Bu çalışmada JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ ve Robert ve Janice McNair Vakfı tarafından finanse edildi.
Biz Sandra Pena ve Andrene McDonald hasta işe alım, Samuel Blum için teknik destek, Dr George Makedonas antikorlar ve kontrol DNA PCR optimizasyonu için kullanılan hediye için teşekkür ederim.

1. ilgi T hücre nüfusu tanımlamak.
 Not: antijen belirli hücre bölünmesi boya (gibi Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE) ile birlikte nükleer silahların yayılmasına karşı-ebilmek var olmak kullanılmış-T hücreleri izole etmek için onların nükleer silahların yayılmasına karşı yanıt olarak antijenik stimülasyon dayalı. PBMCs başlayan, 7 günlük vitro genişleme bir antijen belirli CFSE düşük nüfus 12 tanımlamak için yeterli olmalıdır.
<ol><li>Mix PBMCs besleyici MHC eşlemeli hücreleri ve etiket 5 µM CFSE hücre bölünmesi boya ile 1:1.</li>
	<li>Plaka 2-2,5 x 10 5 hücre başına iyi bir 96-şey yuvarlak-alt plaka 200 µL % 10 FCS tam RPMI medya kültür. 
	Not: Tam RPMI içeren 2 mM l-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 100 µM MEM önemli olmayan amino asitler, 5 mM HEPES, 5.5 × 10 &#8722; 5 2-mercaptoethanol birimleri, 100 U mL &#8722; 1 penisilin ve 100 µg mL &#8722; 1 streptomisin.</li>
	<li>Teşvik hücreleri 25 µM peptid antijen ile.</li>
	<li>Kültür dördüncü gününde dikkatle kaldırın ve medya 100 µL değiştirin. 
	Not: Peptit-HLA tetramers 13 kullanımı antijen spesifik T hücre kimliği için daha uygun bir yaklaşımdır. Tetramer boyama sağlar antijen özgüllük gibi HLA-kısıtlama eşzamanlı değerlendirilmesi için.</li>
</ol> 2. Tek hücre sıralama ayarlayın.
<ol><li>Perform tüm yordamları bir başlık veya belirlenmiş bir alanda güçlendirilmiş şablon / ücretsiz. Aliquot, kontaminasyon reaktifleri temiz tüm çalışma yüzeyleri ve mümkünse, ekipman % 10 ile çamaşır suyu önce PCR Kur. Filtre ipuçları, RNAse ve Dnaz ücretsiz reaktifler ve plastik PCR ve adımları klonlama vektör kullanın. Anahtar reaktifler Malzemeler tablo bulundu. 
	Not: Çoklu PCR reaksiyon son derece duyarlıdır ve kirlenme seviyesinin düşük güçlendirilmiş üründe neden olur.</li>
	<li>Generate 10 x RT tepki birleştirerek ters transkripsiyon ana mix tampon, 25 X DNTPs, 9 U RT enzim, % 0,01 Triton-X, 0.7 U RNAse inhibitörü ve 383 nM (Tablo 1 ' de listelenen) her RT-TCR astar steril pipetting Reservoir. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için her 96-şey plaka için 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için yeterli ana karışımını oluşturur. Reaksiyon bileşenleri ve iyi başına tutarları için bkz: Tablo 2.</li>
	<li>Hazırlama bir 96-şey PCR koleksiyon plaka hücre başına iyi bir çok kanallı pipet ile ters transkripsiyon ana karışımı pipetting 6 µL sıralama için. Plaka buz veya soğuk bir blok içinde devam.</li>
	<li>Etiket (örneğin, CD4 ve CD3, veya CD8 ve CD3, her biri 2 µg/mL, hücre bölünmesi boya veya boyama tetramer) yüzey işaretleyicileri hücre için antikorlar içeren hücreleri.</li>
	<li>Bir sıralama T hücreleri hücre başına iyi, bir negatif kontrol görev yapacak on ikinci satır atlanıyor. 
	Not: Sıralama verimliliğini kesin toplama plaka hizalama plaka sahibi gibi hücreleri ve plakaları cDNA reaksiyon önce düşük ısıda muhafaza içinde bağlı olacaktır. Koleksiyon tabakları buz üzerinde her zaman, dışında onlar içinde soğutma plaka tamir ederken, sıralama sırasında tutulmalıdır. Tüm sorters bir sıcaklık düzenlenmiş plaka sahibi ile donatılmıştır; Ancak, bir kullanımı önerilir. Sıralama genellikle yaklaşık 10-15 dk plaka başına alır bu yana, olup olmadığını RNA bozulması için artan bir potansiyel plaka bir düşük sıcaklıkta korunmaz.</li>
	<li>Pozitif bir denetim olarak hücreleri (100 hücreleri) daha çok sayıda el ile bir pipet ile kuyuları için bu aşamada ekleyin. Alternatif olarak, daha önce izole RNA havuza alınan hücrelerden bir olumlu denetim 10, kullanılabilir ng iyi başına. 
