This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

1. Zellkultur von Human Brain mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC) <ol><li> Beschichtung von Zellkulturflaschen <ol><li> Um die Fibronektin-Lösung vorbereitet, mit 10 ml PBS in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 150 &amp; mgr; l Fibronektin und gut mischen. </li><li> Zur Abdeckung des Bodens einer T-25-Zellkulturflasche 2 mL der Fibronektin-Lösung. Inkubieren der Zellkultur-Kolben bei 37 ° C im Inkubator mindestens 3 h. Fibronectin beschichteten Kolben können für 2 Wochen bei 37 ° C / 5% CO 2 aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Säen und Zellkultur von HBMEC <ol><li> Aspirat Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Zellkulturflasche. Hinzufügen 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² suspendiert in 6 ml ECM-B - Medium (= ECM-B mit 5% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% Endothelzellwachstum Ergänzung). Inkubieren bei 37 ° C / 5% CO 2. Überprüfen Sie das Zellwachstum täglich mit einem Mikroskop. </li><li> Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.Ernte oder Teile von Zellen, wenn HBMEC etwa 80% Konfluenz erreichen. HBMEC sollte zwischen dem Kanal 1 und 15 verwendet werden, Verlust der physiologischen Eigenschaften zu vermeiden. </li></ol></li><li> Ernte HBMEC. <ol><li> Bereiten Accutase Lösung durch Mischen Accutase (1x) mit PBS in einem Verhältnis von 1: 1. Halten Accutase-Lösung bei 37 ° C in einem Wasserbad bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Übertragen ECM-B-Medium von der Zellkulturflasche in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen HBMEC durch Zugabe von 5 ml PBS, um den Boden der Zellkulturflasche. Absaugen PBS und wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male. </li><li> In 2 ml vorgewärmten Accutase Lösung. für 2 min bei 37 ° C inkubieren. Danach HBMEC werden durch fest Antippen der Zellkulturflasche mehrmals wieder suspendiert. Zellablösung wird gesteuert unter Verwendung eines Mikroskops </li><li> Das ECM-B-Medium, die zuvor in einem Rohr 15 mL gespeichert wird zurück in die Zellkulturflasche hinzugefügt, sobald HBMEC abzulösen beginnen. Spülen Sie den Boden des Kolbens wiederholt, bis die meisten HBMEC sinderneut suspendiert. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellen in 1 ml ECM-B-Medium. Zählen von Zellen und verdünne die Zellsuspension zu einer Endkonzentration von 3 × 10 5 pro mL HBMEC ECM-B - Medium zu erreichen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der Zellkultur-Einsätze <ol><li> Beschichtung von Zellkultureinsätzen Wichtiger Hinweis: Vermeiden Sie die Membran der Zellkultur - Einsätze zu berühren. <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l Fibronektin - Lösung (siehe Abschnitt 1.1.1) zu jedem Zellkultureinsatz (1A) und eine Vertiefung einer 96-Well - Flachbodenplatte (optischen Kontrolle gut). Inkubieren bei 37 ° C für mindestens 3 h. Nach der Inkubation absaugen Fibronektinlösung. </li><li> 100 l HBMEC Suspension auf die Zellkultur-Einsätze und die optische Kontrolle gut. Hinzufügen 600 ul ECM-B-Medium mit dem unteren Bereich der ZelleKultureinsätze. Inkubieren für 3 - 4 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 , bis Barrierenintegrität (1B) erreicht ist , das Zellwachstum kontrolliert durch mikroskopische Auswertung des HBMEC in der optischen Kontrollvertiefung. Hinweis: Das Zellwachstum über 4 Tage wird nicht empfohlen. </li><li> Optional: entzündliche Bedingungen nachahmen aspirieren das Medium aus dem unteren Fach und ersetzen sie durch ECM-B-Medium, ergänzt mit 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 h vor der Migrationstest. </li></ol></li></ol> 3. Qualitätskontrolle mit Evans Blue am Tag des Auswanderungs Assay <ol><li> Herstellung von evans blaue Lösung <ol><li> PBS / B27-Lösung der Mischung 10 ml PBS mit 200 &amp; mgr; l B27 Ergänzung unter Verwendung einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen herzustellen. Verdünnte Evans-Blau-Stammlösung (20 mg / ml PBS) 1: 1000 mit PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans-Blau-Assay Permeabilität <ol><li> Anzusaugen, das Medium aus dem unteren Abteil durch die obere Kammer gefolgtvon einer Zellkultureinsatzes eine konfluente Monoschicht HBMEC enthält. 100 l evans blaue Lösung des Zellkultureinsatzes. </li><li> Hinzufügen 600 &amp; mgr; l PBS / B27 zu dem unteren Abteil und Inkubation für 60 min bei 37 ° C / 5% CO 2. Entfernen Sie vorsichtig den Zellkultureinsatz Pinzette. </li></ol></li><li> Evans-Blau-Messung <ol><li> Entfernen PBS / B27 aus dem unteren Abteil und übertragen wurden jeweils 100 ul zu zwei Vertiefungen einer schwarzen 96-Napf-Polystyrol-Platte mit flachem Boden. Legen Sie Platte in einem Tecan Infinite M200 Pro-Plattenleser und bestimmen die optimale z-Position. </li><li> Measure Anregung von Evans-Blau unter Verwendung von entsprechenden Einstellungen (zum Beispiel: Anregung: 620 nm, Emission: 680 nm, Anregungsbandbreite: 9 nm, Emissionsbandbreite: 20 nm, 175x Verbesserung, 25 blinkt, Integrationszeit: 20 us). </li><li> HBMEC Barrierefunktionen vergleichen erfassten Daten zu einer Standardkurve zeigt evans blau Permeation durch HBMEC zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Samen zu bestimmening Zellen (1B, rechts). </li></ol></li></ol> 4. Migration Assay <ol><li> Präparation von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). <ol><li> Fügen Sie 10 ml RPMI in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und 200 &amp; mgr; L B27 Ergänzung. Graf PBMC und zentrifugieren Zellen bei 300 · g für 5 min. Resuspendieren PBMC in einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Aufbau des Migrationstest <ol><li> Aspirat Medium aus der unteren Kammer , gefolgt von der oberen Kammer aus dem Zellkultur - Inserts enthalten konfluenten Monolayern HBMEC (1A). Spender pro 100 uL PBMC - Suspension jeweils mit den Zellkultureinsätzen hinzufügen und auch eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen pro (in vitro - Kontrolle). </li><li> Hinzufügen 600 &amp; mgr; l RPMI / B27 zum unteren Kompartiment der Zellkultureinsätze und 500 &amp; mgr; l auf die PBMC der in vitro - Steuerung und inkubieren 6 h bei 37 ° C / 5% CO 2. </li&gt; </ol></li><li> Ernten von migrierten PBMC <ol><li> Nehmen Sie den Zellkultureinsatz aus einer Pinzette vorsichtig den Boden mit 400 ul PBS spülen, ohne die Membranen zu berühren. Entsorgen Sie den Zellkultureinsatz. </li><li> Fügen Sie 20 &amp; mgr; l Fließzahl Fluorospheres (etwa 1.000 Perlen / ul) zu dem unteren Abteil des Zellkultureinsatzes sowie an die in - vitro - Kontrolle und gut mischen. 1 ml der resultierenden Suspension PBMC Cytometry Rohre zu fließen. </li></ol></li></ol> 5. Durchflusszytometrie <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Zentrifuge PBMC bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Antikörperlösung durch Zugabe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zu 100 &amp; mgr; l Durchflusszytometrie-Puffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) pro Probe. Für die Ergebnisse präsentiert unter 1 &amp; mgr; l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 &amp; mgr; l CD56-PC7, 1 &amp; mgr; l CD8-A700 und 1 ul CD16-A750 wurden pro Probe verwendet. </li><li> Resuspendieren PBMC in 100 &amp; mgr; l der Antikörperlösung und bei 4 ° C für 30 min inkubieren. </li><li> Nach Eintragen von 250 &amp; mgr; L Durchflusszytometrie-Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min. </li></ol></li><li> Probennahme <ol><li> Resuspendieren PBMC in der erforderlichen Menge (variiert in Abhängigkeit von dem Durchflusszytometer verwendet wird) der Durchflusszytometrie-Puffer. </li><li> Acquire stained PBMC unter Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem aktiven Detektors zwischen 525 und 700 nm Wellenlängen-Durchflusszahl Fluorospheres (Anregung 488 nm, Emission 525 bis 700 nm) zu erfassen. (Die folgenden Schritte sind ein Beispiel, wenn ein Gallios Durchflusszytometer betrieben mit Kaluza G-Software verwendet wird. (1) Starten der Computer (2) Wenn das Betriebssystem vollständig geladen ist, startet das Durchflusszytometer durch den „Zytometer auf“ Drücken der Taste das jeweilige Erfassungsprotokoll Laden von „open-Protokoll“ drücken. (4) wählen Sie das gewünschte Protokoll und wählen Sie „öffnen“. (5) Duplizieren Sie das Protokoll für jede Probe mit der rechten Taste anklicken. (3)Maustaste auf das Protokoll sichtbar im virtuellen Karussell und einem Linksklick auf das Feld „Duplikat“. (6) Beschriften jede Probe in der Probenliste. (7) übertragen, die Proben zu den angegebenen Positionen des Karussells und die Übernahme beginnen.) </li></ol></li><li> Probenanalyse <ol><li> Öffnen resultierende Durchflusszytometriedaten die jeweilige Software. Bestimmt Anzahl von Subpopulationen von Interesse für transmigrierten PBMC sowie Zellen , die von in vitro - Kontrollvertiefungen und Zählung Fluorospheres fließt die jeweilige Analyse - Software. (Ein Beispiel für die Gating - Strategie wird im Ergebnisteil (Abbildung 1 C gegeben: die Transmigration von NK-Zell - Untergruppen zu analysieren, zunächst auswählen Lymphozyten in einer Seitwärtsstreuungskanals (SSC) gegen Vorwärtsstreuung Kanal (FSC) Plot Lymphocyten ist. dann in einem CD3 gegen CD56 Plot angezeigt und CD56 + CD3 -. NK - Zellen ausgewählt werden , zu unterscheiden zwischen NK-Zell - Untergruppen, NK - Zellen angezeigt inein CD56 gegen CD16 Grundstück und CD56 hell CD16 dim / - sowie CD56 dim CD16 + NK - Zellen ausgewählt. Außerdem Zählung Strömungs Fluorospheres werden aus einem FSC gegen SSC Stück ausgewählt und anschließend in einem Grundstück eines Kanals mit einer Emission zwischen 525 und 700 nm gegenüber der Zeit angezeigt, deren Anzahl zu bestimmen.) </li><li> Um die Gesamtzellzahl jeder Probe zu berechnen, normalisieren die erfasste Anzahl von Zellen unter Verwendung von Flusszahl Fluorospheres: <img alt="Gleichung" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Bestimmen Prozentsatz der migrierten Zellen als Verhältnis zwischen dem gesamten migrierten Zellen und den Gesamtzellen in der in - vitro - Kontrolle. </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

Hier präsentieren wir eine Technik, um die Seelenwanderung von Lymphozyten über die menschliche Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen. In - vitro - Analyse von Lymphozyten - Migration auf das ZNS ist wichtig , grundlegende Prozesse der Lymphozyten - Extravasation, potentielle krankheitsbedingte Veränderungen und neue therapeutische Ansätze zu studieren. Mehrere Modifikationen der Blut-Hirn-Schranke Modell möglich. So könnten beispielsweise Zellen aus dem oberen Kompartime...

Lymphozytenmigration aus dem Blut in das Gewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Immunüberwachung. Eine Folge von spezifischen molekularen Wechselwirkungen stellt sicher , ortsspezifische Extravasation in Dünndarm, Haut, Lymphknoten, das zentrale Nervensystem (ZNS) und andere Gewebe 1. Veränderungen in der Lymphozytenmigration sind in der Pathophysiologie einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten 2 beteiligt. Migration in die Immunprivilegierten CNS ist streng reguliert und entsprechend Veränderungen dieses Verfahrens sind in CNS-bedingten Krankheiten wie Enzephalomyelitis 3, Neuromyelitis optica, Schlaganfall und Multiple Sklerose (MS) , 2, 4, 5, 6, 7 beteiligt. Daher ist es wichtig, Lymphozyten-Extravasation besser zu verstehen Krankheit Pathophysiologie und Entwicklung von Instrumenten für ein Studium<html> Melioration von Krankheitsbelastung 8, 9, 10, 11, 12. Lymphozyten wandern in das ZNS über verschiedene Routen. Extravasation durch postkapillaren Venolen in den Subarachnoidalraum über die Blut-Liquor - Schranke innerhalb des Plexus choroideus und über die Blut-Hirn - Schranke hat 1 beschrieben worden ist , 13, 14, 15. Migration durch die Blut-Hirn - Schranke wird durch die Wechselwirkung von Lymphozyten mit Endothelzellen 14 durchgeführt. Im Gegensatz Zellen in der Peripherie, Endothelzellen des ZNS äußern an endotheliale hohe Mengen an tight junction-Moleküle, um dadurch genau die Menge von Zellen und Proteinen Begrenzen der Lage Überquerung der Blut-Hirn-Schrankelass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Entzündung führt Lockerung der tight junctions und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen; Somit verbessert Lymphozytenmigration in das ZNS 1, 17, 18. Extravasation über die Blut-Hirn-Schranke ist ein mehrstufiger Prozess. Haltegurt - Lymphocyten an die Endothelzellen und dann entlang dem Endothel in einem Fertigungsrolle hauptsächlich durch Selectine 1, 15 vermittelt. Anschließend Wechselwirkungen zwischen durch das Endothel sekretiert Chemokine und Chemokin den jeweiligen auf Lymphozyten induzieren Konformationsänderungen exprimierten Rezeptoren der Integrine, wodurch feste Adhäsion an die Endothelzellen 1 zu fördern. Schließlich, Lymphozyten entweder Durchforstungs entlang der endothelialen Barriere gegen den Blutstrom, bevor sie in den perivaskulären Raum transmigrating oder abgewürgt sofort und direkt transmigrate an der Stelle der festen Haftung 1, 19, 20. All diese Schritte der Lymphozyten Extravasation kann in vitro unter Verwendung von unterschiedlichen Techniken 21 analysiert werden. Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet , um das anfängliche Tethering zu studieren und Walzen 15. Adhäsions - Assays bieten detaillierte Informationen über feste Verhaftung Barrieren endothelialer 22. Transmigrationsassays als 21 hier erlauben Analyse von Immunzellen - Transmigrations demonstriert, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Unter Verwendung der humanen in vitro - Modell Blut - Hirn - Schranke, konnten wir kürzlich zeigen , dass eine höhere migrAtory Kapazität von CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen im Vergleich zu ihrem CD56 dim CD16 + Pendants durch ein Vorherrschen dieser NK - Zell - Untergruppe in der intrathekalen Kammer 21 reflektiert wurde. So ist unser Versuchsaufbau scheint geeignet zu sein , die in vivo - Situation zu imitieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>without CaCl2 or MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin 1mg/mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-5MG</td>
