The authors wish to acknowledge Dr. A. J. Hudspeth for funding and expertise in developing the preparations described in this paper. We also wish to thank Brian Fabella for creating and maintaining much of the custom equipment and software used in this protocol.
J. B. A. is supported by grant F30DC014215, J. D. S. is supported by grant F30DC013468, and both J. B. A. and J. D. S. are supported by grant T32GM07739 from the National Institutes of Health.

Etik Beyanı: Tüm işlemler Rockefeller Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Ön deney Prespanparation <ol><li> Çözümler <ol><li> Eugenol çözüm hazırlayın (2.5 g · L -1 kg-1 kurbağa). Salin çözeltileri (Tablo 1) hazırlayın. NOT: Bir tek odacıklı hazırlanması için yapay perilenf hazırlamak; İki bölmeli hazırlanması için, suni perilenf ve yapay endolymph hem hazırlanması. </li></ol></li></ol> 2. Deneysel Araçlar <ol><li> Cam stimülasyon elyaf hazırlanması <ol><li> yüksek ısı ve yüksek hızda tek satırlık çekme bir elektrot çektirmesi ile borosilikat cam kılcal daraltın. solenoid odaklı çektirmenin içine çekti kılcal yükleyin. </li><li> Bir cam boncuk ile bir filamanın doğru kapilariteyi en ucu getirKılcal temas cam boncuk kadar bunun üzerine erimiş. </li><li> Cam boncuk halinde kılcal ucu eritmek için filaman açın. kılcal ve boncuk arasındaki cam formları ince bir köprü kez filament kapatın ve aynı zamanda etrafında selenoid çektirme etkinleştirin. NOT: Bu uzun eksenine dik açıyla cam kapiller çekin ve sağlam bir lif yaratacaktır. </li><li> elyafın çapı en fazla 0.5 daha emin olun - 1 mikron ve uzunluğu 100 aşmadığı - 300 mikron. elyafın uzunluğu bu boyutu aşarsa, iris makası ile kırpın. Zaten diseksiyon araçlarını zarar görmemesi için sıkıcı makas kullanın. </li><li> Optik kontrastı artırmak için, kaplamaz lif sputter. altın paladyum kaynağı ile, bir püskürtme kaplayıcıda kullanın. Dikey kaynağına doğru olan konik ucu ile bir püskürtme kaplayıcı içine her lif yükleyin. altın palladyum kaynağının 2 cm - 1 bir mesafeye fiberin ucunu getirmek. </li><li> KapatBir mühür formu ve açmak için kaplayıcının odasına sputter. Tekrar tekrar argon ile ortam havasını dışarı yıkayın. havayı kızarma sonra, 10 Pa (70 mTorr&#39;luk) odanın içindeki basıncı azaltır. </li><li> 120 s boyunca 10 sn gecikme ile 10 s bakliyat kat sputter. NOT: püskürtmeli kaplama başarılı oldu ise fiberin ucu bu protokolün süresi boyunca kararacak. </li></ol></li><li> Keskin Mikroelektronlar hazırlanması <ol><li> tek satırlık yüksek ısı çekme kullanarak bir iç filamanın bir cam kılcal çekin. 3 M KCl ile doldurulduğunda 300 MQ - elektrotlar 100 arasında bir dirence sahip olmalıdır. 3 M KCl ile her elektrot doldurun. </li><li> Amplifikatör headstage 16 monte edildiğinde bend microforge her elektrot ucu saç hücresi apikal yüzeye çok dik hale getirmek. </li></ol></li><li> Iyontoforez pipetler hazırlanması <ol><li> bir iç bir cam kılcal çek50 M? ucu filamanın. Konsantre çözünen (örneğin, 500 mM gentamisin sülfat) ile doldurun. </li></ol></li><li> Alüminyum montaj meydanın hazırlanması <ol><li> alüminyum folyodan bir 1 cm x 1 cm kare kesin. Bir pithing çubuğu veya diğer sivri nesnenin ucuyla merkezinde folyo Perfore. dairesel ve çapı yaklaşık 1 mm olacak şekilde perforasyon şekillendirin. </li></ol></li><li> Vakum gres şırınga hazırlanması. <ol><li> 5 ml şırınga pistonu çıkarın. vakum gres ile arkasından şırınga doldurun. pistonu değiştirin. </li></ol></li><li> Politetrafluoroetilen yapıştırıcı uygulayıcının hazırlanması <ol><li> Bir tahta aplikatör çubuk sonuna oyulmuş 2 mm uzunluğunda eksenel olun. son görüntülendiğinde yarık uygulayıcının merkezinde olmalıdır. </li><li> keskin bir makas veya bir jilet ile, 1 mm kalınlığındaki bir tabakadan politetrafloroetilen 2 mm x 4 mm dikdörtgen kesin. </li&gt; <li> politetrafloroetilen dikdörtgenin 2 mm-uzun kenarlarından ince birine bir jilet kullanın. dikdörtgenin ortasında başlayarak, dikdörtgenin ucunda bir eğim oluşturmak için dışa dilimleme dikdörtgen kalınlığını azaltır. </li><li> Eğimli kenarın uzak sopa bakacak şekilde ahşap aplikatör yarık içine politetrafloroetilen dikdörtgen yerleştirin. yerine sabitlemek için politetrafloroetilen dikdörtgenin tabanına 5 dk epoksi uygulayın. Tutkal uygulama, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bekletilmelidir. </li></ol></li><li> İki bölmenin alt yarısının hazırlanması monte <ol><li> Makine veya 3D iki odasının alt yarısı (İlave dosya 2) monte yazdırın. odasının alt yüzeyi üzerinde 20 mm çaplı gömme daire tanımlar. </li><li> girintili dairenin en yanal 3 mm epoksi ince bir tabaka sürün. epoksi bir 18 mm yuvarlak cam lamel uygulayın. epoksi 1 için kurumaya bırakınızh. </li></ol></li></ol> İç kulak Organ 3. Ekstraksiyon <ol><li> 10 dakika eugenol anestezik solüsyon içeren küçük bir kova yerleştirerek bir Amerikan bullfrog uyutmak. çözümün ses seviyesini ayarlamak, böylece sadece sıvı-hava arayüzü üzerinde kurbağa humero-skapular ortak yatıyor. </li><li> çift ​​pithing tarafından anestezi bullfrog euthanize. <ol><li> çene altında biri kendi burnunun üstüne parmak ve birbirleri ile anestezi kurbağa kavrayın ve ileri kurbağa kafasını döndürün. </li><li> Hızla kurbağa oksipital süreçleri arasındaki orta hat bulunan foramen magnum, kranial tonoz içine pithing çubuğunu dalma. </li><li> Yavaş yavaş çekilme ve ucu foramen magnum yola kadar çubuk döndürün. omurilik yok etmek için vertebra foraminalardan yoluyla kaudal çubuk zorlayın. </li><li> Kurbağa düzgün iki kat alt ekstremite genişletilmiş olduğunu gözlemleyerek pithed olduğunu onaylayın. </li></ol></li><li> Geliştirilmiş istikrar için vomerine diş kavrama burun ve ilk parmağı üzerinde bir başparmak ile kurbağa kavrayın. bilateral temporomandibular eklem kesilmesinin ve daha sonra rostro eksene dik keserek kurbağa başını kesmek. kafatası içinde iç kulak organları sağlam kalmasını sağlamak için, kesim hem tympana aşağısındaki olduğundan emin olun. </li><li> Bir stereodissection mikroskop kullanarak, doku (Şekil 1A) en arka ölçüde vomerine dişlerin damak dokusu kesti bir orta hat yürütmek. </li><li> Sever ve posterior kıkırdak ortaya çıkarmak için damak dokusu altında yatan neşter yatay kesim herhangi bir kas net. kas çıkardıktan sonra, otik kapsülün sınır oluşturan zamansal kıkırdak lolipop şeklini gözlemlemek. </li><li> otik kapsülün kıkırdak ile temas noktasındaki columella