	Not: saf denetim RNA hassasiyetle pipet ve Çapraz bulaşma diğer wells ve yanlış pozitif sonuçlar önlemek için dikkat.</li>
	<li>Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te ° C.</li>
	<li>Hemen uyarlamak RNA cDNA için 25 ° c 10 dk, 37 ° C için 45 dk, plaka kuluçka ve 10 dk. 85 ° C 
	Not: verimli PCR reaksiyon emin olmak için ilk PCR reaksiyon aynı gün yapılması önerilir. Alternatif olarak, kopya etmek plakaları-80 ° C'de 2 aya kadar tutulabilir.</li>
</ol> 3. Multiplex iç içe PCR gerçekleştirmek Not: tüm ana karıştırır kirlenmesini önlemek için bir temiz ücretsiz şablon alanda hazırlayın.
<ol><li>Sulandırmak her değişken bölge astar Dnaz ve RNAse free H 2 O. ile 100 µM Daha sonra her birinin V-Alfa astar havuzu oluşturmak için 44 astar 20 µL birleştirin. Astar havuzu V-beta oluşturmak için her biri 40 V-beta astar artı 80 µL Dnaz ve RNAse free H 2 O. dizileri Tablo 1 ' de listelenen astar 20 µL birleştirir. Havuza alınmış bir kez her astar karışımında 2.3 µM bölgedir.</li>
	<li>Sabit bölge astar Dnaz 100 µM hisse senedi çözüm için sulandırmak ve RNAse free H 2 O. Dilute 10 µM çalışma çözüm ve aliquot kullanılmak için sabit bölge astar.</li>
	<li>İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta amplifikasyon için hazır olun. 5 X birleştirerek ana karışımları oluşturmak tampon, 80 µM dNTPs, % 3 DMSO, 2 µM astar Havuzu (46 son konsantrasyonu nM her astar için), 200 nM TCR-sabit bölge ters astar, 1 U DNA polimeraz ve Dnaz ve RNAse free H 2 O (Tablo 2 ). Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj. 
	Not: Son şey, nerede 22.5 µL ana PCR karışımı 2.5 µL cDNA şablonu ile birleştirilmiştir başına 25 µL PCR hacmi hesaplamaları dayanır.</li>
	<li>Plaka cDNA buz veya soğuk bir blok ile tutun. Bir çok kanallı TCR-beta tepki yeni bir 96-şey PCR tabak içine 22.5 µL pipet için kullanın. Sonra cDNA 2.5 µL PCR plaka aktarmak için bir çok kanallı kullanın.</li>
	<li>Bir çok kanallı TCR-Alfa tepki içine doğrudan cDNA kalan içeren plaka 22.5 µL pipet kullanın.</li>
	<li>Yapıştırıcı, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te plakalarının ° C.</li>
	<li>Multiplex PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 54 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.</li>
	<li>Taşıma 25 son bir hacim içinde iç içe geçmiş PCR reaksiyon dışarı µL, multiplex PCR karışımı 2.5 µL şablon olarak kullanarak.
	<ol><li>İle Dnaz ve RNAse free H 2 O. olun 10 µM aliquots çalışan hisse senedi için 100 µM için iç ve adaptör astar reconstitute.</li>
		<li>İki ayrı ana karışımları TCR-Alfa ve TCR-beta ampl için hazırlanın.ification. Mix 5 X arabellek, 25 X DNTP, % 3 DMSO, 200 nM ileri adaptör astar, 200 nM ters iç içe astar, 1 U DNA polimeraz ve DNA polimeraz ve nükleaz ücretsiz H 2 O 22.5 µL (Tablo 2) son bir birim için. Pipetting sırasında sıvı kaybı telafi etmek için yeterli ana mix 10 ek reaksiyonlar (Toplam 106), için her 96-şey plaka için makyaj. 
		Not: ikinci PCR reaksiyon kullanımda 5 X PCR tampon yükleme özel jel kolaylaştırmak için içeren yükleme boya.</li>
		<li>Bir çok kanallı, kullanarak ana karışımları iyi başına 22,5 µL adlı TCR-Alfa ve TCR-beta tepkiler iki yeni 96-şey PCR tabak içine pipette.</li>
		<li>Şey başına 2.5 µL, multiplex PCR reaksiyon şablonu ekleyin. 
