We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.

NOT: 2 6206 bir avirulent suşu 17, 18 M. tuberculosis mc gibi, bu protokoldeki tüm çalışma Biyogüvenlik Seviye 2 tesis (BSL-2) yapılabilir. M. tuberculosis mc 2 ifade Yeşil Floresan Protein 1. Kültür koşulları 6206 (Mtb GFP) NOT: M. tuberculosis H37Rv auxotroph suşu 6206 mc 2 türetilmiş (Δ panCD, Δ leuCD) plazmid pMN437 ifade GFP bu protokol 16 boyunca kullanılır ile dönüştürdü. Olmayan GFP araştırmacılar için gerginlik daha kolay erişilebilirliği sağlamak için yabani tip gerginlik ifade ile Mtb GFP gerginlik yerine mümkündür. Bununla birlikte, GFP tanımı fagositozu ve Mtb / makrofaj agregaların oluşumunun görsel onay sağlamak için arzu edilir. long süreli depolama, Mtb GFP% 20 gliserol ile desteklenmiş (adım 1.1 tarif edilmiştir) eksiksiz 7H9 ortamında -80 ° C&#39;de dondurulmuştur. <ol><li> % 10 Middlebrook OADC,% 0.02 tiloksapol 24 ug / mL D-pantotenik asit, 50 ug / ml L-lösin ve 50 ug / ml Higromisin B ile 7H9 ortamında ilave tamamlandığını Mtb GFP ortamı (7H9-C) hazırlanması </li><li> Mtb GFP bir şişe çözülme ve 30 ml kare alt PETG şişede 7H9-C 10 mL ekle. </li><li> Döner bir çalkalayıcı (50 rpm) ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Optik yoğunluk ölçümleri (OD 600) birkaç günde OD 600 1.0 (yaklaşık 5-8 gün) ulaşıncaya kadar atın. </li><li> Bir OD 0.2-1.0 arasında 600 korumak için gerektiği gibi sulandırmak ve geçit kültürü. </li><li> Enfeksiyon için, logaritmik büyüme fazı (OD 0.6-1 600) içinde Mtb GFP kurulmuş bir kültür kullanın. Clumpy kültürleri önlemek için, bir su banyosu içinde Mtb kültür şişesi sonikasyon (130 W; 3 x 5 s darbe) ONCE veya haftada iki kez </li></ol> 2. Kültür Koşulları THP-1 hücreleri <ol><li> % 10 ısı ile etkisiz hale getirilen fötal sığır serumu, 2 mM L-glutamin ve 10 mM HEPES ile RPMI 1640 ortamı ilave etmek suretiyle tamamlandı, THP-1 hücre ortamı (RPMI-C) hazırlayın. </li><li> % 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de bir T-75 balonuna hücreleri inkübe edin. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın veya gün aşırı akış sitometrisi ve 0.1 mL başına milyon 0.6 arasında bir yoğunlukta THP-1 hücreleri korumak. </li></ol> 3. Enfeksiyon Protokol Mtb / Makrofaj Agrega Yapıları oluşturmak için <ol><li> THP-1 hücre preparasyonu (96 oyuklu plaka başına) <ol><li> 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüjleyin 7 x 10 6 THP-1 hücreleri. 7 ml RPMI-C süspanse. </li></ol></li><li> Mtb GFP hazırlık <ol><li> Santrifüj 2.8 x 10 8 Mtb GFP sallanan kovası santrifüj 3200 xg 5 dakika süreyle uOD 600, 1.0 = 3 x 10 8 bakteri / ml arasında bir dönüşüm şarkı. </li><li> Adım 3.2.1 olarak RPMI-C ve santrifüj ile bir kez yıkayın. </li><li> 10 s 7 ml RPMI-C süspanse ve vorteks. </li></ol></li><li> enfeksiyon NOT: Şablon için Şekil 1&#39;e bakınız. <ol><li> kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için bir su ağız için satırlar A ve H ve sütun 1 ve 12, steril su, 200 uL eklenmesiyle 96 oyuklu bir plaka hazırlanması. </li><li> Arka plan kontrolü (Boş) sütununda 2 (G2 B2) 200 ul RPMI-C ekleyin. </li><li> Bulaştırmak için, THP-1 hücre süspansiyonu (adım 3.1) Mtb GFP süspansiyon (adım 3.2) ekleyin ve pipetleme iyice karıştırın. Nihai THP-1 hücre yoğunluğu