Bu çalışma bir NSERC doktora sonrası öğretim üyesi (DWDW), bir ARCS Vakfı Bursu (AL) ve bir UC Davis Biyolojik Bilimler Yüksekokulu (KB) tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>West, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exercise-induced+biochemical+milieu+enhances+collagen+content+and+tensile+strength+of+engineered+ligaments.">The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments.</a> J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).</li><li>Booth, F. W., Laye, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+adequate+appreciation+of+physical+exercise's+complexities+can+pre-empt+appropriate+design+and+interpretation+in+scientific+discovery.">Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery.</a> J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).</li><li>Booth, F. W., Hargreaves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+multi-organ+pathology+from+insufficient+exercise.">Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise.</a> J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).</li><li>Shearn, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendon+tissue+engineering:+progress,+challenges,+and+translation+to+the+clinic.">Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).</li><li>Liu, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+should+know+before+using+tissue+engineering+techniques+to+repair+injured+tendons:+a+developmental+biology+perspective.">What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective.</a> Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).</li><li>Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+ligaments.">Tissue engineering of ligaments.</a> Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).</li><li>Bayer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiation+of+embryonic-like+collagen+fibrillogenesis+by+adult+human+tendon+fibroblasts+when+cultured+under+tension.">The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension.</a> Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).</li><li>Guerquin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+EGR1+directs+tendon+differentiation+and+promotes+tendon+repair.">Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair.</a> J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+engineered+bone-ligament-bone+constructs+for+anterior+cruciate+ligament+replacement.">Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement.</a> Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).</li><li>Hagerty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+growth+factors+on+both+collagen+synthesis+and+tensile+strength+of+engineered+human+ligaments.">The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments.</a> Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).</li><li>Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+an+intermittent+stretch+paradigm+using+ERK1/2+phosphorylation+results+in+increased+collagen+synthesis+in+engineered+ligaments.">Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments.</a> Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).</li><li>Safdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice.">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).</li><li>Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscles,+exercise+and+obesity:+skeletal+muscle+as+a+secretory+organ.">Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.</a> Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).</li><li>Crane, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-stimulated+interleukin-15+is+controlled+by+AMPK+and+regulates+skin+metabolism+and+aging.">Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging.</a> Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).</li><li>Rao, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meteorin-like+is+a+hormone+that+regulates+immune-adipose+interactions+to+increase+beige+fat+thermogenesis.">Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis.</a> Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).</li><li>Aswad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+participate+in+the+alteration+of+muscle+homeostasis+during+lipid-induced+insulin+resistance+in+mice.">Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice.</a> Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).</li><li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases.">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li><li>Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiologic+role+of+the+sympathetic+nervous+system+in+exercise.">The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise.</a> J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).</li><li>Pritzlaff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+acute+exercise+intensity+on+pulsatile+growth+hormone+release+in+men.">Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men.</a> J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).</li><li>Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microassay+for+the+assessment+of+low+levels+of+hydroxyproline.">Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline.</a> Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).</li><li>Neuman, R. E., Logan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+of+hydroxyproline.">The determination of hydroxyproline.</a> J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).</li><li>Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+longevity+and+strength+in+an+in+vitro+model+of+the+bone-ligament+interface.">Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface.</a> Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).</li><li>Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+of+hydroxyproline+in+tissue+and+protein+samples+containing+small+proportions+of+this+imino+acid.">The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid.</a> Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).</li><li>Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+sinew+contraction+during+formation+of+tissue-engineered+fibrin-based+ligament+constructs.">Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs.</a> Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).</li><li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+inhibits+lysyl+oxidase+and+decreases+mechanical+function+in+engineered+ligaments.">Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments.</a> J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).</li><li>Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+in+vitro+model+of+a+functional+ligament+from+bone+to+bone.">Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone.</a> Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).</li><li>Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+changes+in+circulating+levels+of+transforming+growth+factor-beta-1+in+humans:+methodological+considerations.">Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations.</a> Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).</li><li>Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+adaptation+of+tendon+and+muscle+connective+tissue+to+mechanical+loading.">Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading.</a> Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).</li><li>Psychogios, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+serum+metabolome.">The human serum metabolome.</a> PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).</li><li>Nguyen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+resting+and+exercise+serum+from+children+with+cystic+fibrosis+on+C2C12+myoblast+proliferation+in+vitro.">The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro.</a> Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).</li><li>Joyner, M. J., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+questions+about+systems+biology.">Ten questions about systems biology.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).</li><li>Joyner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+sucking+sound:+can+physiology+fill+the+intellectual+void+left+by+the+reductionists?.">Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists?.</a> J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).</li><li>Benjamin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+tendons+and+ligaments+meet+bone:+attachment+sites+('entheses')+in+relation+to+exercise+and/or+mechanical+load.">Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load.</a> J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).</li><li>Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+of+tibialis+anterior+tendon+mechanics+is+lost+following+denervation.">Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation.</a> J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).</li><li>Arendt, E., Dick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knee+injury+patterns+among+men+and+women+in+collegiate+basketball+and+soccer.+NCAA+data+and+review+of+literature.">Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature.</a> Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Bu yazıda doku gelişiminden translasyonel / klinik sorulara kadar geniş bir araştırma yelpazesine sahip araştırmacılar için faydalı bir deney platformu olan bir ligament dokusu modeli tanımlanmaktadır. Burada açıklanan mühendislik bağ modeli, iş akışı boyunca çeşitli noktalarda uyarlanabilen çok yönlü bir protokole dayanmaktadır ( Şekil 1 ve Tartışma Bölümü ). Dahası, in vitro ortamın doğal olarak indirgeyici doğası, beslenen ortamı şartlandırılmış insan veya hayvan serumu ile takviye ederek fizyolojik bölgeye daha yakın hale getirebilir. Yapılar, çeşitli kaynaklardan gelen fibroblastlar kullanılarak oluşturulabilir Burada gösterilen metodoloji ve temsili sonuçlar birincil ACL fibroblastlarının kullanımına dayanmasına rağmen, hücre izolasyon protokolü, diğer primer fibroblast türlerini toplamak için ayarlanabilir. Tarif edildiği gibiŞekil 4&#39;te , genç insan donörlerinden izole edilen primer hücrelerle oluşturulan mühendislik yapıları, verici değişkenliği düşüktür. Birincil hücreler ilk yalıtım ve geçit sınırlaması ile sınırlanır; Hücre hatlarının kullanımı deneylerin tekrarlanabilirliğini artırabilir. Diğer hücre tiplerinin kullanımı, hücre kültürü ortamında ve fibrin jel formülasyonunda değişiklikler gerektirebilir. Örneğin, insan mezenşimal kök hücrelerinin (MSC&#39;ler) fırça çimento çapaları arasında 2 hafta boyunca doğrusal dokular oluşturamayacağını gözlemişken, at üstün dijital fleksör tendon fibroblastları, at kemik iliği stromal hücreleri, piliç embriyonik tendon fibroblastları Ve sıçangil C3H10T1 / 2 MSC&#39;ler hızla kasılmakta ve doğrusal bir doku oluşturmak için fibrin jelini sindirmektedirler (yayınlanmamış gözlemler). Bu kontrast, hücre kontraktilitesi, proliferasyon ve fibrinolitik enzim üretimindeki farklılıkların bir sonucu olabilir. Kimyasal uygulamaVe mekanik stimülasyon Burada tarif edilen yöntemde fibrin esaslı doku, fırlık çimento çapa etrafında oluşur ve bir gerilme biyoreaktörü 11 aracılığıyla mekanik uyarının uygulanmasına ve son nokta gerilimi testine izin verir. Fırçasit çimento-yumuşak doku arayüzünün (entez) varlığı, daha ileri araştırmalar ve iyileştirme fırsatı sunmaktadır 22,26 (bkz. Aşağıdaki Klinik uygulamalar bölümü). Bu in vitro ortamda, kimyasal ve mekanik faktörlerin katkısı daha kolay belirlenebilir; Bunun bir örneği, Şekil 5&#39;de gösterilmiştir, böylece egzersiz sonrası serum ortamının etkisi, egzersizin mekanik uyarımından ayrılmıştır. Gözlemlenebilir bir değişim beklemek için deneysel müdahalelerin zaman çizelgesini, tedavi bileşimini ve uygun son noktaları belirlemek için pilot çalışmalara ihtiyaç duyulabilir. foR örnekte, egzersiz sonrası serum çalışmasında 1 , deneysel tedavi uzunluğu, yapıların her iki günde bir beslendiği ek besiyeri için kullanılan serum temini ile sınırlandırılmıştır. Ayrıca, kültürün ikinci haftasında, kültür ortamı, TGF-β1 çıkarıldığında askorbik asit ve L-prolin ile dinlenme veya egzersiz sonrası serum takviye edildi. TGF-β1, egzersiz 27 sonrası serumda artan bilinen bir pro-fibrotik büyüme faktörüdür. Dolayısıyla, egzersiz sonrası serumun TGF-β1 ile ilgili etkilerini örtmekten kaçınmak için, bu sitokin kültür ortamında muhafaza edilmedi. Bu mühendisli bağ modeli mekanik gerilmenin etkisini test etmek için de kullanılabilir. Ters modellenmiş kulpları, fırçasız çimento çapa uçlarını ( Şekil 1&#39;de tasvir edilen tek eksenli çekme test cihazına benzer şekilde) tutmak üzere mühendislik yaparak, esneme biyoreaktörleri, eng<html> Ineered ligamentler. Laboratuvarımız daha önce bu modeli , in vitro bir gerilme paradigmasının veya hatta potansiyel olarak in vivo rasyonel tasarım için daha iyi bir anlayış sağlayacak, ısmarlama biyoreaktör 11&#39;de tek eksenli gerilme gerilmesine yönelik mühendislik yapmış bağların moleküler sinyal tepkisini araştırmak için kullandı. Streç / etkinlik / terapötik uygulamalar. Mühendislik yapıtaşlarının değerlendirilmesi Geleneksel tek katmanlı kültürde olduğu gibi, 3D yapılar, gen / protein ekspresyonu için denenebilir; Buna ek olarak, onların 3B morfolojisi de işlevsel ve morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için fırsat sağlar ve yapılar uzun vadeli çalışmalar için kültürde muhafaza edilebilir ( Şekil 3 ). Yapay bağlar doğal, olgun bağlara eşdeğer olmamakla birlikte, gelişmekte olan tendon / bağlara benzerlik taşırlar ve besin maddeleri karşısında doğal dokuya benzer şekilde davranırlar&quot;26, büyüme faktörleri 10, hormonlar 25 ve egzersiz 11 , 28. Dolayısıyla, herhangi bir in vitro modelden geniş çaplı genellemeler yapmadan önce ihtiyati tedbir alınması gerekmesine rağmen, ligament yapı testinden elde edilen sonuçlar, aksi halde olabilecek başka bir fizyolojik mekanizmayı In vivo araştırılmaları imkansız . Geniş uygulamalara sahip esnek ve dinamik bir model için kıvamlandırılmış serum içeren besleme ortamını tamamlayın İnsan serum metabolomu glikoproteinler, lipoproteinler, lipit türevleri, enerji substratları, metabolitler, vitaminler, enzimler, hormonlar, nörotransmitterler ve yapı taşları / ara ürünlerin bolluğunu içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan 4,500 bileşiğin bir çevredir. 29 İnsan serum metabolomunun bileşik sınıflarına göre daha fazla incelenmesi 29 additi ortaya koymaktadırDeneysel serumun in vitro deneylere entegrasyonunun bir avantajı. Diğer bir deyişle, serumda ~ 4500 bileşiğin çoğunluğu hidrofobik veya lipit türevi olup, taşıma / çözünürlük için bağlama proteinlerinin önemini vurgulamaktadır. Sonuçta, deneysel olarak tekrarlanan endojen bileşik taşıma dinamikleri ve dolayısıyla biyoyararlılık ve bileşik hedef etkileşimleri neredeyse imkansız olurdu. Bu nedenle, deneysel serum, çözündürme, aktarım, hedef bağlama ve etki mekanizması için yardımcı moleküllere bağımlı olduğu bilinen bileşiklerin çalışılması için özellikle etkilidir. Laboratuarımız, egzersizin sağlık yararları konusunda uzun zamandır ilgi duyuyor. Egzersiz, çeşitli faktörlere (örneğin IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin benzeri 15 ,Eksozomlar 16 , 17 ) sistemik dolaşıma bırakılır. Egzersiz sonrası biyokimyasal ortam, hem salgın bezlerinin sempatik sinir sisteminin uyarılması ( örneğin , adrenal bezdeki kortizol ve katekolaminler 18 ve büyümenin sonucu olarak salınan faktörlerin yanı sıra, iskelet kası egzersize duyarlı hormonları kastederek salınan faktörleri yansıtır Ön pituiter hormon hormonu 19 ). Egzersiz kaynaklı biyokimyasal çevrenin mühendislik dokusu üzerindeki etkilerini araştırmak için kısa bir süre önce egzersiz öncesi ve sonrası serum örnekleri kullandık. 1 Pek çok önemli egzersizle ilgili araştırma sorusu kalırken, model hiçbir şekilde bu şekilde kısıtlı değildir. Örneğin, serum diyet veya farmakolojik müdahaleleri takiben hayvan kaynaklı veya beşeri kaynaklardan veya farklı yaş gruplarından veya klinik popülasyondan elde edilebilirS 30 . Bu yolla, eksojen veya endojen olan ilgi çekici bileşikler serum ve tedavi ortamlarında biyoyararlanılabilir miktarlarda bulunacak ve hedef doku ile endojen çevre ile ( yani daha fizyolojik bağlamda) etkileşime girecektir. Bu yaklaşım, belirli bir müdahalenin çoklu organ (ve çoklu bileşik) bir etki göstereceği ve dolayısıyla fizyolojik ortamın birlikte modifiye edileceği ihtimalinin yüksek olması nedeniyle dinamiktir. Bu yaklaşım belirli zorlukları beraberinde getirirken, çoklu sistemik biyokimyasal değişkenler aynı anda değiştirildiğinden saf rediskistist deneysel yöntem 31 , 32&#39;deki dezavantajların üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek bir yaklaşımdır. Birlikte ele alındığında, şartlandırılmış serumun bir doku mühendisliği ( in vitro biomimetik ) doku ile birlikte uygulanması, fizyoloji, beslenme ve klinik araştırma soruları için bir araç olarak kullanılabilir. <stronG&gt; Klinik uygulamalar sayısız Burada sunulan doku mühendisliği modeli, geleneksel in vitro modellerin yapamadığı anatomik ve klinik araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir. In vivo bir ligament veya tendon , entez adı verilen yumuşak-sert doku geçiş bölgesi içerir. Mekanik strese bağlı yaralanmaya karşı savunmasız kalan teleskopi, histokimyasal ve elektron mikroskobu teknikleri 22 , 26 ile kesitsel olarak incelenebilir. Bu eşsiz arayüz, düşük hareketsizliği olan kişiler için iki kat daha önemlidir, çünkü fiziksel hareketsizlik, bağ dokusunun yükü düşükten yükseğe doğru uyumluluk bölgelerine aktarabilme yeteneğini engeller ve sonuçta doku uyumluluğunda genel bir azalma ve yaralanma riskinde artışa neden olur. Laboratuvarımız son zamanlarda bu doku mühendisliği modelini kullandı 25 &lt;/ Sup&gt;, bağ dokusu yaralanmaları için risk altındaki başka bir nüfusu, bayan sporcuları modellemek için kullanılmıştır: ACL yaralanması insidansı erkek meslektaşlarından yaklaşık 35 kat daha fazladır. Yaralanmada cinsiyete dayalı bu farklılığın altını çizen potansiyel mekanizmalar, bağ yapısı döngüsünün aşamalarını taklit eden konsantrasyonlarda bağ yapılarını dişi seks hormonunun fizyolojik konsantrasyonları olan östrojen ile tedavi ederek araştırılmıştır. İlginçtir, yüksek konsantrasyonlarda östrojen, ligamanların ve tendonların kollajen matrisinde lizin-lisin çapraz bağları oluşturan primer enzim olan liz oksidazın gen ifadesini ve aktivitesini inhibe etti. Önemlisi, 48 saatlik yüksek östrojen (folliküler fazı taklit etmek için), yapıların kollajen yoğunluğunu değiştirmeden ligaman yapısının sertliğini azalttı. Fizyolojik bir perspektiften bakıldığında, bu, dişilerde gevşeklikteki artışların en azından kısmen azaltılmışÇapraz bağ oluşumu. Deneysel bir perspektiften bu bulgular 25 , fonksiyonel çapraz bağlanma aktivitesinin incelenmesine izin veren 3D yapım modelinin yararını vurgulamaktadır. Klinik açıdan bakıldığında, bu model bağ işlevinin östrojeninin olumsuz etkilerini önleyebilecek müdahaleleri hızla taramak için kullanılabilir. Kapanış ifadeleri Burada, mühendislik yapılan bağların oluşumu ve 3D in vitro doku modeli olarak kullanılması için ayrıntılı bir metodoloji sunduk. Model, hücre tipinde, müdahalelerde ve sonuç önlemlerinde esneklik sağlayan geniş bir hedef yelpazesine oldukça uyarlanabilir. Besleme ortamının kıvamlandırılmış serum ile desteklenmesi, geleneksel in vitro ortamda elde edilemeyen fizyolojik bir bağlam ekler ve in vivo fizyolojinin modellenmesini geliştirir. Kısacası, bunun geniş ölçüde uygulanabilir bir mod olduğuna inanıyoruzFizyoloji ve doku mühendisliğinin her ikisini de ilerletmek için heyecan verici etkileri olan l.