Sever. </li><li> Defalarca shallo yaparak bu kıkırdak ince tabakalar tıraşiçinden w yatay keser. iç kulak organlarına zarar görmesini önlemek için derin kesikler kaçının. Bu zamansal kıkırdak (Şekil 1B) lolipop yapısı içinde bulundu otik kapsül açılır. Otik kapsül içinde kurbağanın iç kulak organlar (Şekil 1C) bulunmaktadır. </li><li> iç kulak organlara zarar vermemeye özen, posterior ve otik kapsülün yanal kenarları kırpın. disseksiyonda sıklıkla batık ve sulu kalmasını sağlamak için iç kulak organları üzerinde tuzlu su akar. </li><li> orta hatta kıkırdak medial bağlantısında temporal kemiğin iki dairesel açıklıklar bulun. Temporal kemik yırtmak için en medial açıklıktan aşağı doğru kesin. </li><li> onun arka-yan kenarında otik kapsül içinden ikinci bir aşağı kesim olun. iç kulak organlarına erişim sağlamak için bu ve bundan önceki kesim arasındaki kıkırdak parçasını çıkarınız. </li><li> adımlar 3.8 a gelen kesimler arasındaki kıkırdak gevşek gözetlemeknd 3.9 ve otik kapsül uzak kesti. Bu işlem, daha sonra manipülasyonlar için bir sap olarak kullanılabilir yakın yarı dairesel kanal, koparır. </li><li> Sacculus dokunmamaya özen kranial sinir inci VIII sever. </li><li> En yakın semisirküler kanalın ampulla tutun. Yavaşça kalan iki yarı dairesel kanallar ortaya çıkarmak için iç kulağı döndürün. Her kanal açığa üzerine, onu sever. </li><li> sinir veya bir semisirküler kanal ampulla Holding, baş iç kulak ayıklamak ve soğutulmuş oksijenlenmiş yapay perilenf ile dolu bir tabak koyun. Iç kulak çıkarılması semisirküler kanallar kez geçtikleri temporal kemik (Şekil 1D) içinde pasajlar görselleştirme izin verir. NOT: İkinci kulak ayıklamak için bu adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Tek odacıklı Hazırlık <ol><li> Sacculus izolasyonu <ol><li> Geniş katiyen belirleyerek sacculus bulunE otokonin kütlesi ve bunu üstüne yer alan sakküler sinir (Şekil 1 E). Fiziksel Sakküler saç hücrelerinin bütünlüğünü korumak için aşağıdaki adımları sırasında sacculus travmatize özen gösterin. </li><li> iç kulak daha manevra hale getirmek için yarım daire kanalları Trim. </li><li> sacculus nöral tarafını örten perilenfatik sarnıç çıkarın. sarnıç çevresinde yumuşak kesim yapmak. Sonraki sacculus sinirsel tarafına sarnıcın en membran köprü küçük doku ayağı sever. </li><li> lagena ve ilişkili sinir çıkarın. </li><li> sakküler sinir Holding, hafifçe sacculus kaldırın ve otoconial kesenin ince zarından kesti. kesenin dışına otokonin sızıntısı olarak, kendi çevresi etrafında keserek sacculus özgür. NOT: İstenirse sacculus izole sonra, kalan iç kulak organları kaydedilebilir. sacculus çıkarılması gibi başka yapıların belirlenmesini kolaylaştırıramfibi ve baziler papillalar. </li><li> dikkatle sacculus üzerinde kalan otokonin silip makas veya forseps kullanabilir. Bu işlem sırasında sacculus dokunmamaya özen gösterin. </li><li> sacculus &#39;kenarından kalan otoconial-sac membran kesin. Bu zar, plastik ve cam yüzeylerde yapışma eğilimi ve kaldırma dokusunu ele zorlukları en aza indirir. </li><li> Yavaşça kalan otokonin (Şekil 1F) çıkarmak için bir Pasteur pipeti ile sacculus fazla tuzlu su akar. NOT: İlk bir ayna görüntüsü olan ikinci sacculus, bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Sindirim ve montaj <ol><li> Kırık ucu olan bir Pasteur pipeti arka ucunu kullanarak, suni perilenf 67 mg ∙ L-1 proteaz XXIV 3 mL içeren bir Petri kabı izole sacculi aktarın. NOT: Bu proteaz tedavi otolithic her kinociliary ampul hayvan zinciri bağlantıları sindirirMembran, duyusal saç demetleri zarar vermeden membranın çıkarılmasını sağlayan. </li><li> 22 ° C (veya 21 ° C&#39;de 35 dakika), 30 dakika boyunca doku inkübe edin. Açık yüzlü deneysel odasına her sindirilmiş sacculus aktarın ve manyetik pimleri ile doku sabitleyin. </li><li> sakküler makula doğrudan otolithic membranın altında yatıyor ve saç hücreleri içeren sacculus kısmıdır. tanımlamak ve dikkatle sakküler makulayı dokunmamaya özen ince bir kirpik kullanarak üstte otolithic membran kaldırmak. </li></ol></li></ol> 5. İki odalı Hazırlık <ol><li> Sacculus izolasyonu <ol><li> Bölüm 4.1 gibi iç kulak organlarından sacculus izole edin. </li></ol></li><li> Montaj ve sindirim <ol><li> Vakum iki noktalar kullanarak, suni perilenf montaj bloğu (Company dosya 3) doldurun ve bir açılış delikli alüminyum folyo koyunyerinde tutun ve zayıf mühür oluşturacak şekilde yağlayın. </li><li> Transferi bir folyoya sakkuluslar ve aşağı bakacak makula ve yukarı bakacak şekilde sinir güdük ile deliğin üstünde ortalamak. </li><li> bükülmüş doku parçası ile sacculus çevreleyen tuzlu su çıkarın. sacculus çevreleyen alüminyum kare yüzeyini kuru tuzlu fitil. </li><li> sacculus kenarında ve alüminyum meydanı arasındaki sınır boyunca sıkı bir mühür oluşturmak için siyanoakrilat tutkal uygulamak için politetrafloroetilen aplikatör kullanın. sacculus tüm çevresi yapıştırıcı ile kaplanmış olduğundan emin olun. NOT: çok yavaş ilerleyerek siyanoakrilat yapıştırıcı sacculus nöral tarafı üzerinde sürünme ve sonunda onu karşılamak için izin verir. Hızla bu görevi tamamlamak için zorunludur. </li><li> tutkal tedavi monte dokusunun üstüne bir damla serum fizyolojik yerleştirin. tutkal ince bir film tuzlu su damlasının üzerine oluşturabilir; forseps ile çıkarın. </li><li> Dikkatle t kaldırmakO bağlantı bloğundan bozarlar. sacculus maküler tarafı yukarıya bakacak şekilde üzerine monte doku çevirin ve yapay perilenf dolu Petri kabı üzerine yüzer. </li><li> makula üstünde proteaz XXIV solüsyondan bir damla ilave edin ve 22 ° C (veya 21 ° C&#39;de 35 dakika), 30 dakika boyunca inkübe edin. Merkez odasının etrafında perilenf ve yer vakum gres ile iki odalı aparatı (Company dosya 2) alt kanal doldurun. </li><li> bölmenin bakan yüzeyinde sinir alt odasının folyo monte sacculus yerleştirin. folyo çevresinde yağ ekleyin. </li><li> Vakum yağ ile tam bir sızdırmazlık oluşturmak için özen, folyo hazırlık üst bölmeyi (Company Dosya 1) yerleştirilir. kabarmış yapay endolymph üst bölmeyi doldurun ve yavaşça bir kirpik ile otolithic membran kaldırmak. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Adult+Mouse+Utricle+and+Adenovirus-mediated+Supporting-cell+Infection.">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).</li><li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compliance+of+the+hair+bundle+associated+with+gating+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+the+bullfrog's+saccular+hair+cell.">Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell.</a> Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).</li><li>Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+hair+cell's+transduction+channels+at+the+hair+bundle's+top+by+iontophoretic+application+of+a+channel+blocker.">Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker.</a> Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).</li><li>Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependence+of+adaptation+and+active+bundle+movement+in+bullfrog+saccular+hair+cells.">Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).</li><li>Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair-bundle+stiffness+dominates+the+elastic+reactance+to+otolithic-membrane+shear.">Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear.</a> Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).</li><li>Martin, P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+hair-bundle+movements+can+amplify+a+hair+cell's+response+to+oscillatory+mechanical+stimuli.">Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).</li><li>Salvi, J. D., &#211; Maoil&#233;idigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+a+hair+bundle's+mechanosensory+function+by+its+mechanical+load.">Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).</li><li>Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Oscillation+by+Hair+Bundles+of+the+Bullfrog's+Sacculus.">Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus.</a> Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. , (1988).</li><li>Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+electrical+resonance+in+hair+cells.">Imaging electrical resonance in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).</li><li>Patel, S. H., Salvi, J. D., &#211; Maoil&#233;idigh, D., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-selective+exocytosis+by+ribbon+synapses+of+hair+cells+in+the+bullfrog's+amphibian+papilla.">Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).</li><li>Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+bundleless+hair+cells+and+subsequent+bundle+replacement+in+the+bullfrog's+saccule.">Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule.</a> Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).</li><li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanoelectrical+transduction+by+hair+cells+of+the+bullfrog's+sacculus.">Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus.</a> Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).</li><li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+the+active+process+of+hair+cells+with+cochlear+function.">Integrating the active process of hair cells with cochlear function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).</li><li>Corey, D. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+latency+of+vertebrate+hair+cells.">Response latency of vertebrate hair cells.</a> Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).</li><li>Cheung, E. L. M., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+Changes+the+Force+Sensitivity+of+the+Hair-Cell+Transduction+Channel.">Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel.</a> Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).</li><li>Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+amplification+of+hair-bundle+motion+by+cyclical+binding+of+Ca2++to+mechanoelectrical-transduction+channels.">A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).</li><li>Assad, J. A., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+motor+model+for+adaptation+by+vertebrate+hair+cells.">An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells.</a> Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).</li><li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+adaptation+of+transducer+currents+in+turtle+hair+cells.">Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 405-434 (1989).</li><li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+relaxation+of+the+hair+bundle+mediates+adaptation+in+mechanoelectrical+transduction+by+the+bullfrog's+saccular+hair+cell.">Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).</li><li>Purves, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+release+of+drugs+from+iontophoretic+pipettes.">The release of drugs from iontophoretic pipettes.</a> Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).</li><li>Tinevez, J. Y., J&#252;licher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+the+various+incarnations+of+active+hair-bundle+motility+by+the+vertebrate+hair+cell.">Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell.</a> Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).</li><li>&#211; Maoil&#233;idigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+effects+of+mechanical+loading+on+active+hair+bundles.">The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).</li><li>Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+generation+by+mammalian+hair+bundles+supports+a+role+in+cochlear+amplification.">Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification.</a> Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).</li><li>van Netten, S. M., Khanna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness+changes+of+the+cupula+associated+with+the+mechanics+of+hair+cells+in+the+fish+lateral+line.">Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).</li><li>Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., J&#252;licher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+channels'+gating+can+control+friction+on+vibrating+hair-cell+bundles+in+the+ear.">Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).</li><li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actions+of+calcium+on+the+mechano-electrical+transducer+current+of+turtle+hair+cells.">The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 369-398 (1991).</li><li>Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+motion+of+stereocilia+assures+the+concerted+gating+of+hair-cell+transduction+channels.">Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels.</a> Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+free+Ca2++concentration+in+hair-cell+stereocilia.">Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia.</a> Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).</li></ol>