			<td>from bovine plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 cell culture flask</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>690160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBMEC</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pelobiotech</td>
			<td>PB-H-6023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM-b</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth supplement</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1001-b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>clear, 6.5mm diameter, 3.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50x concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200Pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black flat bottom plate</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>675086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Count Fluorospheres</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7547053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios 10-color flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza 1.5a</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300430</td>
			<td>clone UCHT1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-PC7</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A21692</td>
			<td>clone N901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16-A750</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66330</td>
			<td>clone 3G8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300506</td>
			<td>clone RPA-T4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-A700</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66332</td>
			<td>clone B9.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

Lymphocyte Extravasation in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist entscheidend für die Immunüberwachung. Krankheitsbedingte Veränderungen der Lymphozyten-Extravasation könnten in pathophysiologischen Veränderungen im ZNS führen. So Untersuchung der Lymphozytenmigration in das ZNS ist wichtig, entzündlichen ZNS-Erkrankungen zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. Hier präsentieren wir ein in vitro - Modell der menschlichen Blut-Hirn - Schranke Lymphozyten - Extravasation zu studieren. Human brain mikrovaskuläre Endothelzellen (HBMEC) sind konfluent auf einem porösen Polyethylenterephthalat gewachsenen Transwell einzufügen das Endothel der Blut-Hirn-Schranke zu imitieren. Barrierefunktion durch Zonula occludens Immunhistochemie, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen sowie Analyse von Evans-Blau-Permeation validiert. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Diapedese von seltenen Lymphozytteilmengen wie CD56 hell CD16 dim / - NK - Zellen. FurthermErz, die Auswirkungen von anderen Zellen, Zytokinen und Chemokinen, krankheitsbedingte Veränderungen und unterschiedliche Behandlungsschemata auf die Migrationsfähigkeit von Lymphozyten untersucht werden. Schließlich kann die Wirkung von Entzündungsreizen sowie unterschiedliche Behandlungsschemata auf der endothelialen Barriere analysiert werden.

Repräsentative Ergebnisse zeigen Transmigration von NK-Zell- und T-Zell - Untergruppen mit dem menschlichen Blut-Hirn - Schranke - Modell (1A) gezeigt. Die Integrität der HBMEC Monoschicht wurde durch Anfärben des tight junction Moleküls ZO-1, transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) Messungen validiert, und Evans - Blau - Permeation (1B). Folgende 3 - 4 Tage Kultur ausgedrückt HBMEC das tight junction Molekül ZO-1 (1B, lin...

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K Aufrufe.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

Serie: Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

Finger-Stick Blutprobenentnahme Methodik zur Bestimmung der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Entwicklung eines<em&gt; In vitro</em&gt; Modellsystem für die Untersuchung der Wechselwirkung von<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE mit seinen hochaffinen Rezeptors FcsRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...