		Not: Kalan ilk PCR reaksiyon gereken mühürlü ve gerekli olursa ek şablon, bir kaynağı olarak hizmet için-20 ° C'de depolanan (4.3 Not adım bkz:).</li>
		<li>Plakaları, yavaşça girdap ve spin aşağı vasıl 1000 x g 5 min için saat 4'te mühür ° C.</li>
		<li>İç içe geçmiş PCR reaksiyon ile aşağıdaki devir çalıştırın: 95 ° C'de 5 dk 20 34 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 30 s 56 ° c ve 1 dk. 72 ° C'de 72 7 dakika izledi ° C.</li>
		<li>Çalıştırmak 5 µL % 1 özel olarak tepki son jel içeren etidyum bromür (negatif ve pozitif kontrol wells de dahil olmak üzere). 
		Not: Beklenen grup yaklaşık 500 bp boyutunda çalıştırmalısınız. Şekil 2 ' deki bir örnek tepki.</li>
		<li>Bir 96-şey biçimi PCR arıtma seti kullanarak ikinci reaksiyon (20 µL) kalan arındırmak, 70 ° C H 2 O şey başına 15 µL ile elute ve Sanger gerçekleştirmek sıralama. (Tablo 1) sıralama için uygun TCR-alfa veya TCR-beta adaptör ileri astar kullanın. 
		Not: Dizileri online kullanılabilir immunogenetics yazılımı ile çözümlenebilir.</li>
	</ol></li></ol> 4. PCR zincirleri Alfa ve beta alt klonlama.
 Not: ilk tepki olarak kullanılan ileri astar ve ikinci PCR reaksiyon geriye doğru astar havuzu kısıtlama siteleri birleştirmek için kullanılır. Bu nedenle, elde edilen alpha ve beta zinciri PCR ürünleri sırayla alt şablon retroviral vektör ( şekil 1) klonlanmış olmaya hazır mısınız.
Belgili tanımlık beta Urun <ol><li>Özet arıtılmış PCR iç içe tepki ile BstbI ve MfeI (Tablo 3). 
	Not: 5 µg Ekle aşmamaktadır.</li>
	<li>Paralel olarak, BstbI ve MfeI (Tablo 3) ile şablon vektör sindirmek. 1-2 µg şablon vektörünün TCR başına kullanın. Üzerinde bir özel jel sindirilir vektör çalıştırmak ve daha büyük grup (~ 7500 bp) yalıtır. Bir jel DNA arıtma kiti ile vektör arındırmak. 
	Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-beta değişken bölge, insan TCR-beta değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.</li>
	<li>Arındırmak PCR arıtma kiti kullanılarak sindirilir PCR ürünleri. 
	Not: kit ile birlikte sütunları DNA arıtma kapasitesine doğrulayın; birden fazla sütun kullanın. Arıtılmış ekleme başarılı tüp ligasyonu reaksiyon için gerekli minimum meblağ 50 dır 10 ng/µL en az bir konsantrasyon, ng. Arıtılmış Ekle tutar için başarılı bir ligasyonu yeterli değilse, ikinci PCR reaksiyon tekrar edilebilir.</li>
	<li>37 ° C'de ısı inactivation 75 10 dk ardından kendini ligasyonu önlemek için şablon vektör 1 h için 10 U CIP enzim ile tedavi ° C. arındırmak DNA ile bir PCR arıtma Kiti (Tablo 3).</li>
	<li>Ligate TCR-beta takın ve oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak vektör. 
	Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).</li>
	<li>Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Super En iyi suyu Catabolite bastırma (S.O.C.) orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c</li>
	<li>Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.</li>
	<li>Beta zincirinin başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri BstbI ve MfeI ile onaylayın. Bir 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 X enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).</li>
	<li>Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra IRES ters astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-beta bölümü.</li>
	<li>Sıra onay TCR-beta ucun takip Alfa değişken bölge ekleme için benzer işlemler gerçekleştirmek. Alfa iç içe tepki ve SnaBI ve SacII ile vektör içeren yeni oluşturulan TCR-beta INSERT arıtılmış PCR Urun sindirmek. 
	Not: restriksiyon enzimi Özet sırasında şablon fare TCR-Alfa değişken bölge, insan TCR-Alfa değişken bölge eklenmesi için izin kaldırılır.</li>
	<li>Ligate Alfa ekler içine oda sıcaklığında 30 dk için DNA ligaz 6 molar aşırı ucun 20 µL toplam birimi kullanarak karşılık beta değişken bölge kodlaması TCR vektörel çizimler. 