The authors declare no competing interests.

Bullfrog en sacculus içinde birkaç bin kolayca erişilebilir duyusal saç hücrelerinin yalan. Burada tek ve iki odacıklı kayıtları için çıkarma ve sacculus hazırlanmasını göstermektedir. Bu iki hazırlıkları saç hücreleri ve bunların ilişkili demetleri hem mikromekanik ve elektrofizyolojik çalışmalar izin verir. Doku oksijenli tuz sık değiştirilmesi ile birkaç saat yaşayabilir olduğundan, deneyler uzun süreler için devam edebilir. saç demetleri Ekstraksiyon sonra 24 saat süreyle kendiliğinden salınım yaparken bu hazırlıkların içinde saç hücreleri genellikle, diseksiyon sonra 6 saat süreyle mikroelektrot kayıt için geçerli kalır. sacculus Başarılı çıkarma ve montaj birkaç ortak zorlukları aşıp dayandırılmıştır. İlk olarak, sakküler makula apikal yüzeyi ile doğrudan temas hazırlık prosedürü boyunca kaçınılmalıdır. sakküler sinir güvenli manipu için uygun bir tanıtıcı sağlarsacculus bir yon. iç kulak organlarının geri kalan kurtulmuş sonra sakkuluslar sıvısında dalmış kalan onun duyusal epiteli mekanik zarar görmesini önlemek için ise bir büyük kalibreli pipet kullanarak transfer edilmelidir. maküler yüzeyinden otokonin çıkarılması saç hücreleri mekanik zarar vermeden tamamlanmalıdır. otokonin makula üstünde doğrudan yalan, çünkü saç hücreleri diseksiyon araçları ve otokonin sökerken otolithic membranı arasındaki kazara temas ile hasar görebilir. zarar görmemesi için, biz otokonin jelatinimsi kütle makula uzak bir yerde tutulan ve tek bir kütle olarak kaldırılmasını öneriyoruz. Bu bireysel çıkarılan olacağını her biri çok sayıda kümeler içine otoconial kütlenin parçalanmasını önler. otokonin küçük kümeler kalırsa onlar Pasteur pipeti tarafından teslim hafif sıvı basıncı ile kaldırılabilir. Son bir meydan okuma olarak sakkuluslar ve alüminyum montaj Meydanı arasında sıkı bir mühür oluşumuyla ilgilidirİki odacıklı preparat. yaklaşık 100 mikron sacculus ve çevresindeki alüminyum izinlerinin doku tam sızdırmazlık arasındaki örtüşme izin vermek için yeterince küçük bir perforasyon bir kare çalışanı. Tutkal sıkı bir mühür oluşturmak üzere, yaklaşık 100 um, maküler en çevresinde sakküler doku ile temas haline getirilmesi gerekmektedir. Serbest Ca konsantrasyonu 2+ saç hücrelerinin çalışmasında önemli bir husustur. Ca 2 + böylece kendiliğinden paket hareketi 8, 23 de dahil olmak üzere mechanotransduction aygıtının kinetik ve saç demeti aktif işlem olayların özelliklerini belirleyen, hızlı ve yavaş hem de adaptasyon düzenler. In vivo Endolenfatik kalsiyum nedenle çoğu fizyolojik ilgili kinetik bu konsantrasyonda (Maunsell JHR, R. Jacobs ve AJ Hudspeth değerlendirilir, 250 uM&#39;de mevcuttur. Unpublished gözlemler 16). Ancak, saç hücrelerinden mikroelektrot kayıtları mikroelektrot etrafında hücre zarının uygun sızdırmazlık için 2 mM aşan bir dış kalsiyum konsantrasyonunu gerektirir. Deneyler için, yüksek kalsiyum tuz kullanmak zorunludur. Son olarak, bir kalsiyum konsantrasyonları kullanarak çeşitli mechanotransduction üzerine harici kalsiyum etkilerini incelemek isteyebilirsiniz. Bu durumlarda, genellikle uç bağlantı rüptürü ve transdüksiyon 28 geri dönüşümsüz kaybına yol 1 uM&#39;nin altında kalsiyum konsantrasyonlarını hatırlamak önemlidir. Burada tarif edilen iki deney preparatlar kılı hücrelerinde biyofiziksel ölçümlerin bir dizi sağlar. Bununla birlikte, ilave ölçümler bu preparatların küçük değişiklikler yapılabilir. Katlanmış sakküler hazırlanmasında, saç demetleri yanal görüntülenmiştir. Bu noktadan görüntüleme saç demeti hareket tutarlı mot ortayaHem kısa hem de uzun boylu stereocilia 29 iyon. Burada sakküler makula ilk olarak alttaki dokuya ayrılır ve daha sonra, saç demetleri dışarı doğru bakar ve kırışık yanal görselleştirildiği şekilde sakküler sinir tarafından tanımlanan bir eksen boyunca katlanır. İkinci değişiklik, saç hücre ayrışma, saç hücrenin paket ve soma hem çalışma sağlar. Saç hücreleri mekanik görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıt 30 bir cam slayt üzerine ayrışmış bulunmaktadır. Son olarak, saç hücreleri de benzer bir ayrıştırma protokolü izlenerek, ancak, mekanik ayrıştırma aşaması olmadan epitel ekstrüde edilebilir. mekanik hasar en aza indirirken yavaş yavaş elektrofizyolojik kayıtlar için bazolateral erişim sağlayan, epitel dışarı a&#39;ya saç hücreleri Bu tedavi sonuçları. Bu preparatlar, ve pek çok değişiklik biyofiziksel için bir model sistem olarak kurbağa sacculus çok yönlülüğü göstermektedirduyusal saç hücrelerinin çalışma.

