Name: avian semen collection by cloacal massage and isolation of dna from sperm
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm at JoVE.com

Ve Jeffrey Kittilson laboratuvarı için destek biz Jose Noguera cloacal Masaj, erken hakkında yardım almak için teşekkür ederiz. Bu eser bir ND EPSCoR FAR0022429 Ödülü BJH için tarafından desteklenmiştir. Yayın ücreti cömertçe NDSU bölümü Biyolojik Bilimler tarafından desteklendi.

Bu iletişim kuralı omurgalı hayvan konular içerir ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kuzey Dakota Eyalet Üniversitesi tarafından onaylandı.
1. meni koleksiyonundan bir ötücü kuş cloacal masaj kullanarak
Not: Cloacal masaj bir çoğalma etkin kuşlar sadece üzerinde etkili meni koleksiyonu tekniktir, ancak başarıyla uygun esir durumlarda Üreme mevsimi dışında yapılan. Üreme faaliyet cloacal masaj kullanmadan önce hedef türler için tespit edilmelidir. Bu teknik yakalama üzerine yabani kuş vurmak ya da esaret altında düzenlenen kuşlar kullanılabilir.
<ol><li>(İçinde durumu doğurmak) bir erkek kuş ile başlayan sigara dominant el pençesinde bander'ın aktarım kuş dominant el palm (şekil 1) dokunmadan ventral yan ile.<ol>
<li>Kuş başı lateral palmiye kenarına en yakın olduğundan emin olun. Hafif baş ve orta parmak, yüzük ve serçe kullanarak güvenli. Bu kuşun havalandırma ve kuyruk maruz bırakır.</li>
		<li>Kuş bacaklar gevşek veya hafifçe ölçülü palmiye kullanarak bırakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> Resim 1 : Kavrama cloacal masaj için. Kuş hafifçe dominant el palm ve pinky parmak tarafından güvenli baş dokunmadan ventral yan ile sabitlenir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"><li>Baskın işaret parmağı ve başparmak lağım üstün sonu her iki tarafında yerleştirin ve hafifçe parmak birlikte kuyruk ( Şekil 2) doğru çok hafif basınç uygularken çimdik. Lağım cloacal mukoza (pembe iç) açığa çıkar. Not: kuş ise cloacal tümsek küçük olabilir şu anda meni, üreten ve lağım evert zordur. Tecrübesiyle, çoğalma etkin ve etkin olmayan erkek5,11cloacas arasında ayırt etmek kolaydır.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> Resim 2 : Parmak pozisyonu ve cloacal tümsek. Lağım üstün sonuna (A) hafif basınç uygulayarak çıkar. Bir çoğalma aktif erkek ötücü içinde cloacal tümsek açıktır ve firma (B). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="3"><li>Sigara dominant el ile kuyruk el stabilize etmek için tabanının dorsal tarafta parmağı yastık yerleştirin ve diplidir lağım hemen altında parmak ucu yerleştirin. Not: Kısa ve yumuşak küçük resim cloacal masaj gerçekleştirmek için avantajlıdır ve kaza sonucu yaralanma kuş korur.</li>
	<li>Baskın başparmak hareket derin ve cranially lağım kalma orta basınç ile tekrarlayan bir hareket. Kuş cinsel ilißki kadar devam edin. Bireysel bağlı olarak, bu genellikle 1 ve birkaç düzine vuruşları arasında sürer.</li>
	<li>En kısa zamanda kuş cinsel ilißki, meni mikrohematokrit tüp içinde toplamak. Cloacal masaj birden fazla cinsel ilißki elde etmek için yineleyin. Not: Ötücü meni hafif kahverengi ve genellikle biraz kalın bir tutarlılık vardır. Beyaz ve koyu maddelerden lağım atılır meni değildir ve meni örnek kontamine. Az miktarda kan lağım bulunan görünümünü veya içinde ile karışık meni genellikle masaj sırasında çok fazla baskı tarafından neden olur.</li>
	<li>DNA ekstraksiyon için 1 x PBS (pH 7,4) 20 µL ile microcentrifuge tüp meni yerleştirin. Not: 1 x PBS içinde depolanan meni suni tohumlama için uygun değildir, ancak DNA ekstraksiyon daha sonraki bir tarihte kullanılan-80 ° C'de saklandığında PBS Oda sıcaklık olabilir veya soğutulmuş ama meni örnek yatırılır sıvı bir durumda olması gerekir.<ol>
<li>Sperm örnek varlığı seyreltilmiş örnek (şekil 3) bileşik mikroskop altında küçük bir miktar görüntüleyerek doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>-80 ° C'de seyreltilmiş meni ayıklama kadar saklayın.</li>
</ol>2. çıkarma DNA'ın kuş meni
Not: Bu iletişim kuralı birden fazla ticari DNA ekstraksiyon kitleri ile test edilmiştir, ancak sadece bir DNA kiti12ile kullanıldığında başarılı oldu. Değiştirilen kiti Protokolü adım simgesiyle *.
<ol><li>Dithiothreitol (DTT) suda 1 M çözeltisi hazırlamak ve bir vortex.* kullanarak mix<ol>
<li>Aliquot DTT çözüm ve -20 ° c kadar kullanımdan hemen önce saklayın. Elde edilebilir için her örnek, 1 M DTT solution.* 10 µL gerektirir</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 mM Tris-Cl, pH 8.0 içeren bir arabellek hazırlamak; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; ve % 4 SDS. Bu buffer.* 90 µL ayıklanmasını her örneği gerektirir<ol>
<li>Arabellek, oda sıcaklığında saklayın. Çöktürülmüş Eğer o dissolve.* 56 ° c sıcak</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir rocker veya shaker 65 içeren bir kuluçka Onceden ° C.*</li>
	<li>Hemen çıkarma işlemine başlamadan önce 10 µL DTT çözüm 10 örnekleri açılan Eğer adım 2.2 her örnek elde edilebilir, örneğin 900 µL arabellek artı 100 µL DTT çözüm için hazırlanan tampon 90 µL ile karıştırın. Bu karışım DTT-buffer.* adı verilecek</li>
	<li>70 µL 1 x PBS tüm seyreltilmiş meni örnek ve iyi bir vortex.* kullanarak karıştırın</li>
	<li>100 µL eklemek DTT-tampon ve 10 µL İndinavir K çözüm örnek. Girdap 20 saniye sonra bir rocker veya shaker.* 1 saat önceden ısıtılmış kuluçka makinesine kuluçkaya</li>
	<li>200 µL tampon AL ve 200 µL eklemek taze alkol (% 100) ve 20 seconds.* için girdap</li>
	<li>Tüm örnek bir spin sütuna aktarmak ve 6.000 x g. atma 1 dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW1 ekleyin. 1 6.000 x g. atma dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW2 ekleyin. 6.000 x g. adlı 1 dakika santrifüj atmak akışı aracılığıyla ve sütun geri televizyonda yer.</li>
	<li>3 dakika 20.000 x g. atma, koleksiyon tüp santrifüj kapasitesi ve sütun bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin.</li>
	<li>Damlalıklı 35 AE µL arabellek sütun membran doğrudan ve oda sıcaklığında 5 güncellemeler için kuluçkaya</li>
	<li>1 dakikada 14.000 x g. atma spin sütun santrifüj kapasitesi ve ayıklanan örnekleri-80 ° C'de depolayın</li>
</ol>

<ol>
	<li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+size+and+sperm+competition+in+birds.">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li><li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+life+histories:+the+long+and+the+short+of+it.">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li><li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+of+the+male+gamete.">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li><li>Burrows, W. H., Quinn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+collection+of+spermatozoa+from+the+domestic+fowl+and+turkey.">The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey.</a> Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).</li><li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cloacal+protuberance:+a+means+for+determining+breeding+condition+in+live+male+birds.">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li><li>Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+ejaculate+quality+in+dark-eyed+juncos+according+to+season,+stage+of+reproduction,+and+testosterone+treatment.">Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment.</a> The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).</li><li>Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+morphology,+swimming+velocity,+and+longevity+in+the+house+sparrow+Passer+domesticus.">Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).</li><li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifications+to+the+IMAGEJ+computer+assisted+sperm+analysis+plugin+greatly+improve+efficiency+and+fundamentally+alter+the+scope+of+attainable+data.">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li><li>Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+application+of+DNA+'fingerprints'.">Forensic application of DNA 'fingerprints'.</a> Nature. 318 (12), 577-579 (1985).</li><li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR+assay+for+measurement+of+avian+telomeres.">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li><li>Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).</li><li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs.">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li><li>Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Song,+sperm+quality+and+testes+asymmetry+in+the+sedge+warbler.">Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler.</a> Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).</li><li>L&#252;pold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds.">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li><li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+(Melopsittacus+undulates).">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li><li>Stelzer, G., Crosta, L., B&#252;rkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attempted+semen+collection+using+the+massage+technique+and+semen+analysis+in+various+psittacine+species.">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Biz küçük ve orta ölçekli kuşlar üreme etkin durumda sperm toplama ve kuş sperm DNA ayıklanması için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.
Açıklanan Sperm DNA ekstraksiyon protokolü bir kit basitlik için değiştirilebilir, ancak kuş meni kullanmak için rafine. Sperm lizis standart ayıklama kimyasallar9,13tarafından dayanıklı ve sperm örneği ötücüler toplanan oldukça küçük (genellikle bir kaç microliters). Bu faktörler DTT uygun bir konsantrasyon kullanarak ve 65 ° C'de kuluçka başarıyla üstesinden sorunlar mevcut Bu yöntemi kullanarak, biz sürekli DNA kullanılabilir miktarda sperm telomer uzunluğu (genellikle arasında 40-250 ng/µL, boşalmak birim bağlı olarak) qPCR çözümlenmesi için izole ettim.
DTT fenol/kloroform tepki13ile birlikte kuş sperm DNA ayıklamak için daha önce kullanılmış. Fenol/kloroform reaksiyonlar DNA yalıtmak için etkili, ama onlar daha zaman alıcı, daha tehlikeli ve duman kukuIeta gerektirir. Bir önemli bizim ayıklama Protokolü sadece bir marka ve ekstraksiyon kiti, muhtemelen küçük hacimli örnek başlatma nedeniyle türü ile kullanıldığında başarılı geçtiğine kısıtlamasıdır. Çok küçük sperm örneği (1 µL) ya da düşük sperm yoğunluğu ile örnekleri DNA yetersiz DNA örneği mevcut nedeniyle başarılı ayıklama engel olabilir, ama zaman içinde durumu doğurmak kuşlar üzerinde cloacal masaj yapılır Biz bu sorunla karşılaştı değil . Bu sorunu önlemek için cloacal masaj hemen çıkarma için birikmiş birden fazla cinsel ilißki toplamak için tekrar edilebilir.
Cloacal masaj yıllardır kullanılmakta ve birçok tür1,4,5,6,7,15,16,17ve bir kuşlar birçok durumda sperm toplama hızlı ve etkili anlamına gelir. Yakalanabilir vahşi veya eğitimsiz kuşlar ile ilgili çalışmalar için bir madde ile benim ve menisini isteyerek mevduat erkek kuş inandırıcı itimat toplama yöntemlerine göre daha etkili olur4. Testisler veya seminal glomera diseksiyon tarafından başka bir sperm koleksiyonu yöntemdir, ancak bu koruma amaçlı ya da tekrarlanan örnekleme4,14için bir seçenek değil. Birincil cloacal masaj tekniği gösteri olmadan öğrenme güçlüğü kısıtlamasıdır. Yazılı açıklamalar çoğu kez anlamak ve işlemi uygulamak öğrenmek için yetersiz. Cloacal masaj ayrıntılı olarak gösteren tarafından biz öğrenme zamanı ve zorluk tekniği öğrenmek isteyenler için azaltmak umuyoruz.

Sperm kalitesini ve rekabet1, sperm telomer dynamics2, epigenetik3ve benzer konular, ilgili sıra onlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır ve sperm kolayca cloacal kullanarak tatmak mümkündür çalışmaları için ideal konular kuştur Masaj. Cloacal masaj meni kuşlar4,5,6toplamak için bir nazik, non-invaziv manuel tekniktir. Yinelenen örnekleri kolayca elde edilebilir ve hiçbir özel araç alan veya laboratuvar gerçekleştirmek basit yapmak gerekli. Cloacal masaj yıllardır kullanılıyor olsa da, mevcut gelen açıklamalar yazılı öğrenmek zordur. Bu yayın belirsizlik cloacal masaj öğrenmede yer ve zamanı azaltmak için tasarlanmıştır.
Meni cloacal masaj kullanarak kuşlardan toplanan hemen hareketliliği değerlendirme4,7 veya suni tohumlama8için kullanılan veya gelişmiş görüntüleme ve DNA ekstraksiyon gibi diğer kullanımlar için dondurulmuş. Sperm örneği ötücü kuşlar küçük ama yoğun paketlenmiş sperm barındırır. DNA sperm9özel koruyucu özellikleri üstesinden gelmek için değişiklikleri ile sadelik için bir ticari ekstraksiyon kiti kullanılarak elde edilir. Çıkarma sonra sperm telomerlerin qPCR10kullanılarak ölçülebilir.

<table><tbody><tr><td>Microhematocrit capillary tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362566</td><td>Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Any</td><td></td><td>Used for storing semen samples prior to DNA extraction.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1233508</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>Any supplier can be used.</td></tr><tr><td>QIAamp DNA micro kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

avian semen collection by cloacal massage and isolation of dna from sperm

Meni topluluğu çeşitli sperm kalitesi, sperm telomer dynamics ve epigenetik ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere uygulamalar için yararlı olabilir. Kuşlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan konulardır ve tekrarlanan sperm örnekleri içeren çalışmaları için idealdir. Ancak, az kaynak şu anda toplamak ve kuş sperm DNA ayıklamak nasıl öğrenmek isteyenler için kullanılabilir. Burada cloacal Masaj, kuş sperm toplamak için bir nazik, non-invaziv el ile teknik açıklayın. Ne kadar bu teknik literatürde kurulur, kullanılabilir açıklamaları öğrenmek zor olabilir. Ayrıca DNA kuş meni bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma hakkında bilgi sağlar. Cloacal masaj kolayca herhangi bir küçük ve orta boyutlu erkek kuş üreme durumda kullanılabilir. Koleksiyon meni hemen motilite testleri için kullanılan, veya burada açıklanan protokol sonrası DNA ekstraksiyon için dondurulmuş. Bu ayıklama protokolü için kuş sperm rafine ve başarıyla birçok ötücü türü (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusve Turdus migratorius toplanan örnekleri üzerinde kullanılan ) ve bir columbid (Columba livia).

Cloacal masaj ve açıklanan protokol birçok ötücü türü ve bir columbid (Tablo 1) gerçekleştirilen ayıklama DNA'yı kullanarak. Sperm meni örneklerinin cloacal masaj tarafından toplanan varlığı 400 X büyütme (şekil 3) seyreltilmiş numune bir bileşik mikroskop altında küçük bir miktar ile ilgilenen tarafından doğrulandı. DNA sperm örneği açılan house burada açıklanan protokolü kullanarak serçeler toplanan sonra sekiz örnekleri Jel Elektroforez (üç örnek şekil 4' te görülebilir) bir DNA merdiven ile çalıştırın. Bulaşması olmadan farklı gruplar sekiz yüksek kalitede DNA başarılı yalıtım gösteren örnek şerit içinde görüldü. Bu iletişim kuralını kullanan çıkarılan diğer örnekleri Spektrofotometre (bakınız Tablo 1) kullanarak DNA toplama için değerlendirildi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig3.jpg"> Şekil 3: iki küçük ötücü spermi. Bu sperm örnekleri ev finch (Haemorhous mexicanus), cloacal masaj yaptı ve bir ev serçesi (Passer domesticus), doğru tarafından elde edildi 2016 yılında Fargo, ND içinde sıkışmış. Örnekleri her 20 µL PBS içinde seyreltilmiş ve 1000 X ve 400 X büyütme, bileşik mikroskop altında sırasıyla görüntülenebilir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig4.jpg"> Şekil 4 : DNA Jel Elektroforez Sperm DNA'sı. Üç ev serçe sperm çıkarılan DNA örnekleri bir jel bir DNA merdiven ile çalıştırın. Farklı grup, yüksek kalitede DNA başarılı ayıklama gösteren varlığını unutmayın. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55324/55324fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Ev serçesi (Passer domesticus)</td>
			<td>Yonga serçe (Spizella passerina)</td>
			<td>House finch (Haemorhous mexicanus)</td>
			<td>Amerikan robin (Turdus migratorius)</td>
			<td>Kaya güvercini (Columba livia)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplanan örneklerin sayısını</td>
			<td>156</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Çıkarılan örneklerin sayısını</td>
			<td>90</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sperm toplama başarı oranı</td>
			<td>% 98</td>
			<td>% 75</td>
			<td>% 100</td>
			<td>% 67</td>
			<td>% 67</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: türler ve örnekleri toplanan ve bugüne kadar çıkarılan. Yayın sırasında örnekleri 4 ötücü tür ve 1 columbid açıklanan protokolünü kullanarak işlendi. Sperm toplama başarı oranı her hangi bir örnek başarıyla denedi toplam numarası dışında elde edildi yüzde ifade eder.

Watch this Scientific Journal Video about Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm at JoVE.com

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Bu iletişim kuralı cloacal Masaj, kuşlar ve kuş sperm bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma DNA meni toplamak için bir non-invaziv el ile teknik açıklar.

Kuş sperm toplama Cloacal masaj ve Sperm DNA izolasyonu

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

avian-semen-collection-cloacal-massage-isolation-dna-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.9K Görüntüleme.  North Dakota State University. Bu iletişim kuralı cloacal Masaj, kuşlar ve kuş sperm bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma DNA meni toplamak için bir non-invaziv el ile teknik açıklar.

Video: Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Memeli Erkek Germ Hücrelerinin Çok Denekli Saflaştırılmasında Standart Bir Yaklaşım, Mekanik Doku Ayrılma ve Akış Sitometrisi ile

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Gelişim Biyolojisi

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and maturation. As of yet, weekly injections of human chorionic gonadotropin (hCG) have proved to maturate males after just 5-6 weeks of treatment, producing high volumes of high-quality sperm during several weeks. In addition, sperm cryopreservation protocols using different extenders, cryoprotectants and cooling and thawing times have been previously described for European eel. Here, we show that Tanaka&#180;s extender solution can be directly used for fertilization or for cryopreservation, making unnecessary the usage of different types of solutions and dilutions. Furthermore, the use of methanol as a cryoprotectant makes this protocol easy to use as methanol has low toxicity and does not activate the sperm. The sperm does not need to be cryopreserved immediately after the addition of the cryoprotectant, and it can be used long after being thawed. Moreover, sperm motility is still high after thawing although it is lower than that of fresh sperm. The aim of this work is to show the best available protocol for European eel handling, maturation, and sperm cryopreservation.

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocols for European eel maturation and sperm cryopreservation have been improved over the last years. This article describes the best protocol available using human chorionic gonadotropin (hCG) for inducing maturation and methanol as cryoprotectant.

Kullanım ve tedavi, erkek Avrupa yılan balığı (Anguilla anguilla) Hormonal olgunlaşma ve Sperm dondurma için

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Standart Laboratuvar Ekipmanları Kullanılarak Fare Testlerinden Pachytene Spermatosit ve Spermatidlerin Zenginleşmesi

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Biyoloji

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

Gamete koleksiyonu ve Astyanax mexicanus In vitro fertilizasyon

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Recording Electrical Currents across the Plasma Membrane of Mammalian Sperm Cells

Recording of the electrical activity from one of the smallest cells of a mammalian organism- a sperm cell- has been a challenging task for electrophysiologists for many decades. The method known as "spermatozoan patch clamp" was introduced in 2006. It has enabled the direct recording of ion channel activity in whole-cell and cell-attached configurations and has been instrumental in describing sperm cell physiology and the molecular identity of various calcium, potassium, sodium, chloride, and proton ion channels. However, recording from single spermatozoa requires advanced skills and training in electrophysiology. This detailed protocol summarizes the step-by-step procedure and highlights several 'tricks-of-the-trade' in order to make it available to anyone who wishes to explore the fascinating physiology of the sperm cell. Specifically, the protocol describes recording from human and murine sperm cells but can be adapted to essentially any mammalian sperm cell of any species. The protocol covers important details of the application of this technique, such as isolation of sperm cells, selection of reagents and equipment, immobilization of the highly motile cells, formation of the tight (Gigaohm) seal between a recording electrode and the plasma membrane of the sperm cells, transition into the whole-spermatozoan mode (also known as break-in), and exemplary recordings of the sperm cell calcium ion channel, CatSper, from six mammalian species. The advantages and limitations of the sperm patch clamp method, as well as the most critical steps, are discussed.

<meta charset="utf8"></head><body>Memeli Sperm Hücrelerinin Plazma Zarı Boyunca Elektrik Akımlarının Kaydedilmesi

This protocol describes how to perform electrical recordings from mammalian sperm cells in a whole-cell configuration, with the goal of directly recording ion channel activity. The method has been instrumental in describing the electrophysiological profiles of several sperm ion channels and helped to reveal their molecular identity and regulation.