Tendon ve bağ yaralanmaları yaygındır ve normal hareketlilik ve yaşam kalitesi üzerinde zayıflatıcı sonuçlar doğurabilir. Cerrahi müdahale genellikle gereklidir ancak sınırlı ve çeşitli başarılara sahip olabilir 4 , 5 . Tendonların ve bağların nasıl geliştiğini, olgunlaştığını ve hasara yanıt vermenin nasıl olduğu konusunda mevcut anlayış eksiktir ve bu nedenle daha etkili tedavilerin geliştirilmesine ilişkin fikir edinmek için etkili araştırma modellerine ihtiyaç vardır 5 . Bu bilgi boşluğuna değinmek için hayvan modelleri kullanılabilir, ancak in vivo çalışmalar doğal olarak çevreyi kontrol etme ve hedeflenen dokuya doğrudan müdahale etme zorluğu ile karmaşıktır. Buna karşılık, deney ortamı , geleneksel tek tabaka hücre kültürü ile in vitro olarak kolayca kontrol edilebilir ve izlenebilir. Bununla birlikte, bu teknik, kimyasal ve mekanik çevreyi basitleştirmeyebilir ve bu nedenle tekrarlayıcı olmayabilirGeç hücrelerin in vivo davranış. Doku mühendisliği, in vitro ortamın kontrolü ile hayvan modellerinde kompleks in vivo ortamın avantajlarıyla evlenebilir ve fizyolojiyi incelemek için ek bir araç sağlar. İlave olarak, bağ gelişimi hakkında daha iyi bir anlayışa sahip olan silahlı doku mühendisliği, cerrahi rekonstrüksiyon gerektiğinde greft dokusu sağlayabilir 6 . Bu nedenle, burada açıklanan yöntem, ligaman işlevini ve morfolojisini incelemek için kullanılabilen bir in vitro 3D mühendislik dokusunu doğrular. Fibrin esaslı tendon veya ligaman yapıları, kollajen fibrilogenezisi 7 ve tendon gelişimi 8 gibi fizyolojik işlemleri incelemek için bir in vitro model olarak kullanılmış ve aynı zamanda, greft dokusu olarak yararlanılmasının, ön kuzu koyun modelinde değerlendirildiği translasyon uygulamalarıCiate ligaman (ACL) rekonstrüksiyonu 9 . Laboratuvarımız daha önce iki fırçayla, kalsiyum fosfat kemik ikame edici malzeme, çimento çapa üzerinde uzanan üç boyutlu bir bağ modeli kurdu. Bu model, kültür ortamını biyolojik faktörler 10 ile takviye ederek veya mekanik stimülasyon 11 uygulayarak kolaylıkla farklı deney koşullarına tabi tutulabilir. Önemlisi, bu kemikten kemik bağ modeli, yaralanmaya duyarlı olan boney ve sinir elemanları arasındaki arayüzün sentezinin derinlemesine analizine olanak tanır. Çalışmada burada bu metodolojiyi sunmak için 1 vurgulandı, biyokimyasal çevredeki egzersiz kaynaklı değişikliklerin ligaman fonksiyonu üzerine olan ilgisi üzerinde durduk. Egzersiz vücudun her yerinde çeşitli dokulardaki hücresel ve organ fonksiyonlarını geliştirir 2 , 3 , </suP&gt; 12 , çeşitli bilinen (örneğin IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin benzeri 15 , eksosomlar 16 , 17 ) salınımına atfedilebilecek bir etki ve sistemik dolaşıma salınan diğer bilinmeyen biyokimyasal faktörler . Ayrıca, egzersiz sonrası biyokimyasal ortam salınım bezlerinin sempatik sinir sistemi uyarımı ( örneğin , adrenal bezin 18&#39;inden kortizol ve katekolaminler ve ön pitüiter 19&#39;un büyüme hormonu) tarafından uyarılan egzersiz yanıtlı hormonlarla zenginleştirilmiştir ). Bununla birlikte, n vivo olarak , egzersizin mekanik uyarımının egzersize bağlı biyokimyasal değişikliklerden etkilenme ayrımını yapmak imkansızdır. Bazı çalışmalar, egzersize yanıt olarak bazı dolaşımdaki hormonların ve sitokinlerin beklenen yükselişini karakterize ederkenE yukarıda belirtildiği gibi, in vitro olarak sadakatle tekrarlanan çok sayıda faktör bilinmektedir ve bilinmemektedir . Yani, bir in vitro çalışma için birkaç faktörün izole edilmesi, biyokimyasal tepkinin karmaşıklığına yetersiz şekilde hitap etmektedir. Bu çalışmada, egzersizle tetiklenen serum biyokimyasal ortamdaki değişikliklerin mühendisli ligament fonksiyonunu nasıl etkilediğini araştırdık. Biyokimyasal değişikliklerin etkilerini izole etmek için, bir direnç egzersizinden önce ve sonra insan katılımcıdan serum elde ettik ve insan ön çapraz bağ (ACL) fibroblastları kullanılarak oluşturulan 3D mühendislik yapıları tedavi ettik. Bu modeli kullanarak, mekanik özellikler ve kollajen içeriği üzerindeki etkileri içeren fonksiyonel veriler elde edebiliriz ve moleküler sinyalleme üzerindeki etkileri nicel olarak değerlendirebiliriz.

<table><tbody><tr><td>Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20</td><td>Entomoravia</td><td>N/A</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tricalcium phosphate</td><td>Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)</td><td>N/A</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>o-phosphoric acid, 85% (w/w)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX0995</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm tissue culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>For silicone-coated plates</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>For silicone-coated plates</td></tr><tr><td>1x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>For cell isolation and expansion</td></tr><tr><td>100x antibiotic/antimycotic solution</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Type II collagenase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>100x penicillin/streptomycin solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m pore, polyethersulfone, gamma irradiated</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>For reagent sterilization</td></tr><tr><td>DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>For cell and tissue culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>BioSera</td><td>FBS2000</td><td>Component of tissue digestion media and growth media</td></tr><tr><td>Penicillin G Potassium Salt</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219453680 - 100 MU</td><td>Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>For cell freezing media</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>For cell freezing</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Red Plastic 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>367820</td><td>For human serum collection</td></tr><tr><td>Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>354221</td><td>For human serum collection</td></tr><tr><td>Thrombin, bovine origin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogen, bovine origin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>6-Aminohexanoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &amp;mu;m and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &amp;mu;m and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Transforming growth factor-&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer&#039;s instructions at a concentration of 10 &amp;mu;g/mL. Aliquot and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, polyethersulfone, 250&amp;nbsp;mL, radio-sterilized</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>For reagent sterilization</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Dilute in water to 6 M</td></tr><tr><td>4-Dimethylaminobenzaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Chloramine-T trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>trans-4-Hydroxy-L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Perchloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0073-9</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Toluene, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-656</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr></tbody></table>

treatment of ligament constructs with exercise-conditioned serum: a translational tissue engineering model

Biyolojik mekanizmaları anlamak için in vitro deneyler gereklidir; Bununla birlikte, tek katmanlı doku kültürü ve insan fizyolojisi arasındaki boşluk büyüktür ve bulguların çevirisi genellikle zayıftır. Böylece, alternatif deneysel yaklaşımlar için geniş bir fırsat var. Burada insan hücrelerinin insan ön çapraz bağ dokusu kalıntılarından izole edildiği, kültürde genişlediği ve mühendisliğe tabi tutulmuş bağlar oluşturduğu bir yaklaşım sunuyoruz. Egzersiz, birçok dokunun, organların ve vücut süreçlerinin işlevinin geliştirilmesi için kandaki biyokimyasal ortamı değiştirir. Bu deneyde, bağ yapılandırma kültürü ortamı, egzersiz yoluyla &#39;şartlandırılmış&#39; deneysel insan serumu ile takviye edilmiştir. Dolayısıyla, deneysel bir doku, bağlanma proteinleri ve ek aktiviteleri ile birlikte değiştirilebilen ek bileşikler de dahil olmak üzere, tam endojen biyokimyasal çevrenin etkisine maruz kaldığından, müdahale daha biyolojik olarak ilgilidir.Bilinmeyen temsilci. Tedaviden sonra mühendisli ligamanlar mekanik fonksiyon, kollajen içeriği, morfoloji ve hücresel biyokimya için analiz edilebilir. Genel olarak, burada sunulan ligament dokusunun fizyolojik modelinin geleneksel tek tabaka kültürü ve hayvan modellerine göre dört ana avantajı vardır. Birincisi, ligaman yapıları üç boyutludur ve nihai çekme gerilmesi, maksimum gerilme yükü ve modül gibi sayısallaştırılacak mekanik özelliklere ( yani , fonksiyona) izin verir. İkincisi, boney ve sinüse unsurları arasındaki arayüz olan entez, ayrıntılı ve fonksiyonel bağlamda incelenebilir. Üçüncü olarak, medyayı egzersiz sonrası serum ile hazırlamak, egzersizin sağlığa etkilerinin geniş bir yelpazesinden sorumlu olan egzersize bağlı biyokimyasal çevrenin etkisini tarafsız bir şekilde araştırmaya olanak tanır. Son olarak, bu deneysel model, bilimsel araştırmaları insani ve ahlaki bir yaklaşımla,Hayvanlar, Ulusal Sağlık Enstitüsünün temel yetkisi, Hastalık Kontrol Merkezi ve Gıda ve İlaç İdaresi.

Yapay ligament oluşumu ve deneysel müdahaleye genel bakış Şekil 1 , yapay bağların oluşumuna genel bir bakış sunmaktadır. Bir kemik yerine kullanılan malzeme 22 olan brusit çimentosu, bir ortofosforik asit / sitrik asit solüsyonunu, silikon kuyularda β-trikalsiyum fosfat ile birleştirerek hazırlanır. Alternatif olarak, dokuların mekanik fonksiyonlarını doğrudan ölçmüyorsa, bir doku oluşumunda demir olarak 3-0 ipek dikiş kullanılabilir. Bunlar silikon kaplı 35 mm tabaklarda 12 mm aralıklarla sabitlenir ve% 70 etanol içinde ıslatılarak sterilize edilir. Fibroblastlar, ÇB rekonstrüksiyon cerrahisi sırasında elde edilen ön çapraz bağ kalıntılarından izole edilmiştir. Genişletildikten sonra, 2.5 x 105 hücre, brushite çimento çapa tutturulmuş tabağında oluşturulan bir fibrin jelinde kapsüllenir. Oluşumdan sonra, ligament constrMekanik özellikler, kollajen içeriği, hücre proliferasyonu, gen ifadesi, protein seviyeleri ve doku morfolojisi değişiklikleri için incelenebilir. Kültür boyunca, hücreler fibrin jelini küçültür ve iki çapa arasında doğrusal bir doku oluşturur ( Şekil 2A ). Kültürde 1-2 gün sonra, hücreler fibrin jeline yapıştı, hücre proseslerini uzattı ve çekiş kuvvetleri uygulamaya başladı ( Şekil 2B ). Fibrin jel çekiş kuvvetleri ile kontrendikçe ve hücresel enzimlerle parçalandığında, iki bağlama noktası arasında gerginlik oluşur ve hücrelerimiz bu eksene paralel olarak hizalanır ( Şekil 2B ) ve kollajen yatırmaya başlarlar. 4-5 gün sonra, yapılar doğrusal bir silindirik doku oluşturan çapalar etrafında daralmıştır ( Şekil 2A ; bu noktada dış uyaranlar sisteme uygulanabilir (intervEntion, bu sefer doğrusal doku oluşum sürecinin bozulmasını önlemektedir). Müdahaleler, belirli bir müdahalenin ardından kültür ortamını insan veya hayvan serumuyla, ekzojen sitokinler ve büyüme faktörleri, mekanik stimülasyon kullanarak veya oksijen gerilimi gibi diğer çevresel faktörlerin değiştirilmesinden oluşabilir. 200 uM askorbik asit, 50 uM L-prolin ve 5 ng / mL TGF-β1 ile takviye edilmiş büyüme ortamı (% 10 FBS ve 100 U / mL penisilin ile DMEM) kullanılarak, hücre çoğalmasının 2 haftalık bir kültür boyunca devam ettiğini tespit ettik ( Şekil 2C ) ve gerçekten, ışık mikroskopisi, 14 günlük kültürde yüksek hizalanmış hücreleri içeren yoğun bir dokuyu ortaya çıkarmaktadır ( Şekil 2B ). Mühendislik yapıtaşlarının değerlendirilmesi Kültür periyodunun sonunda, mühendislik yapmış bağlar bir çeşitte değerlendirilebilirY yoldan. Bu sistemin en büyük avantajı, doğal bağın mekanik rolü göz önüne alındığında hayati bir değerlendirmeyle mekanik test yoluyla dokuda fonksiyonel değişiklikleri belirleme becerisidir. Tek eksenli gerilme testi, yüke karşı hata, en büyük gerilme mukavemeti ve Young modülünü içeren mekanik özellikleri ölçmek için kullanılabilir. Viskoelastik özellikler stres gevşetme ve sünme testleri ile de ölçülebilir. Şekil 3A , özel yapılmış bir tek eksenli çekme test cihazında ters kalıp tutma yerlerinde tutulmuş olan mühendisliğe tabi tutulmuş bir bağ tasvir etmektedir. Sağ tutamak, doku hasarına bağlı olarak bağ boyunca yükü ölçmek için bir güç çeviricisine bağlanır. Şekil 3B , başarısızlığa karşı bir test için temsili bir gerilme-gerinim çizimini göstermektedir. Mekanik testlerden geçtikten sonra, aynı yapılar kurutulabilir ve bir hidroksiprolin analizi 23 için işlenebilir ve toplam kollajen içeriğini ve diğer biyokheyi değerlendirir.Mical deneyleri. Her bir koşul için yeterli miktarda ilave numune ile hücre proliferasyonu, gen ve protein ekspresyonu ve histolojik morfoloji üzerindeki etkileri dahil olmak üzere deneysel bir müdahalenin kapsamlı bir incelemesi yapılabilir. Çalışmalarımız için 14 gün tipik bir son nokta iken, mühendislik yapılan bağlar Şekil 3C&#39;de gösterildiği gibi 28 günlük kültür boyunca mekanik özelliklerini ve kollajen içeriğini geliştirmeye devam etmektedir ve kültürde en az 3 ay hayatta kalabilmektedir24. Donör değişkenliği, deneysel tekrarlanabilirlik için önemli bir husustur. Şekil 4 , Lee ve diğ. Tarafından rapor edilen temsili bir deney göstermektedir . 25 daha önce tarif edilen 2 haftalık bir kültürden sonra tipik gerilme özelliklerini ve kolajen içeriğini gösteren 7 farklı ACL verici (n = 3 erkek ve n = 4 kadın)<html> Ilave büyüme ortamı. Benzer ACL koleksiyonlarından, donörün yaşı, yaralanmadan sonraki süre, cinsiyet vb.&#39;den gelen hücreleri kullanarak, donatılar arasındaki düşük değişkenlik ve mühendislik bağları, kollajen fraksiyonundaki fark hariç, erkek ve kadın donörler arasında benzer özellikler göstermektedir. Daha önce bahsedilen çalışmada, mühendislik yapmış bağlar, kadınların erkeklere göre ACL yaralanma riskini neden daha fazla araştırdıklarını araştırmak için in vitro bir model olarak kullanıldı ve kadın donörlerden izole edilen ACL fibroblastların doğal olarak zayıf ve daha az kolajen mühendislik yapısına sahip bağları oluşturmadığını gösterdi 25 . Egzersiz sonrası serum ortamının in vitro ligament fonksiyonu üzerine etkisi Daha önce, fizyolojik süreçleri sondalama için kullanılacak mühendisli ligamentlerin yeteneğini göstermiştik 1 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 25. West ve ark. Tarafından bildirilen aşağıdaki temsilci deneyde; 1 , egzersizin bağ fonksiyonu üzerindeki biyokimyasal etkilerini belirledik ve burada metodoloji ve bulguları vurguladık. İnsan ACL hücrelerini kullanarak mühendislik yapıları kurduk ve egzersiz öncesi veya sonrasında toplanan insan serumuyla kondisyonlanan kültür ortamından oluşan 7. günde bir müdahale uyguladık. Kısacası, sağlıklı genç erkek katılımcıları işe aldık ve dolaşımdaki hormonları ve insan büyüme hormonu (GH) dahil sitokinleri artıran akut bir direnç egzersizi öncesi ve sonrasında kan örnekleri topladık. Egzersiz öncesi ve sonrasındaki kan numunelerinden insan serumu izole edildi ve işlenmiş ligament kültürünün ikinci haftası için kültür ortamında fetal sığır serumu yerine kullanıldı ( Şekil 5A ). Egzersiz öncesi ve sonras&gt; serum örnekleri, GH ve insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) de¤ifliklikleri için ELISA kullan&gt; larak analiz edildi;Konsantrasyonları egzersizle değiştirilebilir ( Şekil 5B ). Bu bilgiler, mühendisliğe tabi tutulmuş bağlarda serum etkilerini egzersize yanıt olarak serumdaki değişikliklerle ilişkilendirmek için kullanılmıştır. 14 günlük bir kültür periyodundan sonra bağ yapısı, mekanik test ve kolajen içeriğinin hidroksiprolin tayini ile değerlendirildi ve egzersiz sonrası seruma cevap olarak maksimal gerilme yükü ve kollajen içeriğinde belirgin bir artış gösterdi. Bu etkinin, egzersize bağlı GH veya IGF-1 salımları ile ilişkili olup olmadığını değerlendirmeyi amaçlamada, mühendislik yapmış bağlar ayrı bir deneyde oluşturuldu ve insan rekombinant GH veya IGF-1&#39;in bir doz yanıtıyla tedavi edildi. İlginçtir ki, serum GH kan içinde yükselirken ( Şekil 5B -i), kültür ortamındaki artan şekilde rekombinant GH konsantrasyonu artışı kollajen içeriğini ( Şekil 5D -i) veya mekanik artışı sağlamazYapay bağlarda özellikleri (verileri gösterilmemiştir). Bunun aksine, egzersiz sonrası serum IGF-1 seviyeleri artmadı, ancak bir doz yanıt deneyinde, kültür ortamında artan düzeylerin ligaman yapılarının kollajen içeriğini geliştirdiği ortaya çıktı ( Şekil 4D -ii). Dolayısıyla, egzersiz, egzersiz sonrası GH&#39;da sağlam artışlara neden olurken, rhGH&#39;yi kullanan doz yanıtı deneyinde, GH&#39;nin, mühendislik yapmış bağların fenotipik zenginleşmesinden doğrudan sorumlu olup olmadığı sorgulanmaktadır (en azından tek başına 22 kDa izoformu Sorumlu olduğu görülmektedir). Aksine, serum IGF-1 egzersizden 15 dakika sonra değiştirilmemesine rağmen, rhIGF-1&#39;i geniş bir konsantrasyon konsantrasyonunda test etmek, IGF-1&#39;in kollajen içeriğini iyileştirme kabiliyetine sahip olduğunu ortaya koymuştur; Bununla birlikte, fizyolojik seviyeleri tahmin eden bir aralıkta rhIGF-1 konsantrasyonlarının artmasının, kollajen içeriğini önemli ölçüde arttırmadığına dikkat edilmelidir. Böylece, eşsiz egzersiz sonrası serum enviroMühendislik yapmış bağların mekaniği ve kolajenini geliştirmede önem taşıyordu. Burada vurgulanan çalışmada 1 , deneysel serumun hacmi etik hususlar nedeniyle sınırlıydı; Bu nedenle, düşük serum talepleri olan kısa vadeli 2D biyolojik tahliller, gözlemlenen kollajenin artmasından sorumlu olan moleküler mekanizmaları ileri araştırmak için kullanılmıştır. ACL fibroblastları 6 oyuklu plakalarda konfüzyona kadar kültürlendi ve dinlenme veya egzersiz sonrası serum ile 1 saat süreyle muamele edildi ve rekombinant GH, IGF-1, TGF-β1&#39;in doz yanıtları ve PI3K / mTORC1&#39;de hedeflerin aktivasyonu ile karşılaştırıldı , ERK1 / 2 ve Smad sinyal yolakları belirlendi. Egzersiz sonrası serum varlığında PI3K / mTORC1 ve ERK1 / 2 yolu, sırasıyla S6K&#39;nın ( Şekil 5D -i) ve ERKl / 2&#39;nin ( Şekil 5D -ii) fosforilasyonu ile değerlendirildiğinde daha fazla aktivasyon gösterdi.Hormon ve sitokin doz tepkileri ile karşılaştırıldığında, GH&#39;nin mTOR sinyallemesi üzerinde küçük bir pozitif etki ( Şekil 5D -i) ve IGF-1&#39;in en düşük dozda pozitif bir etki gösterdiği halde GH, IGF-1 ve TGF&#39;nin üç tedavisi -β1, PI3K / mTORC1 ve ERK1 / 2 sinyalizasyonundaki artıştan sorumlu değildi. Birlikte ele alındığında, 3D mühendislik bağ modeli ve 2D biyolojik tahlil verileri, egzersiz sonrası serum ortamının, PI3K / mTORC1 ve ERK1 / 2 yolaklarının aktivasyonu yoluyla mühendislik bağ fonksiyonunu ve kollajen içeriğini iyileştirebildiğini düşündürmektedir. Özetle, egzersiz klimalı serum ile kombine edilmiş bir mühendislik bağ modeli kullanarak, i) egzersiz sonrası serum ortamının mühendisli bağ fonksiyonu ve kollajen üzerine etkisini araştırmayı, ii) bağ fenotipindeki değişiklikleri serum hormonu konsantrasyonundaki değişikliklerle ilişkilendirmeyi, Hangi değişikliklerin serumda meydana geldiğini belirlemek amacıylaVe iii) ligaman işlevinde gelişmelere yol açan egzersiz sonrası serum ile aktive edilen moleküler mekanizmaları belirlemek için serum biyokimyasal çevrenin moleküler hedeflerini araştırmak için 2D biyolojik tahliller kullanarak çalışmanın kapsamını genişletmek. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" /> Şekil 1: Yapay bağların oluşumuna ve kullanımına genel bakış. Fırçalık çimento çapaları imal edilir ve silikon kaplı plakalar halinde sabitlenir. Primer fibroblastlar, ACL kalıntılarından izole edilir ve genişletilir. Mühendislik yapıları, fibroblastları iki brushite çimento çapa etrafında bir fibrin jelinde kapsülleyerek oluşturulur. İşlenmiş bağlar, istenen hangisi istenen kimyasal veya mekanik ( örn. Bir biyoreaktör yoluyla) istenen uyaranlarla kültürlenir ve işlenir. Arzulanan bitim noktasında mühendislik yapılan bağlar mekanik için toplanabilir ve değerlendirilebilirL özellikleri, gen ifadesi, kollajen içeriği, protein ekspresyonu ve histoloji. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" /> Şekil 2. Primer ligaman fibroblastları, iki fırçak çimento çapasına dayanan fibrin esaslı kemikten kemik yapımı ligament oluştururlar. ( A ) Zamanla, fibroblastlar fibrin jelini fırça çimento çapaları etrafında doğrusal bir doku oluşturarak kasılmaktadır. ( B ) İlk üç günde, hücreler fibrin jeline yapışır ve çekme kuvvetleri uygulayarak hücreleri yapının uzun ekseni ile hizalaştırır. Hücreler, 14 günden uzun sürede hizalanmış bir doku oluşturur. Ölçek çubuğu = 160 μm. ( C ) Yapay bağların DNA içeriği artmaya devam ediyor oHücreler çoğaldığında kültürde 14 gün. Veriler grup başına n = 3-4 yapıları ile ortalama ± SD olarak sunulmuştur. grupları. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" /> Şekil 3: Yapay bağ mekanik özellikleri ve kollajen içeriği zamanla gelişir. ( A ) Ligament yapıları, belirli bir müdahalenin bağ fonksiyonu üzerindeki etkisini belirlemek için tek eksenli olarak çekme testine tabi tutulmuştur. Gösterildiği gibi, iki adet ters kalıplanmış, 3D baskılı tutma yeri, mühendislik şeridi ile köprülenen karşılıklı olarak şekillendirilmiş çapaları tutar. Çapalar, test edilen dokunun stres / şekil değiştirme eğrileri oluşturmak için bir kademeli motora ve kuvvet transdüserine bağlanır ve mekanik özelliklerin belirlenmesine izin verir. ( B &lt;/ Strong&gt;) Başarısızlığa maruz kalmış mühendislik yapmış bir bağın temsil ettiği stres-gerinim eğrisi. 28 gün boyunca, ( C ) nihai gerilme mukavemeti (UTS), ( D ) maksimum çekme yükü (MTL), ( E ) Young modülü ve ( F ) kollajen fraksiyonu iyileşmeye devam etmektedir. Veriler grup başına n = 5 yapı ile ortalama ± SD olarak sunulmuştur. * Diğer tüm gruplardan önemli farklılık göstermektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" /> Şekil 4: Mühendisli bağlar işlevsellik ve biyokimyasal içerik açısından düşük donör değişkenliği göstererek değerlendirilebilir. Mühendislik yapmış bağlarda 7 farklı donör (n = 3 erkek, n ​​= 4 kadın) oluşturuldu. 2 hafta sonra oF kültürü için, ( A ) maksimum gerilme yükü, ( B ) nihai gerilme mukavemeti ( U ), ( C ) Young modülü, ( D ) kesit alanı (CSA), ( E ) toplam kollajen içeriği Ve ( F ) kuru kütlenin bir fraksiyonu olarak kollajen. Veriler ortalama ± SD, istatistiksel anlamlılık Student&#39;s t-testi ile gösterildi. * Diğer gruplara göre anlamlı farklılık gösterir (p &lt;0.05). Şekil Lee ve diğ. 25 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" /> Şekil 5. Mühendislik yapıları biyolojiye yanıt olarak mekanik ve biyokimyasal değişiklikler gösterirMüdahaleler. ( A ) Serum, pre- (RestTx) ve egzersiz sonrası (ExTx) deneklerden toplanan kan çekimlerinden izole edildi ve kültürlenen ikinci hafta boyunca mühendisli ligamanları tedavi etmek için kullanıldı. ( B ) (i) Dinlenme ve egzersiz serumundaki insan büyüme hormonu (GH) ve (ii) insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) -1 seviyeleri ELISA ile nicelleştirildi. ( C ) ExTx ile işlenmiş mühendislik yapıları iyileştirilmiş (i) kollajen içeriği ve (ii) maksimal gerilme yükü göstermiştir. Eşleştirilmiş karşılaştırmaların (RestTx ve ExTx) istatistiksel önemi, anlamlılık düzeyi p &lt;0.05 olarak belirlenmiş bir t-testi ile analiz edildi. ( D ) ExTx&#39;e bağlı kollajen içeriğindeki değişikliklere bu faktörlerin olası katkısını belirlemek için (i) GH ve (ii) IGF-1&#39;in bir doz-tepkisi kullanıldı. E) 2D biyolojik tahliller, (i) S6K Thr38&#39;in fosforilasyonu gibi moleküler sinyal hedefleri üzerindeki artan dozlarda GH, RestTx ve ExTx&#39;in etkilerini karşılaştırmak için kullanıldı.9 ve (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . İki den fazla deney grubunun istatistiksel karşılaştırması ANOVA ve Tukey&#39;s HSD kullanılarak yapıldı. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. * Kontrol ile anlamlı bir fark (p &lt;0.05) ve § 150 ng / mL ve 300 ng / mL IGF-1&#39;den anlamlı fark olduğunu gösterir. Şekil, West ve diğ. 1 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model at JoVE.com

Ligament Yapılarının Egzersiz Şartlandırılmış Serumla Tedavisi: Çevirisel Doku Mühendisliği Modeli | Biyomühendislik | Video

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Üç boyutlu yapıların insan egzersize şartlandırılmış serum ile muamele edildiği ve kollajen içeriği, fonksiyonu ve hücre biyokimyası için analiz edildiği bir ligament doku modeli sunuyoruz.

Egzersiz Koşullandırılmış Serum İle Ligament Yapılarının Tedavisi: Bir Translasyonel Doku Mühendisliği Modeli

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

treatment-ligament-constructs-with-exercise-conditioned-serum

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Bioengineering

Human Biology

Nutrition and Digestion

SCIENTISTS IN ACTION

13.5K Görüntüleme.  University of California, Davis.  Üç boyutlu yapıların insan egzersize şartlandırılmış serum ile muamele edildiği ve kollajen içeriği, fonksiyonu ve hücre biyokimyası için analiz edildiği bir ligament doku modeli sunuyoruz. 

Video: Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Biyomühendislik

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Cerrahi Alma, İzolasyon ve<em&gt; In vitro</em&gt; Doku Mühendisliği Uygulamaları için İnsan Ön Çapraz Bağ-türevli Hücreleri Genişleme

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Engineered Ön Çapraz Bağ Greftlerinin Değerlendirme Atimik Rat Modeli

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Hastalıkta hücresel etkileşimleri incelemek için fare tendon assembloidlerinin üretilmesi

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell populations. This load-bearing core is encompassed, nourished, and repaired by a synovial-like tissue layer comprising the extrinsic tendon compartment. Despite this sophisticated design, tendon injuries are common, and clinical treatment still relies on physiotherapy and surgery. The limitations of available experimental model systems have slowed the development of novel disease-modifying treatments and relapse-preventing clinical regimes. 
In vivo human studies are limited to comparing healthy tendons to end-stage diseased or ruptured tissues sampled during repair surgery and do not allow the longitudinal study of the underlying tendon disease. In vivo animal models also present important limits regarding opaque physiological complexity, the ethical burden on the animals, and large economic costs associated with their use. Further, in vivo animal models are poorly suited to systematic probing of drugs and multicellular, multi-tissue interaction pathways. Simpler in vitro model systems have also fallen short. One major reason is a failure to adequately replicate the three-dimensional mechanical loading necessary to meaningfully study tendon cells and their function. 
The new 3D model system presented here alleviates some of these issues by exploiting murine tail tendon core explants. Importantly, these explants are easily accessible in large numbers from a single mouse, retain 3D in situ loading patterns at the cellular level, and feature an in vivo-like extracellular matrix. In this protocol, step-by-step instructions are given on how to augment tendon core explants with collagen hydrogels laden with muscle-derived endothelial cells, tendon-derived fibroblasts, and bone marrow-derived macrophages to substitute disease- and injury-activated cell populations within the extrinsic tendon compartment. It is demonstrated how the resulting tendon assembloids can be challenged mechanically or through defined microenvironmental stimuli to investigate emerging multicellular crosstalk during disease and injury.

Yazar Spotlight: Hücresel Mekanizmaları Anlamak için Fare Toplulukları Geliştirerek Tendon Araştırmalarını İlerletmek

Here, we present an assembloid model system to mimic tendon cellular crosstalk between the load-bearing tendon core tissue and an extrinsic compartment containing cell populations activated by disease and injury. As an important use case, we demonstrate how the system can be deployed to probe disease-relevant activation of extrinsic endothelial cells.

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell ...

Tendon Araştırma ve Mühendisliği için Üç Adımlı Organoid Model

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly arranged collagen type&#160;I-rich extracellular matrix (ECM) and T/L-lineage cells mainly positioned in parallel rows. After injury, T/L require a long time for rehabilitation with high failure risk and often unsatisfactory repair outcomes. Despite recent advancements in T/L biology research, one of the remaining challenges is that the T/L field still lacks a standardized differentiation protocol that is able to recapitulate T/L formation process in vitro. For example, bone and fat differentiation of mesenchymal precursor cells require just standard two-dimensional (2D) cell culture and the addition of specific stimulation media. For differentiation to cartilage, three-dimensional (3D) pellet culture and supplementation of TGF&#223; is necessary. However, cell differentiation to tendon needs a very orderly 3D culture model, which ideally should also be subjectable to dynamic mechanical stimulation. We have established a 3-step (expansion, stimulation, and maturation) organoid model to form a 3D rod-like structure out of a self-assembled cell sheet, which delivers a natural microenvironment with its own ECM, autocrine, and paracrine factors. These rod-like organoids have a multi-layered cellular architecture within rich ECM and can be handled quite easily for exposure to static mechanical strain. Here, we demonstrated the 3-step protocol by using commercially available dermal fibroblasts. We could show that this cell type forms robust and ECM-abundant organoids. The described procedure can be further optimized in terms of culture media and optimized toward dynamic axial mechanical stimulation. In the same way, alternative cell sources can be tested for their potential to form T/L organoids and thus undergo T/L differentiation. In sum, the established 3D T/L organoid approach can be used as a model for tendon basic research and even for scaffold-free T/L engineering.

Yazar Spotlight: 3D Organoid Modellerle Tendon Doku Mühendisliğini İlerletmek

Herein, we demonstrate a three-step organoid model (two-dimensional [2D] expansion, 2D stimulation, three-dimensional [3D] maturation) offering a promising tool for tendon fundamental research and a potential scaffold-free method for tendon tissue engineering.

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

Egzersiz Koşullandırılmış Serum İle Ligament Yapılarının Tedavisi: Bir Translasyonel Doku Mühendisliği Modeli

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mühendislik Fibrin tabanlı Doku miyofibroblastlar ve Kısıtlar Uygulamasından Yapıları ve Hücre ve Kollajen (Re) Organizasyon tetikleyebilecek süzün

Cerrahi Alma, İzolasyon ve

Engineered Ön Çapraz Bağ Greftlerinin Değerlendirme Atimik Rat Modeli

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

Hastalık ve Onarımda Hücresel Karışmayı Araştırmak için Mühendislik Tendon Toplulukları

İnsan Dermal Fibroblastları Kullanılarak Kendi Kendine Monte Edilmiş Hücre Tabakası Kültürünün ve 3D Tendon/Ligament Benzeri Organoidin Manuel Olarak Üretilmesinin Gösterilmesi