Memelilerin acousticolateralis organları karmaşık bir mimari sahip ve erişim zor olabilir anatomik bir niş içinde yalan. Örneğin, memeli koklea bir sarmal labirent oluşur ve kalın temporal kemik içinde gömülü. Koklea izolasyonu sık sık içinde yatan duyusal hücrelerin mekanik hasara neden olur ve bu nedenle zor bir görev 1 olduğu kanıtlanmıştır. Sinirbilimciler böylece daha kolay kulak kutsal ayıklanır sistemlerin modellenmesi döndü. Bu model sistemlerinde biri, Amerikan bullfrog (Rana catesbeiana) ve sakkuluslar, yıllardır işitsel ve vestibüler sistemin işlevi içine genellenebilir fikir vermiştir için vardır. sakkuluslar düşük frekanslı işitme ve sismik hissi hem de duyusal rolleri olan bir karma işlev organıdır. sacculus duyusal hücrelerin kendi saç hücreleri, mekanik enerjiyi dönüştürmek uzman dönüştürücüler vardırBizim işitsel ve vestibüler organları içinde elektrik sinyallerine. Her saç hücresinin apikal yüzeyinde çıkıntı stereocilia denilen genişlemiş mikrovilluslar kademeli bir tutam içeren bir mechanosensitive saç demetidir. Bitişik stereocilia uçları lifli uç bağlantı proteinleri ile birbirine mekanik olarak kapısı iyon kanalları mekanik uyarıcılara 2, 3 yanıt olarak. İşitsel ve vestibüler organlar uyaranlara farklı yanıt da, ortak bir algılama mekanizması paylaşır. Bu ortak nokta bullfrog sacculus çalışmaları sayesinde saç hücre mechanotransduction içine aldığı birçok anlayışlar yatmaktadır. Örneğin, saç hücrenin etkin bir süreç bu organ 4, 5, 6, 7 yaygın olarak incelenmiştir, ve saç demeti, mekanik üretmek için bir enerji tüketen işlemini kullanmaktadıriş. Sadece saç hücreleri aktif çalışma 6 oluşturmak olduğu gösterilmiştir, ancak farklı etken sürecini altında yatan mekanizmalar ve saç hücrenin akort özellikleri organlarının acousticolateralis bullfrog çalışmaları ile tanıtıldı edilmiştir. Amfibi papilla saç hücrenin şerit sinaps 12 aktif saç demeti motilite 8 ve saç hücresi elektrik rezonans 9, 10, sacculus 11 ve frekans seçiciliği bulunmaktadır. Bullfrog en sakkuluslar çeşitli nedenlerle duyusal sinirbilimciler hitap ediyor. Memeli koklea aksine, bu organın kolayca erişilebilir otik kapsül içinde yatıyor. İkincisi, bu organın içindeki saç hücreleri, 14 uygun koşullar 13 altında birkaç saat sağlıklı kalabilir. Bu experimentat izinonların memeli meslektaşları göre uzun zaman ölçekleri üzerinde bu hücrelerin iyon. Üçüncü olarak, organ kolay manipülasyon izin, küçük eğrilik taşır. Dördüncü, her organ, yüksek verimlilik ve belirli bir deney için saç hücrelerinin uygun bir dizi bulma olasılığı yüksek hem de sağlayarak, bin ya da daha fazla saç hücrelerinin 15 içermektedir. Son olarak, Bullfrog en sakkuluslar kolayca nedeniyle saç hücrelerinin bu organ ve büyük boy inceliği ile görüntülenmiştir. Bu özellikler Bullfrog en sacculus içinde duyu hücrelerinin çalışma için büyük bir çok yönlülük sağlar. eldeki soruya bağlı olarak, bir çok deneysel preparatlarının bir sacculus elde edilebilir. Bu en basit bir bölme hazırlığı olduğunu. Burada sacculus yapay perilenf bir sodyum-zengin ve yüksek kalsiyum tuzlu su ile doldurulmuş bir odacığm içine tesbit edilir. Bu hazırlık saç hücre akımları ve temel saç demeti mekaniği çalışma sağlar. Ikinci bir konfigürasyon, iki odacıklı preparat, kendiliğinden saç demeti hareketleri incelemek için kullanılabilir. bazolateral tarafı yapay perilenf yıkandığı ise burada saç hücrelerinin apikal tarafı potasyum bakımından zengin ve kalsiyum bakımından fakir tuzlu maruz kaldığı, yapay endolymph olarak adlandırılan. Bu iki bölme salines in vivo düzenleme taklit ve saç demetleri kendiliğinden salınım sağlayan bir ortam sağlar. Bu yazıda duyusal saç hücrelerinin biyofiziksel çalışma için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz ilk Kurbağanın iç kulak bu organın izole ayrıntılı bir tasvirini sunar. Daha sonra tek ve iki odacıklı hem deneysel hazırlıkları tanımlamak ve her yapılandırma için temsili sonuçlar içermektedir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Common to both preparations&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo-dissection microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Metal pithing rod</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette and bulb (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>Fine eyelash mounted on a hypodermic needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-557-172</td><td></td></tr><tr><td>Dow-corning vacuum grease</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td></td></tr><tr><td>Syringe for vacuum grease</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>35 mm Petri dish (x2 - 3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter</td><td>P-97 or P-2000</td><td></td></tr><tr><td>120 V Solenoid puller</td><td></td><td></td><td>Home-made, see parts list</td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Anatech USA</td><td>Hummer 6.2</td><td></td></tr><tr><td>Current source for iontophoresis</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Piezoelectric actuator</td><td>Piezosystem Jena</td><td>P-150-00</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier for piezoelectric actuator</td><td>Piezosystem Jena</td><td>ENV800</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For one-chamber preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode amplifier</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously</td></tr><tr><td>Magnetic pins (x2)</td><td></td><td></td><td>Home-made, see parts list</td></tr><tr><td>Open-top chamber with magnetic sheet</td><td></td><td></td><td>Home-made, see parts list</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;For two-chamber preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upper chamber</td><td></td><td></td><td>Supplementary file 1</td></tr><tr><td>Troughed lower chamber</td><td></td><td></td><td>Supplementary file 2</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Mounting block</td><td></td><td></td><td>Supplementary file 3</td></tr><tr><td>Wooden applicator sticks</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Teflon sheet</td><td>McMaster-Carr</td><td>8545K12</td><td>For teflon applicator</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Lab tissues (Kimwipes)</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Quick-setting epoxy</td><td>McMaster-Carr</td><td>7605A18</td><td></td></tr><tr><td>18 mm glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-546</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Saline components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;&amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Parts lists for home-made equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solenoid puller&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solenoid</td><td>Guardian Electric</td><td>A420-065426-00</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Foot-pedal switch</td><td>Linemaster</td><td>T-51-SC36</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Pipette holder</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH900R</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Coarse manipulator</td><td>Narishige Group</td><td>MM-3</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Platinum wire</td><td>Alfa Aesar</td><td>25093</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Leica</td><td>Z050-261</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Magnetic pins&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>McMaster-Carr</td><td>7556A33</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>1 mm thickness aluminum</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Open-top magnetic chamber&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexible magnetic strip</td><td>McMaster-Carr</td><td>5759K75</td><td>Other sources can be used</td></tr><tr><td>1 mm thickness aluminum</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>Other sources can be used</td></tr></tbody></table>

