerisinde 1 saat süreyle oda sıcaklığında yıkayın. PFA&#39;yı çıkarmak için numuneyi nazikçe sallayın. Çözüm alışverişi yaparken numuneye zarar vermemek. </li><li> % 1 (w / v) ortoperiodik asit hazırlamak için 1 g ortoperiodik asit 100 mL DW&#39;de eritilir. </li><li> Entrensek peroksidaz reaksiyonunu önlemek için numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 1 ortoperyodik asit ile inkübe edin. </li><li> 0.004 g papainin, 100 mL 0.025 mol / L Tris-HC1 tamponunda (pH 7.6) çözülmesi ile% 0.004 (w / v) papain hazırlayın. </li><li> Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika oda sıcaklığında yıkayın. </li><li> Örnek, yeni hazırlanmış% 0.004 papain içinde 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle hafifçe sallanan bir sabit sıcaklık banyosunda inkübe edin. </li><li> Numuneyi D ile yıkayınOda sıcaklığında 50-60 dk. </li><li> Numuneyi 4 ° C / N&#39;de% 4 PFA içinde saklayın. </li></ol></li><li> 2. Gün: Enzimatik tedavi <ol><li> Elde edilen numuneyi 1 saat boyunca oda sıcaklığında DW ile 4 kez yıkayın. </li><li> Örnek, yeni hazırlanmış% 0.004 papain içinde 37 ° C&#39;de 2 saat süreyle hafifçe sallanan bir sabit sıcaklık banyosunda inkübe edin. </li><li> Numuneyi oda sıcaklığında 50-60 dakika oda sıcaklığında yıkayın. Numuneyi 4 ° C / N&#39;de% 4 PFA içinde saklayın. </li></ol></li><li> 3. Gün: Dondurma tedavisi <ol><li> Depolanmış numuneyi, yukarıdaki gibi RT&#39;de 1 saat boyunca DW 4x ile yıkayın. </li><li> 2.5 g, 5 g ve 10 g sakrozun sırasıyla 100 mL 0.01 M PBS&#39;de çözülmesi ile% 2.5 (w / v),% 5 (w / v) ve% 10 (w / v) sukroz hazırlayın PH 7.4). </li><li> Numuneyi, her biri 30 dakika boyunca% 2.5 (w / v),% 5 (w / v) ve% 10 (w / v) sakroz içine daldırın. </li><li> Numuneyi -20 ° C&#39;de 30-60 dakika boyunca dondurun ve sonra oda sıcaklığında tam olarak çözündürün; Döngüyü 3x tekrarlayın. </li><li> Üst% 2 Triton X-100 (v / v), 100 mL 0.01 M PBS&#39;ye (pH 7.4) 2 mL Triton X-100 ekleyin. </li><li> Numuneyi% 2 Triton X-100&#39;de 4 ° CO / N&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> 4. Gün: Birincil antikor inkübasyonu <ol><li> Primer antikorun seyreltme solüsyonunu 0.2 mL Bovine Serum Albumin (BSA), 0.3 mL Triton X-100 ve 0.1 g sodyum azid&#39;in 100 mL 0.01 M PBS (pH 7.4) içerisinde çözündürülmesi ile hazırlayın. Dikkat: Sodyum azid akut toksiktir. Solunması ve dokunulması engellenmelidir. Uygun PPE kullanın. </li><li> Yukarıdaki seyreltme tamponunda primer antikoru (NFP) 1: 600 sulandırın (adım 3.4.1). Örnek hafifçe besleyici üzerinde sallanan tutarak, 3 ° C 3-6 gün boyunca NFP antikoru ile örneği inkübe edin. Daha büyük numuneler inkübasyon sürelerinin artmasını gerektirecektir. </li></ol></li><li> İkincil antikor inkubasyonu <ol><li> Bağlanmamış birincil antikoru çıkarmak için numuneyi oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS&#39;de 4x yıkayın. </li&gt; <li> 0.2 g BSA ve 0,3 mL Triton X-100&#39;ün 100 mL 0.01 M PBS (pH 7.4) içinde eritilmesi ile sekonder antikor için seyreltme solüsyonunu hazırlayın. </li><li> Seyreltme tamponu (adım 3.5.2) ikincil antikor (peroksidaz konjuge, afinite saflaştırılmış koyun anti-fare IgG-HRP) 1: 600 seyreltin. Numuneyi, ikincil antikor ile 4 ° C&#39;de 3 gün inkübe edin ve numuneyi yavaşça nutrator üzerinde salıncak tutun. </li></ol></li><li> renklendirme <ol><li> Çözeltiyi karanlıkta tutarak, duman dolabının altında 0.002 g 3,3&#39;-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB), 0,05 mL mol / L Tris-HCI tamponuna (pH 7.6) ilave ederek DAB renklendirme çözeltisini hazırlayın. </li><li> Numuneleri oda sıcaklığında PBS 4x&#39;de 1 saat boyunca yıkayın. </li><li> Yeni hazırlanmış DAB renklendirme çözeltisine 10 uL% 30 H202 ekleyin ve 4 ° CO / N&#39;de solüsyon ile inkübe edin veya hafifçe nutrator&#39;da sallanırken 3 d süreyle inkübe edin. </li><li> Reaksiyonu pla tarafından durdurunOptimum boyama yoğunluğuna ulaşıldığında PBS içinde% 0.04 sodyum azid ile numuneyi cingleyin. NOT: Bu adıma kadar sodyum azid kullanmaktan kaçının, çünkü bu yaban mersini peroksidazını inhibe eder. </li></ol></li><li> Boyalı dokuyu görüntüleme <ol><li> PBS içeren bir petri cam tabakasına (5 cm yüksekliğinde, 10 cm çapında) dikkatli bir şekilde örnek aktarın. Bir stereomikroskopta monte edilmiş bir kamera kullanarak tümüyle monte edilmiş görüntüleri yakalayın. NOT: Şeffaf bir cam tabağa PBS içinde tamamen batırılmışken, tümüyle monte lekelenmiş dokular görüntülenecektir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+hypoglossal+nerve+in+the+chick+embryo+as+observed+by+the+whole-mount+nerve+staining+method.">Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method.</a> Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).</li><li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+development+of+the+avian+vagus+nerve+with+special+reference+to+the+morphological+innervation+of+heart+and+lung.">Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung.</a> Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).</li><li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+development+of+avian+trigeminal+nerves.">Peripheral development of avian trigeminal nerves.</a> Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).</li><li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=House+musk+shrew,+Suncus+murinus:+a+novel+and+natural+obesity-resistant+animal+model.">House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model.</a> Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).</li><li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+anatomy+of+innervation+of+the+gallbladder+in+humans+and+Suncus+murinus+with+special+reference+to+morphological+understanding+of+gallstone+formation+after+gastrectomy.">Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy.</a> World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).</li><li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+study+of+the+pancreas+in+the+house+musk+shrew,+Suncus+murinus,+with+special+reference+to+the+blood+supply+and+innervation.">Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).</li><li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+anatomy+of+the+innervation+of+the+major+duodenal+papilla+in+humans+and+Suncus+murinus,+from+the+perspective+of+preserving+innervation+in+organ-saving+procedures.">Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures.</a> Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).</li><li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+anatomy+of+the+innervation+of+the+pylorus+in+humans+and+Suncus+murinus,+in+relation+to+the+surgical+technique+for+pylorus-preserving+pancreatoduodenectomy.">Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy.</a> World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).</li><li>Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+Extrahepatic+Biliary+Tract,+With+Special+Reference+to+the+Direct+Bidirectional+Neural+Connections+of+the+Gall+Bladder,+Sphincter+of+Oddi+and+Duodenum+in+Suncus+murinus,+in+Whole-Mount+Immunohistochemical+Study.">Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study.</a> Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+proteins+in+axonal+regeneration+and+neurodegenerative+diseases.">Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases.</a> Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).</li><li>Wyatt, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+the+sphincter+of+Oddi+to+the+stomach,+duodenum+and+gall-bladder.">The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder.</a> J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).</li><li>Mawe, G. M., Kennedy, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duodenal+neurons+provide+nicotinic+fast+synaptic+input+to+sphincter+of+Oddi+neurons+in+guinea+pig.">Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig.</a> Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).</li><li>Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+neuropeptidergic+properties+of+the+duodenal+neurons+projecting+to+the+gallbladder+in+the+golden+hamster.">Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster.</a> Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).</li><li>Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+nerve+cells+from+the+duodenum+to+the+sphincter+of+Oddi+and+gallbladder+of+the+Australian+possum.">Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum.</a> Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).</li><li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography.">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu çalışma, nörofilament proteine ​​karşı bir antikor kullanarak ekstrahepatik safra yolunun innervasyonunun görselleştirilmesi için deneysel prosedürü açıklamaktadır. Bu protokol, Kuratani ve Tanaka 1 , 2 , 3 tarafından tanımlanan protokolden uyarlanmıştır. Bu deney için, tüm montaj boyama yaklaşımı 2-3 hafta sürdüğü için, deneylerin her biri için zaman çizelgesini planlayın. Dondurma / çözülme işlemi dışında, dokuyu içeren damar her zaman bir besleyici üzerinde döndürülmelidir. Özellikle birincil ve ikincil antikorlar ile inkübasyon sırasında örnek, reaksiyon solüsyonlarına numunenin üniform bir şekilde maruz kalmasını sağlamak için bir besleyici üzerinde dönerken soğuk bir muhafaza odasında tutuldu. Çeşitli çözeltiler -% 1 (ağ / hac) ortopereodik asit,% 0.004 (ağ / hac) papain ve birincil / ikincil antibiyotik için seyreltme tamponuÖlür - her deney için taze yapılmalıdır. Protokol boyunca, çözeltiler değiştirilirken numuneye dokunmaktan ve dokunmaktan kaçınmak için çözümler forseps 15 ile çıkartılmak yerine dökülmelidir. PFA ile sabitlendikten sonra numuneler DW veya PBS ile yeterince yıkanmalıdır. Buna ek olarak, papain kuluçka ile enzimatik muamele önemlidir. Antijen alımı için kullanılan ısı ve enzim antikor penetrasyonu için dokuyu hazırlamaya yardımcı olur. Çözeltilerin penetrasyonunu arttırmak için dokunun dış zarının 30 dakika -20 ° C&#39;de veya -80 ° CO / N 15 dondurma işlemi ile bozulması gerekir. Solüsyonun tüm numuneyi inkübe edebilmesi için deneysel numuneyi yeterli miktarda tampon çözeltisi içine daldırmak önemlidir. Birincil antikorun inkübasyon süresi ampirik olarak belirlenmelidirD farklı dokular ve numune boyutları için. Genellikle, 2-3 cm&#39;lik bir numune için 3 gün olmalıdır. Her bir antikor için optimal seyreltme ampirik olarak belirlenmelidir. Uygun antikor tamponu kullanıldığında hem primer hem de sekonder antikorlar için 1: 600&#39;lük bir seyreltme önerilir. Bu çalışma, ayrıntılı olarak, S. murinus&#39;un safra yolunda nörofilament proteini ekspresyonunu ortaya çıkarmak için çok yönlü, tamamen montajlı bir immünohistokimyasal yaklaşımın protokolünü tanımlamaktadır. Bu yöntem, pek çok türün tüm organlardaki inervasyonu analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol, diğer nöronal antikorları test etmek için uyarlanabilir, ancak antikorların optimizasyonu yapılmalıdır. Bununla birlikte, teknik sığ sinir dokusunun etiketlenmesinde ve innervasyonun üç boyutlu bir modelinin oluşturulmasında sınırlıydı. Ayrıca, sinir liflerinin özelliklerini ( yani sempatik veya parAsimptetik, motor veya duyu, vb. ).

