Bu araştırma T32 (CA 9686-18) ve 1 TL (TL1TR001431) doktora sonrası eğitim bursu ödülleri (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) yanı sıra tarafından desteklenmiştir U01 PAR-12-095 (Kumar) ve P30 CA051008-21 (Weiner). Örnek sabitleme, kesit ve boyama Lombardi Kapsamlı Kanser Merkezi Histoloji ve Doku Paylaşılan Kaynak gerçekleştirildi. Biz yararlı tartışmalar için Richard Schlegel teşekkür ederiz. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

3D Hücre 1. Kuruluş Kültür takın Sistemi <ol><li> Aşağı 6 kuyu plaka (Şekil 1A) bir ters yönde (yukarı filtre tarafı) 2 polikarbonat hücre kültürü ekler yerleştirin. </li><li> parçanın alt tarafına su içinde% 0.1 jelatin, ince bir tabaka halinde yayılır ve sterilliği korumak için, biyolojik bir güvenlik kabini (10-20 dakika) kurutun. </li><li> Adımı tekrar 1.2 insert% 0.1 jelatin 3 uygulama toplam iki kere daha. NOT: Jelatin kaplama odacıkları arasındaki sınır difüzyon yardımcı olacaktır. </li><li> kültür şişesi yıkamak için 5 ml PBS ekleyin standart kültür koşullarında birincil Literatürde KRK toplamak için. <ol><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA (T-75 T-25 ve 2 mL için 1 mL) kullanılarak hücreler tripsinize. Yavaşça hücreleri yerinden çıkarılmasına yardımcı olmak için balonun yan dokunun. Sonra tripsin reaksiyonu durdurmak ve tam DMEM 5 ml ekleyerek hücreleri toplamak için devam edin. </li><li> Toplamak<html> 15 ml bir tüp içinde hücreleri. 4 ° C ve 188 x g&#39;de tüpü santrifüjünde ve otomatik bir hücre sayacı ya hemasitometre kullanarak sayın. </li><li> Medya (CM) klimalı 250 uL 600.000 Literatürde KRK yeniden askıya ve düzgün odaklı (filtre tarafı aşağı) kültür insert (Şekil 1B) ekleyin. Bu iç hazne olarak adlandırılır. Not: CM ışınlanmış J2 hücreleri şartlandırılmış F ortamı ve daha önce 7, 8, 9, 11 tarif edilen şekilde 10 um Y-27632 içerir. </li></ol></li><li> 6 plaka dış haznesine CM 2 mL uygulayın ve (en azından 18 saat için) gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasının CM kaldırmak ve yavaş yavaş tam kadar 1 ml pipet ile iç odaya farklılaşma medya (DM) ekleyin. Hücre tabakası rahatsız için dikkatli olun. </li></ol>3D Kültürlerin le &quot;&gt; 2. Bakım <ol><li> Her gün kültürleri kontrol edin. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, sağlıklı hücreler görünür. </li><li> Dış odasında CM her gün ya da hücrelerin metabolizması bağlı olarak her geçen gün değiştirin. </li><li> (Sarı), iç bölme değişiklikleri renk medya, dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç filtre odasının medya kaldırdığınızda. </li><li> Bir aspirasyon ucu ile dış 6 kuyu plaka odasında medya aspire. </li><li> 1 ml pipet kullanarak, yavaşça tam kadar iç odaya taze DM uygulayın. kazımak veya başka hücre tabakası çıkarmak için dikkatli olun. </li><li> Taze CM 2 mL dış odasının ortamı değiştirin. </li><li> 2 hafta kültürleri korumak ve daha sonra istenen bimolecular izolasyonu için işleme devam edin. NOT: 6 plaka her satır, altı ekler (Şekil 1B) toplam, DN için yeterli hücre elde etmek için deney başına işleme tabi tutulmalıdırAnaliz için bir RNA ya da protein. </li><li> dış odanın aspire ortam ve 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile durulayın. </li><li> Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından ortamı çıkarın ve 500 uL PBS ekleyin. kazıma veya başka membran üzerinde hücrelerin rahatsız etmemek. </li><li> Aspire dış odasından PBS ve dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından PBS kaldırmak. PBS çıkarıldı sonra, aşağıda ayrıntılı olarak uygun bir uygulama direkt olarak devam edin. Membran kurumasına izin vermeyin. Uygulama başlamaya hazır olana kadar kültür PBS kısaca tutulabilir. </li></ol> 3. Pelet Bankacılık için filtreler İşleme <ol><li> her bir iç bölmeye 100 uL% 0.25 tripsin-EDTA ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. </li><li> aşağı yukarı pipetleme ve süre Kısaca ve özenle / ajitasyon 200 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın (Punc önlemek) Membran açmadan. 