physiological preparation of hair cells from the sacculus of the american bullfrog (rana catesbeiana)

işitme ve denge çalışma modeli sistemlerinde biyofiziksel çalışmalardan alınan bilgilerle üzerine oturmaktadır. Böyle bir model Amerikan bullfrog sakkuluslar, işitsel ve vestibüler araştırma bir dayanak noktası haline gelmiştir. Bu organın Çalışmalar aktif ortamdan sinyalleri tespit nasıl duyusal hücrelerin saç ortaya koymuştur. Çünkü bu çalışmaların, şimdi daha iyi mekanik yolluk ve saç hücrenin transdüksiyon kanalları, mekanik uyarlamasında Kalsiyum rolü lokalizasyonu ve saç hücresi akımların kimliğini anlıyorum. Bu son derece erişilebilir bir organ saç hücrelerinin işleyişini içgörü sağlamaya devam etmektedir. Burada da saç hücreleri üzerinde biyofiziksel çalışmalar için BULLFROG en sacculus hazırlanmasını tarif etmektedir. Biz tam diseksiyon prosedürü içeren ve belirli bağlamlarda sacculus hazırlanması için özel protokolleri sağlar. Biz ayrıca hesaplanması dahil olmak üzere bu hazırlık kullanılarak temsilcisi sonuçları içerirsaç Paketin anlık kuvvet-deplasman ilişkisi ve Paketin kendiliğinden salınım ölçümü.

Bullfrog en sacculus duyusal epitel saç hücrelerinin fizyolojisini prob çeşitli konfigürasyonlarda kullanılabilir. Doku nispeten düz olduğu için, tek ve iki-odacıklı preparatlar hem de monte edilebilir. tek odalı yapılandırma saç hücreleri elektrofizyolojik ve mikromekanik kayıtlar için basit bir kurulum sağlar. iki odacıklı hazırlık yerine Endolenfatik ve saç hücrelerinin sırasıyla apikal ve bazal tarafta perilenfatik bölmeleri simüle eder. Bu bölmeler birbirine saç hücreleri tarafından mechanotransduction çalışma için fizyolojik olarak uygun bir ortam sağlar. saç hücrelerinin duyarlılığı ve transdüksiyon özellikleri, mekanik stimülasyon elektrik tepki temelini oluşturur. Bu özellikleri prob, biz aynı anda tek bir saç kaydedilen onun paket konumunu hücre veHücrenin reseptör potansiyeli (Şekil 2). Biz ilk kuvvet darbelerini uygulamak için saç demeti kinociliary ampul için esnek bir cam elyaf bağlı. Daha sonra çift fotodiyot sistemi 2 (Şekil 2A) ile saç demeti en deplasman ölçüldü. Biz aynı anda keskin bir mikroelektrot ile hücreyi impaling saç hücrenin potansiyelini satın aldı. Bu saç demeti karşılık gelen yer değiştirme (Şekil 2B) karşı her bir mekanik uyarıma neden tepe voltaj yanıt işaretlenmesiyle bir yer değiştirme-yanıt eğrisi elde edilmiştir. saç hücrenin elektriksel tepki hem pozitif-negatif-deplasman ekstramumların için doyurur. Negatif değiştirme adımları ile membran potansiyelinin azalmasına mechanotransduction akım içeri doğru, bir dinlenme varlığını gösterir. Bu dinlenme akımı, hem hızlı hem de yavaş adaptasyon 17 Ca 2+ hareketi ile modüle edilir 18, 19, 20, 21. Bir saç hücrenin davranışı elektrik özellikleri üzerine değil, aynı zamanda onun duyusal saç demetinin mikromekanik üzerine sadece bağlıdır. İki odalı yapılandırma taklit bir saç demeti mekaniği çalışmaları için ideal koşullar sağlayan in vivo endolymph ve perilenf ayrılması. Bu koşullar altında ve kaldırılır otolithic membran ile, saç demetleri kendiliğinden 6 salınım olabilir. Burada bireysel demetleri mikromekanik değerlendirmek için iki odacıklı hazırlık kullandı. Biz bir çift fotodiyot deplasman monitör (Şekil 3) üzerindeki gölge döküm bir saç demeti spontan salınımların kaydedildi. mechanotransduction üzerinde antibiyotik aminoglikozid gentamisin rolünü değerlendirmek için, iyontoferik rele<html> saç demeti doğrudan gentamisin ased (Şekil 3). serbest gentamisin konsantrasyonu mikropipet geçti akım ile orantılı artar. Gentamisin saç Paketin salınımları inhibe ederek uzun tarafına doğru demetin ofset statik neden olur. Bu etkiler kendi nüfuz gözenek bloke ederken mechanotransduction kanalların açık durumunu koruyan bir açık kanal blokörü olarak gentamisin rolünü yansıtmaktadır. Yüklü kimyasal iyontoforez lokalize ve sıvı akış kaynaklı mekanik bozulma olmaksızın çeşitli konsantrasyonlarda kimyasal ölçülebilir salma ve bu nedenle ideal olarak saç demeti 22 ile mechanosensitive organellerin çalışma için uygundur izin verir. Bir saç demeti spontan hareket, uyum ve doğrusal olmayan demet sertlik 7 arasındaki etkileşim doğarxref &quot;&gt; 8, 23, 24. Bu kendiliğinden hareket viskoz sürükle aşmak için mekanik çalışma içine sinyal enerjisini dönüştüren bir saç demeti aktif sürecin, bir imza. Saç demetleri vestibüler 2, işitsel nonlineer anlık sertliği sergiledikleri görülmüştür 25, ve lateral hattı sistemleri 26. Bu doğrudan BULLFROG en sacculus (Şekil 4) bağımsız bir saç demeti ani sertlik ölçülmüştür. Bu amaca ulaşmak için, saç demeti en kinociliary ampul (Şekil 4A) için esnek bir cam elyaf ucu bağlanmış. Biz elyafın tabanını yerinden saç demeti kuvvetleri teslim. uyarıcı fiber saç demeti üzerine uygulanan kuvvet elyafın bas deplasmanları arasındaki farka tekabüle ve ucu, fiberin sertlik 2, 27 ile çarpılır. güçlerin bir dizi genelinde bakliyat teslim paket ve Paketin takip eden yerinden üzerine uygulanan kuvvet arasındaki ilişkiyi ortaya koymaktadır. Bu kuvvet-deplasman ilişkisi eğimi saç Paketin anlık sertlik (Şekil 4A) karşılık gelir. Bu yöntem kendi sapma (Şekil 4B) &#39;in bir fonksiyonu olarak tek bir grubu en anlık sertliği ölçmek için izin verdi. ani kuvvet-yer değiştirme eğrisinin dinlenme konumu etrafında yaklaşık 20 nm aralığında demetin lineer olmayan bir sertlik ortaya, doğrusal olmayan bir ilişkiyi gösterir. bu kapsam dışında, saç demeti, bir Hookyen malzeme gibi, kendi sertliği büyük büyüklüğü saptırma lineer şekilde hareket eder. Bu sonuçlar, demonstsaç hücre fizyolojisinin çalışmada bullfrog sacculus çok yönlülüğünü oranı. Bu ve diğer hazırlıkları kullanarak, bir beyne doğru paket bilgilerin iletimi birden aşamalarında mekanotransdüksiyonu keşfedebilirsiniz. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig1.jpg" /> Şekil 1: Bullfrog Inner Kulak diseksiyonu. Ventral taraftan Bullfrog üst damak görüntüleme (A) Östaki borusu (daire) tanımlanmasına izin verir. Üst damak sağ tarafını kaplayan derinin yan yansıma iç kulak (kesik kutu) yerini ortaya koymaktadır. Kurbağanın temporal kemiğin ventral tarafta kıkırdak (B) Temizleme otik kapsül (kesikli çizgi) açılır. Görüntülenen (C) otik kapsül daha yüksek bir büyütme görüntü, hangi sakkuluslar, lagena, CN VIII, ve SACC içinde<html> nitlerin sinir kolaylıkla tespit edilebilir. (D) iç kulak organların çıkarıldıktan sonra otik kapsül bir görünüm semisirküler kanalların yerleri ortaya koymaktadır. Kraniyal sinir (CN VIII) &#39;inci izole iç kulak, sacculus, lagena ve VIII çıkarılmasından sonra (E) kolayca tespit edilebilir. (F) izole sakkuluslar sakküler sinir ve duyu epiteli üstünde yatan bir otolithic zarının kısa güdük sahiptir. Etiketler (ii) lagena, (iii) CN VIII (IV) &#39;sakküler sinir ve (v) otolithic membran (I)&#39; in sacculus karşılık gelmektedir. Eksen P etiketler ve A posterior ve anterior yönde sırasıyla gelmektedir. Ölçek çubukları 1 cm (A, B), 1 mM (C, D, E) ve 400 um (F) ifade etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55380/55380fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> s &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig2.jpg" /> Şekil 2: Tek Saç Hücre Deplasman-cevap Eğrisi. (A) bir cam uyaran lif ucu kinociliary saç demetinin ampul ve fiberin tabana birleştirilmiş olan, daha sonra, dokuz farklı aşamalarda arasında yer değiştirmiştir. Paketin konumu çift fotodiyot sisteminde takip edildi, ve onun reseptörü aynı zamanda, potansiyel, çıkış köprüsü modunda bir amplifikatör içinden geçirilmiş bir mikroelektrot kullanılarak ölçülmüştür. elektrot ucu direnci 95 M? ve Paketin istirahat membran potansiyeli oldu -47 mV. (B) yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak Paketin reseptör potansiyel bir arsa Paketin yanıtı ve onun arasında doğrusal olmayan bir ilişkiye ortayapozisyon. Her nokta mekanik stimülasyon başlamasından sonra 2.5 ms başlayan bir 2.5 ms zaman pencere üzerinde ortalama potansiyeli ve ortalama yerinden karşılık gelir. Her renk, aynı deplasman darbesine karşılık gelen zaman serilerinin bir dizi temsil eder. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55380/55380fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55380/Figure2_Xd_Xc_Vm_version4.eps" target="_blank">Bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55380/55380fig3.jpg" /> Şekil 3: Spontan Saç Bundle Salınım üzerinde Gentamisin Etkisi. İki odacıklı preparat bir saç demeti kendiliğinden hareket çift fotodiyot sistemi kullanılarak kaydedilmiştir. gentamisin iyontoforetik sürümü yokluğunda (0 nA) ise, saçdemet simetrik titreşimleri görüntüler. Mevcut büyüklüğü gentamisin sülfat büyür 500 mm (10 Na, 20 nA), saç demeti başka bir frekans doza bağlı bir şekilde düşer ve paket uzun için uzun kenarına doğru ofset dolu bir iyontoforetik pipet geçerken zaman dilimleri. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55380/55380fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55380/Figure3_GentaSpontOsc_version2.eps" target="_blank">Bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55380/55380fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir saç demeti en Ani Rijitliğinin hesaplanması. Sertlik K F (A) uyaran lif (kırmızı) t bağlanıro ayrı bir saç demeti (sarı) ve (kahverengi) kinociliary ampul. Lif tabanını yerinden bilinen bir mesafe X F X mesafesi B taşımak için paket neden olur. Kuvvet uyaran lif, F F paket üzerine uygulanan lif ve paketin deplasmanları arasındaki fark orantılıdır. güçlerin bir dizi genelinde bu Tekrarı anlık kuvvet-deplasman ilişkisi (sağda), eğim olan saç Paketin anlık sertlik karşılık verir. (B) Bireysel paket darbe başlangıcı (mavi noktalar) ölçüldü sonra ilk 50 ms içinde artan büyüklük ve yer değiştirme darbeleri zorlamak tabi tutuldu. Burada saç demeti dinlenme konumu etrafında yaklaşık 20 nm aralığında doğrusal olmayan bir anlık sertliğini gösterir. * Z - 60 * z * (1 / (1 + exp (- kırmızı eğri ilişkisi F = k * X bir uyum tekabül<html> (X - X 0) F paket uygulanan kuvvet olduğu / (k B * T))) + F 0, X Paketin deplasman, k = 790 ± 51 μN m -1 paket en sabittir ∙ sertlik tüm kanallar kapalı ya da açık olan, z = 0.43 ± 0.04 pN tek yolluk yayının kuvveti, X 0 = 2 ± 1.9 nm kendi kanalları% 50 açık hangi Paketin konumu, k B Boltzmann olduğunu sabit, T sıcaklığı ve F 0 = 11.7 ± 1.3 pN ofset güçtür. uygun 0.98 belirlenmesi bir katsayısına sahiptir. Uyarıcı lif 107 μN bir sertlik m -1 ∙ vardı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55380/55380fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> es / ftp_upload / 55380 / Figure4_v5.eps &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın bir vektör sürümünü indirmek için buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> çözünen </td><td rowspan="2"> Formül Ağırlığı (g / mol) </td><td colspan="2"> 1 L Ekle </td></tr><tr><td> yapay perilenf </td><td> yapay endolymph </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 58.4 </td><td> 6.54 g </td><td> 0.117 g </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 0.149 </td><td> 0.149 g </td><td> 8.62 gr </td></tr><tr><td> CaCl2 ⦁ 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 1 M CaCI2 stokunun 2 mL </td><td> 1 M CaCl2 stokunun 250 uL </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 238,3 </td><td> 1.19 g </td><td> 1.19 g </td></tr><tr><td> D - (+) - glukoz </td><td> 180.2 </td><td> 0.541 g </td><td> 0. 541 gr </td></tr></tbody></table> Diseksiyon ve Deneysel Hazırlama Tablo 1. çözümler. Yapay perilenf ve diseksiyon ve tek veya iki odalı hazırlıkları kullanılan yapay endolymph çözümleri için tarifler bu tabloda alınmaz. çözeltiler pH 7.2 getirilmelidir - 7.4 NaOH (perilenf) ya da 2 mL KOH (endolymph) yaklaşık 2 mL. Ozmotik gücü yaklaşık 230 mmol okumalısınız · kg-1 eksik iyonik ayrışma nedeniyle.

