This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Hücre İnsan Beyin mikrovasküler endotel hücreleri Kültürü (HBMEC) <ol><li> hücre kültürü şişelerinde kaplanması <ol><li> Fibronektin, bir çözelti hazırlamak bir 15 mL santrifüj tüpüne 10 ml PBS ekleyin. 150 ul fibronektin ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> alt kapak için bir T-25 hücre kültür şişesi fibronektin çözeltisi 2 ml. kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de en az 3 saat boyunca hücre kültür şişesi inkübe edin. Fibronektin kaplanmış şişeler 37 ° C /% 5 CO2 ile 2 hafta boyunca depolanabilir. </li></ol></li><li> Tohumlama ve HBMEC hücre kültürü <ol><li> Hücre kültür şişesi altından aspire fibronektin çözeltisi. 6 ml ECM-b ortamda süspansiyon haline getirilmiş 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² ekle (= ECM-b,% 5 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ile takviye edilmiştir). 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin. Bir mikroskop kullanılarak günlük hücre büyümesini kontrol edin. </li><li> 3 günde ortamı değiştirin.Hasat veya HBMEC yaklaşık% 80 konfluansa ulaşmalarına bölünmüş hücreleri. HBMEC fizyolojik özellikleri kaybını önlemek için geçit 1 ile 15 arasında kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> Hasat HBMEC. <ol><li> 1 oranında PBS ile Accutase (1x) ile muamele Accutase çözelti hazırlayın: 1 arasındadır. sonraki kullanıma kadar bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de Accutase çözüm tutun. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre kültür şişesi ECM-b ortamı aktarın. Hücre kültür şişesinin dibinde 5 ml PBS ilave edilerek HBMEC yıkayın. PBS aspire ve yıkama adım iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 2 mL Accutase önceden ısıtılmış solüsyonu ekleyin. 2 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Sonrasında HBMEC sıkıca hücre kültürü şişesi birkaç kez dokunarak yeniden askıya alınır. Hücre kopması, bir mikroskop kullanılarak kontrol edilir </li><li> Daha önce, bir 15 ml tüp içinde saklanan ECM-b-orta kısa HBMEC ayırmak için başlangıç ​​olarak geri hücre kültür şişesi içine ilave edilir. En HBMEC kadar tekrar tekrar şişenin alt durulayınyeniden süspansiyon haline getirilmiştir. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 mL ECM-b ortamda hücrelerin yeniden askıya. Hücre sayımı ve ml ECM-b ortamı başına 3 x 10 5 HBMEC bir son konsantrasyon elde etmek için bir hücre süspansiyonu seyreltin. </li></ol></li></ol> Hücre Kültürü ekler 2. hazırlanması <ol><li> hücre kültürü ekler kaplanması Önemli not: hücre kültürü ekler zarını dokunmaktan kaçının. <ol><li> Her bir hücre kültürü eki 100 uL fibronektin çözeltisi (1.1.1 bakınız) (Şekil 1A) ve bir 96-gözlü düz tabanlı plakanın bir kuyu (optik kontrol çukur) ekleyin. 37 ° C&#39;de en az 3 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon aspirat fibronektin çözeltisi sonra. </li><li> 100 uL HBMEC hücre kültürü ekler süspansiyonun ve iyi optik kontrol ekleyin. Hücrenin alt bölmeye 600 ul ECM-b orta ekleyinkültür ekleri. , 37 ° C / 5 bariyer bütünlüğünü (Şekil 1B) kadar% CO2 ulaşıldığında 4 gün de optik kontrol HBMEC mikroskopik değerlendirme hücre büyümesini kontrol - 3 inkübe edin. Not: Dört gün ötesinde Hücre büyümesi önerilmez. </li><li> İsteğe bağlı: enflamatuvar koşulları taklit etmek için alt bölmeden orta aspire ve 24 saat göç deneyi öncesinde 500 U / ml IFN-γ / TNF-a ile takviye ECM-b ortamı ile değiştirin. </li></ol></li></ol> Hicret Testinin gününde Evans Blue ile 3. Kalite Kontrolü <ol><li> Evans mavisi çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 15 ml santrifüj tüpü kullanılarak 200 ul B27 eki ile, PBS / B27 çözeltisi karışımı 10 ml PBS hazırlamak. Evans mavi stok çözeltisi ile seyreltilir (20 mg / ml PBS) 1: PBS / B27 1.000. </li></ol></li><li> Evans mavisi geçirgenlik deneyi <ol><li> Üst bölme, ardından alt bölmeden orta aspirekonfluent tek tabaka HBMEC ihtiva eden bir hücre kültürü ucun. hücre kültürü eki 100 mcL Evans mavisi solüsyonu ekleyin. </li><li> Alt bölmeye 600 uL PBS / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 &#39;de 60 dakika boyunca inkübe edin. Dikkatle forseps kullanarak hücre kültürü eki çıkarın. </li></ol></li><li> Evans mavisi ölçüm <ol><li> alt bölme PBS / B27 çıkarın ve siyah bir polistirol 96-gözlü düz dipli levhanın iki oyuklarına 100 uL her aktarın. bir Tecan Sonsuz M200 Pro plaka okuyucuda plaka yerleştirin ve optimal z konumunu belirler. </li><li> (Örneğin: eksitasyon: 620 nm, emisyon: 680 nm, bant genişliği eksitasyon: 9 nm, emisyon bant genişliği: 20 nm, 175x geliştirme, 25 yanıp söner, entegrasyon süresi: 20 us) Evans mavisi kullanılarak ilgili ayarlar Ölçü uyarım. </li><li> HBMEC bariyer fonksiyonu tohum sonra farklı zaman noktalarında HBMEC boyunca Evans mavi geçirgenliğini tasvir eden bir standart eğriye elde edilen veriler karşılaştırma belirlemek içining hücreler (sağ Şekil 1B). </li></ol></li></ol> 4. Yer değiştirme tahlili <ol><li> periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) hazırlanması. <ol><li> 15 ml lik santrifüj tüpüne 10 ml RPMI ekleyin ve 200 uL B27 ek ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de PBMC ve santrifüj hücreleri sayın. 5 x 10 6 hücre / ml RPMI / B27 bir nihai konsantrasyona kadar PBMC yeniden askıya. </li></ol></li><li> göç deneyi kunnak <ol><li> Konfluent HBMEC mono tabakalar (Şekil 1A) ihtiva eden hücre kültürü eklerin üst bölme ve ardından alt bölmeden orta aspire. Donör başına başına 24 oyuklu plakanın bir oyuk (in vitro kontrol), hücre kültürü ekler 100 uL PBMC süspansiyonu, her ekleme ve. </li><li> In vitro kontrol ait PBMC hücre kültürü ekler ve 500 uL alt bölmeye 600 uL RPMI / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 de 6 saat inkübe edilir. </li&gt; </ol></li><li> Taşınan PBMC&#39;nin Hasat <ol><li> forseps kullanılarak hücre kültürü eki çıkarın ve dikkatli bir şekilde membran dokunmadan 400 uL PBS ile alt yıkayın. Hücre kültürü eki atın. </li><li> 20 uL akış sayısı flüoro ekleme hücre kültürünün alt bölüme (yaklaşık 1.000 boncuk / uL) in vitro kontrol için hem de eklemek ve iyice karıştırın. borular akış sitometrisi PBMC süspansiyonun devri 1 ml. </li></ol></li></ol> 5. Akış Sitometri <ol><li> örnek hazırlama <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin PBMC. </li><li> 100 ul florokrom-eşlenik antikorlar ekleyerek antikor çözeltisi hazırlayın numune başına (PBS /% 1 BSA / 2 mM EDTA) içinde tampon akış sitometrisi. 1 uL CD4-FITC aşağıdaki sonuçları elde etmek için, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5 @, 1 uL, CD56-PY7, 1 uL CD8-A700 ve 1 uL CD16-A750 numune başına kullanılmıştır. </li><li> PB Re-askıyaAntikor çözeltisinin 100 uL MC ve 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 250 uL, 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de tampon ve santrifüj akış sitometrisi ekleyin. </li></ol></li><li> Numune toplama <ol><li> gereken miktarda PBMC askıya yeniden akış sitometrisi tampon maddesiyle (kullanılan akış sitometresi bağlı olarak değişir). </li><li> akış sayısı flüoro tespit etmek için 525 ile 700 nm dalga boyunda arasında aktif detektörü ile akış sitometresiyle lekeli PBMC Edinme (eksitasyon 488 nm, emisyon 525-700 nm). (Aşağıdaki adımlar Kaluza G yazılımı ile çalışan sitometresi Gallios akış kullanıldığında bir örnektir. (1) başlatın işletim sistem tamamen dolu olduğu zaman (2), renkli &quot;sitometresinde&quot; tuşuna basarak akış sitometresi başlangıç . (3) &quot;açık protokol&quot; düğmesine basarak ilgili edinim protokolünü yükleyin. (4) gerekli protokolü seçin ve &quot;açık&quot; seçeneğini seçin. (5) sağ ile tıklayarak her numune için protokol çoğaltınSanal atlıkarınca ve &quot;yinelenen&quot; sahada sol klik görünür protokolüne fare düğmesi. (6) örnek bir liste her bir örnek olarak etiketleyin. (7) döner piramit belirtilen pozisyonlarında örnekleri aktarın ve satın alma başlar.) </li></ol></li><li> Numune analizi <ol><li> İlgili yazılım kullanarak veri sitometrisi Açık çıkan akışı. In vitro kontrol gözlerinden elde transmigrant PBMC ilgi olarak hücre alt popülasyonlarının sayısını belirler ve ilgili analiz yazılımı kullanılarak sayım flüoro akar. (Yolluk stratejinin bir örneği (Şekil sonuç bölümünde 1 C verilmiştir: İleri saçılma kanalı (FSC) grafiği yana doğru bir dağılım kanalı (SSC) içerisinde lenfositleri seçmek için, ilk, NK-hücre alt setlerinin bir transmigrasyonu, analiz etmek lenfositlerdir. daha sonra bir CD56 grafiği CD3 ve CD56 +, CD3 görüntülenen -. NK hücreleri seçilmektedir NK-hücre alt kümeleri arasında ayrım yapmak için, NK hücreleri de gösterildiBir CD56 CD16 karşı grafiğidir ve CD56 parlak CD16 / dim - hem de CD56 loş CD16 + NK hücreleri seçilmektedir. Buna ek olarak, akış sayısı florosferler bunların sayısını belirlemek için zamana karşı 525 ila 700 nm arasında bir emisyon ile bir kanalın bir arsa görüntülenen daha sonra FSC SSC karşı grafiğinden seçilir ve.) </li><li> Her numunenin toplam hücre sayısını hesaplamak için, akış sayısı flüoro kullanarak hücrelerin tespit sayısını normalize: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Toplam geçen hücre ve in vitro kontrol toplam hücrelerin arasındaki oran olarak yayılan hücrelerin yüzdesini belirlemek. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Burada insan kan-beyin bariyeri üzerinden lenfositlerin tenasüh araştırmak için bir teknik sunar. CNS&#39;ye lenfosit göçü in vitro analizleri, lenfosit ekstravazasyonu, potansiyel hastalıkla ilgili değişiklikler ve yeni terapötik yaklaşımlar temel işlemlerini incelemek için önemlidir. Kan-beyin bariyeri modelinin çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Örneğin, üst bölmeden hücreleri göç-hücre populasyonunun bileşimini incelemek için analiz edilebilir. Bundan başka, 24 saat önce deney, IFN-y ve TNF-a ile HBMEC tek tabaka tedavi enflamatuar CNS bozuklukları 21, 25 etkisini incelemek amacıyla, iltihaplı kan-beyin engelini taklit etmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, diğer maddeler ile HBMEC veya lenfositler tedavisi lenfosit ekstravazasyonunun üzerindeki etkisini inceleyen sağlar (örneğin onlarınadezyon molekülleri üzerinde etki) 30, 31. Bazı yapışma moleküllerine katılımı entergnler ya da ligandları 32 bloke edici antikorların kullanıldığı incelenebilir. Bundan başka, burada sunulan deney düzeneği kemokinlerin veya astrosit veya başka hücrelerden 33, 34 türetilmiş süpernatanlarından kemotaktik etkileri analizine izin verir. Primer insan beyin türevi epitel hücreleri ile HBMEC değiştirilmesi, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyeri 15 araştırılması için, bu deney düzeneği spektrumunu genişletmektedir. HBMEC modelinin merkezi sinir sistemi spesifikliğini muhafaza etmek için diğer organlar elde ölümsüzleştirilmiş endotel hücreleri ya da hücreleri ile değiştirilmesi gerekir. Ancak, başka türlerin beyin türevli endotel hücreler, ilgili hayvan 35 transmigrasyonun analiz etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, retinoik asit veya hidrolizocortisone bariyer fonksiyonlarını geliştirmek için tarif edilmiştir ve bu yüzden, 37 36 bir şekilde kullanılabilecektir. Bizim modeli PBMC (veriler gösterilmemiştir) 6 ila 10 x 5 x 10 2 ile 1 arasında doğrusal geri kazanım oranlarını sağlar, çünkü sınırlı hücre sayıları halinde analize tabi hücre miktarı, azaltılabilir. göçüne aşağıdaki nadir hücre popülasyonlarının analiz etmek için akış sitometrisi için gerekli olan yeterli hücreleri elde etmek için birkaç kuyulardan havuz hücreleri için gerekli olabilir. Son olarak, deney düzeneği de CNS 38 içine ilaç verilmesini incelemek için kullanılabilir. 0.4 um arasında bir gözenek boyutuna lenfosit transmigrasyonun önler, ancak ilaç teslim 39, 40, 41, 42 çalışma sağlar, oysa 3 um arasında bir gözenek boyutu tipik haliyle, lenfosit transmigrasyonun izin vermek için kullanılır. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada anlatılan deney düzeneği çeşitli uygulamalar rağmen, pek çok noktalar anlamlı sonuçlar sağlamak için akılda tutulması gerekmektedir. gözenekli membran hem de HBMEC tek tabaka bütünlüğü kritiktir. Böylece, pipet uçları ile örneğin membranın fiziksel zarardan kaçınmak zorunludur. Hücre kültürü ekin üst kısmına sıvı veya hücre süspansiyonu ilave doğrudan temas olmadan gerçekleştirilmelidir. Damlacıklar hücre kültürü eki sınırında sildi olabilir. pipet ucu yatay olarak yerleştirilmesi, ablüminal zar geçiş testin sonunda çalkalanır zarın korunmasını sağlar. Kemirgen deneylerde 43, kan-beyin bariyeri güvenilirliğinin değerlendirilmesi için gösterildiği gibi HBMEC tek tabaka kalitesi izdiham mikroskopik değerlendirme gibi Evans mavisi nüfuz ile analiz edilebilir. Düşük g kuvvetleri ve erken pasajlar kullanımlarda HBMEC santrifüjlenmesi (yani </em&gt; 1-15) tek tabaka kalite ve uyum sağlar. Gözenekli membrandan çözünmesini önlemek için, HBMEC tek tabaka ile çalışırken, aspirasyon ve ortamın eklenmesi tarif amacıyla uyması önemlidir. Burada anlatılan protokole uyulması anlamlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlasa da, bu tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Her şeyden önce, in vivo olarak kan-beyin bariyeri, çeşitli yollarla etkileşim ve sıkı birleşme 1 oluşumunu etkileyen bariyer fonksiyonunu güçlendirmek hücreleri, bir dizi ile oluşturulur. Bu kan-beyin bariyeri modeli, in vivo durumu iyi bir yaklaşım olmasına rağmen Dolayısıyla, önemli yönleri eksik. Ek olarak, kan-beyin bariyeri boyunca merkezi sinir sistemi içine lenfosit ekstravazasyon çok aşamalı bir süreçtir. Her bir adım ayrı ayrı araştırılmalıdır mümkün olmakla birlikte, burada sunulan teknik kim hakkında bilgi sağlamazkesme kuvvetleri 2, 44, 45, 46 etkisi altında ekstravazasyon le proses. hücrelerin genellikle sadece tek haneli frekansları transmigrate Son olarak, bu PBMC&#39;den geçen hücre analizi, ilgilenilen hücrelerden sıklığına bağlı olarak zor olabilir. Bu nedenle, daha önceki çok sayıda hücre kültürü ekler arasında geçen hücre deneyi ya da havuzu ilgi popülasyonlarının ayrılması gerekli olabilir. CNS içine lökosit göç analizi için diğer modeller bizim modelinde eksik yönlerinin bazı kapsar. Astrositler, perisitler ve / veya nöronlarla Co-kültür, kan-beyin bariyerinin 47 daha karmaşıklığı taklit etmek için kullanılır. Örneğin DIV BBB kesme kuvvetleri dahil modelleri lenfosit diyapedezin 48 daha sofistike bir analiz sağlayarak, bu nedenle, daha fazla fizyolojik kondisyon göstermektedir. </p&gt; Özet olarak, insan kan-beyin bariyeri boyunca nitel ve nicel lenfosit diyapedezin araştırılması için uygun kolay ulaşılabilir bir teknik sunar.

dokulara kan lenfosit göçü immün gözetim için çok önemlidir. Özel molekül etkileşimleri sonunda bir dizi ince bağırsak, deri, lenf düğümleri, merkezi sinir sistemi (CNS) ve diğer dokular 1 içine alana özgü ekstravazasyonu sağlamaktadır. Lenfosit göçü değişiklikler yaygın hastalıklar 2 bir dizi patofizyolojisinde rol oynamaktadır. Immün öncelikli CNS&#39;ye Geçiş sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve buna göre bu işlemin değişiklikler ensefalomiyelit 3, neuromyelitis optica, inme ve multipl skleroz (MS) 2, 4, 5, 6, 7 gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar dahil olmaktadır. Nedenle, daha iyi hastalık patofizyolojisinin ve araçları geliştirmeye lenfosit ekstravazasyondan incelemek için önemlidir<html> hastalık yükü 8, 9, 10, 11, 12 ıslah. Lenfositler farklı yollardan CNS içine göç ederler. Kan-beyin bariyeri koroid pleksus içinde ve boyunca, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyer subaraknoid boşluk içine postkapiler venüllerde yoluyla damar dışına 1, 13, 14, 15 tarif edilmiştir. Kan-beyin bariyeri boyunca geçiş endotel hücreleri 14 lenfositlerin etkileşimi ile yürütülür. periferde endotelyal hücrelere aksine, merkezi sinir sisteminin endotel hücreleri, böylece sıkı bir kan-beyin bariyerini geçme kabiliyetine sahip olan hücreleri ve protein miktarının sınırlandırılması, sıkı bağlantı moleküllerinin yüksek miktarda ekspreselass = &quot;xref&quot;&gt; 16. sıkı bağlantıları gevşemesine iltihabı sonuçları ve yapışma moleküllerinin ifadesini indükler; Bu şekilde, merkezi sinir sistemi 1, 17, 18 içine lenfosit göçünü artar. Kan-beyin bariyeri üzerinden damar dışına çok aşamalı bir süreçtir. Endotel hücreleri için ipi lenfositler ve daha sonra esas olarak selektinler 1, 15 kaynaklı bir işlemde endotel boyunca rulo. Daha sonra, lenfositler üzerinde ifade edilen endotel tarafından salgılanan kemokinlerin ve ilgili kemokin reseptörlerinin arasındaki etkileşimler endotel hücreleri 1 yapışmasını teşvik integrinlerin uyumsal değişiklikleri başlatır. Son olarak, perivasküler boşluğa transmigrating önce kan akışına karşı endotelyal engeli boyunca her iki taramayı lenfositler ya da hemen ve doğrudan doğruya şanzıman durakfirması yapışma 1, 19, 20 bölgesinde igrate. Lenfosit ekstravazasyon Tüm bu olaylar farklı teknikler 21 kullanılarak in vitro analiz edilebilir. Zaman atlamalı video mikroskopi başlangıç tethering&#39;i ve 15 haddeleme incelemek için kullanılır. Adezyon tahliller engelleri 22 endotel firma tutuklama ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar. Burada gösterildiği gibi transmigrasyon tahlilleri, bağışıklık-hücre göçüne 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 analizini sağlar. In vitro kan beyin bariyeri modelinde insan kullanarak, daha yüksek bir MIGR olduğunu göstermektedir geçenlerde olabilirCD56 parlak CD16 arasında atory kapasitesi / dim - NK hücrelerini CD16 + muadilleri intratekal bölme 21 bu NK hücresi alt-kümesinin bir ağırlığı tarafından yansıyan dim bunların CD56 ile karşılaştırıldığında. Böylece, bizim deney düzeneği in vitro durumu taklit etmek uygun görünmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>without CaCl2 or MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin 1mg/mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 cell culture flask</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBMEC</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pelobiotech</td>
			<td>PB-H-6023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM-b</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth supplement</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>clear, 6.5mm diameter, 3.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50x concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200Pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black flat bottom plate</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>675086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Count Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7547053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios 10-color flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza 1.5a</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300430</td>
			<td>clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-PC7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A21692</td>
			<td>clone N901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16-A750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66330</td>
			<td>clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300506</td>
			<td>clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-A700</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66332</td>
			<td>clone B9.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içine Lenfosit ekstravazasyon immün gözetim için kritiktir. lenfosit ekstravazasyon hastalığa ilgili değişiklikler CNS&#39;de patofizyolojik değişikliklere neden olabilir. Böylece, CNS içine lenfosit göç soruşturma inflamatuar CNS hastalıkları anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek önemlidir. Burada lenfosit ekstravazasyonu çalışma insan kan-beyin engelinin bir in vitro model sunmaktadır. İnsan beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (HBMEC) confluently, kan-beyin bariyerinin endotelyumu taklit etmek için eklemek Transwell gözenekli polietilen tereftalat yetiştirilmektedir. Bariyer fonksiyonu zonula occludens immünohistokimya, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri olarak Evans mavisi nüfuz analizi ile doğrulanır. NK hücrelerini - Bu model, / dim CD56 parlak CD16 gibi nadir lenfosit alt grupları diyapedezin soruşturma sağlar. Furthermcevher, diğer hücrelerin, sitokinler ve kemokinlerin, hastalıkla ilişkili değişiklikler ve lenfosit göç kapasitesine belirgin bir tedavi yönteminin etkinliği incelenebilir. Son olarak, endotel bariyere üzerinde iltihabı etkiler etkisi yanı sıra, farklı tedavi rejimleri analiz edilebilir.

NK-hücresi ve insan kan-beyin bariyeri modeli (Şekil 1A) kullanılarak T-hücresi alt kümelerinin bir transmigrasyonu, Örnek teşkil eden sonuçlar gösterilmektedir. HBMEC tek tabaka bütünlüğü sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçülmesi, ve Evans mavisi geçirgenlik (Şekil 1B) lekelenmesi ile doğrulandı. 3 sonra - 4 gün kültür HBMEC sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1 (sol Şekil 1B,) olarak ifade edilmiştir. Bundan başka, HBMEC (sağ, Şekil 1B) Evans mavisi için transendotelyal elektrik direnci (Şekil 1B, orta) ve aynı zamanda düşük nüfuz sergileyen tek tabaka içinde büyüdü. Ve CD56, CD4 + ve CD8 + T iki ex hücreler de dahil olmak üzere CD16 + NK-hücre alt ve T hücrelerini loş - HBMEC mono tabakalar CD56 parlak CD16 / dim içeren NK hücrelerinin bir transmigrasyonu yapısını incelemek için kullanılmıştıramples (sırasıyla Şekil 1D + E). Göç eden hücre yüzdesi, bir iç kontrol (Şekil 1C) olarak akış sitometrisi ve normalize kullanılarak akış sayısı flüorosfer ile elde edilen hücre sayısı üzerinden hesaplanmıştır. HBMEC tek tabaka enflamatuvar koşulları taklit etmek üzere tahlilde önce IFN-y ve TNF-α, 24 saat ile uyarılmıştır. Sitokin uyarılması analiz edilen tüm lenfosit popülasyonu artan göç ile sonuçlanmıştır. Bu, ICAM-1 de dahil olmak üzere yapışma moleküllerinin ifadesindeki artışa olabilir (veriler gösterilmemiştir). CD56 parlak