37 ° C&#39;de 1 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Filtreyi durulama yavaşça ilk iç odaya CM 250 uL ekleyin ve yukarı pipet ve. </li><li> Transferi Aynı medya koşullarını içerir ve aşağı yukarı pipetleme tekrarlayın ve komşu filtre odasına hücreleri yeniden süspanse. </li><li> Tek bir durumun ekler her biri için bu işlemi tekrarlayın. Toplamak ve 1.5 ml santrifüj tüpüne hücreleri transferi. </li><li> kalan hücreleri toplamak için CM ek 100-200 uL her bir iç bölmeyi durulayın. Aşama 3.5, 1.5 ml santrifüj tüpüne ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 423 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> Süpernatantı aspire ve 1000 uL PBS ile bir kez hücre pelet yıkayın. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde 423 x g hızında tekrar Spin. </li><li> PBS aspire ve daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de dondurularak. </li></ol> 4. RNA veya DNA İzolasyon için filtreler İşleme <ol&gt; <li> İç bölmeye guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform veya benzer ekstraksiyon reaktifi, 200 uL ilave edilmekte ve kısaca bir şekilde pipetli yukan aşağı çekilerek membran yüzeyinde hücreleri çalkalayın. </li><li> Dış oda kuru ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ekstre edici reaktif olarak inkübe edin. <ol><li> filtre elemanından ayırmak gibi, yukarı ve aşağı çekme çözüm pipetleme kopuk filtre membran yıkayın. 6 plaka devirme ve herhangi bir kalıntı sıvıyı aspire mümkün olduğunca çıkarma reaktif kadar toplayın. </li></ol></li><li> saflaştırılması ve DNA, RNA ya da protein geri kazanımı için imalatçının protokolü takip edin. </li></ol> 5. Protein İzolasyonu için filtreler İşleme <ol><li> Buz üzerinde 6 plaka filtre koyunuz. İç bölmeye, 10 ul 1 mM sodyum florit (NAF), 1 mM sodyum vanadat (NAV), 100 mM dithiothre ile takviye edilmiş bir protein liziz tamponu ilaveinositol (DTT) ve anti-proteaz kokteyli 100 uL. </li><li> / Çalkalamak yukarı ve aşağı pipetleme ise 20 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın. lizis tamponunda kabarcıkları üreten kaçının. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde filtre eklenmiş 6 yuvalı plaka inkübe edin. </li><li> kazıma Tekrar sonra lizis tamponu ile membran yüzeyin durulanması. </li><li> 6 uçlar arasında lisatlan toplayın ve buz üzerinde 1.5 ml santrifüj tüpüne aktarılır. </li><li> Bir sonraki filtreye liziz tamponu ve transfer ek olarak 10 uL ilk membran durulayın. </li><li> Tüm ekler için yineleyin 5.6, herhangi bir kalıntı lizis tampon çözeltisi toplama ve 1.5 mL tüp (adım 5.5) ekleyin. </li><li> ilave bir 5 dakika boyunca buz üzerinde örnek inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika maksimum hızda (bir masa üstü santrifüjü içinde 16.873 xg) dönerler. </li><li> Taze 1.5 ml tüp içine Pipet lizat süpernatant. </li><li> protein konsantrasyonu ya da taştan analizine devam edin-80 ° C&#39;de lizatları Re. </li></ol> H &amp; E ve Immuno-boyama 6. İşleme <ol><li> İç ve dış bölmeye 500 uL% 10 1 ml NBF (nötr tamponlu formalin) ilave edin ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Dış odasından NBF aspire ve 1 mL hidroksietil agaroz (HEA), 1.5 mL santrifüj işleme jeli ilave edin. Yavaş yavaş düşük güç kullanan bir mikrodalga agaroz eritebilir ve erimiş agaroz kadar 10-20 s darbeleri tekrarladı. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar katılaşmasını önlemek için, 37 ° C sıcak bir banyoda HEA tutun. </li><li> iç odanın NBF çıkarın ve iç bölme erimiş HEA 25 uL uygulanır ve agaroz 2-5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar. </li><li> % 10 NBF Islak 2 köpük histoloji yastıkları ve (Şekil 3D bakınız) gömme kaset bir ped yerleştirin. </li><li> parçanın alt tarafında filtreyi skor (çok keskin, ince uçlu bir bıçak olan) bir 11. bıçak neşter kullanabilirsinizodası kısmen plastik uç haznesinden bırakmadan. </li><li> Bir Petri kabındaki NBF küçük bir miktar (100-200 ul) yerleştirin ve NBF (Şekil 3A) kısmen yerinden filtreyi batırmayın. </li><li> Bir # 10 bıçak neşter ile hafifçe tam uç haznenin (Şekil 3B) filtre çıkarmak için, uç bölmenin içinden, filtre ortasında karşı baskı. hala hazne takılı filtrenin bir kısmı olması durumunda, neşter ile sever. </li><li> 10. bıçak neşter (Şekil 3C) ile ikiye HEA kaplı filtre kesin. </li><li> Aşama 6.4 (Şekil 3D) &#39;de hazırlanan histolojik kaset köpük ped üzerine, filtrenin her yarım yerleştirin. </li><li> Filtreyi sandviç, kaset ikinci% 10 NBF batırılmış sünger ekleyin. </li><li> Yapış NBF kaseti, yer mühür ve gece inkübe edin. </li><li> kesit ve boyama olarak parafin bloklar halinde süreç filtreleriDaha önce 12 tarif. </li></ol>

<ol>
	<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor.">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis.">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li><li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development.">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li><li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer+stem+cells.">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li><li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells.">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li><li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells.">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li><li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogs+of+the+Novel+Phytohormone,+Strigolactone,+Trigger+Apoptosis+and+Synergy+with+PARP1+Inhibitors+by+Inducing+DNA+Damage+and+Inhibiting+DNA+Repair.">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li><li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor(s)+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells.">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868 (2015).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Primer hücre hatları kanser araştırmaları için önemli ve hızla gelişen bir platform vardır. kültür insert tabanlı 3D kültür sistemi bir iki haftalık süre içinde birincil prostat CRClerin farklılaşmasını desteklemektedir. CRC filtre yöntemi prostat araştırma için yeni bir orta hacimli yöntemi temsil eder. Mevcut fare PDX modelleri zaman alıcı ve son derece pahalıdır ve PDX örneklerin birçok araştırmacı tarafından başlatılan deney ve kullanımını sınırlayan, kültür içinde yetiştirilen edilemez. PDX kurma başarı oranları büyük ölçüde 13 değişebilir Buna ek olarak, CRC yöntemi hücre hatları 3 kurulmasında yüksek bir başarı oranına sahiptir. Bizim sistem R-spondin tabanlı prostat organoid yaklaşımın tamamlayıcı olarak düşünün; Bununla birlikte, birincil prostat kanserinden organoids kurulması ile ilgili olarak başarı eksikliği 14 bildirilmiştir. Ayrıca, medya, kuruluş yöntemleri,ve CRClerin bakım R-spondin tabanlı prostat organoid yaklaşıma göre önemli ölçüde basittir. Ek bir avantaj olarak, CRC kurulan ve doğrudan moleküler karşılaştırmalar için eşleştirilmiş normal ve tümör kültürleri test etmek için kullanılır. Bazı teknik sorunlar bu sistemi kurarken ele alınması gerekmektedir. İlk olarak, jelatin kaplama uç yardımcı filtrenin alt tarafına uygulanabilir ancak, zarından medya difüzyonunu ortadan kaldırmaz. Sık ortam değişiklikleri (hücrelerin daha düşük ya da taban tabakası) bölme içinde koşulları büyüme vs farklılaşması (üst ya da apikal hücre tabakası) ilgili gradyanı sürdürmek için kullanılır. İkinci olarak, başarılı 3D CRC kültürleri nispeten yüksek bir hücre ekim yoğunluğu gereklidir. Alt tohumlama yoğunlukları filtre yüzeyinde gelişen hücre tabakasının bütünlüğü açısından kötü sonuçlar vermiştir. Literatürde KRK kültürleme Bu bir bakımı yapıldığında en çok şiddetle büyüdükçe, ortak bir hususturt yüksek hücre yoğunlukları. Son olarak, uygun bir çıkarma ve sağlam hücre tabakasını parafine gömme hücre farklılaşması ölçüde tanımlamak için çok önemliydi. hidroksietil agaroz (HEA) eklenmesi her iki hücre kaybına da yol açmaktadır ve gömülü olmayan filtrelerle karşılaştırıldığında hücrelerin genel morfolojisi geliştirilmiş (gösterilmemiştir). düzgün bir şekilde yerleşik sonra, filtreler kesitli ve tipik hücre ve doku örneklerinin farksız bir şekilde işlenmiştir. Biz sadece bu filtre yöntemi kullanılarak prostat epitel mimarisini taklit başlıyor. medyaya ve alt tabakaya kültür koşullarına ek değişiklikler, kolaylıkla ele alınabileceğini, hangi garanti altındadır. Örneğin, daha iyi bazal farklılaşma vs luminal teşvik edebilir yeniden formüle farklılaşma ortamlarının hızla test edilebilir. CRClerin lentiviral enfeksiyonu ticari kanser hücrelerinin 7 ve 2D CRC ile olduğu kadar kolay uygulanabilir beri al varböylece kalıcı bir şekilde hücre genomu (veriler gösterilmemiştir), mutasyona uğramış silinmiş veya tamir genlerin etkisi test edilebilir değiştirmek için CAS9 / CRISPR gen düzenleme teknolojisi vektörleri ile transfekte edilmiş. Benzer bir şekilde, soy izleme soyu, özgül raportör genleri ile mümkün olabilir. ortam veya hücre değiştirmeye ek olarak, filtre yüzeyine değişiklikler de test edilebilir. Farklı filtre zarı substratlar ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, filtrenin içine uygulandığında, ticari hücre dışı matris uygun bir büyüme ortamı sağlar bulmuşlardır. insert sisteminin amaçlarından biri daha prostat mikro modeli olduğu için, belki de en ilginç değişiklikler, normal veya tümör kaynaklı stromal hücrelerin giriş olması ya ucun sınırları içinde veya CRClerin ile ko-kültür olabilir alt bölmede büyüme ortamı koşulu. o bölümleri ile iyi insert değiştirmef Decellularized prostat dokusu da mümkündür. Bu yaklaşımda, stromal / epitelyal etkileşimler birincil hücreler büyüme için bir iskele olarak decellularized doku kullanmak için izin verebilir. birincil hücreler kurmak ve daha sonra onların farklılaşması için koşulları sağlamak için yeteneği, normal glandüler gelişme içine ve kanser araştırmaları için daha biyolojik ilgili araştırma için ideal bir formattır. Bu tarifnamede anlatılan sistem, hücre tipleri ve modifikasyonlar sınırsız sayıda ayrı ayrı deney ihtiyaçlarına sistemi oluşturmak için ve güvenilir analiz için numune toplamak için kombine edilebildiği, bir platform sağlar.

bireylere kişiselleştirilmiş kimlik ve kanser tedavilerinin kullanımı kanser araştırmalarında bir birincil hedefi vardır. Son zamanlarda, yeni yaklaşımlar potansiyel olarak her iki belirleme ve kişiye özel tedavilerin test yolları sağlayan primer hücre kültürlerinde kurulmasında daha kolay izin geliştirilmiştir. Örneğin, R-spondin bazlı prostat organoid yaklaşım 1 bir ticari hücre dışı matris içinde normal ve metastatik prostat kanseri hücrelerinin üç boyutlu (3D) kültür (ör Matrigel) için Hücrelerin Şartlı yeniden programlanması (CRC) yöntemi ise Georgetown 2 geliştirilen, 3 daha fazla standart 2D kültür koşulları kullanır. Spesifik olarak, Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ve ışınlanmış J2 fare fibroblast besleyici hücreler kombinasyonu keratinosit CRC 2 belirsiz kültür yol açar. CRC metodolojiSon derece sağlam, birincil hücre hatları başarıyla kuruldu ve prostat ve diğer birçok normal ve malign epitelyal dokuların 3 süresiz muhafaza ile. Önemlisi, bizim CRC teknolojisi önceki ilaç tedavileri bir dizi başarısız olan bir hastada tekrarlayan solunum papillomatozis için etyolojik temeli hızla tanımlanması için izin verdi. Buna ek olarak, normal ve tümör kaynaklı Literatürde KRK kullanılarak bir FDA başarılı kimlik ilk doku biyopsisi iki hafta içinde yapıldı, vorinostat ilaç onaylanmıştır. Hastalar, hastalıkları 4 başarılı bir şekilde tedavi ile sonuçlanan vorinostat yerleştirildi. Normal prostat bezi luminal, bazal ve nadir nöroendokrin hücrelerden 5 oluşmaktadır. Luminal hücrelerin bezinin kolon epitel tabakasının oluşturulması ve androjen reseptörü (AR), hem de bu sitokeratin 8 ve 18 ve ön ve diğer lümen belirteçlerdevlet-spesifik antijen (PSA) 6. Tersine, bazal hücre lümen tabakasının altında lokalize ve sitokeratinin 5 ve p63, ama AR 5 düşük seviyelerde ifade edilir. Biz 7, 8, 9 ve diğerleri 10 başarılı bir şekilde klinik öncesi mekanik ilaç duyarlılığı araştırmalarda prostat Literatürde KRK kullandık. Standart 2D doku kültürü koşullarında yetiştirilen Ancak, bu hücrelerin tam 10 sinyalizasyon AR kavrayana başarısız. bağışıklık yetersizliği olan farelerde böbrek kapsülü altına En önemlisi, CRC permisif ortamına yerleştirildiklerinde prostat CRC kendi soy kararlılığını muhafaza belirten normal prostat glandüler mimarinin ve fonksiyonu geri kazanılmaz. Burada açıklanan Filtre elemanı dayalı hücre kültür sisteminin gelişimi hızlı (2 hafta) kanıtlandığı b prostat CRC in vitro farklılaşmasını sağlarY, artan Ar ve Ar, hedef genlerin ekspresyonu da azaldıkça p63 seviyeleri. Kullanılan filtre ekler memeli hücrelerinin kültürlenmesini destekleyebilir polikarbonat zarları (gözenek boyutu, 0.4 mikron) ihtiva ederler. Sistem, geliştirilmiş olarak normal ve habis prostat CRC, 6 oyuklu kültür tabaklarında ve filtre insertlerin kullanımını sağlar. J2 hücreleri 11 ile belirlenen hücre kültür ortamı, üst bölme alt bölmesi ve prostat ayırt ortam yerleştirilir. teknikler, burada kişiselleştirilmiş tıp hedefleriyle uyumlu bir 2 hafta süre içinde prostat lümen hücre farklılaşmasını destekleyen tarif. Kültürlerin kapsamlı, moleküler genetik ve hücresel profil izin metodolojiler geliştirilmesi de zorunluluk oldu. Filtre yüzeyinden salınan hücrelerden DNA, RNA ve protein izole edilmesine yönelik yaklaşımlar geliştirilmiş ve doğru tekrar numune işleme için aerodinamik edilmiştir. FinaLly, metodoloji H &amp; E, immünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama, gömme etkinleştirmek için filtreyi kaldırma kesit için ve gerekli, tam bir şekilde anlatılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3801</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 Well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin 0.1% in water</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7903</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpel 11 Blade</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>S299-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Vanadate</td>
			<td>Fishcer Scientific</td>
			<td>13721-39-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483123</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030081&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mix Media</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-270-333-M025</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PHG0315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>12585-014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15710-064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP264550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Adherent Dressing</td>
			<td>Telfa</td>
			<td>KDL2132Z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SIAL0167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>CG-M492</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid filter insert-based 3d culture system for primary prostate cell differentiation

Şartlı yeniden programlanması hücreleri (CRC), birincil hücre kültürü ve hasta türevi hücre hatlarının geniş bir &quot;canlı biyobankalar&quot; geliştirilmesi yeteneğine için kalıcı bir yöntem sağlar. Epitel hücrelerinin pek çok türleri için, farklı üç boyutlu (3D) bir kültür yaklaşımları, geliştirilmiş bir farklılaşmış hallerinin destekleyen tarif edilmiştir. CRC de izole edildiği doku olarak soy kararlılığını muhafaza ederken, normal, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirildiğinde kaynaklı doku ile ilişkili farklılaşma markörünü ifade etmiş başarısız olur. prostat kanseri araştırması için, hasta türevi CRC uygulama geliştirmek için, 3D kültür formatı, normal ve tümör türetilmiş prostat epitelial hücreleri hem de hızlı bir şekilde (2 gün toplam) lümen hücre farklılaşması sağlayan tanımlanmıştır. Burada, bir filtre elemanı tabanlı formatı, normal ve habis prostat CRC hem kültür ve farklılaşması için tarif edilmiştir. bir deimmünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama hücre toplama ve işleme için gerekli prosedürlerin kuyruklu açıklaması verilmektedir. Topluca ilköğretim CRC hatları ile kombine tarif 3D kültür biçimi, biospecimen tabanlı prostat araştırma için verim model sistemi belirginleştirebilirsiniz önemli bir orta sağlar.

Hücre kültürü uç tabanlı sistem lümen hücre farklılaşmasını destekleyen prostat CRC 3D kültürleri üretmek için göreceli olarak basit ve hızlı bir yöntemdir. Sistemin şematik bir filtre elemanının alt yüzeyine jelatin kaplama uygulamasını öne (Şekil 1A) gösterilmektedir. dolgular yalnızca jelatin uygulanması için devrilmiştir. Şekil 1B filtreler kültürlenmesi için uygun doğrultuda bulunmaktadır. Şeffaf bir hücre ekleme kullanarak, sağlıklı bir 3D prostat CRC kültürünün bir temsilcisi görüntü (10X) (Şekil 2) gösterilmektedir. gösterdi sağlıklı CRClerin yoğun katman kurulmasından sonra tipik ve standart ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi olabilir. Başlangıç ​​kurulması sırasında, yöntem, belirli bir hücre hattı ile uyumlu olmasını sağlamak için kurulan hücre tabakasının ve uygun ek ve la görselleştirmek için önemlidirhücrelerin Yering meydana gelmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi HEA ucun içine uygulanır. Ek parçası (Şekil 3A, 3B) çıkarmak için bir filtre puanlama zaman HEA uygulanmasından sonra, dikkat edilmelidir. Tüm adımları (Şekil 3A-3D) olarak bakımı da hücreleri ile filtre üzerinde HEA tabakasının gereksiz hareketini en aza indirmek için dikkatli olunmalıdır. CRC tabaka kolayca bozulur ve H &amp; E kaset (Şekil 3B) transferi sırasında zarar görebilir. Plastik varil (Şekil 3A-3C) den HEA kaplı filtre eksizyonu sonra, filtre yarıya olabilir ve kesit ve standart katıştırma kasetleri (Şekil 3D) kullanarak boyanarak için işlenmiş. devre filtresi bölme H &amp; E ve IF çapraz kesit için uygun olan yüzey maksimize etmek önemlidir. immünofloresan boyamaayrıca parlak saha (BF) ve filtre tabakası üzerinde kültür hücreleri Çıkan DSU (disk Tarama Birimi) döner diskli konfokal yetenekleri olan bir mikroskop kullanılarak toplanmıştır. Histoloji ve H &amp; E boyama için Örnek sonuçlar filtre elemanının ve hücreler (20X) (Şekil 4) bir kesiti gösterilmektedir. Doğru bakım ile, doku histolojisi için standart bir uygulama olduğu gibi filtre ekler üzerinde bir CRC tabaka kesitli ve lekeli edilebilir olduğunu göstermektedir. Kesitlere ayırma esnasında (Şekil 4) görüldüğü gibi CRC hücrelerin dokunulmamış tabaka olarak filtreden müstakil olmak mümkündür. BF görüntü gözenekli membran (Şekil 5A) üzerinde çok katmanlı hücre tabakalarını göstermektedir. Her üç floresan belirteçleri (Şekil 5E) birleştirme gibi çekirdeklerin için bireysel floresan görüntüler (DAPI, Şekil 5B), p63 (Şekil 5C) ve AR (Şekil 5D), gösterilmiştir. Son olarak, kompozithücre ve filtreye floresan sinyali göreceli lokalizasyonu kurulması e BF ve bindirme gösterilir IF (Şekil 5F). p63 ile DAPI leke bindirme boyama açıkça proliferatif devlet hala bazı hücreleri gösterir IF. AR lokalizasyonu çekirdeğinde boyama prostat hücrelerinde AR fonksiyonel reaktivasyonu göstergesidir IF. Bizim filtre elemanı sistemi olduğunda bir kesit prostat dokusu arasında bir karşılaştırma, prostat epitel edilene eden soğuk rulo uç tabakasının gelişmesinde benzerliği göstermek için (Şekiller 6a, 6b) de gösterilmiştir. Prostat kanalı prostat bazal hücreler ile tutarlı p63 ifadesini gösterir. p63 boyama, bir ek üzerine CRC görülür. hücrelerini tanımlayan Daha yüksek bir yüzde p63 sağlam doku kesiti ile karşılaştırıldığında bizim geçme gözlenmiştir. Buna ek olarak, nükleer ve sitoplazmik AR hem prostat tis görülür<html> filtre elemanı göstermek daha az genel AR ifade nükleer AR ifade ve sitoplazmik boyanma hem CRC, bozulmamış prostat benzer görülürken bölümü dava ve. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig1.jpg" /> Şekil 1: 3D Kültür sistemini içeren 6-kuyu Kültür Bulaşık ve Ekle Temsilcisi Görüntüler. Filtre (ok) alt tarafına jelatin kaplama uygulamak için (A) Ters ekler. insert ve filtrenin bir büyük resim gösterisi (ek) &#39;dir. (B) Düzgün yerleştirilmiş ekler. Sistemin dış ve iç odalar (oklar) görülmektedir. B kutulu satır belirli bir deneysel durum için elde nasıl birden örnekleri göstermektedir. 2 haftalık büyüme süresinin bitiminde, bu uçlar analiz için yeterli malzeme elde etmek için bir araya getirilmiş olabilir.&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55279/55279fig2.jpg" /> Şekil 2: Şeffaf Filtre Membran üzerine Sağlıklı CRC numaralı seribaşı bir Katmanı bir Temsilci Görüntü Gösterildi edilir. Iç ve dış odalar koşullu ortam ihtiva etmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55279/55279fig3.jpg" /> Şekil 3: Filtre bir Temsilci resmi iki bölüme yarıya ve Gömme bir Parafin Kaset içine yerleştirilir. (A) Filtre puanlama sonra çıkarmadan önce HEA kaplama ile yerleştirin. (B) polikarbonat varil salınan filtresi elemanı. ( <stRong&gt; C) doğru yarıya filtre. (D) Uygun yerleştirme ve gömme kaseti içinde iki yarım oryantasyon. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55279/55279fig4.jpg" /> Şekil 4: Filtre Ekle ve Hücreleri A Temsilcisi H &amp; E Lekeli Kesit (20X). Hem zar (altta) ve hücre tabakası (üst) gösterilmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/55279/55279fig5.jpg" /> Şekil 5: Temsilcisi Parlak Field (BF) ve İmmünoflöresan (IF) A Serisi görüntüleriHücreler Filtre (40X) üzerine Parçal. filtre ve hücrelerin kesitleri gösterilmiştir. Filtre yüzey (5A) bir hücre lekelenmemiş BF görüntü iki farklı protein, p63 (5c) ve androjen reseptörü (AR, 5D) DAPI lekeli çekirdeğe (5B) ve imünoflöresan boyaması için görüntü eşlik eder. Hücre bölümlerine (5E, F) bir kompozit katlamalı hücreleri ve filtre bağlamında IF sinyallerinin lokalizasyonunu tanımlar. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55279/55279fig6.jpg" /> Şekil 6: Doku Prostat Epitelinin bir bölüm (20X) karşı Filtre üzerinde Parçal Hücreleri Bir Temsilci İmmünoflöresan (IF) Görüntü.Bizim filtre elemanının bir kesit görüntüsü, sağlam bir prostat (Şekil 6B) duktal epitelyum tabakalarına kıyasla (Şekil 6A) gösterilmektedir. P63 boyanması, AR ve çekirdek, Şekil 5&#39;te olduğu gibi gerçekleştirilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55279/55279fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation at JoVE.com

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K Görüntüleme.  Lombardi Comprehensive Cancer Center. Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Video: A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a viable treatment strategy and biopsy is not routinely performed, the availability of patient samples for research is limited. Consequently, efforts to study this disease have been challenged by a paucity of faithful disease models. To address this need, we describe here a protocol for the rapid processing of post-mortem autopsy tissue samples in order to generate durable patient-derived cell culture models that can be used in in vitro assays or in vivo orthotopic xenograft experiments. These models can be used to screen for potential drug targets and to study fundamental pathobiological processes within DIPG. This protocol can further be extended to analyze and isolate tumor and microenvironmental cells using Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS), which enables subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA at the bulk cell or single cell level. Finally, this protocol can also be adapted to generate patient-derived cultures for other central nervous system tumors.

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

This protocol describes a method for the rapid processing of post-mortem diffuse intrinsic pontine glioma samples for the establishment of patient-derived cell culture models or direct characterization of tumor and microenvironmental cells.

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Kanser Araştırmaları

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

Hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) for prostate cancer are hampered by tumor heterogeneity and its complex microevolution dynamics. Traditional prostate cancer mouse models include, amongst others, germline and conditional knockouts, transgenic expression of oncogenes, and xenograft models. Generation of de novo mutations in these models is complex, time-consuming, and costly. In addition, most of traditional models target the majority of the prostate epithelium, whereas human prostate cancer is well known to evolve as an isolated event in only a small subset of cells. Valuable models need to simulate not only prostate cancer initiation, but also progression to advanced disease.
Here we describe a method to target a few cells in the prostate epithelium by transducing cells by viral particles. The delivery of an engineered virus to the murine prostate allows alteration of gene expression in the prostate epithelia. Virus type and quantity will hereby define the number of targeted cells for gene alteration by transducing a few cells for cancer initiation and many cells for gene therapy. Through surgery-based injection in the anterior lobe, distal from the urinary track, the tumor in this model can expand without impairing the urinary function of the animal. Furthermore, by targeting only a subset of prostate epithelial cells the technique enables clonal expansion of the tumor, and therefore mimics human tumor initiation, progression, as well as invasion through the basal membrane.
This novel technique provides a powerful prostate cancer model with improved physiological relevance. Animal suffering is limited, and since no additional breeding is required, overall animal count is reduced. At the same time, analysis of new candidate genes and pathways is accelerated, which in turn is more cost efficient.

This protocol describes a newly established method for virus delivery to the murine prostate. Using either CRISPR/Cas9 technology, gene overexpression, or Cre recombinase delivery, the technique allows orthotopic alteration of gene expression and implements a novel mouse model for prostate cancer.

Virüs gen değiştirme için fare prostat CRISPR kılavuzları teslimini

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. While 75% of bladder cancers are non-invasive and unlikely to metastasize, about 25% progress to an invasive growth pattern. Up to half of the patients with invasive cancers will develop lethal metastatic relapse. Thus, understanding the mechanism of invasive progression in bladder cancer is crucial to predict patient outcomes and prevent lethal metastases. In this article, we present a three-dimensional cancer invasion model which allows incorporation of tumor cells and stromal components to mimic in vivo conditions occurring in the bladder tumor microenvironment. This model provides the opportunity to observe the invasive process in real time using time-lapse imaging, interrogate the molecular pathways involved using confocal immunofluorescent imaging and screen compounds with the potential to block invasion. While this protocol focuses on bladder cancer, it is likely that similar methods could be used to examine invasion and motility in other tumor types as well.

The processes governing bladder cancer invasion represent opportunities for biomarker and therapeutic development. Here we present a bladder cancer invasion model which incorporates 3-D culture of tumor spheroids, time-lapse imaging and confocal microscopy. This technique is useful for defining the features of the invasive process and for screening therapeutic agents.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...