Watch this Scientific Journal Video about Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana at JoVE.com

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

Amerikan bullfrog en (Rana catesbeiana) sakkuluslar saç hücre fizyolojisinin doğrudan muayene izin verir. İşte diseksiyon ve biyofiziksel çalışmaları için Bullfrog en sacculus hazırlanması tarif edilmektedir. Biz onun unforced bir hareket Paketin kuvvet-deplasman ilişkisi hesaplanması ve ölçümü de dahil olmak üzere, bu saç hücrelerinden temsili deneyler göstermektedir.

Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

physiological-preparation-hair-cells-from-sacculus-american-bullfrog

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

16.7K Görüntüleme.  The Rockefeller University.  Amerikan bullfrog en (Rana catesbeiana) sakkuluslar saç hücre fizyolojisinin doğrudan muayene izin verir. İşte diseksiyon ve biyofiziksel çalışmaları için Bullfrog en sacculus hazırlanması tarif edilmektedir. Biz onun unforced bir hareket Paketin kuvvet-deplasman ilişkisi hesaplanması ve ölçümü de dahil olmak üzere, bu saç hücrelerinden temsili deneyler göstermektedir. 

Video: Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Nörobilim

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives from their characteristic apical bundle of stereocilia, a critical element for detection and transduction of sound energy 1. OHCs are able to change shape &#x2014;elongate, shorten and bend&#x2014; in response to electrical, mechanical and chemical stimulation, a motor response considered crucial for cochlear amplification of acoustic signals 2.
OHC stimulation induces two different motile responses: i) electromotility, a.k.a fast motility, changes in length in the microsecond range derived from electrically-driven conformational changes in motor proteins densely packed in OHC plasma membrane, and ii) slow motility, shape changes in the millisecond to seconds range involving cytoskeletal reorganization 2, 3. OHC bending is associated with electromotility, and result either from an asymmetric distribution of motor proteins in the lateral plasma membrane, or asymmetric electrical stimulation of those motor proteins (e.g., with an electrical field perpendicular to the long axis of the cells) 4. Mechanical and chemical stimuli induce essentially slow motile responses, even though changes in the ionic conditions of the cells and/or their environment can also stimulate the plasma membrane-embedded motor proteins 5, 6. Since OHC motile responses are an essential component of the cochlear amplifier, the qualitative and quantitative analysis of these motile responses at acoustic frequencies (roughly from 20 Hz to 20 kHz in humans) is a very important matter in the field of hearing research 7.
The development of new imaging technology combining high-speed videocameras, LED-based illumination systems, and sophisticated image analysis software now provides the ability to perform reliable qualitative and quantitative studies of the motile response of isolated OHCs to an external alternating electrical field (EAEF) 8. This is a simple and non-invasive technique that circumvents most of the limitations of previous approaches 9-11. Moreover, the LED-based illumination system provides extreme brightness with insignificant thermal effects on the samples and, because of the use of video microscopy, optical resolution is at least 10-fold higher than with conventional light microscopy techniques 12. For instance, with the experimental setup described here, changes in cell length of about 20 nm can be routinely and reliably detected at frequencies of 10 kHz, and this resolution can be further improved at lower frequencies. 
We are confident that this experimental approach will help to extend our understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying OHC motility.

A reliable method to investigate outer hair cell (OHC) motile responses, including electromotility, slow motility and bending, is described. OHC motility is elicited by stimulation with an external alternating electrical field, and the method takes advantage of high-speed image recording, LED-based illumination, and last generation image analysis software.

Harici Alternatif Elektrik Alan Uyarılma ve Görüntü Analizi Yüksek hızlı bir kombinasyonu ile Dış Saç Hücre Motilite incelenmesi

OHCs are cylindrical sensorimotor cells located in the Organ of Corti, the auditory organ inside the mammalian inner ear. The name "hair cells" derives ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Elektrofizyoloji ve yüksek çözünürlüklü İki foton Mikroskopi için Fare Vestibüler Duyu epiteli bir İzole Yarı sağlam Hazırlık

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Gelişim Biyolojisi

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Biyomühendislik

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler