Kullanılan mikroskobu İmkanları, Erasmus optik görüntüleme Merkezi parçasıdır ve personel İKT kendi hizmetleri için teşekkür etmek istiyorum.

1. hazırlık <ol><li>iki parçadan oluşur görüntüleme odası montajı.
	<ol><li>Yer Odası ( şekil 1A -2) alt kısmı ve vida üst kısmı alt kısmı ( şekil 1A -3) içine 25 mm kapak cam ( şekil 1A -1). Cama zarar verebilir gibi çok sert sıkın değil. Otoklav tüm Odası ( şekil 1A -4).</li>
	</ol></li> <li>Dulbecco ilave tarafından hücre kültür ortamı hazırlamak &#39; modifiye kartal s &#39; s orta (DMEM) fenol red % 10 fetal buzağı ısı inaktive serum (FCS) ile ve steril koşullarda 1 mM L-glutamin olmadan. 4 ° C ve kullanımdan önce 37 ° c sıcak mağaza.</li>
	<li>Korumak hücre kültür Standart hücre kültürü teknikleri kullanarak şişeler kültür içinde orta hücrelerle. 
	Not: Burada, iki fare hücre hatları, Melanom B16BL6 11 ve Lewis akciğer Karsinomu (LLC) ve iki insan melanomlar, BLM ve 1F6 12, kullanıldı.</li>
	<li>Tartım ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 37 ° C'de içinde jelatin eriterek olun % 0,1 jelatin bir gecede. 0,22-µm filtreden süzerek çözüm sterilize ve 4'te saklayın ° C.</li>
</ol> 2. Plaka hücreleri <ol><li>görüntüleme odası dolap laminar akışı sterilizasyon çantasından çıkarın, dikkatle odası sıkın ve bir kabında yerleştirin. 
	Not: odası-ebilmek var olmak konulmak mikroskop altında kadar kirlenmesini önlemek için görüntüleme odası bir kabında tutun.</li>
	<li>Kat görüntüleme odası cam ile 1 mL %0.1 20 dk 37 ° C ve % 5 CO 2 için steril jelatin. 
	Not: Bu daha iyi hücre eki sağlayacaktır.</li>
	<li>Orta (1.2 ve 1.3 adımlara bakın) hücre kültür şişeler kaldırmak, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve % 0.25 tripsin kullanarak hücre bağlantısını kesin. Tripsin hücre kültür orta ekleyerek devre dışı bırakın, hücreleri toplamak, onları vasıl 1100 x g 5 min için spin aşağı ve Pelet hücre kültür orta 5 mL resuspend.</li>
	(Hangi ölü hücreleri tarafından alınan) trypan mavi <li>seyreltik 20 µL hücre süspansiyon 20 µL. Bir hemasitometre kullanarak canlı ve ölü hücreleri saydırmak; ölü hücre sayısı % 10 geçmemelidir.</li>
	<li>Jelatin Aspire edin ve en fazla 24 saat içinde % 70 kapsamı için izin veren bir seyreltme hücrelerde plakası. Örneğin, 5 x 10 4 veya 10 x 10 4 hücreleri 1 ml seyreltme kullanın. Hücreleri % 5 CO 2 ve 37 ° C 24 h için bağlı kalmak izin</li>
</ol> 3. Hızlandırılmış mikroskobu ( Şekil 2) Not: canlı hücre bu görüntüleme için çoğu üretmektedir İnkübatörler sunmaktadır, ancak burada, bir ısmarlama sahne alanı sahibi confocal mikroskop, kullanılan nanoparticulated ilaç dağıtım araştırmak de uygundur.
<ol><li>Confluency, hücresel morfoloji ve kirlenme mikroskopla hücre değerlendirmek. Odaya geri CO 2 kuluçka makinesine koyun. 
	Not: Confluency % 70 aşmaması gerekir. Hücresel Morfoloji (hücreleri uygun değil tutarsız Yani) bir ya da bulaşma algılandı, atmak görüntüleme odası.</li>
	<li>Confocal mikroskop ( şekil 1E -1), geçiş Floresan ışık ( şekil 1E -2) ve bilgisayar ( şekil 1E -3).</li>
	<li>Amacı objektif ısıtıcı bağlanmak ve 35 ° C (-4 rakam 1E + sokmak) için ayarlayın.</li>
	<li>Hazırlamak kuluçka birimi şekil 1B adımında gösterildiği gibi. 
	Not: Bu bir ısıtmalı aşaması ( şekil 1B -1), bir akış sahne CO 2 tüpler ( şekil 1B -2) için bir bağlantı ve CO 2 sonda ile oluşur ( şekil 1B -3) ve bir kırmızı kapanış yama ( şekil 1B -4). Bu düzeltme eki birim görüntüleme odası yerleştirilir kadar geçici olarak kapatmak için kullanılır.</li>
	<li>Kuluçka birimi mikroskop sahnesinde yerini ve içinde - ve çıkış - flow CO 2 tüpler ( şekil 1E -5) bağlanın. Ana CO 2 Vana ( şekil 1E -6) açın ve CO 2 denetleyicisinde ( şekil 1E -7) geçin. Denetleyicisi % 5 CO 2 ' ye ayarla onay. 
	Not: nem için CO 2 bir nemlendirici ( şekil 1E -8) geçer. Hipoksi deneyler için ayrı bir O 2 regülatörü ( şekil 1E -9) kurulumunda eklenir.</li>
	<li>Sahne sıcaklık 37 ° C ( şekil 1E -10) ayarlayın. Hipertermi deneyler için sıcaklığı 42'ye ayarlamak ° C. izin ver seçili sıcaklık ve CO 2 yüzde ulaşmak için kuluçka birimi.</li>
	<li>Ana CO görüntüleme odasından 2 kuluçka makinesi almak ve bir petri mikroskobu odasına odasında taşıma.</li>
	<li>Görüntüleme Odası ( şekil 1A -4) özel bir yer, 35 mm çaplı sahne tutucu ( şekil 1A -5) ve özel yapım bir mühürleme kapaklı odası kapatın ( Şekil 1A -6). 
	Not: Kapağı geçmek CO 2 sağlar ve buharlaşma ve diğer yabancı maddelerden engeller.
	<ol><li>Kuluçka ünitesini açın, kırmızı düzeltme eki ile görüntüleme odası yerine ve ( şekil 1 c) birimini kapatın. Bunu aşağı hücreleri soğutma önlemek için mümkün olduğunca hızlı. Kablo sahne ve mikroskop arasında sıkışmış olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li> <li>İçin 30 dk. parkenizin birimi bırak</li>
	<li>Yazılımını açın ve lazerler üzerinde geçiş. 
	Not: Burada, 488 nm argon, 543 nm helyum-neon ve 633 nm helyum-neon lazer kullanıldı.</li>
	<li>Yeni bir veritabanı yapabilirsiniz &#34; New &#34; Dosya sekmesini adı altında ve kurtarmak belgili tanımlık database.</li>
	<li>Yanında tıkırtı yapılandırma ayarla &#34; Config &#34; da ele geçirme sekmesini altında &#34; kanal modu &#34; ve &#34; tek parça &#34; tek bir fluorophore değerlendirmek için veya &#34; çoklu parça &#34; birkaç fluorophores için. Fluorophore (Örneğin, 560-615 nm bant geçiren Filtre dox ve Dox-NP; bkz: daha fazla örnek için temsilcisi sonuçları) eşleşen uygun bant geçiren filtre seçin. Parlak alan kanal içinde bir-in belgili tanımlık iz seçin.</li>
	<li>Ayarla tarama denetimi tıklatarak &#34; tarama &#34; yön (8-bit, tek) ele geçirme sekmesini (1024 x 1024), çerçeve boyutunu ayarlama tarama hızı (en uygun), altında tarayın ve tarama ortalama (4) tıklatarak &#34; modu. &#34; iğne deliği ve sondaj (200 µm) ayarla, kazanmak ve ofset () Örneğin, 580, 700 ve 835; bkz. şekil 3) ve lazer güç (488 = %10, 543 = %100, 633 = %100) tıklayarak &#34; kanalları. &#34;</li> <li>tıklatarak bu ayarları Kaydet &#34; Config &#34; Yapılandırma sekmesini ve yapılandırma veritabanında saklayabilirsiniz.</li>
	<li>Hızlandırılmış tıklatarak ayarlayın &#34; çok zaman X &#34; ( şekil 1 d) makro sekmesini içinde &#34; tek yer &#34;.</li>
	<li>Hücreleri odak içinde tutmak için Otomatik odak tıklatarak makroyu seçin &#34; Auto odak. &#34; 
	Not: otomatik odaklama cam yansıması bir referans noktası olarak kullanarak 633 nm lazer ile elde edilir.</li>
	<li>Tıklayarak kaydedilmiş olan yapılandırmayı uygulamak &#34; tek parça &#34; veya &#34; çoklu parça, &#34; zaman aralığı (örneğin, 15 dk), (örneğin, 97) tarama sayısı ayarını yapılandırma veritabanında gerekli yapılandırma için kaydırma ve tıklayarak &#34; yük Config. &#34; Not: Bu ayarları kullanarak, bir saat serisi 97 x 15 dk = 24 h yapılacaktır.</li>
	<li>Hızlandırılmış olarak isim &#34; Bankası dosya adı &#34; ve veritabanı (Adım 3,11 oldu) tıklatarak seçin &#34; görüntü veri tabanı &#34; hızlandırılmış kaydetmek için. Tıklatarak bir geçici klasör ayarlayın &#34; Tmp görüntü klasör. &#34; Not: sistem durur veya herhangi bir nedenle çöküyor, görüntüleri bu klasöründe yer alır.</li>
	<li>İncubating ünitesini açın, görüntüleme yüzük kaldırın, amaca bir damla daldırma yağı ekleyin ve olabildiğince çabuk birimini kapatın. Odak ve görüntüleme odasında bir konum seçin. 
	Not: Bu pozisyon ile % 70 confluency, tek tek hücreleri görüntüleme için izin en az bir monolayer hücrelerde içerir.</li>
	<li>Arka planı için yapılandırma ayarlarını denetleyin ve gerekirse düzeltin. 
	Not: Arka plan kazanç veya lazer güç azaltarak düzeltilebilir. Yapılandırmasında herhangi bir değişiklik (bkz. Adım 3,17) kaydedilmiş olması gerekir ve (bkz. Adım 3.18) yüklü tekrar makroda.</li>
	<li>Laminar akış kabine, ücretsiz ilaç ya da 5 µg/mL ilaç bir konsantrasyon veya hücre kültürü ortamında lipidler 0,05 µmol nano tanecikleri sulandırmak. Filtre bir 0,22-µm şırınga filtreden uyuşturucu/nano tanecikleri steril değildir.</li>
	<li>İncubating odası açmak, mühürleme kapağı kaldırın, orta hücrelerden kaldırma, seyreltilmiş uyuşturucu/nano tanecikleri 1 mL ekleyin ve kısa sürede birimini kapatın.</li>
	<li>Odak üstünde belgili tanımlık hücre ve başlangıç hızlandırılmış tıklatarak &#34; başlattığınızda &#34; çok zaman X makroda.</li>
	<li>Hücreleri hala odakta olup olmadığını görmek için düzenli olarak kontrol edin veya (bkz. Adım 3,16) otomatik netleme işlemi kullanın. Program veritabanında otomatik olarak hızlandırılmış kaydeder; program çalışırken veritabanı kapatmayın.</li>
</ol> 4. Veri analizi <ol><li>Orijinal Araştırma soru bağlı olarak, ImageJ gibi yazılım programlarının veri analizi için kullanın (örnekler için sonuçlar bölümüne bakın).</li></ol>

<ol>
	<li>Duggan, S. T., Keating, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+liposomal+doxorubicin:+a+review+of+its+use+in+metastatic+breast+cancer,+ovarian+cancer,+multiple+myeloma+and+AIDS-related+Kaposi's+sarcoma.">Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma.</a> Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes.">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).</li><li>Ten Hagen, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+augments+antitumor+activity+of+stealth+liposomal+doxorubicin+(DOXIL)+in+soft+tissue+sarcoma-bearing+rats.">Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats.</a> Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).</li><li>Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+low-dose+tumor+necrosis+factor-alpha+to+systemic+treatment+with+STEALTH+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+improved+anti-tumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+rats.">Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats.</a> Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).</li><li>Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+safety+of+pegylated+liposomal+doxorubicin+(Doxil/Caelyx)+demonstrated+by+endomyocardial+biopsy+in+patients+with+advanced+malignancies.">Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies.</a> Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).</li><li>Muggia, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+encapsulated+anthracyclines:+new+therapeutic+horizons.">Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons.</a> Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggered+content+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+using+mild+hyperthermia.">Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia.</a> J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).</li><li>Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+and+optimization+of+idarubicin+thermosensitive+liposomes+provides+ultrafast+triggered+release+at+mild+hyperthermia+and+improves+tumor+response.">Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response.</a> J Control Release. 220, 425-437 (2015).</li><li>Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+Doxil+is+taken+up+intracellularly+and+released+doxorubicin+sequesters+in+the+lysosome:+Evaluated+by+in+vitro/in+vivo+live+cell+imaging.">Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging.</a> J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).</li><li>Dicheva, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+Thermosensitive+Liposomes:+A+Novel+Dual+Targeted+Heat-Triggered+Drug+Delivery+Approach+for+Endothelial+and+Tumor+Cells.">Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells.</a> Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).</li><li>Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+anti-tumour+activity+of+recombinant+human+and+murine+TNF,+alone+and+in+combination+with+murine+IFN-gamma,+on+a+syngeneic+murine+melanoma.">In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma.</a> Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).</li><li>Van Muijen, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+of+metastasizing+and+non-metastasizing+human+melanoma+cells+xenografted+into+nude+mice.">Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).</li><li>Das, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+TIMP3+expression+affects+tumor+progression+and+angiogenesis+in+melanomas+through+regulation+of+directionally+persistent+endothelial+cell+migration.">Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).</li><li>Brouckaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-alpha+augmented+tumor+response+in+B16BL6+melanoma-bearing+mice+treated+with+stealth+liposomal+doxorubicin+(Doxil)+correlates+with+altered+Doxil+pharmacokinetics.">Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics.</a> Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).</li><li>Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+doxorubicin+efflux+from+the+nucleus+of+drug-resistant+cancer+cells+following+extracellular+drug+clearance.">Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance.</a> Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).</li><li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging.">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+hyperthermia+triggered+doxorubicin+release+from+optimized+stealth+thermosensitive+liposomes+improves+intratumoral+drug+delivery+and+efficacy.">Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+intracellular+Doxorubicin+delivery+through+nanoliposomes+equipped+with+selective+tumor+cell+membrane+permeabilizing+short-chain+sphingolipids.">Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids.</a> Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).</li><li>Pedrosa, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+glycoceramides+promote+intracellular+mitoxantrone+delivery+from+novel+nanoliposomes+into+breast+cancer+cells.">Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells.</a> Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geçmişte gözlemlediği gibi liposomal nanocarriers hemen fiksasyon yok edebilir ve veri yorumlanması yapım çok zor ve hatta yanıltıcı formu yok edilen bu lipozomlar hala çekirdek, girmek için zaman vardı DXR serbest. Mikroskobik bazı ayarlamalar ile canlı hücreler ve dokuların kemoterapötik kadere onaylamak veya histolojik gözlemler devirmek için rutin olarak araştırılması. Son bir kağıt alımı, yayın ve yerelleştirme DXR ücretsiz ve kapsüllenmiş dox canlı hücre zaman hata görüntüleme9kullanılarak tedavi hücreleri gösterdi. Bu eser deneysel kurulumu daha ayrıntılı olarak açıklar. Bu modeli kullanarak, bu hücre sonunda ölene kadar o sürekli birikir nerede dox çekirdeği için acil ulaşım görselleştirmek mümkündür. Buna ek olarak, Dox-NP kullanıldığında, sadece küçük miktarlarda yayımlanan dox çekirdeğinde bulunur. Cildin sürekli nikele maruz sürekli DXR birikimini içinde sonuç, floresan sinyal Dox içinde çok daha düşük olsa da-dox tedavi hücreleri karşı NP-hücresel konsantrasyon ve sonraki sitotoksisite bir fark gösteren. Ayrıca, canlı hücre işaretçileri kullanarak, bu hücrelere Dox-NP açığa zaman DXR ve nanocarrier lysosome içinde bulunduğu, gösterilmiştir. Bu tam lipozom hücre tarafından alınır ve endositik bir yolu da katılımı sırasında bu nano tanecikleri alımını gösterir gösterir. Çekirdek DXR yayımlanan dox olduğu açık. Ancak, DXR ve taşıyıcı co yerelleştirilmesine ve organellerin içinde entrapped gibi görünüyor gibi bu yöntemi kullanarak, ister bu kapsüllenir veya dox piyasaya hala sonuçsuz 's. Nanopartikül içsel kararlılığını ne zaman lysosome içinde lokalize dox yayın engeller mümkündür.
Bu protokol için canlı hücre görüntüleme (teknik özellikleri istek üzerine verilebilir) bir ısmarlama sahne alanı sahibi ile belirli bir mikroskobik Kurulumu kullanarak gösterilmiştir. Ancak, en confocal mikroskop üretmektedir canlı hücre görüntüleme gerçekleştirmek İnkübatörler sunmaktadır. Hücre kültür koşulları (Yani, sıcaklık, CO2, pH, nem ve kısırlık) koruyarak bu İnkübatörler ana kriterdir ve uygun koşulları belirlemek için bazı ön test gerektirir hangi daha da açıklanmıştır. Otomatik veri toplama programları de aynı üretici tarafından teslim edilebilir. "Çok yeri" seçeneği, istatistiksel analiz rafine aynı odasında çeşitli kademelerde görüntü olanak verir. Ancak, bu seçenek, bu el yazması belirtilen makro tarafından Z-drift için düzeltmek için olasılık kayıp olduğu sabit XYZ pozisyonlarda gerektirir. Z-boyut tarama bu makro ve bir odak uçak analizi için eklenebilir. Ancak, bu ilave tarama, fototoksisite olasılığı artan ve ağartma gerektirir.
İle tüm floresan ölçümleri gibi dozun bir sorun ne zaman özellikle iki bileşikler farklı bir hücresel alımı ile karşılaştırma. Floresan yoğunluğu sadece bahçedeki içsel sinyal üzerine, aynı zamanda alımını, konsantrasyon ve uyuşturucu çekim hızı oranı üzerine bağımlı değildir. Sinyal yok Dox NP tedavi edilen hücrelerde görülür, ancak Şekil 3'te gösterildiği gibi nükleer DXR dox tedavi hücre zaten görünür, içeriğidir. Sadece kazanç artırarak Dox-NP-tedavi hücrelerdeki DXR, dozun dox tedavi hücrelerdeki önde gelen görüntülenmeyecektir. Ayrıca, hatta intracellularly Dox-NP heterogeneously, hangi altında kaçınılmaz neden olabilir dağıtılır- veya dozun. Özellikle hücresel DXR tuzak soruşturma zaman kazanç bireysel organelleri (rakamlar 5B ve 5 C) ayırt etmek için önemli ölçüde azaldı. Böylece, piksel yoğunluğu tarafından temsil edilen ölçümlerin sonuçları doğru biçimde yorumlayabilmek için temsil edici görüntüleri eşlik etmelidir.
Fototoksisite, ağartma ve düşük sinyal-gürültü oranı da önemli sorunlar floresan mikroskopi ve görüntü kalitesi ve resim alma arasında bir uzlaşma oluşturulmalıdır. Ancak, mikroskop kurulum en uygun olsa bile, görüntü kalitesi de büyük ölçüde hücreleri ve eklenen bileşik kalitesi ile belirlenir. DXR güçlü bir sinyal verir ve uygun önlemler ile ağartma, (en fazla 72 s) daha uzun süre sonra bile gözlendi değil. Ancak, floresan sinyal azalması da sızma bir sonucu olabilir. Sızma ilaç direnci15 önemli bir olgudur ve hücreleri uyuşturucu eylem hücre içi sitesinden dışarı pompa oluşur. Floresan sinyal bir azalma zaman içinde bu nedenle de dox sızma9bir sonucu olabilir. Floresan sinyal hızlandırılmış serisinin son görüntü ile deneme sonunda sigara inceden inceye gözden geçirmek konumunun karşılaştırma göstermek ağartma (Yani, sinyal-ecek var olmak yüksek taranan olmayan konumda) veya (Yani, her iki sızma sinyalleri aynı olacaktır). Birkaç ıslah seçenekleri (Örneğin, arka plan, drift, ağartma, vb) ImageJ16gibi programlarda kullanılabilir. Ayrıca, floresan yoğunluğu zamanla artar, yapılandırma ayarlarını dozun hızlandırılmış (Adım 3,21) sonunda en aza indirmek için pilot bir deneyde önceden değerlendirilmiş olabilir. Alternatif olarak, bir görüntüleme odası zaten istediğiniz zaman dönemi için ilaç maruz hücrelerle ayarları başlatmak için kullanılabilir. Son olarak, bu tür bir çözümleme, toksik ilaç konsantrasyonları (Adım 3,22) kaçınılmalıdır ve geleneksel biyo-deneyleri kullanarak önceden kurulmuş.
Hücreler sürekli kültürlü ve orta fenol red olmadan saklanır. Fenol red spektrumunun kırmızı bölümünde fluoresces ve hücre organelleri, büyük olasılıkla organellerin, yanlış bilgi (Adım 1.2) görülebilir. Bireysel hücrelerin izlemek için izin vermek için hücre izdiham % 70 (Adım 3.1.) geçmemelidir. CO2 akış-hızı (Adım 3.5) bir doğrulama deneme ekipman satın aldığınızda veya sonrası bakım düzenlenmiş olması gerekir. Hızı çok yüksek olduğunda, orta buharlaşır gider. Hızı çok düşük olduğunda, hangi-ebilmek tesir etmek hücre büyümesini ortamın pH artacaktır. Orta olmadan olduğu gibi pH fenol red pH göstergesi değişimler dikkat edilmesi ve bu nedenle kolayca göz ardı edilir. CO2 akışı doğrulandıktan sonra bu ayarları olarak tüm gelecekteki deneyler kullanılabilir.
Burada açıklanan yöntemi kullanarak, nano tanecikleri kaderi kolayca canlı hücre görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskobu kullanarak araştırılması. Bu yordam, piyasada bulunan nano tanecikleri kullanılmıştır. Ancak, kader thermosensitive17, Katyonik lipozomlar10; kısa Zincirli shingolipids18ile zenginleştirilmiş lipozomlar; ve8,19 da tümör ve normal hücrelerin bu şekilde soruşturma diğer ilaçlar nano tanecikleri Kapsüllenen.

Hücre-hücre arasındaki etkileşimleri gibi biyolojik bir süreci takip yeteneği Inter- ve hücre içi ulaşım, sitotoksik bileşik alımı ve canlı hücreler ve dokular, tek moleküllerin protein-protein etkileşim büyük ilgi son kazanmıştır on yıl, "gerçek zamanlı" ekstra boyut sağladığından Bu makale, ücretsiz dox ve nano tanecikleri (Dox-NP) dahil dox hücre içi kaderi takip için bir yöntem tanımlanır.
Nano tanecikleri yıllardır bazı kanserlerin tedavisinde kullanılmaktadır. AIDS ile ilgili Kaposi sarkomu, tedavisi ve yumurtalık gelişmiş meme kanseri ve Multipl Miyelom1Dox-NP onaylandı. Geliştirilen ve klinik ortamda tanıttı ilk liposomal nano tanecikleri biriydi. Serbest form, dox, büyük ölçüde yeterli miktarda tümör sitesine ulaşmak için kapasitesini sınırlama kan dolaşımını üzerinden temizlenir. Ayrıca, tedavi şiddetli ve doz sınırlama yan etkiler, Stomatit ve kalp yetmezliği gibi eşlik ediyor. Pegile liposomal nano tanecikleri saklanmış zaman dolaşım süresi dakika mesafede gün2' ye artar. Kolesterol içeren bu tür lipozom oldukça kararlı ve bu istikrar kapsüllenmiş ilaç dozları belirler.
Ancak, bu sertlik bir dezavantajı vardır. İlk Değerlendirilmiş vitrositotoksik bir bileşik tümör hücrelerinin doğru özelliğidir ve o dox Dox-NP sitotoksik içinde3,4deneyleri daha güçlü gösterilmiştir. Taşıyıcı kararlılığını yayın ve hücresel ilaç alımını engeller ve bu olay daha fazla araştırmak için faydalıdır onaylanmadığına karar. Sitotoksik bileşeninin (Yani, dox) hedef site (Yani, tümör, Engelli bioavailability kanda agresif elemanları sürmesi ve bozulmamış, tümör sitesine ulaşmak için inşa iç liposomal özellikleri sonuçlandı hücre çekirdeği). Dox-NP hardily serbest forma göre yanıt gelişmiş olsa da, kapsülleme Kardiyotoksik efektleri5azaltılacağını hala klinik değeri, öyleydi. Ertesi yıl, diğer bileşikler nano-taşıyıcılar6' kapsüllü. Ayrıca, taşıyıcılar değiştirme harekete geçirilen uyuşturucu yayın (Yani, tümör sitesinde) sonuçlandı ama istikrar kan dolaşımını7,8yapılmaktadır. Araştırma ve klinik kullanım yaşında olmasına rağmen nanocarriers Dox-NP gibi intratumoral kaderi hala tam olarak belli değildir. Son bir yayında dox organellerin9' kapana kısılmış kalırken nanopartikül bir bütün olarak alınır gösterildi.
Hücresel bir nanopartikül ve uyuşturucu yayın alımını en iyi canlı hücre Imaging'i kullanma izlenebilir dinamik süreçler vardır. Ayrıca, hangi hücrelerin içinde klasik Histoloji inkübe ve fiksasyon liposomal taşıyıcı yok eder ve eserler tanıttı bundan sonra sabit, yanlış sonuçlar verebilir. Ana canlı hücre görüntüleme için görselleştirme, Floresan, tercihen tarafından istenen işlem gereklidir. Dox gibi bazı bileşikler içsel bir kırmızı Floresans var. Ayrıca, floresan işaretleri taşıyıcı tanıtıldı ve hücre organelleri canlı hücre işaretçileri kullanarak görüntülenir. Bu şekilde, taşıyıcı, uyuşturucu yayın ve taşıyıcı ve uyuşturucu, hücrede yerleşimi alımını gibi parametreleri bir dizi görüntüsü ve analiz. Burada, bir yöntem dox ve Dox-NP birkaç tümör hücrelerindeki hücreler arası kaderi gerçek zamanlı olarak izlenir açıklanmıştır. Ayrıca, bu yöntem (nano tanecikleri10ücretmesela ) hedef ve tetikleyen için ideal koşulları oluşturmak için kolayca adapte edilebilir (Örneğin, Hipertermi7) uyuşturucu serbest bırakmak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">DMEM (no phenol-red)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D1145</td>
			<td style="width:384px;">Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Trypsin-versene (EDTA)</td>
			<td style="width:263px;">Lonza</td>
			<td style="width:115px;">BE17-161E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Heat inactivate for 30 min at 55 &#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">L-Glutamin</td>
			<td style="width:263px;">Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G9391</td>
			<td>Make a 0,1% solution in PBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Stericup 0,22 &#181;m filter - 500 ml&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Millipore</td>
			<td style="width:115px;">SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Trypan-blue</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:252px;">Cells: Lewis lung carcimoma</td>
			<td style="width:263px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:252px;">Cells: B16BL6</td>
			<td style="width:263px;">Dr. P. Brouckaert, Ghent University</td>
			<td>donated</td>
			<td>Ref.10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:252px;">Cells: BLM and 1F6</td>
			<td style="width:263px;">Dr. van Muijen, University of Nijmegen</td>
			<td>donated</td>
			<td>Ref.11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Petri dish</td>
			<td style="width:263px;">Greiner</td>
			<td style="width:115px;">664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Doxorubicin</td>
			<td style="width:263px;">Actavis&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>mentioned as dox in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Doxil/Caelyx</td>
			<td style="width:263px;">Janssen-Cilag</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>mentioned as Dox-NP in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:263px;">VWR international</td>
			<td style="width:115px;">10462200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Lysotracker-green DND-26</td>
			<td style="width:263px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:115px;">L7526</td>
			<td>mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Lysotracker-red DND-99</td>
			<td style="width:263px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:115px;">L7528</td>
			<td>mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:252px;">Attofluor cell ring</td>
			<td style="width:263px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:115px;">A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:252px;">Cover glass 25 mm #1</td>
			<td style="width:263px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:115px;">CB00250RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Stage holder + sealing lid</td>
			<td style="width:263px;">Custom made</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZEISS LSM 510 microscope</td>
			<td style="width:263px;">Zeiss</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software LSM 510 version 3.2 SP2</td>
			<td style="width:263px;">Zeiss</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Image J</td>
			<td style="width:263px;">NIH</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vitro live-cell imaging to explore chemotherapeutics delivered by lipid-based nanoparticles

Konvansiyonel görüntüleme teknikleri hücresel süreçler hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Ancak, bu bilgiler üzerinde statik resimler yoksa dinamik bir sisteme dayanır ve art arda gelen aşamalarını kolayca gözden kaçan veya yanlış yorumlanabilir. Canlı hücre görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskobu içinde canlı hücreler için saatler ya da günler az ya da sürekli bir biçimde takip edilebilir, bu nedenle çok bilgilendirici. Burada açıklanan protokol ilaçlar nano tanecikleri kaderi araştırmaların ardından doksorubisin (dox) canlı hücrelerdeki teslimini sağlar. Dox onun nanocarrier biyolojik olarak aktif olmak için serbest bırakılması gereken intercalating bir ajandır. Fazla iki yıl için klinik kayıt rağmen alımı, arıza ve uyuşturucu yayın hala tam anlaşılır. Bu makalede lipid tabanlı nano tanecikleri tümör hücreleri tarafından alınır ve yavaş yavaş bozulmuş hipotezini araştırıyor. Yayımlanan dox sonra çekirdeğine translocated. Fiksasyon eserler önlemek için canlı hücre görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskobu, deneysel bu yordamda açıklanan uygulanabilir.

Liposomal taşıyıcıları farklı işaretleri ile etiketleme yukarıda açıklanan9oldu. Taşıyıcılar (yaptım; far-red dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine perklorat ile Etiketlenmiş Eski 644 = nm; Em 665 = nm) veya yeşil 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE; Eski 490 = nm; Em 515 = nm) bu el yazması sunulmaktadır. Hücreler arası benzerlikler ve farklar liposomal alımı, yayın ve hücre içi yerelleştirme göstermek için birçok tümör tipi incelenmiştir. Bu iki fare çizgi, B16BL6 Melanom11 ve Lewis akciğer Karsinomu (LLC) ve iki insan melanomlar, son derece metastatik (BLM) ve sigara-metastatik (1F6) Melanom12,13içerir. Tüm deneyler canlı hücreler kullanılarak yapıldı. Tüm deneylerde bir konsantrasyon 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP veya nano tanecikleri 0,05 µmol yönetilen için 3 veya 24 h. ölçülür ve ücretsiz, serbest, kapsüllenmiş, münzevi veya ara formu) (olarak analiz dox DXR anılacaktır. 40 X (sayısal Diyafram: 1.3) petrol objektif lens kullanıldı ve görüntüleme gerçekleştirilen bir 488 nm argon lazer (% 10/0.2 mW güç) ve 505-550 nm bant geçiren filtre ile CF-PE ve lizozomal marker (LM) için-yeşil. 543 nm helyum-neon lazer (% 100 / 0.2 mW güç) ve 560-615 nm bant geçiren Filtre dox, Dox-NP ve lizozomal marker-kırmızı için kullanıldı. 633 nm helyum-neon lazer (% 100/0,5 mW güç) ve 640 nm uzun geçiren Filtre kullanılan için yaptım.
Onun kapsülleme nedeniyle vitro sitotoksisite, bioavailability ve dox farmakokinetik önemli ölçüde değişmiş3,9,14idi. Ne zaman özgür ve kapsüllenmiş formunda yönetilen uyuşturucu bioavailability arasındaki farkı şekil 3' te gösterilmiştir. Dox intercalating bir ajandır ve sitotoksik olmak için hücre çekirdeği girmeniz gerekir. Şekil 3 ve ilgili filmler 1 ve 2 3 h dox veya Dox-NP ile aynı koşullarda tedavi BLM hücre zaman hata gösterir. Dakika içinde dox maruz kalma nükleer DXR (şekil 3A, film 1) görülebilir ve, daha düşük bir kullanarak (INSERT) kazanç, çekirdeğinde enterkalasyon görülebilir. Buna ek olarak, Dox-NP isteyeceksiniz maruz kaldığında, hücre içi DXR bu zaman çerçevesi içinde (şekil 3B, film 2) zor görünür. Sadece photomultiplier kazanç artırarak, DXR sitoplazmada görülebilmektedir (Ekle). ImageJ kullanarak, sitoplazmik ve nükleer DXR piksel yoğunluğu analiz edildi. Hücreleri hızlandırılmış değerlendirme sırasında hareket halinde olduğundan, floresan alan parlak görüntülerle birleştirmek önemlidir. Bu tek tek hücreleri izleme ve ImageJ içinde belirli eklentileri kullanarak XY-drift sabitleme imkanı sunar. Şekil 3' te sunulan analiz, alan parlak görüntü bir bölge sitoplazma (düz çizgi) ve çekirdek (noktalı çizgi) etrafında (ROI) ilgi çekmek için kullanıldı. ImageJ yatırım Getirisi Manager'da Çözümle menü öğesinde bulunabilir &#62; araçlar &#62; ROI Yöneticisi. Bu ROIs floresan görüntü piksel yoğunluğu Çözümle menü öğesini kullanarak çözümlemek için kullanılır &#62; ölçü birimi. Çekirdek (şekil 3 c) piksel yoğunluğu ve dox veya Dox-NP-tedavi edilen hücre sitoplazma (şekil 3D) arasındaki fark ne görüntüleri görülür onaylar. Ayrıca, hücreleri için dox veya Dox-NP, sonra bahçedeki orta yerine ve hemen photomultiplier kazanç (şekil 4) artan duyarlılığı ile görüntüsü ile 24 saat inkübe. Lazer güç, ofset, iğne deliği ve resim görüntüleme, gibi diğer ayarları aynıydı. Düşük DXR sinyal Dox-NP-tedavi dox tedavi ile karşılaştırıldığında hücrelerdeki dikkat çekicidir. Dox görüntüsünü zaten pozlanmış ise 700 bir kazanç kullanarak, DXR Dox-NP-tedavi hücrelerdeki görünür, hale gelir. Bu basit vitro deney bioavailability ücretsiz saklanmış uyuşturucu karşı önemli bir fark görüntüler.
Hücreler sürekli Dox-NP için 24 saat maruz kaldığında, DXR zamanla şekil 5A ve filmler 3 ve 4 gösterildiği gibi kurar. Sinyal içinde sitoplazma artırır ve daha sonra DXR Ayrıca çekirdeğinde ara bulunur. Bu gözlemler piksel yoğunluğu grafikler (şekil 5B) tarafından onaylanır. Hücre içi dağıtım farklılığı nedeniyle 1F6 hücrelere kıyasla BLM ölçülen sitoplazmik piksel yoğunluğu düşüktür. DXR 1F6 hücrelerde hücre dağıtılır ise BLM hücrelerdeki DXR daha çekirdeği (şekil 5C) yakın bir organel içinde yoğunlaşmıştır.
Bu nedenle, uyuşturucu ve farklı hücre hatları (şekil 6) taşıyıcıya lokalizasyonu araştırılmıştır. Hücreler için Dox-NP/yaptım ve görüntülü ile 24 saat inkübe. Alan parlak görüntü kullanarak, bir bindirme hücre zarı (düz çizgi) ve çekirdek (noktalı çizgi) üç farklı hücre satır floresan görüntü çizilmiştir. Burada taşıyıcı ile etiketli, aynı sitoplazmik desen DXR olarak izler gösterilmiştir: bir organel yakın BLM, çekirdeğinde LLC, tüm çekirdek çevresinde yoğunlaştı ve rasgele B16BL6 hücrelerin sitoplazma boyunca dağınık. Çekirdeğinde, tek DXR ve hayır görülebilir, gösteren dox yayımladı. Photomultiplier kazanç azaltarak, bireysel hücresel veziküller DXR ve taşıyıcı ile etiketli, içeren, yaptım yanı sıra CF-PE ile (rakamlar 6B ve 6 C), görülebilir.
Sitoplazmik DXR küçük veziküller içinde tüketiyor ve hücreleri bir canlı hücre lizozomal işaretleyicisinde yeşil ya da kırmızı etiketli. Bu organellerin hareketi hücrelerde (film 5) izlenebilir. Sitoplazmik DXR ve nanocarrier bu yapılar içinde colocalize ve hücreler arası fark DXR desen, şekil 6' da görüldüğü gibi burada açıklanmıştır. Organellerin rastgele B16BL6 içinde sitoplazma boyunca dağıtılır ve BLM hücreleri (şekil 7A) çekirdeğinde yanında yer alır. ImageJ kullanarak, colocalization lysosome taşıyıcıya arasındaki DXR hesaplanmıştır (şekil 7B). Renkli görüntüler ikili yapılmıştır (işlem &#62; ikili &#62; yapmak ikili) ve colocalization eklentisi kullanarak (Analiz &#62; Colocalization), colocalization görüntü DXR ile yapılmış yaptı. Bu her iki görüntülerin colocalized piksel temsil eden beyaz piksellerle yeşil-kırmızı-beyaz renkli görüntü oluşturur. Menü aracılığı ile işlem madde &#62; ikili &#62; ikili, yapmak beyaz piksel ayrılmış ve piksel yoğunluğu ölçülür siyah piksel olarak dönüştürülür (Analyze &#62; ölçü birimi). Bundan sonra bir colocalization görüntüsü arasında bu DXR was-den yapılmış-resim ve ikili resim lizozomal marker (LM) ve piksel yoğunluğu ölçülür. Colocalization veri piksel DXR için olumlu yüzdesidir-yaptım ve DXR-mi/lizozomal marker (şekil 7C). CF-PE ile de etiketli taşıyıcı, yaptığı gibi lysosome içinde yer aldığını da Şekil 7 diçinde görüntülenir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig1.jpg"> 
Şekil 1: Kur donatım ve aygıtlar. A) görüntüleme odası + ihtiyaçlar. 25 mm #1 cam (1), alt kısmı Odası (2), top Odası (yer parçasıaşağı ters d) ve O-ring (3), sahne alanı sahibi (4) ve mühürleme kapak (5). Ölçek çubuğu: 2 cm. B) kuluçka birimi. Isıtmalı mikroskop sahne (1), akış sahne ile içinde - ve çıkış - flow CO2 (2), bir CO2 sonda (3) ve bir kapanış yama (4). Ölçek çubuğu: 2 cm. C) mikroskop altında görülen odası kuluçka birimi görüntüleme. D) çok zaman serisi makro. E) görüntüleme için ekipman. O2 Vana ters mikroskop (1), Floresan ışık (2), bilgisayar (3), yüzük ısıtıcı (4, INSERT) ve denetleyicisi (4, ana şekil), CO2 akışı boru (5), CO2 Vana (6), CO2 denetleyicisi (7), CO2 nemlendirici (8), ve denetleyicisi (9) ve sahne sıcaklık denetleyicisi (10). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/55405fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig2.jpg"> 
Resim 2: Bölüm 3 iletişim kuralında ayrıntılı mikroskop parametrelerinin şematik. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/55405fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig3.jpg"> 
Şekil 3: dox ve Dox-NP kısa vadeli alımını araştırıyor.  BLM hücreleri sürekli maruz dox veya Dox-NP 3 h ve hızlandırılmış bir alınmıştır. (A)hala resimleri hızlandırılmış dox ile inkübe hücre. (B) hala resimlerini hızlandırılmış hücre Dox-NP ile inkübe. Ölçek çubuğu 50 µm. (C) piksel yoğunluğu artış dox-Dox-NP-tedavi ve hücrelerdeki nükleer DXR =. (D) piksel yoğunluğu artış dox ve Dox-NP-tedavi edilen hücrelerde sitoplazmik DXR. Verileri 3 hücre başına ortalama ± SD temsil eder. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/55405fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig4.jpg"> 
Şekil 4: dox ve Dox-NP uzun vadeli alımını farklı hücre hatlarında soruşturma. Hücreleri dox veya Dox-NP maruz kaldılar ve 24 saat sonra görüntüsü. Görüntüleri 3 farklı kazançlar ile uyuşturucu çıkarıldıktan hemen sonra alındı. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/55405fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig5.jpg"> 
Şekil 5: hücresel alımı ve yayın liposomal ajanların soruşturma. Hücreler sürekli olarak 24 saat Dox-NP isteyeceksiniz maruz bırakıldı ve bir zaman hata yapıldı. (A)hala resimleri hızlandırılmış. Ölçek çubuğu 50 µm. (B) piksel yoğunluğu artış DXR çekirdeği ve sitoplazma =. Verileri 3 hücre başına ortalama ± SD temsil eder. (C) görüntüleri DXR yerelleştirme hücre içinde gösteren. Düz çizgi: hücre zarı, noktalı çizgi: çekirdek. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/55405fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig6.jpg"> 
Şekil 6: uyuşturucu ve taşıyıcı farklı hücre hatlarında lokalizasyonu soruşturma. (A)hücreleri Dox-NP/mi 24 h için maruz ve görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) hücreleri Dox-NP/mi/CF-PE için 24 saat maruz ve bireysel veziküller ayırt etmek için daha düşük bir yoğunluk kazanç ile görüntüsü. (C) parlak-alan ve DXR DXR sitoplazmik veziküller (ok) gösterilen yerleşimi. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/55405fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55405/55405fig7.jpg"> 
Şekil 7: hücre içi yerelleştirme ilaç ve taşıyıcı soruşturma. Hücreleri Dox-NP/mi CF-PE/24 h için sinin ve organellerin yeşil ya da kırmızı canlı hücre lizozomal işaretçisi (LM) kullanarak görüntülenir. (A)hücre içi yerelleştirme DXR ve taşıyıcı (yaptım). Okları DXR 3 örnekleri temsil ve lysosome yerelleştirilmiş yaptı. Ölçek çubuğu = 50 µm. (B) Co yerelleştirme analizini DXR ve ImageJ kullanarak organellerin (LM) taşıyıcıya (yaptım). (C) Co DXR lokalizasyonu ve organellerin taşıyıcıya yüzdesi. Verileri 3 bireysel deneyler ortalama ± SEM temsil eder. (D) taşıyıcı lizozomal iyon iki farklı işaretçileri kullanarak görüntülenir. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/55405fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov1.jpg"> 
Film 1: ile ilgili Şekil 3 : BLM hücreleri dox için 3 h. ile inkübe Hızlandırılmış: 10 dk. kare hızı aralığı 19 resim: saniyede 3 kare. Ölçek çubuğu 50 µm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/Movie_1_BLM_Doxorubicin_for_3h.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov2.jpg"> 
Film 2: ile ilgili Şekil 3 : BLM hücreleri Dox-NP için 3 h. ile inkübe Hızlandırılmış: 10 dk. kare hızı aralığı 19 resim: saniyede 3 kare. Ölçek çubuğu 50 µm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/Movie_2_BLM_Doxil_for_3h.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov3v3.jpg"> 
Film 3: ile ilgili Şekil 5 : BLM hücreleri Dox-NP için 24 h ile inkübe Hızlandırılmış: 96 görüntülerle, 15 dk. kare hızı aralığı: 8 fps. Ölçek çubuğu 50 µm =.<a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a href=""></a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/Movie_3,_BLM_Doxil_for_24h_correct2.a>VI"hedef ="_blank"> Bu videoyu izlemek için buraya tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov4.jpg"> 
Film 4: ile ilgili Şekil 5 : 1F6 hücreleri için 24 h Dox-NP ile inkübe Hızlandırılmış: 96 görüntülerle, 15 dk. kare hızı aralığı: 8 fps. Ölçek çubuğu 50 µm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/Movie_4_1F6_Doxil_for_24h.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 5" src="/files/ftp_upload/55405/55405mov5.jpg"> 
Film 5: ile ilgili Şekil 7 : B16BL6 organellerin hücre bir canlı hücre marker ile lekeli. Hızlandırılmış: 10 aralığının 10 resim s. kare hızı: saniyede 3 kare. Ölçek çubuğu 50 µm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55405/Movie_5_B16BL6_lysotracker.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için =. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles at JoVE.com

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Canlı hücre görüntüleme dinamik süreçler görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Sabit hücrelerin incelenmesi yanlış yorumlama ve süreci hakkında kafa karışıklığı yol açabilir yalnızca statik resimler sağlar. Bu eser alımı, uyuşturucu yayın ve hücre içi canlı hücrelerdeki liposomal nano tanecikleri yerelleştirilmesini çalışmak için bir yöntem sunar.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

using-vitro-live-cell-imaging-to-explore-chemotherapeutics-delivered

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

8.3K Görüntüleme.  Erasmus MC. Canlı hücre görüntüleme dinamik süreçler görselleştirmek için güçlü bir araçtır. Sabit hücrelerin incelenmesi yanlış yorumlama ve süreci hakkında kafa karışıklığı yol açabilir yalnızca statik resimler sağlar. Bu eser alımı, uyuşturucu yayın ve hücre içi canlı hücrelerdeki liposomal nano tanecikleri yerelleştirilmesini çalışmak için bir yöntem sunar.

Video: Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Tıp

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

Pre-klinik araştırma Farmakolojik-meydan fMRI Kullanımı: 5-HT Sistemi Uygulaması

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and bronchodilator drugs. Despite the availability of multiple treatments, both diseases are growing public health concerns. The majority of asthma patients are well controlled on current inhaled therapies but a substantial number of patients with severe asthma are not. Asthma affects an estimated 300 million people worldwide and approximately 20 percent have a severe form of the disease. In contrast to asthma, there are few effective therapies for COPD. An estimated 10% of the population has COPD and the trend in death rates is increasing for COPD while decreasing for other major diseases. Although developing drugs for inhaled delivery is challenging, the nose-only inhalation unit enables direct delivery of novel drugs to the lung of rodents for pre-clinical efficacy and safety/toxicology studies. Inhaled drug delivery has multiple advantages for respiratory diseases, where high concentration in the lung improves efficacy and minimizes systemic side effects. Inhaled corticosteroids and bronchodilators benefit from these advantages and inhaled delivery may also hold potential for future biologic therapies. The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs of rodents, key data required before initiating clinical development.

The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs; key data enabling clinical inhaled drug development.

Kuru Toz ve Eczacılık Nebulize Aerosol Soluma bir Burun sadece Pozlama Sistemi Kullanarak Fare teslim

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Demans çalışması için retina Imaging'i kullanma

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Quantification of Levator Ani Hiatus Enlargement by Magnetic Resonance Imaging in Males and Females with Pelvic Organ Prolapse

Here we present a protocol to examine the levator ani hiatus in males and females with pelvic organ prolapse, during the Valsalva maneuver and while evacuating acoustic gel, using a horizontally oriented 1.5 T magnetic resonance (MR) scanner. On midsagittal images, the vertical distance of pelvic organs is measured in millimeters relative to the hymen plane (female) and to the lower border of the symphysis pubis (male), preceded by - (above) or + ( below) signs. On axial images, the levator ani area is calculated in square centimeters with a free-hand tracing method from three key images, passing through the midsymphysis (level I), tangential to the lower border of the symphysis (level II), and at the maximal anterior rectal wall bulging (level III). Areas at rest and strained are compared to find evidence of a percentage of increase. The purpose is to provide objective evidence of the maximal extent of pelvic organs descent and hiatus enlargement without the interference of foreign objects or the examiner&#39;s proximity, so as to overcome the limitations of pelvic examination and transperineal sonography (i.e., subjectivity and sex-related limitations [female only]).

Here we present a protocol to standardize the measurement of the levator ani hiatus size&#160;by magnetic resonance imaging. The purpose is to extract biomechanical inferences from image analysis by comparing resting and straining values in patients of both sexes with pelvic prolapse, using consistent anatomical bony landmarks.

Miktar Levator Ani aradan genişleme tarafından kadın ve erkek pelvik Organ prolapsusu ile manyetik rezonans görüntüleme

Here we present a protocol to examine the levator ani hiatus in males and females with pelvic organ prolapse, during the Valsalva maneuver and while ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...