	Not: Toplamda, yaklaşık 150 ligasyonu tepki içermelidir ng DNA (Tablo 3).</li>
	<li>Dönüştürmeleri için ligasyonu tepki 8 µL 80 µL kimyasal olarak yetkili E.coli DH5α hücrelerinin (Malzemeler tablo) ile karıştırın ve 30 dk. 45 s. eklemek 500 µL S.O.C. için 42 ° C'de ısı şok buz üzerinde kuluçkaya Orta ve sallamak için 1,5 saat 37 ° c</li>
	<li>Plaka 250 dışarı µL bakteriyel kültür Lysogeny suyu (LB) agar plaka içeren bir Ampisilin üzerinde. Plaka gecede (~ 16 h) 37, kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Ertesi gün bakteri kolonileri almak ve gecede Ampisilin içeren 3 mL LB ortamda büyümek. DNA plazmid arıtma kit kullanarak plazmid DNA izole.</li>
	<li>Alfa zinciri başarılı ekleme tarafından küçük ölçekli test Özeti enzimleri SnaBI ve SacII ile onaylayın. 12 µL toplam reaksiyon hacminde 200-500 µg plazmid DNA, 0,25 µL her enzim ve 10 x enzim tampon (Tablo 3) oluşur. Reaksiyon dışarı Ekle grup boyutunu onaylamak için etidyum bromür içeren bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırmak (~ 500 bp).</li>
	<li>Ekleme varlığı onayladıktan sonra sıra MSCV2 ileri astar (Tablo 1) kullanarak vektör TCR-alfa bölümünü.</li>
	<li>Alfa zinciri sıra doğrulandıktan sonra sıralama ile TCR-beta-ters ve IRES mütedavil astar (Tablo 1) tarafından tam TCR Ekle doğrulayın.</li>
</ol> 5. TCR hücre yüzey ifade ve özgüllük doğrulayın.
 Not: HEK293T hücreleri başarılı TCR zincir PARI sınamak için kullanılırNG ve hücre ifade ( şekil 3A) 8 yüzey. Peptid-MHC tetramer boyama da gerçekleştirilebilir antijenik özgüllük yazı TCR gen yalıtımı ( şekil 3B) saklamak için test etmek için transfected HEK293T hücrelerde.
<ol><li>Plaka dışarı HEK293T hücreler 12-iyi doku kültürü plakaları, 1 mL tam DMEM medya içeren % 5 FCS kuyuda başına 1 x 10 5 hücre ve kültür gecede at 37 ° C. plaka ayrı wells her yeni TCR için tanımladığınız için yeterince hücre dışarı , denetim şablonu TCR vektör, CD3 vektör sadece, kontrol TCR vektör tek ve bir transfected de. 
	Not: Transfection bir şablonla tam olarak fare TCR vektör (mTCR-pMIA) kombinasyonu ile mCD3εγδζ-pMIG vektör, vektör yalnız, mTCR-pMIA ve mCD3εγδζ-pMIG vektör yalnız pozitif ve negatif denetimler kullanılır. 
	Not: Tam DMEM 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum Pyruvate, 100 µM içerir Sigara-esansiyel Amino asitler, 5 mM HEPES tampon, 5,5 x 10 -5 ünite 2-mercaptoethanol, 100 U/ml penisilin/streptomisin.</li>
	<li>Ertesi gün 1 µg chimeric h/mTCR-pMIA vektör, 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör ve üretici talimatları lipozom tabanlı transfection reaktif hücrelerle transfect.</li>
	<li>Her TCR için 6 µL transfection reaktif 100 µL oda sıcaklığına, serum-Alerjik DMEM ekleyin. Kısaca girdap ve 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Ayrı 1,5 mL tüpler TCR-pMIA vektör 1 µg 1 µg fare CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vektör veya denetimler için ayrı her vektör 1 µg birleştirin.</li>
	<li>Dropwise, vektör DNA içeren tüpler transfection reaktif/DMEM çözüm ekleyin. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
	<li>Dropwise, HEK293T hücrelere transfection reaktif/DMEM/DNA çözüm ekleyin. Yavaşça karıştırın için plaka dokunun. 24 h için 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Sonra 24 h ortamı, değiştirin ve hücreler kültür ek 24 h için tutmak</li>
	<li>Kaldırmak hücreleri plaka dinç pipetting tarafından ve anti-fare CD3 antikor (2,5 µg/mL) Akış Sitometresi tarafından chimeric TCR yüzey ifade doğrulamak için hücrelerle leke.</li>
	CD3 ifade benzer bir seviyeye transfected hücreler arasında karşılaştırmak için <li>kapı hücreleri floresan muhabir molekülleri (CD3 kompleksinin için GFP ve Ametrine TCR ifade vektör için) benzer yüksek düzeyde ifade analiz. En iyi şekilde, analiz geçişli GFP + Ametrine + 10 içindeki hücreleri 4 ' e 10 5 floresan yoğunluğu ( şekil 3A). 
	Not: Sahip chimeric yapı transfected hücrelerin CD3 ifade düzeyini kontrol fare (özgün şablon) vektör ( şekil 3A) yakın olabilir. Oluşturulan TCR retroviral vektörler vivo içinde ifade sistemleri ile uyumlu yukarıda açıklanan 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+development+and+the+CD4-CD8+lineage+decision.">T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision.</a> Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).</li><li>Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+fate+and+intense+debate:+myths,+models+and+mechanisms+of+CD4-+versus+CD8-lineage+choice.">Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice.</a> Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).</li><li>Tubo, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+naive+CD4++T+cells+from+a+diverse+repertoire+produce+different+effector+cell+types+during+infection.">Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection.</a> Cell. 153 (4), 785-796 (2013).</li><li>Sprouse, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+and+expression+of+human+TCRs+in+retrogenic+mice.">Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice.</a> J Immunol Methods. , (2016).</li><li>Lennon, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+islet+accumulation+in+type+1+diabetes+is+a+tightly+regulated,+cell-autonomous+event.">T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event.</a> Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).</li><li>Dash, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+analysis+of+TCRalpha+and+TCRbeta+chains+at+the+single-cell+level+in+mice.">Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice.</a> J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).</li><li>Kobayashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+cloning+and+expression+system+yields+and+validates+TCRs+from+blood+lymphocytes+of+patients+with+cancer+within+10+days.">A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days.</a> Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).</li><li>Szymczak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+multi-gene+deficiency+in+vivo+using+a+single+'self-cleaving'+2A+peptide-based+retroviral+vector.">Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector.</a> Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).</li><li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors.">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+retrogenic+mice:+a+rapid,+flexible+alternative+to+T-cell+receptor+transgenic+mice.">T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice.</a> Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).</li><li>Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+T-cell+selection+in+vivo+using+T+cell-receptor+retrogenic+mice.">Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice.</a> Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).</li><li>Mannering, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells.">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+percentage+of+peripheral+T+cells+with+two+different+T+cell+receptor+alpha-chains+and+of+their+potential+role+in+autoimmunity.">Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity.</a> J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).</li><li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice.">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+T+cell+receptor-retrogenic+mice:+improved+retroviral-mediated+stem+cell+gene+transfer.">Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer.</a> Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).</li><li>Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antitumor+activity+of+murine-human+hybrid+T-cell+receptor+(TCR)+in+human+lymphocytes+is+associated+with+improved+pairing+and+TCR/CD3+stability.">Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability.</a> Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geçerli protokol tek hücre TCR amplifikasyon ve sonraki eşleştirilmiş TCR alpha ve beta zincirleri bir şablon retroviral ifade vektör alt klonlama için verimli bir yöntem açıklanmaktadır. Her ne kadar bazı tek hücre PCR protokollerine geliştirilmiştir, hiçbiri defa hemen bir ifade vektör alt klonlama ile uyumlu olması. Çoğu durumda, son derece değişken CDR3 bölgeleri kapsayan bir kısmi sıra, değişken bölge ulaşmak için yeterli sırası ile güçlendirilmiş. Bu daha küçük PCR ürün boyutu yüksek PCR verimliliği destekler, ancak de novo TCR gen sentezi için fonksiyonel çalışmaları gerektirir. Geçerli protokol CDR3 odaklı daha önce yayımlanmış tek hücre TCR sıralama iletişim kuralları, aynı zamanda tüm değişken bölge klonlama için uygun içeren daha uzun bir amplicon verimli verimliliğini tutar. Bu nedenle, açıklanan sistem işlev çıktı yanı sıra bir nicel sıra vererek artan bir esnekliğe sahiptir.
Bilimsel soru ele bağlı olarak, kaynak ve özgüllük analiz T hücrelerinin değişebilir. Ancak, nihai hedef proje içinde vivo TCR işlevi analizi ise, HLA kısıtlama izole T hücrelerinin biliyorum gereklidir. Geçerli protokol vivo içinde TCR ifade HLA insanlaşmış farelerde ile uyumlu olacak şekilde özel olarak tasarlanmıştır. Çoğu bu fareler üretilen ve şimdi HLA-A2.1, HLA-DQ8 dahil olmak üzere ticari olarak kullanılabilir (HLA-DQA1 * 301, HLA-DQB1 * 302), HLA-DQ6 (DQA1 * 0102, HLADQB1 * 0602), HLA-DR4 (DRB1 * 0401), HLA-DR1 (DRA * 0101, DRB1 * 0101), HLA-A11 (A * 11:01 / K), HLA-B2705, HLA-A24 ve HLA - B * 0702 transgenik suşları. Bu iletişim kuralı başarıyla retroviral aracılı kemik iliği kök hücre ifade insan TCRs4,15,16için daha önce yayımlanmış protokolü ile kombine edilebilir. Otoimmün, beklediğimiz insanlaşmış TCR retrogenic sistemi uygulanabilir ve çeşitli insan TCRs fonksiyonel analiz için son derece yararlı olacak kanser ve enfeksiyon modelleri.
Şu anki tek hücre PCR Protokolü kritik adımları açıklar ve eşleştirilmiş TCR-Alfa ve TCR-beta sahneleri başarılı amplifikasyon için gerekli öneriler verir. İlk kritik adım cDNA transkripsiyon zamanında performansını ve çoklu PCR sonraki ilk tur olduğunu. Tüm adımları yer-meli var olmak kılınmak zamanında ve tüm reaktifler ve hücrelerin RNA ve cDNA yıkımı önlemek için buz tuttu. İkinci olarak, iletişim kuralı şablonu seviyesinin düşük son derece hassas olmak için tasarlandığından, kirlenme için son derece duyarlı. Bu nedenle, güçlendirilmiş PCR ürünleri veya vektör TCR klonlama uzak bir ücretsiz şablon alanında çalışmak şarttır. Bir ayrı oda ya da hood cDNA ve PCR reaksiyonları ayarlamak için kullanılır. İlk PCR reaksiyon şablonundan farklı bir alanda nerede PCR kurmak--dan eklenmesi gerekir. Bölünmemeli reaktifler ayrı bir kümesi tek hücre PCR deneyler için kullanılması tavsiye edilir.
Bu iletişim kuralı özellikle Malzemeler tabloiçinde listelenen reaktifler kullanarak optimize edilmiş ve herhangi bir oyuncu değişikliği reaktifler içinde ek optimizasyonu gerektirir. Antijen spesifik hücreleri ilk kimlik peptid-MHC tetramers kullanmak için değiştirilebilir. Tetramer boyama antijen özgüllük gibi HLA-kısıtlama eşzamanlı değerlendirmesi için sağlar. Upregulation erken harekete geçirmek işaretleri veya inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını gibi antijen reaktivite tespiti için alternatif yöntemler tetramer reaktifler olmaması durumunda kabul edilebilir. Örneğin, çift özgüllük füzyon antikorlar T hücre antijen ve IFNγ için özel antijen reaktif IFNγ üreten hücreler için zenginleştirmek için manyetik boncuk yalıtım ile kombine edilebilir.
Bizim iletişim kuralında tanımlanan chimeric insan/fare yapı fare hücreleri ile uyumluluğunu sağlar iken, insan CD3 kompleksinin ile uyumluluk düzeyi bilinmiyor. Resmen değil bizim tarafımızdan test rağmen diğerleri chimeric TCR yapıları fare sürekli bölgeleriyle insan lenfosit17yüzeyinde ifade edilebilir göstermiştir. Bu fare TCR sürekli bölgeler insan CD3 karmaşık sinyal ile etkileşim destekleyebilir gösterir. Ancak, Eğer amaç insan Primer hücre veya Jurkat hücreleri gibi insan hücre hatları tespit TCRs ifade etmek için tamamen insan bir yapı kullanan için daha iyi bir yaklaşım olabilir. Bu vektör içinde fare sürekli bölgeler insan sürekli bölgeleriyle swapping tarafından gerçekleştirilebilir.
Tanımlanan bir TCR değişken bölge klonlama için kullanılan kısıtlama sitelerinden birini içeriyorsa, TCR Servisi vektör eklenmesi gereken ve daha sonra kısıtlama içinde sessiz nükleotid değişim ikna etmek için bir site yönettiği mutagenesis kit kullanarak mutasyona uğramış site kesmek. TCR değişken bölge istenmeyen kısıtlama sitesi dışlamak için modifiye ilgi de novo sentezi bir alternatif yaklaşımdır.
Ana bu teknik yetersizlik ikincil 'sitoplazmik' Alfa zincirleri amplifikasyon ortadan kaldırmak için kısıtlamadır. TCR-Alfa gen TCR-beta genler gibi allelic dışlama ile böylece T hücreleri önemli bir bölümünü ikincil 'sitoplazmik' Alfa zinciri14hızlı gitme. Açıklanan PCR Protokolü sadece güçlendirilmiş Alfa zinciri ile güçlendirilmiş beta zinciri çifti değil 'sitoplazmik' Alfa zinciri olup olmadığını ama bir TCR Alfa zinciri amplifikasyon sonuçlanır. Bu nedenle, başarılı zincir eşleştirme sağlamak için HEK293T hücrelerde TCR hücre yüzey ifade sınamak için şarttır.

T hücre reseptör (TCR) T hücre kaderi karar geliştirme, kararlı duruma/homeostazı ve çevre1,2,3' te antijenik stimülasyon sırasında belirler. Son teknolojileri sıralama derin genişlemesi antijen belirli T hücre yanıt içinde daha önce değersiz bir TCR çeşitlilik ortaya çıkardı. TCR çeşitlilik işlevsel olarak geniş T hücre yanıt için bir potansiyel göstermektedir. TCR dizi repertuar analizi TCR fonksiyonel deneyleri ile entegrasyon için sıralama yaklaşımlar deneysel sistemleri ve seçin sonraki fonksiyonel analiz için kullanılan vivo içinde modelleri ile uyumlu olacak şekilde tasarlanmış olmalıdır TCRs. Biz insan TCR sıra izolasyonu için etkili bir yaklaşım geliştirdik ve TCR ifade HLA insanlaşmış fareler4ile uyumlu bir chimeric insan/fare TCR şablon vektör içine alt klonlama aerodinamik. Heterodimeric TCRs karşılık gelen alpha ve beta zincirleri yalıtımı PCR güçlendirme tek bir hücreden her iki zincirlerinin gerektirir. Rağmen birkaç tek hücreli TCR klonlama protokol geliştirilen ve kullanılan, hiçbiri defa kolayca yüksek üretilen iş kolaylaştırılmış doğrudan bilinmeyen Vα/Vβ TCRs retroviral vektörler yeniden ifade için içinde vivo gerekli içine klonlama ile uyumlu olması 4,5,6,7. Önceki çalışmalarda iki ana yaklaşım, ya seçerek sıra tahmin veya tüm TCR sıra4,5,6 yükseltmek için yeterli TCR sınırlı bir bölümünü yükseltmek için kullanılan , 7. ilk yaklaşım elde edilen TCR sıralarının aşağı akım fonksiyonel analiz gerektirir pahalı silico montaj ve de novo inşaat TCR. İkinci yaklaşım tam TCR sıra sağlamasına karşın, insan sabit bölge fare modellerinde klonlanmış TCRs vivo içinde ifade ile uyumlu değildir. Yaklaşımımız TCRs in vivo fare modelleri fonksiyonel analiz ile uyumlu olacak şekilde özel olarak tasarlanmıştır. Bir verimli ve rahat tek hücre doğrudan PCR parçalarının şablon ifade vektör alt klonlama için sağlar PCR Protokolü geliştirdik.
Bizim yaklaşım iki adımda gerçekleştirilen bir son derece hassas multiplex iç içe PCR reaksiyon kullanır. İlk multiplex tepki adım 40 astar V-beta zincirler için belirli bir havuz ve 44 astar tüm V-Alfa zincirleri TCR-alfa veya TCR-beta (Tablo 1) serisi ön bilgi olmadan yükseltmek için kullanılan belirli bir havuz. İleri astar 5' PCR ürününün dahil bir adaptör sırası vardır. Ters astar TCR sabit bölge üzerinde temel alır. Biz belirledik benzersiz kısıtlama siteleri yok insan değişken veya kavşak TCR bölgeler ve bunlar yeni redesigned TCRα ve TCRβ astar (şekil 1) içine dahil. İkinci iç içe geçmiş tepki olarak bir astar olarak adaptörü sırası için belirli ve sürekli bölgesi içinde iç içe geçmiş bir ters astar daha da artan özgüllük ile (Tablo 1, şekil 1) TCR zincir yükseltmek için kullanılır. Tek hücre izolasyon sonra iki PCR yuvarlar (ilk tepki Vα ve Vβ astar havuzu olan ve ikinci adaptör astar ile) neden doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlanmış bir PCR ürünü olup. Son TCR yapı, bir tek açık okuma çerçevesi (ORF), 'kendi kendine sıyırmada' protein sırayla bağlı fare sürekli bölgeleri ile birlikte insan değişken bölgeler içinde kodlar P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A sırası birden çok sistemlerinde kullanılan ve TCRs8,9,10,11Ifade özellikle kapsamlı olarak sınanmıştır. Her ne kadar sonra çeviri P2A sıra kalır çoğu bağlı için C-terminus beta zinciri sinyal sıra ek bir prolin, bu değişiklik ise esnek bir bağlayıcı tarafından bağlı Alfa zincirinin TCR işlevi üzerinde zararlı bir etkisi yoktur. Fare sürekli bölgesi insan yerine yapısında sinyal akış yönündeki bileşenlere ile potansiyel değişmiş etkileşimleri önlemek için kullanılır ne zaman fare hücrelerinde yeniden dile getirdi. Tek ORF alpha ve beta zincirleri9,11stokiometrik ayrı ifade neden olur. Geçerli protokol reaktifler ve yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar dayanmaktadır ve aerodinamik ve verimli bir şekilde yapılması için tasarlanmıştır. Biz özellikle otoimmün diyabet karıştığı self-reactive T hücrelerden TCRs tahlil için bu tekniği kullanmış olsa da, biz bu protokolü kimlik ve insan TCRs için belirli bir işlevsel değerlendirme için yaygın olarak uygulanabilir olabilir tahmin Otoimmün epitopları, kanser epitopları veya yanıt patojenlerin ve aşılar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">CFSE&#160;</td>
			<td style="width:148px;">eBioscience&#160;</td>
			<td style="width:116px;">65-0850-84</td>