mL başına 5 x 10 5 ve enfeksiyonun gelen çokluğu 40. </li><li> 25 ml rezervuar içine THP-1 / Mtb GFP süspansiyon dökün. </li><li> (G11 yoluyla B3), THP-1 kalan 96 oyuklara / MTB GFP süspansiyonu 200 uL usin eklemega çok kanallı pipet. Not: birden çok 96 oyuklu plakalar çalışma durumunda, düzenli daha kanşım her bir göze ilave edilir sağlamak için rezervuar içinde kalan, THP-1 / MTB süspansiyon tekrar süspansiyon. </li><li> 7-10 gün süreyle% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> yavaş yavaş 100 çıkararak her 2 günde bir ortam değiştirme uL 100 uL, çok kanallı bir pipet kullanılarak, RPMI-C önceden ısıtılmış eklenmesi de yavaşça her birinin en ortam geçirdi. Kuyu tekrar süspansiyon ve kuyu dibinde Mtb / makrofaj agrega rahatsız etmeyin. </li><li> Görme Mtb / makrofaj agrega büyüklüğü dikkate alınarak, günlük floresan mikroskobu (4-10X objektif) tarafından kuyuları incelemek. Günün 7-10 tarafından, Mtb / makrofaj agrega yeterince büyük olmalıdır ilaç etkinlik testleri (Bölüm 4) için devam etmek (referans için Şekil 2&#39;ye bakınız). </li><li> İstenirse, bir otomatik hücre görüntüleme sistemi kullanılarak 96-kuyuların yakalama görüntüleri monteparlak bir alan ve GFP filtresi ile Mtb / makrofaj agrega oluşumu belgelemek için ayarlar. NOT: Kullanıcıların otomatik görüntüleme sistemine erişimi yoksa, temsilci kuyuların görüntüleri GFP ve parlak bir alan yetenekleri ile herhangi bir uygun mikroskop kullanılarak alınabilir. </li></ol></li></ol> 4. Büyüme İnhibisyon Tahlili Mtb / Makrofaj Agrega türetilen Uyuşturucu Etkinlik Karşı MTB Değerlendirmek için <ol><li> İlaç hazırlama (iki ilaç için üçlü koşullar) NOT: Şablon için Şekil 1A bakınız. <ol><li> Ayrı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, G10 üzerine B2&#39;ye 7H9-Cı ortamın 125 uL ekleyin. </li><li> Aşama 4.2.4 seyreltmeden dolayı 7H9-C 1 mL çift en arzu edilen nihai konsantrasyonda iki ilaç hazırlanması. </li><li> üçlü tedaviler için sırasıyla kuyulara B11-C11-D11 ve E11-F11-G11 her ilacın 250 mcL ekleyin. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak, seri Dilute testi ilaçlar B10-G10 içine B11-G11 125 uL hareket ettirerek iki kat. Her adımda 5 kez pipetleme karıştırın. </li><li> plaka üzerinde (sağdan sola) sütun sütun 125 uL taşımak ve sütun 4 sonra durdurmak için devam edin. </li><li> sütunu 4 karıştırıldıktan sonra, bir atık kabı içine 125 uL atın. Sütunlar 2, 3 arka plan (boş) ve pozitif bir büyüme kontrol olarak kullanmak için izin vermek için herhangi bir ilaç içermemelidir. Alternatif test ilaç kütüphaneleri için Şekil 1B şablonu izleyin: Not. Her 96 oyuklu plaka tek bir konsantrasyonda 58 ilaçları verebilir. bu adımda 4.2.4 yarı yarıya seyreltilmiş olacağından çift arzu edilen nihai konsantrasyonu kullanılarak bu ilaç tabak hazırlayın. </li></ol></li><li> İlaç tedavisi: <ol><li> MTB ihtiva eden 96 oyuklu plaka makrofajlar (MTB / makrofaj agregalar) ile enfekte al. </li><li> Dikkatle çok kanallı pipet ile ilgili tüm kuyular (G11 yoluyla B2) süzün.iki adımlı bir şekilde bu gerçekleştirin: ilk plaka eğmeden 150 uL kaldırın ve ardından plakayı devirme ve iyi alt kenarına pipet takarak kalan medya (~ 50 uL) çıkarın. Makrofaj Mtb / agrega, çukurun tabanına yapışık olarak, önemli bir yok olması gerekmektedir. </li><li> Yavaşça Mtb / makrofaj toplulukları ihtiva plakanın ilgili tüm kuyular (G11 ile B2) 7H9-C medya 100 mcL ekleyin. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak, enfeksiyon levhanın tekabül eden gözleri 96 oyuklu plaka (aşama 4.1) ihtiva eden bir ilaç kupasında 100 uL aktarın. </li><li> kapalı torbada yer ve 37 ° C &#39;de 3 gün boyunca inkübe edilir. </li></ol></li></ol> Resazurin microtiter Test kullanma Niceleme İlaç Etkinliğinin 5. <ol><li> 0.8 mg nihai konsantrasyonda stok solüsyonu resazurin Hazırlama / ml H 2 O. sterilizasyon için 0.22 um gözenek boyutlu PVDF zarından filtre.</li><li> 1: 1 oranında bir 2 resazurin stok solüsyonu, H2O ve Tween-80 (H 2 O içinde% 20 çözelti) karıştırılarak çalışma çözeltisi resazurin hazırlayın. Nihai konsantrasyon 0.4 mg / mL resazurin ve% 5 Tween-80 bulunmaktadır. </li><li> Bir plaka okuyucusu, kurulum 530 nm&#39;de uyarma ve 590 nm&#39;de emisyonla 37 ° C&#39;de 24 saat süre ile, her 30 dk floresan okumak için bir programı kullanarak. 37 ° C&#39;ye kadar ön-sıcak plaka okuyucu. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanılarak ilaç tedavi plaka (aşama 4.11) ilgili tüm oyuklara (G11 ile B2) resazurin çalışma çözeltisinin 20 uL ekleyin. </li><li> plaka okuyucu üzerinde plakası yerleştirin ve adım 5.3 kurmak programını başlatın. Not: deney plakası, yüksek hacimli işlenmesini kolaylaştırmak için, 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir analiz geliştirmek, tek flüoresan 24 saatte bir okuma yapmak için yeterlidir. Bu aynı zamanda kinetik ve inkübasyon özelliklerine sahip bir plaka okuyucu erişimi olmayan kullanıcılar için geçerlidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery.">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li><li>Bass, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention.">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li><li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis.">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li><li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMC207+becomes+bedaquiline,+a+new+anti-TB+drug.">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li><li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery.">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li><li>Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy:+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them.">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li><li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+back+to+the+future:+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis.">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li><li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2'+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors.">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).</li><li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis,+and+the+impact+of+P-glycoprotein.">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li><li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput/high-content+screening.">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114 (2014).</li><li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages.">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li><li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis.">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li><li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin?.">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?.</a> Front Microbiol. 6, 1117 (2015).</li><li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment?.">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?.</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li><li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children.">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li><li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis.">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li><li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs.">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li><li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li><li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection.">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li><li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium.">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li><li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, ayrıntılı olarak ilaç etkinlik testleri için uygun bir alternatif Mtb enfeksiyonu modeli tarif var. Bu model hesabına erken TB ilaç geliştirme sürecinde daha fazla dikkate alınmalıdır iki önemli faktör dikkate alır: ilaç penetrasyonu ve enfeksiyon sırasında Mtb metabolik değişikliklere fizyolojik ilgili engellerin varlığı. Daha önce bizim enfeksiyon modelinin yararları gösterilmiştir ve verimlilik uyumluluğu 16 enfeksiyon ölçekleme olasılığını önerdi ederken, biz burada bu 96-plaka biçiminde doğrudan sisteme adapte ederek aslında ulaşılabilir olduğunu göstermektedir. Bu pipet gereksinimi ortadan kaldırır ve agrega boyutları boyutları ulaşabilir olarak doğal zor bireysel çukurlar halinde büyük bir kültür şişesi, agrega dağıtma olarak Mtb / makrofaj oluşturma yeteneği, 96 oyuklu plakalar içinde doğrudan agregatlar avantajlıdır&gt; 500 mikron. enfekte makrofaj agrega büyüklüğü bu ipuçlarını yapışmasına neden olur ya da geniş bir pipetleme agrega parçalanmak gibi verimli deneyler için gerekli olan P200 çok kanallı pipet kullanımını engellemek olacaktır. 96 oyuklu plakalara Bu enfeksiyonun sistemin modifikasyonu gerekli manipülasyon adımları miktarını azaltır ve Mtb / makrofaj agrega içindeki miktarları ile homojen kuyu oluşturur. Bu nedenle, bu deney sistemi, sadece, in vivo olarak talebi Aday bileşiklerin etkinliğini öngörmek için erken geliştirme sürecinde özellikle değerli olan, ancak ilaç kütüphanelerinin akışı taramada. Açıklanan enfeksiyon modelinde önemli bir avantajı, bir BSL-2 uyumlu Mtb gerginlik kullanılmasıdır. BSL-2 koşullarda çalışma yeteneği, yüksek maliyetli olan protokol manipülasyon hızlandırır, ve en önemlisi gerçekleştirmek için bir BSL-3 tesise erişimi olmayan laboratuarlar sağlarse ilaç tarama deneyleri gelişmiş. Kullanılan oksotropik Mtb MC 2 6206 suşu, ilaç direnci ya da toleransı 16 etkilemez 4 genleri panCD ve leuCD, ancak tüm muhafaza H37Rv 17, 18 bir türevidir. Bu M.bovis BCG ve M. smegmatis, 6206 en yakın Mtb H37Rv, patojenik incelemelerinde referans suşu virulent ilgilidir Mtb mc 2 gibi diğer yaygın olarak kullanılan Mtb vekillere karşılaştırılmıştır. Önemli olarak, BCG&#39;nin eksik ve Mtb hastalık oluşturma ve granülom oluşumunun 19 önemli bir rol oynar RD-1 lokusundan korur. Nispeten, Mtb mc 2 6206 da Mtb gelen genomik farklı bir hızlı büyüyen bir türdür ve farklı antibiyotik direnç profilleri vardır M. smegmatis, daha TB-ilaç geliştirme deneyleri için daha uygun olduğunu. Burada tarif edilen deney, bağlı esneklik, yüksek düzeyde de değerlidir. (Şekil 3), aynı zamanda, tüm madde kütüphaneleri (Şekil 1B) taranması için gösterildiği gibi Mtb / makrofaj toplulukları ihtiva 96 oyuklu plakalar sadece üç kez ilaç tedavilerinin titrasyonu için kullanılabilir. tek bir konsantrasyonda, her 96 oyuklu plaka 58 bileşikleri tarayabilir. Enfeksiyon sistemi göre tam olarak mümkün olan bir 384-oyuklu bir plaka, için uyarlanmış, bu sayısı önemli ölçüde 300&gt; terkipleri artacaktır sadece bakteriler 3 gün boyunca çoğaltmak için izin verildikten sonra, güçlü bir resazurin sinyallerini almak bu gerçeği. Aslında, aşağı ölçekleme küçük de biçimine göre orantılı birimleri için diğer gibi protokol çoğunluğu değişmeden kalacak daha 384 oyuklu plaka formatı için bu sistemi adapte nispeten basit olacaktır. resazurin tahlil için yeterli sinyali etkinleştirmek için, bu olabilirYeterince bakteri çoğaltma için izin vermek için 4.2.5 ila 7 gün adımda inkübasyon uzatmak için gerekli. Mtb canlılığı için bir okuma olarak resazurin tahlil için bu enfeksiyon modeli birleştirilmesi birçok faydası, yani maliyet etkinliği ve hızlı tahlil protokolü gibi BACTEC 460 20 gibi diğer altın standart sistemlerine karşılaştırılabilir sonuçlar elde ederken sahipken, yine de bazı sınırlamalar var . sadece metabolik aktivitesini ölçer beri resazurin tahlil bakteriyostatik ve bakterisidal ilaçlar arasında ayrım olamaz. Bu metabolik aktivite gizli Mtb içinde doğal olarak düşük olduğu, akılda tutulması gereken önemli bir sınırlamadır. Ancak, bu testin temel bileşeni resazurin tahlili dışında Mtb ilaç duyarlılık için okuma-çıkışları ile uyumlu olabilir enfeksiyon modelidir. Örneğin, ilaç tedavisinden sonra, kuyular GOLD stan koloni birimi formasyonu (CFU) sayımı için plakalanır olabilir(Bu verimli tarama ile uyumlu olmasa da) dart bileşimlerinin bakterisit aktivitesi test etmek. Seçenek olarak ise, bu sistem CFU 21 sayım yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir ifade MTB, lusiferaz için bağlanabilir. İlaç duyarlılık ölçmek için bir lusiferaz sistemini kullanmak için, protokol sadece iki değişiklik gerekli olacaktır: Mtb -lusiferazdır ve 5. adımda resazurin yerine Parlak-Glo luciferin reaktif ii) kullanımı ile Mtb GFP i) yerine. önemli ölçüde 384 oyuklu plaka formatı ile kolayca uyum olacaktır seviyelere deney hassasiyetini arttırırken Mtb 30 dakika tahlilin gelişimini kısaltılacak ifade lusiferaz kullanımı. Özet olarak, başarılı bir şekilde çok az sayıda işlem adımını yüksek yeniden üretilebilirliğe sahip bir 96 oyuklu plaka formatı içine Bu enfeksiyon modeli, ve başlangıçtan sonsuz miktarda üretme yeteneğini geçiş yapanMalzeme, verim uyumluluk tüm önemli faktörler. Bu tahlil erken Mtb ilaç keşfi süreci için değerli bir varlık haline de pek çok farklı biçimlerde ve okuma-çıkışları için de uyarlanabilir.

<html> Tüberküloz (TB) 40 yılı aşkın 1 TBC kemoterapi rejimlerinin varlığına rağmen ciddi bir küresel sağlık tehdidi olmaya devam etmektedir. Bu uyumsuzluğu 2 hastaya neden çoklu ilaç kombinasyonları kullanılarak 6 aydan uzun tedavi dönemleri için gereksinimi, kısmen kaynaklanmaktadır. Klinik onaylı ilaçların başarılı gelişimi 3 neredeyse varolmayan olduğu son yıllarda ilaca dirençli TB çıkması ayrıca bir alanda sorunları bileşik etti. Nitekim, ayrıntılı bir anti-TB ilaç geliştirme rağmen, sadece tek bir ilaç FDA son 40 yılda 4 klinik kullanım için onaylanmıştır olmuştur. Bu nedenle, anti-TB ilaçların yeni nesil acilen bu sorunu çözmek için ihtiyaç vardır. TB ilaç keşfinde önemli bir sorun klinik ortamda etkinliğine in vitro aktiviteye sahip bileşikler başarılı transfer olmaması= &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Başlangıçta, hedef bazlı yaklaşımlar tam bakteriyel hücrelere çevirmek için başarısız anti-Mtb Drugs 5, taranması için kullanıldı. Mtb hücreleri kullanılır bile, genellikle doğru vivo 8, 9 ilaç etkinliğini öngörmek olmayan suyu üreyen kültürler, kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sorunlar, tanınmış ve MTB veya gizli Mtb içeren makrofajlar karşı ilaç tarama deneyleri başarıyla 8, 10, 11, 12 tespit edilmiştir. Ancak, hatta bu daha gelişmiş analizler ilaçlar non-vaskülarize akciğer lezyonları karşılaştıkları penetrasyon engelleri yeterli önem vermesi ve yok enfeksiyon yerinde nekrotik odaklar. AslındaHatta ilk basamak TB ilaç rifampisin için, sub-optimal doz nedeniyle in vivo doku ve beyin omurilik sıvısı (BOS) &#39;de vasat sorgulanmıştır hücre içi Mtb 8, 9 karşı etkinin azalmasına yanı sıra 13, 14, 15 nüfuz. şüphesiz TB ilaç keşif çabalarını artıracak erken kurşun geliştirme sürecinde dikkate bu parametreleri alacak gibi, yeni modeller ve tahlilleri gibi. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz son zamanlarda Mtb ilaç etkinlik testleri 16 için, ucuz, hızlı ve BSL-2 uyumlu alternatif enfeksiyon modeli kurdu. Fizyolojik ilgili hücresel penetrasyon engelleri değinmeyecek ve makrofaj pasajlandı oluşturulan yoğun üretilen büyük makrofaj agrega yapılar içinde Mtb paketlenmiş Bu enfeksiyon modeli, <em&gt; gizli Mtb benzeyen değiştirilmiş bir fizyolojik durum ile Mtb. Bu enfeksiyon modeli türetilmiş Mtb diğer hücre içi enfeksiyon modellerinde tutarlı sonuçlar ilaç etkinliğini değerlendirmek için resazurin mikrotiter tahlilde (REMA) ile birleştirildi ve serum konsantrasyonlarına kıyasla yüksek CSF konsantrasyonlarının elde edilmesi için ortak bir TBC ilaç bildirilen yeteneği ile de korelasyon 16. Burada ayrıntılı olarak rema kullanılarak ilaç duyarlılık testi için makrofaj geçirilmiş Mtb uygun üretmek Mtb / makrofaj agrega yapıların üretilmesini tarif eder. Özel olarak, bu enfeksiyonun sistemi aday anti-TBC ilaçların verimli tarama ile uyumlu bir 96-gözlü formata adapte olabilir şeklini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Follow manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Prepare 20% stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Prepare 24 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>Prepare 50 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Prepare 200 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nalgene Square PETG media bottle</td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 plate reader</td><td>Biotek</td><td></td><td>Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope</td></tr><tr><td>Gen5 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Recording and analysis of rezasurin coversion</td></tr><tr><td>Rifampicin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>Prepare 10 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Moxifloxacin Hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Prepare 10 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Prepare 800 &amp;mu;g/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>Prepare 20% stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr></tbody></table>

a high-throughput compatible assay to evaluate drug efficacy against macrophage passaged mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

96 gözlü plaka formatında bu enfeksiyon modeli uyarlamak sağlamlığını teyit etmek için, burada Şekil verilen şablona göre bir ilaç eden 96 oyuklu türetilen Mtb duyarlılığını enfeksiyonu rifampisin modeli (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) adapte incelenmiştir 1 A. Bu deneyde anahtarı Mtb / makrofaj agrega yapıların üretimi güvenilir bir şekilde ve böylece verim uyumluluğu (Şekil 1B) sağlayarak, bir 96 gözlü plaka formatında (Şekil 2) üretilebilir olduğunu göstermektedir. Makrofaj Mtb doğrudan iyi karakterize resazurin mikrotitre deneyi (Şekil 3) kullanılarak ilaç etkinliği test etmek için kullanılabilir, bu şekilde üretilen pasajlanmağa devam edildi. Resazurin tahlil flor mavi resazurin dönüştürmek için metabolik olarak aktif Mtb tarafından üretilen oksidatif türlerinin dayanır olarakPembe rezorfuinin escent, renk ve parlaklıkta meydana gelen değişiklikler bakteri miktarını belirlemek için bir belirteç olarak da kullanılabilir. Şekil 3A&#39;da olarak, güvenilir bir inkübasyon yalnızca 3 gün sonra ilaçlar yok iken replike edebilen canlı Mtb bakterilerin saptanmasıyla ilgili resazurin deneyi içinde yeterli hassasiyeti olduğunu göstermektedir. Son nokta renk değişimi görsel onay büyümesinin yalnızca yaklaşık bir değerlendirme olmakla birlikte, biz doğru kinetik bir plaka okuyucu (Şekil 3B) kullanılarak Resorufm onun floresan metaboliti için resazurin dönüşüm ölçerek bu ölçmek olabilir. Pozitif büyüme kontrolü (ilaçların yokluğu) ile normalize, bu verileri kullanarak makrofaj-pasajını Mtb karşı ilaç etkinliğini görselleştirmek için duyarlılık öldürme eğrileri hesaplanması (Şekil 4) için izin verir. Burada, Şekil temsilcisi sonuçları 3 </strong&gt; 4% 90 büyüme inhibisyonu gözlendiği en düşük antibiyotik konsantrasyonu olarak tarif edilen en az önleyici konsantrasyon (MIC), bizim enfeksiyon modelinden türetilen Mtb karşı hem rifampisin ve moksifloksasin için daha fazla 2 mg / ml olduğunu gösterir. Bu bizim enfeksiyon modeli hücre içi Mtb 8 karşı belirlenen MİK değerleri ile daha uyumlu olan anti Mtb ilaçların etkinliğini tahmin olduğunu gösteriyor ve bu nedenle suyu yetiştirilen bakteri hücreleri kullanarak en Mtb ilaç duyarlılık deneylerinde ihmal edilen difüzyon bariyer özelliklerini yansıtır. Önemli olarak, 96 gözlü bir formatta tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilen veriler, daha önce makrofaj geçirilmiş Mtb 16&#39;ya karşı rifampisin ve moksifloksasin için belirlenen olan kişilerce da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Şekil 1: İlaç plaka düzeni. Adım 4&#39;te kullanılan ilaç testi levhası (A) Örnek şablonu Bu 8 tanımlanan konsantrasyonlarda üçlü kuyucuklara iki ilacın paralel test sağlar. temsili bir deney olarak, sırasıyla, 2 uM ve 2.5 uM başlayan rifampisin (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) kullanılır. (B) veri akışı tarama için alternatif bir şablon ayrıca, tek bir konsantrasyonda 58 bileşiklerinin test edilmesi olanağını göstermektedirler sağlanır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55453/55453fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55453/55453fig2.jpg" /> Şekil 2: Mtb üretilmesi / makrofaj agrega yapılar 96 oyuklu plaka içerisindebiçim. (A) Temsilcisi parlak bir alan ve GFP Gün 9 sonrası enfeksiyon Mtb -macrophage agrega görüntüleri birleşti. Görüntüler 3 ayrı çekilen görüntülerin tarafından 3 bir montaj dikiş ile tüm kuyu belgeleyen bir otomatik hücre görüntüleme programı kullanarak 4X amacı ile ele geçirildi. (B), (A) &#39;da gösterilen görme alanından bir birey olmayan dikişli görüntü. (C) bir temsilci 10X amacı ile yakalanan bir Mtb / makrofaj agrega yapısının parlak bir alan ve GFP görüntü birleşti. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55453/55453fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55453/55453fig3.jpg" /> Şekil 3: Mtb canlılığı ölçmek için resazurin mikrotiter testi kullanılarak. (A) viabl varlığıe Mtb hücreleri sadece kendi pembe, indirgenmiş biçimine mavi resazurin boya dönüştürülmesiyle belirlenebilir. Temsilcisi sonuçları Şekil 1A şablona göre rifampisin (RIF) ve moksifloksasin (Moxi) kullanarak burada gösterilmektedir. Aşamasında tarif edildiği gibi (B) elde edildi, tek tek oyuklara floresans (Şekil 3A&#39;ya tekabül eder), resazurin dönüşümünü ölçmek için 5. Örnek mini grafikler zaman karşısındaki bağıl floresan birimlerinin (y-ekseni) gösteren 24 st için kinetik gözlenmiş (X ekseni). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55453/55453fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55453/55453fig4.jpg" /> Şekil 4: REMA verilerinden eğrileri öldürme ilaç duyarlılık belirlenmesi. maksimal resaz zamanında bağıl floresans birimleri(A) rifampisin ve (Şekil 3B den) (B) moksifloksasin tedavi kuyularda idrar sinyali% 100 sağkalım olarak herhangi bir ilaç kontrolü (maksimal Mtb büyüme) normalize edildi. Arka plan kontrolü (Boş) sinyalleri de her numuneden çıkarıldı. Yüzde hayatta kalma bir ölüm eğrisi oluşturmak için ilaç tedavisi, her bir konsantrasyonu için işaretlenmiştir. Bu şekilde Veriler, üç bağımsız deneyin ortalama ± SD temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55453/55453fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis at JoVE.com

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

a-high-throughput-compatible-assay-to-evaluate-drug-efficacy-against

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

7.7K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening. 

Video: A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mycobacterium abscessus için Çift Raportör Kullanarak Yüksek Verimli Tarama Testi

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: M. abscessus Tedavilerinin Etkili Keşfi için Ölçeklenebilir İlaç Tarama Protokolü

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1

The evaluation of direct interaction between pathogens and immune receptors usually involves sophisticated techniques or implies the use of transgenic strains and genetically engineered cells. Here, an alternative method to detect biochemical interaction between the macrophage microbial sensor SLAMF1 and Mycobacterium tuberculosis is described. Two technical approaches employing flow cytometry and fluorescence microscopy were developed. Total cell protein extracts from human macrophages were generated, then incubated with whole cells of M. tuberculosis (WCMtb)&#160;or M. tuberculosis antigens (Mtb Ags) overnight at 4 &#176;C and finally cross-linked using formaldehyde/glycine/ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) treatment. SLAMF1 interaction with WCMtb by flow cytometry was detected with a PE-specific anti-SLAMF1 antibody. The existence of interaction by fluorescence microscopy was performed by attaching Rhodamine-PE stained Mtb Ags to poly-D-lysine coated slides, which were incubated with the total protein extract from monocyte-derived macrophages. After cross-linking treatment, SLAMF1 was visualized using primary (anti-SLAMF1) and secondary (Alexa Fluor 488) antibodies. The assays provided a strong biochemical tool to measure pathogen-immunoreceptor interactions, overcoming the difficulties associated with transgenic cell lines and protein gene expression modulation experiments.

This study provides a protocol for evaluating the interaction of Mycobacterium tuberculosis with the SLAMF1 microbial sensor. The assays were conducted on human monocyte-derived macrophages using flow cytometry and fluorescence microscopy. The described tools are relevant for studying interactions between pathogens and immunoreceptors.

Mycobacterium tuberculosis'in İmmün Reseptör SLAMF1 ile Etkileşiminin İncelenmesi için Floresan Testleri

The evaluation of direct interaction between pathogens and immune receptors usually involves sophisticated techniques or implies the use of transgenic ...

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem

Tüberküloz için Ev Sahibi Tarafından Yönlendirilen Tedavilerin Preklinik Testlerinde Kullanılmak Üzere Otomatik Bir Kültür Sistemi

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mycobacterium tuberculosis'in İmmün Reseptör SLAMF1 ile Etkileşiminin İncelenmesi için Floresan Testleri