Ev sinek fıtığı , Suncus murinus , Insectivora ve Soricidae ailesine aittir. Bu minik memeli, Güneydoğu Asya&#39;da dağılmıştır ve insan yerleşim yerleri veya sığır kalemlerinin yakınında bulunan evlere ve çimenlik alanlara yerleşmiştir. Bu tür, fare, sıçan ve tavşan gibi diğer laboratuar hayvanlarına göre insanlara daha fazla benzeyen genel morfolojik özellikleri sergilemektedir. Daha önce, pankreas 6 , büyük duodenal papilla 7 , pilor 8 , safra kesesi 5 ve ekstrahepatik safra yolu 9&#39;daki periferik sinirleri etiketlemek için S. murinus nevrofilament proteini (NFP) için bir periferik nöron işaretleyici ile birlikte tümüyle bağlanan immün boyama yapıldı. NFP olgun nöronal hücre iskeletinin bir parçası olan makromoleküler bir kompleksdir. Nörofilamanla ilgili proteinNFP ve zigosom arasındaki etkileşime aracılık eder. Hem enzim fonksiyonu hem de bağlayıcı proteinlerin yapısı NFP 10 tarafından düzenlenir. NFP kompleksi üç polipeptidden oluşur: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) ve NF-H (200 kDa). NFP hem merkezi hem de periferik sinir sisteminde nöronal aksonlarda bulunabilir. Anti-insan NFP antikorunun, merkezi ve periferik sinir sisteminin aksonlarını işaret ettiği gösterilmiştir. Anatomik ve elektrofizyolojik araştırmalar sfinkter, safra kesesi ve proksimal gastrointestinal sistemin 11 , 12 , 13 , 14&#39;e bağlı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, nöronal bağlantılarının morfolojik özellikleri henüz tanımlanmamıştır. Bu çalışma, S. murinus bil&#39;in innervasyonunu etiketlemek için tam monte bir immünohistokimyasal boyama yönteminin kullanılmasını göstermektedirBir NFP antikoru ile birlikte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">orthoperiodic acid</td>
			<td style="width:71px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">162-00732</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">papain</td>
			<td style="width:71px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">164-00172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:71px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">010-15131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium azide</td>
			<td style="width:71px;">Nacalai Tesque</td>
			<td style="width:119px;">312-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">neurofilament protein (NFP) antibody</td>
			<td style="width:71px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">M0762, lot 089, clone: 2F11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td style="width:71px;">MBL</td>
			<td style="width:119px;">Code 330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td>
			<td style="width:71px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">349-00903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">imidazole</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using a whole-mount immunohistochemical method to study the innervation of the biliary tract in suncus murinus

Bu çalışma, tüm montaj immünohistokimyası boyama yöntemini detaylı olarak anlatmaktadır; nörofilament protein antikoru, Sunci murinus ( S. murinus) &#39; daki safra yolunun innervasyonunu etiketlemek için kullanmaktadır &#160; ). İlk olarak, numune S. murinus&#39;dan ayrılmış ve% 4 paraformaldehitle (PFA) sabitlenmiştir. İkincisi, bir enzimatik tedavi ve potansiyel endojen peroksidaz inaktivasyonu gerçekleştirildi. Sonra, numune birincil antikor anti-nörofilament protein antikoruna 3-6 gün maruz bırakılmıştır. Ardından, yaban mersini peroksidazı ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile inkübe edildi. Renk reaksiyonu, numunenin bir 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB) substratı ile reaksiyona sokulmasıyla ortaya çıkmıştır. Bu yöntem bütün iç organların innervasyonunu analiz etmek için uygulanabilir. Ayrıca, bu protokol, diğer nöronal antikorları test etmek için de adapte edilebilir, ancak antibodilerin optimizasyonuEsler önce yapılmalıdır. Bu yöntem başlangıçta Kuratani ve Tanaka tarafından tanıtıldı 1 , 2 , 3 .

Şekil 1 - 4 , S. murinus&#39;un ekstrahepatik safra yolunda NFP-pozitif sinir lifleri için tipik sonuçları göstermektedir. NFP&#39;ye karşı antikor, yüksek özgünlük ve asgari seviyede ekstrahepatik safra yolunun ( Şekil 1 ), safrakesesi ( Şekil 2 ), üst safra kanalının ( Şekil 3 ) ve duodenal papilla alanının ( Şekil 4 ) tüm görüntüsünde innervasyonu etiketli olarak etiketledi arka fon. Numunenin tüm dokuları için şekil ve boyut ne olursa olsun, tegmental sinirler aynı anda boyanabilir. Ekstrahepatik safra yolunun innervasyonuna ek olarak, özofagus ve midenin vagusunun çalışma ve dağılım yoğunluğu açıkça sergilenmiştir ( Şekil 1 ). <p clSafra kesesi kan damarları beyaz neopren lateks ile etiketlendiğinde, ince sinir fibrosları yüksek kontrastla açıkça gösterildi. İnervasyon yoğunluğu boyunda glukabondaki fundusdan daha yüksekti ( Şekil 2 ). Üst safra kanalında iki tür sinir demeti etiketli idi. İnce sinir demetleri düzensiz ve yoğun bir sinir ağı oluşturdu, yapıştırabildi ve safra yolunda varlığını sürdürdü; Daha kalın sinir demetleri safra yolunun yüzeyine paralel olarak dağıldı ( Şekil 3 ). Ortak safra kanalı mavi neopren lateksi ve beyaz neopren lateksi olan damarlarla etiketlendi. Ortak safra kanalının ve duodenal papilla alanının sonundaki ince sinir lifleri, yüksek c ile açıkça gösterildi<html> Ontrast ( Şekil 4 ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55483/55483fig1.jpg" /> Şekil 1: Safra Yollarında, Özofagusta ve Midede NFP-pozitif Sinir Lifleri. Oklar, yemek borusu boyunca giden vagusun karnına gösteriyor. CBD, Ortak Şiddetli Kanal; Özofagus; St, karın. Ölçek çubuğu = 1,300 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55483/55483fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55483/55483fig2.jpg" /> Şekil 2: Safra Kesesinde NFP-Pozitif Sinir Lifleri. Safra kesesinin kan damarları beyaz lateks ile etiketlendi. Safra kesesinin boynunda bol miktarda innervasyon meydana geldi (oklar). Ölçek çubuğu = 1,000 μm.Ref = &quot;https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55483/55483fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55483/55483fig3.jpg" /> Şekil 3: Üst Safra Kanalı&#39;nda NFP-pozitif Sinir Lifleri. İki tip sinir demeti gözlemlendi. Bir tip yapışkan koştu ve ekstrahepatik safra yolunda / içinde bulunan ince sinir demetiydi (oklar); Diğer tür, ekstrahepatik safra yolunun yüzeyine paralel olarak dağılan ve safra kesesi ile duodenum arasında (üçgenler) koştuğu daha kalın sinir demetleriydi. PV, Portal Damar. Ölçek çubuğu = 650 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55483/55483fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class= &quot;Xfigimg&quot; src = &quot;/ dosyalar / ftp_upload / 55483 / 55483fig4.jpg&quot; /&gt; Şekil 4: Duodenal Papilla Bölgesi&#39;nde NFP-pozitif Sinir Lifleri. Ortak safra kanalı mavi lateks ve beyaz lateksli damarlar (*) ile etiketlendi. Oklar, ortak safra kanalının sonunun inervasyonunu gösterir ve üçgenler, ortak safra kanalından ve damarlardan gelen duodenal papilla alanının (P) inervasyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 1,000 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55483/55483fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus at JoVE.com

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Sunkus murinustaki ekstrahepatik safra yolundaki nörofilament protein ekspresyonunu görselleştirmek için bütünüyle monte edilen bir immünohistokimyasal yaklaşım . Burada sunulmaktadır. Bu protokol, S. murinus veya diğer türlerdeki tüm iç organların innervasyonunu analiz etmek için kullanılabilir.

Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

using-whole-mount-immunohistochemical-method-to-study-innervation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

6.7K Görüntüleme.  Tokyo Metropolitan University.  Sunkus murinustaki ekstrahepatik safra yolundaki nörofilament protein ekspresyonunu görselleştirmek için bütünüyle monte edilen bir immünohistokimyasal yaklaşım . Burada sunulmaktadır. Bu protokol, S. murinus veya diğer türlerdeki tüm iç organların innervasyonunu analiz etmek için kullanılabilir. 

Video: Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Safra Yolunun İnternalasyonunu İncelemek İçin Bir Tam Montajlı İmmünohistokimyasal Yöntem Kullanmak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Tüm Dağı

Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism