Bu çalışma VLK Alexander von Humboldt Vakfı Sofja Kovalevskaja Ödülü ile desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+isolation+of+liver+progenitor+cells+by+aldehyde+dehydrogenase+activity+in+naive+mice.">Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice.</a> Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).</li><li>Dolle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+liver+progenitor+cells:+a+practical+point+of+view.">The quest for liver progenitor cells: a practical point of view.</a> J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+for+the+murine+oval+cell+response.">Surface markers for the murine oval cell response.</a> Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).</li><li>Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductular+reactions+in+human+liver:+diversity+at+the+interface.">Ductular reactions in human liver: diversity at the interface.</a> Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).</li><li>Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+tracing+of+Sox9++liver+progenitors+in+mouse+oval+cell+injury.">Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury.</a> Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).</li><li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxl1-Cre-marked+adult+hepatic+progenitors+have+clonogenic+and+bilineage+differentiation+potential.">Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential.</a> Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).</li><li>Furuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver,+exocrine+pancreas+and+intestine.">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).</li><li>Font-Burgada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Periportal+Hepatocytes+Regenerate+the+Injured+Liver+without+Giving+Rise+to+Cancer.">Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer.</a> Cell. 162 (4), 766-779 (2015).</li><li>Kuramitsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+fibrotic+liver+regeneration+in+mice+is+linked+to+a+severe+fibrogenic+response+driven+by+hepatic+progenitor+cell+activation.">Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation.</a> Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).</li><li>Pritchard, M. T., Nagy, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+fibrosis+is+enhanced+and+accompanied+by+robust+oval+cell+activation+after+chronic+carbon+tetrachloride+administration+to+Egr-1-deficient+mice.">Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice.</a> Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).</li><li>Spee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+liver+progenitor+cell+niche+in+liver+diseases:+potential+involvement+of+Wnt+and+Notch+signalling.">Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling.</a> Gut. 59 (2), 247-257 (2010).</li><li>Eckert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podoplanin+discriminates+distinct+stromal+cell+populations+and+a+novel+progenitor+subset+in+the+liver.">Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).</li><li>Epting, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+antigen-1+is+necessary+for+cell-cycle+withdrawal+and+myoblast+differentiation+in+C2C12+cells.">Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).</li><li>Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+immortalisation+of+hepatic+oval+cells+from+adult+mice+fed+a+choline-deficient,+ethionine-supplemented+diet.">Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).</li><li>Rountree, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential.">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).</li><li>Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD133++liver+stem+cells+for+clonal+expansion.">Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion.</a> J Vis Exp. (56), (2011).</li><li>Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Change+and+Induction+of+Cytokeratin+Expression+During+In+Vitro+Culture+of+Corneal+Stromal+Cells.">Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).</li><li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC):+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC.">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).</li><li>Schmelzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+stem+cells+from+fetal+and+postnatal+donors.">Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors.</a> J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Karaciğer iltihabı, farklı kökenlerden gelen hasarı progenitör hücre genişlemesi ve aktivasyon 2, 3 ile birlikte karaciğerdeki yenilenme sürecini tetikler. Bu karaciğer progenitör hücrelerin hücre özelliklerini kök sahip ve büyük olasılıkla çeşitli karaciğer hastalıklarının mekanizmasında önemli bir rol oynamaktadır. Karaciğer progenitör hücrelerin heterojenliği uzun önerilmiştir. Farklı yüzey belirteçleri taşıyan alt kümelerini belirlemek ve karaciğer hasarı 12 sırasında inflamasyon ile ilişkili genlerin özel bir takım ifade edebilecekleri CD133 ve gp38 yeni bir yüzey işaretleyici kombinasyonunu kullanarak karaciğer progenitör alt kümelerinin yeniden değerlendirilmesi. Burada anlatılan yöntemi nadir hücrelerin sitometri analizi doğrudan akış ve çeşitli karaciğer hasarı modellerinde onların doğrudan karşılaştırma için izin verir. Çeşitli yaralanmalar çoklu progenitör s aktivasyonunu tetikler gibi bu özellikle geçerlidirkanalsal reaksiyonlar 3, 4, 11, 12 gözlenen hücresel heterojenlik yansıtıcı olabilir ubsets. Özellikle, murin karaciğer dokusu (0.2 g) küçük bir kısmı anlatılan yöntem kullanılarak progenitörlerin akış sitometri analizi için yeterli hücreleri izole etmek için yeterlidir. sitometri alt kümelerinin yüksek saflıkta popülasyonları, tasnif Akış eşsiz gen ekspresyon profillerini keşfetmek için gereklidir. Önceki raporlar açıklanan akış sitometri tabanlı progenitör hücre izolasyonu 15, 16. Bununla birlikte, burada sunulan protokol bu hücrelerin yüksek saflık ve canlılığı sağlayan iyileştirilmiş bir yöntem temin etmektedir. Özellikle, daha önce tarif edilen in vitro kültürlenmesi ve genişleme teknikleri güzel buraya 15 sunulan protokolü ile kombine edilebilir <s16,&gt; kadar. seçmeler akış sitometri Birçok tür çeşitli kurumlar mevcuttur ve bunların belirli ölçekler biraz farklı olabilir. Bununla birlikte, hücre sıralama için genel ilkeler, tarif edilen protokol ile sunulmuştur. Genel olarak, düşük bir basınç ve daha büyük meme boyutu, makine türü ve özellikleri bağımsız kesinlikle gereklidir. Ayrıca, uygun bir ayırma ortamının kullanımı önemli ölçüde canlılığı ve özellikle de gen ekspresyonu çalışmaları için, önemli bir faktördür kriteri hücrelerin RNA kalitesini artırabilir. projenitör hücrelerin ayrıştırılması, ancak, büyük ölçüde hücre canlılığını azaltır ve sıralama sonra hücre verimi (4-5 sağlıklı karaciğer toplanmış gereken 7-10,000 olaylar / alt populasyonun yüksek saflıkta tür için) göreceli olarak düşüktür. Bu analizler vitro ileri için sınırlayıcı bir faktör olabilir. Biz manyetik microbead tabanlı izolasyon önermeknitro deneyler nedeniyle, daha yüksek verim ve hücre canlılığı, ve akış daha özel alt analiz eder ve izolasyonu gerekli, özellikle gen ekspresyon analizi için sıralama sitometrisi. hücrelerin canlılığı büyük ölçüde sıralama flow sitometri sonra azalır gerçeğine dayanarak, progenitör hücrelerin otomatik manyetik microbead tabanlı yalıtım geliştirilmiş ve burada sunulmuştur. Yüksek saflıkta (çoklu karaciğerler birleştirerek) ile progenitör hücrelerin daha büyük bir sayıda izole edilmesi için izin verir. Bundan başka, hücrelerin canlılığı izolasyon süreci için gerekli zaman büyük ölçüde azalır, çünkü muhafaza edilir. Progenitör hücrelerin alt sayılar vitro 1, 2, 15, 16 genişletilmiş edilebilir olsa da, in vitro manipülasyonlar kök / ProGen hücresel özelliklerini değiştirebilir nasıl dikkate tavsiye edilirin- hücreleri diğer mezenşimal stromal hücre popülasyonlarının 17, 18 için tarif edildiği. Sunulan manyetik microbead bazlı izolasyon önemli kısıtlılığı CD133 + ve gp38 + hücre popülasyonları heterojen hücreleri temsil olmasıdır. Ek yüzey belirteçleri küçük hücre popülasyonlarının tanımlanması gerekli olabilir. Karaciğer kök hücreler ve atalarıdır birbirleriyle ilişkilerini nasıl anlaşılması Lola Reid ve diğerleri 1, 8, 19 ile mükemmel çalışmalara rağmen, tam olmaktan uzak. Dolayısıyla, bu tür Burada önerilen biri olarak yüksek verim ve canlılığı, sonuçlanan tekniklerin dikkatli bir şekilde düşündükten progenitör altkümesinin tahlillerini ve birbirine ilişkilerin anlaşılmasını uzatmak için yardımcı olabilir. Genel olarak, biz anlattığımız to tecrit ve yakın zamanda 12 ayırt edildi karaciğer progenitör alt kümelerinin detaylı analizi. Ayrıca, yeni bir enzim kombinasyonu kullanılarak, nadir ataları direkt akış sitometrisi ölçümleri ile analiz edilebilir. Ayrıca, protokol hücre sıralama veya otomatik microbead bazlı teknik kullanarak, yüksek saflıkta progenitör hücreleri zenginleştirmek gösterilmiştir. Sorun giderme: Hücre enkaz yüzdeler ve ölmekte olan hücrelerin yüksek Sindirim (aşama 2) sırasında, karaciğer örneklerinin pipetleme çok sertse, tek hücreli bir süspansiyon artar hücrelerin ölme yüzdesi. Karaciğer önerilenden daha büyük parçalar halinde kesilmiş ise, sindirim daha az verimli ve hazırlanması sırasında daha fazla hücre ölümü ile sonuçlanır. 5. adımda işlemini tamamladıktan sonra, numunelerin saflığı yeterli değildir Yüzde varsaAşama 2&#39;de hazırlanan tek hücre süspansiyonu, hücre kalıntılarının n avantaj ve ölmekte olan hücre mikro-spesifik olmayan bağlanma ve bu nedenle, izolasyon saflığı önemli ölçüde azalır, çok yüksektir. microbead tabanlı saflaştırma sonrası düşük hücre sayısı tarif edilen protokol başarılı olabilmesi için, protokolde önerilen mikro-hücrelerin oranı optimal olması önemlidir. Daha fazla mikroboncuklar kullanılması saflık azaltır ve izole hücrelerin verimini ve canlılığını azaltır. protokol anlatılandan daha başka yüzey işaretleme maddeleri progenitör alt izolasyonu için kullanılır ise, mikro-hücrelerin optimal oranı tespit edilmelidir. Gp38 + CD133 Manyetik microbead bazlı izolasyon - Nüfus Ayrıca 10 uL, anti-CD133 + mikro boncuk eklemek Adım 5.3 yılında 5. bölümde adımları izleyin, sonra izleyin adımları 5, 6.2 ve tarif olarak 6.3d. mutlak hücre sayıları hesaplanması Karaciğer ağırlığı Belirli bir alt kümesinin birçok hücre gram karaciğer dokusu başına mevcut nasıl hesaplamak için kullanılır. (Canlı hücreler subpopülasyonu (%) flow sitometri dayalı / 100), karaciğer parçası = Z izole toplam canlı hücre sayısını x (Karaciğer parçasının 1 / ağırlık) Z = hücre sayısı / g karaciğer dokusu x Bu yöntemle izole edilebilir diğer hücre popülasyonları (Vs. veya hematopoietik hücrelerin bir alt grubu, örneğin, Kupffer hücreleri, dendritik hücreler, T hücreleri, NK hücreleri), CD45 + hücreleri ve LSECs: Aşağıdaki karaciğer bu sindirme protokolü kullanarak hücreleri izole etmek mümkündür. Sindirim protokolü hepatositler ya da hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için uygun değildir. Bu hücreler, nispeten düşük hücre sayıları mevcut olup tasarımlarıyla karşılaştırıldığında, indirgenmiş canlılığını gösterenMevcut yöntemler r.

Karaciğer yenilenmesi çok hepatosit kendini yenileme kapasitesi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kronik karaciğer yaralanması ve hepatositlerin cholangiocytes, 1, 2, 3, 4 ayırt etme kabiliyetleri ile ilişkilendirilmiştir progenitör hücre aktivasyonu ve genişleme ile meydana gelir. Kronik yaralanma sırasında hepatosit proliferasyonu etkili değildir, çünkü bu özellikle geçerlidir. Progenitör hücreleri hedef alan çok sayıda genetik izleme çalışmalara rağmen, karaciğer rejenerasyonu rolleri 5, 6, 7, 8 tartışmalıdır. Ayrıca, progenitör hücrelerin aktivasyon yaralanmalarında 9 sırasında tam rolü hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır karaciğerde artan fibrotik yanıtı, bağlantılı olmuştur10. Progenitör hücre bölmesine heterojen doğası uzun mikrodiseksiyon veya hücre sıralama tabanlı yöntemler 1, 11 ile tek bir yüzey işaretleyici ifade eden progenitör hücreler izole edilmiş gen ekspresyon çalışmaları ile öne sürülmüştür. Gerçekten de, en son, yeni bir yüzey markör kombinasyonu kullanılarak gp38 (podoplanin) açık bir şekilde, çeşitli alt-12 progenitör hücrelerin önceki tek belirteçleri bağlandı. Önemlisi, bu alt-gruplar sadece yüzey işaretleyici ifadesinde farklılık değil, aynı zamanda yaralanmaların 12 sırasında işlevsel değişiklikler sergilemiştir. Çoklu hayvan modelleri progenitör hücre aktivasyonu ve karaciğer rejenerasyonu araştırmak için kullanılmıştır. Çeşitli yaralanma türleri progenitör hücrelerin 12 alt kümelerini farklı aktivasyonunu teşvik gibi görünüyor. Bu ph açıklayabilirİnsanlarda 4 gözlenen kanalsal reaksiyon enotypic sapma. Böylece, progenitör hücrelerin karmaşık fenotipik ve fonksiyonel analizleri kendi yaralanmalarda rolü ve karaciğer hastalıklarında kanalsal reaksiyonun gerçek önemini anlamak için çok önemlidir. Yüzey işaretleyici kombinasyonları yanı sıra, hücre izolasyonu protokolleri önemli farklılıklar daha önceki çalışmalarda 2 dayanarak sonuçları zorlaştırıyor. Bazı çalışmalar, önemli miktarda büyük ölçüde izole protokolünde farklıdır progenitör hücreler (örneğin, karaciğer ayrılma (enzim kombinasyonu ve işlemin süresi), yoğunluk, orta ve santrifüj hızı) rolünü ele 2. Optimize edilmiş izolasyon tekniği, nadir hücre popülasyonlarının daha iyi canlılığı sağlayan ve alt küme bileşiminin yansıtıcı, gelişmiş ve son zamanlarda 12 yayımlanmıştır. Bu makalenin amacı, bir daha det sağlamaktırBu karaciğer hücre izolasyon prosedürü ve alt küme analizi ailed protokol tekniğinin uygun üreme için izin vermek. Ayrıca, protokol yeni protokole göre farklılıklar göstermek için önceki izolasyon yöntemi ile bir karşılaştırmasını içerir.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>phenol red free DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Prepare 1% stock solution</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>add 0.5% (v/v) BSA and store on ice</td></tr><tr><td>Phenol-red free DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>counting Beads Count Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 Purified</td><td>BioLegend</td><td>139302</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 Purified</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td>Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells</td></tr><tr><td>CD31 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>102504</td><td>Dilution: 1:200, marks endothelial cells</td></tr><tr><td>ASGPR1 Purified</td><td>Bio-Techne</td><td>AF2755-SP</td><td>Dilution: 1:100, marks hepatocytes</td></tr><tr><td>Podoplanin APC</td><td>BioLegend</td><td>127410</td><td>Dilution: 1:1,400, marks progenior cells</td></tr><tr><td>Podoplanin Biotin</td><td>BioLegend</td><td>127404</td><td>Dilution: 1:1,400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>use 3 &amp;micro;L, marks progenitor cells</td></tr><tr><td>CD133 Biotin</td><td>BioLegend</td><td>141206</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotin</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>140306</td><td>Dilution: 1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>Dilution: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>Dilution: 1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 Biotin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>use 10 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b, &amp;kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, &amp;kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a, &amp;kappa; Biotin</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2a, &amp;kappa; Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>Syrian Hamster IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>Syrian Hamster IgG Biotin</td><td>BioLegend</td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat IgG Control Purified</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>Dilution: 1:800</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>Dilution: 1:400</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m Filter mesh</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene Round bottom tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RLT lysis buffer is included</td></tr></tbody></table>

isolation and enrichment of liver progenitor subsets identified by a novel surface marker combination

Kronik karaciğer yaralanmaları sırasında, progenitör hücreler aynı zamanda inflamatuar hücre infiltrasyonu ve epitel hücre aktivasyonu görünümünü gerektirir kanalsal reaksiyon denilen bir süreçle, genişletmek. enflamatuar reaksiyonlar sırasında projenitör hücre popülasyonu çok histolojik analiz ile veya akış sitometri tabanlı teknikler ile, ya tek bir yüzey belirteçleri kullanılarak araştırılmıştır. Ancak, yeni yüzey belirteçleri karaciğer atası içinde çeşitli fonksiyonel olarak farklı alt kümeleri tespit / hücre bölmesini kaynaklanıyor. Burada sunulan yöntem, yalıtım ve yeni yüzey işaretleyici kombinasyonlarını kullanarak progenitör alt kümelerinin sitometri analizi ayrıntılı akışını açıklar. Ayrıca, çeşitli progenitör hücre alt yüksek saflıkta manyetik otomatik kullanılarak ve FACS ayıklama bazlı yöntemler ile izole edilebilir gösterilmiştir. Önemlisi, karaciğer roman ve basitleştirilmiş enzimatik ayrılma yüksek canlılığı bu nadir bir hücre popülasyonlarının izolasyonu sağlardiğer mevcut yöntemlere kıyasla üstündür. Bu da, in vitro projenitör hücreleri incelemek için ya da gen tanımlama profili analiz yüksek kaliteli RNA izole edilmesi için özellikle uygundur.

Parankimal olmayan parankimal karaciğer hücreleri (Şekil 1 ve 2a) ihtiva eden bir tek hücre süspansiyonu enzimler sonuçlar için yeni bir karışımı ile karaciğer, sindirim için burada sunulan prosedür. Kırmızı kan hücrelerinin ACK-Lize etme sonrasında tek hücre süspansiyonu sitometri analizi doğrudan akım olanağı (Şekil 1 ve 2) &#39;dir. Yolluk strateji çiftler ve ölü hücreleri (Şekil 2a) dışlanması içerir. CD45, CD31 ve ASGPR1 için negatif hücreler Geçitli. Bu nüfus, karaciğer progenitör hücreler içerir ve bunların gp38 ve CD133 ekspresyonu (Şekil 2a) dayalı toplanabilir. Gp38 + CD133 + ve gp38 - sağlıklı yetişkin fare liv hücreleri - CD31 - - ASGPR1 CD133 + hücreler en bol hücre CD45 arasında popülasyonları temsiler (Şekil 2a, b). Bu alt-gruplar, daha önce bu EpCAM, Sca-1 ve CD34 (Şekil 2c) halinde progenitör hücreleri ile ilişkili ek yüzey markerlerinin ifadesiyle farklıdır. Progenitör hücreler, hepatositler ve karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSECs) (Şekil 1 ve 3), ve projenitör hücreler, manyetik mikroboncuk bazlı yalıtımlı daha da arıtılabilir olabilir (Şekil 3a, b) ya da olduğu gibi hematopoietik ve parankimal hücreler, boşaltılabilir ayırma yüksek saflıkta (Şekiller 1 ve 4). % 90 saflıkta CD133 + veya gp38 + hücrelerinin sonuçları manyetik mikroboncuk bazlı yalıtım (Şekil 3a, b) kirletici CD45, CD31 veya ASGPR1 + hücreleri ile ilgili olarak, ve hücreler, yüksek canlı kalır (Şekil 3a, b). <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; progenitör hücre biyolojisinde önemli bir engel-hücrelerinin iltihabı durumunda, nadir hücre popülasyonlarının temsil olmasıdır. Diğer taraftan, mevcut izolasyon teknikleri çeşitli hücre yapısı ve izole edilmiş karaciğer hücrelerinin 2 canlılığı açısından farklılık gösterebilir. Bu doku ayrılması için kullanılan enzim karışımının seçimi için özellikle uygundur. Burada, kolajenaz P yerine kolajenaz D karaciğer, 1, 2, 8 kullanılmıştır. Önemli olarak, progenitör hücreler üzerindeki CD133 ekspresyon düzeyi ve izole edilmiş bir hücre popülasyonlarının verimi büyük ölçüde kolajenaz D varlığında azalmış (Şekil 5a, b). Buna ek olarak, karışım, hafif bir ayrıştırma ve çeşitli hücre tipleri 13 alt kültür için son derece uygun olan, dispaz ihtiva etmiştir. dispaz temsil birlikte kollajenaz Pprogenitör hücre analizi için karaciğer hücre ayrışma için ideal bir kombinasyon. Bu kombinasyon aynı zamanda, tripsin üstündü veya karaciğer Pronaz tabanlı sindirimi (veriler gösterilmemiştir). Progenitör Bu protokol sunulan analizler için böyle Percoll tabanlı zenginleştirme 2, 14 olarak o yoğunluk santrifüj dikkat etmek aynı derecede önemlidir, gerekli değildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55284/55284fig1.jpg" /> Şekil 1: tarif protokolün iş akışı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55284/55284fig2.jpg" /> Şekil 2: Karaciğer progenitör alt gruplarının Roman sınıflandırılması. Tek hücreli birSüspansiyon, sağlıklı karaciğerler hazırlanabilir ve daha sonra yüzey bir belirteç panelinin ile boyanmıştır: CD45, CD31, CD133 ve gp38 (A). Ölü hücre dışlama için propidium iyodür (PI) kullanılmıştır. yolluk stratejisi ile temsili nokta araziler tasvir edilmektedir. Hücre sayısı tayin akış sitometrisi için kullanılan kapıları da işaretlenir. (B) yüzdeleri ve vahşi tip tedavi edilmemiş hayvanlarda CD45-negatif hücreleri arasında, çeşitli stromal hücre alt karaciğer dokusunda gramı başına mevcut hücrelerinin mutlak sayısı gösterilmektedir. (C) histogram sağlıklı karaciğerde stromal hücre alt ayırt edici işaret özelliklerini gösterir. CD34 B Sca-1 B içinde mevcut olan alt-popülasyonundan özgü ise yüksek CD90.2 ifadesi ve CD157 varlığı, spesifik olan, C, D ve EpCAM nüfusu C ve D ortalama ± SEM sadece mevcuttur; veri (AC) n 2-3 bağımsız deneyler = Deneme başına 3-4 temsil etmektedir. veri were Eşleştirilmemiş, iki kuyruklu T testi * P &lt;0.05, ** p &lt;0,005, *** P &lt;0.0001 kullanılarak karşılaştırıldı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55284/55284fig3.jpg" /> Şekil 3: Manyetik microbead tabanlı zenginleştirme ve otomatik hücre arıtma. CD45 (A) Manyetik microbead dayalı zenginleştirme - CD31 - ve ASGPR1 - hücrelerin önce ve zenginleştirme sonrası tasvir edilmiştir. Otomatik microbead bazlı hücre izolasyonların (B) Temsilcisi nokta araziler solda, CD133 + ve gp38 + hücreleri için tasvir edilmektedir. Sağ tarafta, önce ve zenginleştirmeden sonra hücre popülasyonlarının canlılığı yüzdesi olarak gösterilirpropidium iyodür (PI) negatif hücreler. Ortalama ± SEM; verileri (AB) deney başına n = 3 ile 3 bağımsız deneyler temsil etmektedir. Veriler unpaired, iki kuyruklu T testi * P &lt;0.05, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0.0001 kullanılarak karşılaştırıldı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55284/55284fig4.jpg" /> Şekil 4: Yüksek saflıkta progenitör alt kümelerinin tür Flow sitometri. Nokta araziler sıralanmış numuneler (post-sort) hücre popülasyonlarının saflığını betimliyor. Veri 3 bağımsız deneyler temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55284/55284fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55284/55284fig5.jpg" /> Şekil 5: sindirim enzimleri karşılaştırılması. veya collagenase D (adım 2&#39;de tarif edildiği gibi), tek hücreli bir süspansiyon kolajenaz P kullanılarak elde edilmiştir (1 mg / ml + DNaz I 0.1 mg / mL), sağlıklı ciğeri ve daha sonra yüzey bir belirteç panelinin ile boyanmıştır: CD45, CD31, CD133 ve gp38 (A). yabani tip tedavi edilmeyen hayvanlarda CD45-negatif hücreleri arasında çeşitli stromal hücre alt gruplarının karaciğer dokusunda gramı başına mevcut hücrelerin yüzdeleri gösterilmiştir. (B) CD133 ortalama florasan yoğunluğu CD133 + hücre popülasyonu için gösterilmiştir. Ortalama ± SEM; verileri (AB) deney başına n = 3 ile 2 bağımsız deneyler temsil etmektedir. Veriler unpaired, iki kuyruklu T testi * P &lt;0.05, ** p &lt;0,005, *** p &lt;0.0001 kullanılarak karşılaştırıldı.target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination at JoVE.com

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Görüntüleme.  Saarland University Medical Center.  Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir. 

Video: Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Biyoloji

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Biyomühendislik

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Tıp

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Tanımlanmış Bir Farklılaşma Sistemi Kullanarak Pluripotent Kök Hücrelerden Hepatik Progenitör Spesifikasyonu

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...