CD16 / dim - kendi CD56 ile kıyaslandığında, NK hücreleri, daha yüksek bir göç kapasitesi sergilemiştir uyarılmış hem de uyanlmamış (10.88 ve% 0.86%) ve IFN-γγ / TNF-a arasında CD16 + NK dim (18.22 ve% 2.94%) HBMEC (Şekil 1D). Bununla birlikte, iltihaplanma sonucu göçü nispi artış + CD16 dim CD56 için daha yüksekti </syukarı&gt; NK-hücre alt kümeleridir (CD56 parlak CD16 + için 342 ve% + 167% / dim -). Bu sonuçlar, CD56 parlak CD16 / dim in vivo gözlemler taklit - NK hücreleri intratekal bölmesine zenginleştirilmiştir. Bu nedenle, kan-beyin bariyeri modeli CNS 21 içine nadir lenfosit popülasyonu bağışıklık hücresi diyapedezin temel ilkelerini analiz için uygun olacak gibi görünüyor. Son olarak, CD4 ve CD8 T hücresi alt kümelerinin transmigratory kapasitesi (Şekil 1 E) gösterilmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55390/55390fig1.jpg" /> Şekil 1: Enflamasyon olmayan ve iltihaplı HBMEC mono-tabakalar üzerinde, NK-hücre alt Diferansiyel Göç. C. Transwell ekler (sol) ve deneysel düzenek (sağ) gösterim resmi. HBMEC baryer fonksiyonları B. Doğrulama. Sol: sıkı bağlantı mol immünohistokimyasal boyamaecule ZO-1 tavşan anti-insan ZO-1 (Abcam, 1: 200) kullanılarak: 3 gün boyunca yetiştirilen HBMEC üzerinde anti-tavşan IgG-Cy3 (300 1) ve keçi. Centre: 2. günde ve yetiştirme 4 gün arasında HBMEC transendotelyal elektrik direnci (TEER). Sağ: ile ( &quot;İltihaplı&quot; kırmızı) ve olmayan ( &quot;Enflamasyon olmayan&quot;, siyah) uyarılması ile HBMEC için Evans mavi nüfuz için standart eğri 500 U / ml IFN-γ ve 24 saat süre ile, TNF-α. 96 saat HBMEC (siyah ok) ekimden - göçü deneyleri 72 gerçekleştirilir. CE. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi 16 sağlıklı bireylerden elde edilen PBMC, göç deneylere tabi tutulmuştur. tahlilden önce 24 saat, hücre kültürü ekler yarısı ile uyarılmıştır 500 lU / ml IFN-γ, TNF-α. Transmigrant hücreler hasat edilmiştir ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. PBMC C. Örnek sonuçlar iyi in vitro kontrol (en üst) ve Enflamasyon olmayan HBMEC (alt) boyunca taşıma işleminden sonra elde edilen. NK cel<html> / dim CD56 + hücreleri ve CD56 parlak CD16 içine daha fazla seçkin - - ( &quot;CD56 parlak &quot;) ve CD56 loş CD16 + (&quot; CD56 dim&quot;), NK-hücre alt ls toplam CD3 olarak lenfositlerden geçirilmiştir. Akış sayım Flüorosferler ( &quot;boncuk&quot;) FSC / SSC özelliklerine göre kapılı edildi ve sayıları zaman grafiği bir FL3 tespit edilmiştir. Örnek hesaplamalar sağda gösterilmiştir geçirilmiş CD56 parlak ve CD56 loş NK hücrelerinin yüzdesini belirlemek mümkündür. Göç NK hücreleri D. yüzdesi olarak CD56, aydınlık ve CD56 loş, NK-hücre alt ve CD4 + ve Enflamasyon olmayan (siyah) boyunca Tenâsüh veya iltihaplı (kırmızı), aşağıdaki, CD8 + T-hücre alt kümesine dahil olmak üzere göç T hücrelerinin, E. yüzdesi HBMEC, ortalama ± SEM olarak gösterilmektedir. P-değerleri eşleştirilmiş Student t-testi ile hesaplandı; ** p &lt;0.01, *** P &lt;0.001./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55390/55390fig1large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier at JoVE.com

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Görüntüleme.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

Video: Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Egzersizle indüklenen Lenfosit Apoptoz belirlenmesi için parmak sopa Kan Örnekleme Metodolojisi

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Bir Geliştirilmesi<em&gt; In vitro</emEtkileşimini incelemek için&gt; bir model sistem<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</emYüksek afiniteli reseptör FcεRI&gt; ile IgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...