			<td style="width:223px;">5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human CD4 (OKT4) BV421</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>317433</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>317336</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse CD3 AF647</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>100322</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-158</td>
			<td>0.7 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit&#160;</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>4368814</td>
			<td>9 U (RT enzyme)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gotaq DNA polymerase 2500U</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PAM3008</td>
			<td>1 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 Well Half Skirt PCR Plate</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>MPX-96M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Clear Adhesive Film&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>4306311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td>Invirtogen&#160;</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SnaBI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0130</td>
			<td>15 U (insert) 30 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacII</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0157</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MfeI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R3589S</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BstBI</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>R0519</td>
			<td>40 U (insert) 80 U (vector)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calf Intestinal Phosphatase (CIP)</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10 U</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs&#160;</td>
			<td>M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Plus minipreps DNA purification systems&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A1460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Plus midipreps DNA purification systems&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>A7640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA clean &#38; concentrator-25 kit</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>11-304C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZR-96 DNA clean &#38; concentrator-5 kit</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>11-306A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>18265017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent)</td>
			<td>Mirus&#160;</td>
			<td>MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACS Aria II (sorter)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Fortessa (flow cytometer)</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined single cell tcr isolation and generation of retroviral vectors for in vitro and in vivo expression of human tcrs

Sıralama eşleştirilmiş T hücre reseptör (TCR) Alfa ve beta zincirleri tek T hücrelerden için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir rağmen hiçbiri defa TCR heterodimers aşağı akım için elverişli vivo içinde fonksiyonel analiz edilmiştir. Biz neden olan bir insan TCR alpha ve beta zincirleri değişken bölgeleri kapsayan bir PCR ürünü bir iki adım multiplex iç içe PCR, dayalı gelişmiş bir iletişim kuralı geliştirdik. Benzersiz kısıtlama siteleri tanımlama ve onları PCR astar birleşmeyle, PCR ürünü doğrudan şablon retroviral vektör alt klonlama ile uyumlu yaptık. Elde edilen retroviral yapı chimeric insan/fare TCR fare hücreleri veya vivo içinde fare modelleri fonksiyonel bir fare hücre içi etki ile kodlar. Genel olarak, burada açıklanan protokol eşleştirilmiş insan tek hücre TCR alpha ve beta zinciri kimlik retroviral vektörler kolayca uyarlanabilir aerodinamik nesil vitro ve in vivo TCR ifade ile birleştirir. Böylece kritik adımları takip ve potansiyel tuzaklar kaçınılmalıdır olabilir video ve eşlik eden malzeme tek hücre PCR, son derece ayrıntılı bir tanımını vermek için tasarlanmıştır. Ayrıca, biz klonlama ifade vektör oluşturmak için gereken adımları ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Kez hakim, tüm prosedürü tek hücreden TCR ifade için sıralama kısa bir iki haftalık süre içinde gerçekleştirilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs at JoVE.com

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Tek hücre TCR yalıtım ve üretme-in Vitro için Retroviral Vektörler ve In Vivo ifade insan TCRs aerodinamik

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

streamlined-single-cell-tcr-isolation-generation-retroviral-vectors

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

9.3K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital. Geçerli protokol birleştiren tek hücre insan TCR alpha ve beta zinciri sıralama ile eşleştirilmiş retroviral vektörler vitro ve in vivo TCR ifade ile uyumlu nesil aerodinamik.

Video: Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.