This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

NOT: trofoblast atalarıdır içine ya hESC veya hiPSCs farklılaşma için, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) üzerinde yetiştirilen hPSCs BMP4 / A / P ile farklılaşmayı başlamadan önce iki pasaj koşullarını serbest besleyici geçişi yapılır. Bu işlem, farklılaşmış hücre MEF kontaminasyonu ortadan kaldırır. Burada, HESC farklılaşması için bir protokol mevcut ve aynı protokol hiPSCs uygulanabilir. 1. Kültür ve Işınlanmış Fare Embriyonik Fibroblastlar üzerinde hESC Kurtarma (MEFS) (preparatlar) <ol><li> MEF&#39;ler gama-radyasyon <ol><li> % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin (pen / strep) ile DMEM, ve 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) MEFS kültürlenmesi için ortam 500 ml olun. </li><li> Birincil MEFS bir şişe çözülme ve hücrelerin kültürlenmesi için MEF orta kullanın. MEF kültür ortamı kullanılarak 30 plakalara birincil MEFS genişletin. NOT: oksijen konsantrasyonları bu aşama için kritik öneme sahip değildir, bu yüzdenHer iki kuvöz içinde (% 4), fizyolojik ya da ortam (% 20) koşullar kullanılabilir. </li><li> MEFS hasat. plakalardan MEFS çıkarmak ve konik tüp hücrelerin aktarımı için% 0.25 tripsin kullanın. Bir ışınlama aracı haline MEFS yerleştirin ve 3.500 griler hücreleri maruz bırakmaktadır. NOT: süre ışınlayıcı ünitesi içindeki kaynağın etkinliği bağlıdır. </li><li> MEF kültür ortamı ile ışınlanmış MEFS tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını. </li><li> Bir santrifüj kullanılarak MEFS Pelet,% 50 MEF kültür ortamı ve ortam (% 80 FBS ve% 20 MEF kültür ortamı) dondurma% 50 hücre ilave edin. Kısım şişe başına 1 x 10 6 hücre. </li><li> bir gecede -80 ° C derin dondurucuda ışınlanmış MEF şişeleri yerleştirin ve sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen aktarabilirsiniz. </li></ol></li><li> Kültür için dondurulmuş MEFS ve hESC çözülme <ol><li> HESC ortamının 500 ml yapmak: DMEM / F-12,% 20 serum Replacası, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0.1 mM beta-merkaptoetanol ve 1 x Pen / Strep. </li><li> hESC çözülme önce MEFS bir gün bir şişe çözülme. Kat her bir 1 ml kullanılarak,% 0.1 jelatin ile bir 6 yuvalı plaka. Oda sıcaklığında, en az 20 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra jelatin çıkarın. </li><li> Sıvı azot içinde depolama MEF&#39;ler bir şişe çıkarın ve 37 ° C su banyosu içinde şişeyi bırakın. sadece küçük buz kristalleri kalır aralıklı kadar flakon izleyin. Hızla 15 ml konik tüp içinde MEF ortamın 9 ml flakon içeriğini aktarmak. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı aspire ve MEF ortamında hücre pelletini. 6 yuvalı bir plaka uzerinde eşit MEFS kısım. gece boyunca 37 ° C düşük oksijen (% 4) inkübatör içine plaka koyun. </li></ol></li><li> MEFS üzerinde hESC rutin kültür <ol><li> sıvı azot bir HESC şişe çıkarın ve hızlı bir şekilde 3 ile flakon çözülme7 ° C su banyosu. Yavaşça HESC ortamın 9 ml içeren 15 ml konik bir tüp içine hESC pipet ve 5 dakika 200 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. Ortamı çıkarın ve HESC ortamı, 1 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Aşama 1.2.4 hazırlanan levhadan MEF orta aspire ve HESC ortamının 1 ml. HESC ortamına Kaya önleyicisi Y-27632 (10 uM) ekleyin. MEFS üzerine hESC aktarın. </li><li> gece boyunca 37 ° C düşük oksijenli (% 4) inkübatör içine hücreleri yerleştirin. Günlük HESC orta yerine. 4X de dik bir mikroskop altında görüntülendi Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak. </li><li> Geçiş HESC her 4-6 günde hücre konfluent ve HESC kolonilerinin boyutuna bağlı olarak değişebilir. Pasajlanması gün önce MEFS bir tabak hazırlayın. Hücreler geçit hazır olduğunuzda, HESC orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile iyice yıkayın. </li><li> 1 mg / ml kollajenaz ekleme (37 ° C önceden ısıtılmış), 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin ve kolajenaz çıkarın. W, Hücrelerin PBS ile kül oyuk başına HESC ortamın 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak, küçük topaklar içine hücreleri kazıyın. Yeni MEF kaplı iyi (ler) içine askıya hücre kümeleri aktarın. </li></ol></li></ol> MEF&#39;lerden HESC 2. Geçiş besleyici-hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde Koşulları <ol><li> Hazırlayın MEF Orta (CM) Buzdolabı <ol><li> % 90-100 confluency T75 şişesi içinde ışınlanmış MEFS Plaka; MEF&#39;ler yoğun kaplanır önemlidir. onlar şişenin dibine bağlı olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop kullanılarak hücrelerin uyun (MEFS kaplama veya ertesi gün sonra yaklaşık 6 saat ekleyiniz). NOT: Bir mikroskop kullanılarak gözlenen Bekâr hücreler ortamda yüzer. Ertesi gün, MEF orta kaldırmak ve B-FGF eksik hESC orta 25 ml ekleyin. </li><li> inkübasyondan 24 saat sonra koşullu ortam toplanır. 12 günlük bir süre boyunca her gün taze ortam ile değiştirin. </li&gt; <li> 0.22 um bir filtre ile toplanmıştır cm filtre. Önce kullanmak CM taze B-FGF ekleyin. Not: CM, -80 ° C&#39;de dondurulmuş ve 1 yıla kadar depolanabilir. Seçenek olarak ise, 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de CM saklayın. </li></ol></li><li> Geçiş MEFS üzerinde kültür hESC besleyici serbest hücre dışı matriks kaplı plakalar. <ol><li> Kaplama doku kültürü plakaları için hücre dışı matrisin hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde hücre dışı matrisin bir kısım (yaklaşık 3-4 saat) çözülme. buz soğukluğunda ipuçları, tek bir soğuk 50 ml konik tüp, ve DMEM / F12 ortamı transfer buz soğukluğunda DMEM 24 ml hücre dışı matrisin 2 mg kullanarak / F-12 (dilüsyon Sunucunun hücre dışı matris konsantrasyonuna bağlıdır ). </li><li> Hemen buz 50 ml konik tüp transferi ve 4 ° C&#39;de saklayın. Kaplama doku kültürü plakaları için, oyuk seyreltilmiş hücre dışı matrisin uygun miktarda (örneğin, 6-oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 1 mi). plakayı kaplamak için girdap ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> B-FGF (10 ng / ml) ihtiva eden CM kullanılarak MEF&#39;lerden (adım 1.3 gibi) Geçiş HESC. <ol><li> Aspire yeni plakadan ekstraselüler matriks kaldırmak ve B-FGF içeren CM ekleyin. Bir pipet kullanarak MEF plaka kazınmış hücresel kümeleri aktarın ve hücre dışı matriks kaplı plaka içine bölmeyin. gece boyunca 37 ° C&#39;de, düşük oksijen inkübatörde inkübe edin. </li><li> günlük B-FGF orta CM değiştirin; ortamın miktarı, kültür şişesi boyutuna bağlı olacaktır. bir 6-iyi de için orta 2 ml kullanın. Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak. </li><li> Geçiş hESC mikroskop altında bakıldığında koloniler parlak her 6-7 gün. Not: hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyütülmüş HESC koloniler, MEF-kültürlenmiş hücrelerden daha büyük bir büyür. </li><li> besleyici içermeyen hücreler geçiş hazır olduğunuzda, reklama göre yıkayın, orta kaldırmakPBS kaldırmak için bir pipet, aspirat kullanılarak PBS Ding 1 mi, ilave 0.5 mg / ml dispaz bir pipetle (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> oyuk başına 2 ml PBS ilave edilmesi ve daha sonra aspire hücrelerin PBS ile yıkayın. kuyu başına CM 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak küçük öbekler içine hücreleri kazıyın. </li><li> Yeni hücre dışı matris kaplı tabak içine askıya hücre kümeleri Plate; Hücreler 24 saat sonra uymalıdır. </li></ol></li></ol></li></ol> BMP4 / A / P Kullanma hESC 3. Farklılaşma <ol><li> farklılaşma ortamı hazırlayın. Kullanım CM (B-FGF eksik) ekleyin (taze) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) ve PD173074 (0.1 uM). kullanımdan önce CM bu inhibitörleri ekleyin. </li><li> % 4 oksijen ayarlanmış bir inkübatör içinde kültürlendi 1 geçişi için hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyüyen besleyici içermeyen hESC kullanın. hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerine ilk geçişten sonra,Hücreler 24 saat takmak edelim. Sonraki gün, farklılaşma başlatır. (B-FGF ihtiva) cm çıkarın ve BMP4 / A / P (6 çukurlu bir levha içinde çukur başına 2 mi) ihtiva eden CM ile değiştirin. % 4 oksijen seviyelerini kullanarak hücrelerin kültürlenmesi devam edin. </li><li> BMP4 / A / P ihtiva eden cm (2 ml / oyuk bir 6-yuvalı plaka) 2 günde değiştirin. Aspire eski orta kaldırmak ve bir pipet kullanarak yeni CM ekleyin. B-FGF (kabul farklılaşma gün 2) BMP4 ekleme ve kaldırdıktan sonra ikinci gününde, hücre morfolojisi, bir mikroskop kullanılarak gözlenen büyük görünen değişecektir. NOT: Parlak yuvarlak kenarları sergileyen farklılaşmamış hücreler, mevcut olmayacaktır. </li><li> İstenen zaman noktalarında hücreler toplanır. Farklılaştırılmış hücreler yaklaşık 2 hafta sonra bölünmesi durur. Bu süre içinde Transfect hücreleri (bir sonraki bölüme bakınız). </li></ol> siRNA&#39;lar veya plazmid DNA ile trofoblastik hücrelerin 4. transfeksiyonu <ol><li> Transfeksiyon için, trofoblastik hücrelerin hazırlanması </strong&gt; <ol><li> MEFS bunları aktardıktan sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın. </li><li> farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün en az% 50 confluency sağlayacak olan, iyi / yeni bir plaka üzerine 1: Yüksek hücresel confluency önemlidir, bu nedenle hücreler 1 ayrıldı. düşük oksijenli gece boyunca inkübatör içinde inkübe hücreleri. Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur. </li><li> Sonraki gün, farklılaştırma ortamının orta yerine (CM 6 plaka ml / oyuk BMP4 / A / P ihtiva eden B-FGF eksik 2 kullanılarak). Aspirasyon ile eski orta alın ve bir pipet kullanılarak, yeni, orta (2 mi) aktarın. gece boyunca, düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) hücreleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Transfections gen bozulması için siRNA&#39;lar kullanarak veya plazmid DNA kullanılarak <ol><li> İstenilen zaman-kadar hücreleri ayırt(Gün 1 ve 14 arasında) işaret etmektedir. Transfeksiyondan bir önceki gün, 5 dakika için% 0.05 tripsin kullanılarak Hücreleri tripsinize edin. Bir jelatin kaplı plaka üzerine istenen confluency (transfeksiyon reaktif protokolüne bağlı olarak) bunları Plakalı (kaldırmak için 20 dakika ve aspirat için bir doku kültürü plakası% 0.1 jelatin ekleyin). (B-FGF eksik) BMP4 / A / P içeren CM ekleyin ve gece inkübe edin. </li><li> Sonraki gün, hücrelere taze farklılaşma orta ekleyin. Bir siRNA transfeksiyon ayıracı kullanılarak transfeksiyonu siRNA&#39;lar. Plazmid DNA, bir uygun lipofektamin reaktif kullanın. </li><li> Her transfeksiyon reaktifi için tarif edildiği gibi ürün, protokol takip edin. düşük oksijen inkübatör içinde gece boyunca hücrelerin, hücrelerin her bir / plaka siRNA lipofektamin kompleksleri transfer yavaşça karıştırın ve kültür. NOT: Bazı transfeksiyon ayıraçları CM Kalem / Strep eksik gerektiren antibiyotikler tarafından inhibe edilir. </li><li> Ertesi gün, taze farklılaşma medya ile değiştirin. </li><li> arzu hücreleri Hasatd zaman noktaları (örneğin, 24 saat, 48 saat ve 72 saat) kantitatif RT-PCR kullanılarak gen bozulması verimliliğini kontrol etmek. hasat hücreleri için, oyuk başına 1 ml ilave edilmesi ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca inkübe,% 0.05 tripsin kullanın. Tripsin nötralize etmek için, göz başına MEF ortamın 5 ml ekleyin. 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri Spin ve RNA izolasyonu için hücre pelletini kullanın. </li></ol></li></ol> Trofoblastik Hücreleri 5. Patojen Enfeksiyon: Sendai Viral Enfeksiyon <ol><li> Farklılaşması için hESC hazırlanması <ol><li> MEF&#39;lerden transferinden sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın. </li><li> farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün, en az% 50 konfluent sağlayacak yeni bir plaka / çukur üzerine 1: Yüksek hücre birbirine karışmaya önemli için ayrı hücreler 1 olduğu. düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) &#39;de bir gece boyunca inkübe hücreleri. &lt;Br /&gt; Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur. </li><li> Sonraki gün, düşük oksijenli bir inkübatör (% 4 oksijen) farklılaşma madde (ihtiva BMP4 / A / P ve eksik B-FGF) ve gece boyunca kültür ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Trofoblastik hücrelerin Sendai viral enfeksiyon <ol><li> Bir gün istenen farklılaşma bir gün önce, 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin kullanılarak (tek hücre) ayırt Hücreleri tripsinize edin ve jelatin kaplı plaka aktarın. farklılaşma ortamı ilave edin ve düşük oksijenli inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Sonraki gün, (bu virüs ile ilgili olarak değişir), enfeksiyon için orta ekleyin. 6 oyuklu plakanın bir kuyu için 0.5 ml kullanılarak BMP4 / A / P ihtiva eden Pen / Strep eksik kullanımı CM. MOI, düşük oksijen inkübatör 8 saat 1. inkübe for = Sendai virüsü ekleyin. </li><li> ek zaman noktaları gerekli ise, 4 saat sonra virüs içeren orta kaldırmak ve BMP4 / A / P CM ile değiştirin. hücreleri toplayınRNA izolasyonu için bir hücre kazıyıcı kullanarak. </li><li> Viral cevap 18 yer alan genlerin QRT-PCR gerçekleştirilerek viral enfeksiyonun etkinliğini belirler. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast.">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-four+fertilized+human+ova,+good,+bad+and+indifferent,+recovered+from+210+women+of+known+fertility;+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy.">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li><li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blastocysts+grown+in+culture.">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li><li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections.">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes:+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma.">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li><li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast.">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li><li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4.">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li><li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion.">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li><li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model.">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li><li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages.">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li><li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events.">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li><li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li><li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li><li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells:+to+be+or+not+to+be?.">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?.</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li><li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin/nodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts.">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages.">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li><li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways.">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082 (2009).</li><li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+(FGF)+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development.">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li><li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li><li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast.">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li><li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotrophoblastic+cell,+a+mononuclear+chameleon.">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li><li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biz trofoblast atalarıdır içine hESC ayırt etmek için temel adımları sundu. Bu protokol, en son trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını arttırmak ve tipik haliyle, tek başına BMP4 tedavisi ile gözlenir mezoderm progenitörlerle üretilmesini önlemek hızla Aktivin / Düğüm sinyal inhibitörleri ilavesiyle hESC ayırt etmek için optimize edilmiştir. BMP4 model sistem insan trofoblast soy şartname ve genişleme erken aşamalarında incelenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bu BMP4 modeli sistemi, koryokarsinom hücre hatları ve extravillous trofoblast hücre çizgileri kullanılarak mümkün değildir belirli alt soy e trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını araştırmak için yararlıdır. Nitro türevi trofoblastik hücrelerin, aynı zamanda siRNA&#39;lar 19 ile zarar-fonksiyon deneyleri için de kullanılabilir. Buna ek olarak, HESC ya hiPSCs genetik transgen endüklenebilir ifadesi için değiştirilebilir<html> ES 19 ya da endojen loci 20 de haberci genlerin sokulması için ve bu hücreler de burada tarif edilen koşullar kullanılarak trofoblastik hücrelerin içine ayırt edilebilir. Protokol çerçevesinde kritik adımlar HESC trofoblastik progenitör hücreleri elde etmek CM farklılaşma ortamından B-FGF (FGF2) atlamak için zorunludur. Kültür ortamı içinde BMP4 ile birlikte B-FGF varlığı mezoderm ve endoderm atalarıdır 16 ifadesini artırır. Trofoblast farklılaşma ortamında B-FGF dahil güncel bir çalışmada BMP4 aracılı farklılaşma yerine trofoblastlar 21 mezoderm ve endoderm hücreleri üretir bulundu açıklamak inanılmaktadır. Birlikte Aktivin A ve BMP4 B-FGF endoderm ve mezoderm farklılaşma doza bağımlı bir şekilde 22 teşvik o, köklü birs = &quot;xref&quot;&gt; 23. Fare, epiblast, ilkel trofoblast gelişimi ve ilkel endoderm soylar FGF sinyal yollarının 24 bağlıdır. BMP4 farklılaşma 21, 25 sağlamak için kullanıldığı zaman hESC ayırt olarak, B-FGF&#39;nin neden olduğu sinyal mezoderm oluşumu için gereklidir. Bunun aksine, BMP4 ile birlikte, her iki FGF ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının engellenmesi, HESC türevi trofoblast progenitörlerinin syn oluşmasını teşvik eder ve mezoderm ve ilkel endoderm progenitörlerin 26 oluşumunu önler. Tekniğin Sınırlamalar trofoblast atalarıdır için hPSC farklılaşma bu protokol ile en tipik sorun MEFS üzerinde hESC veya hiPSCs bir baskın farklılaşmamış nüfusu ile başlayan ile ilişkilidir. hPSCs hem iç hem de dış kenarlarında farklılaşmış hücreleri birikir içinKolonilerin, günlük farklılaşma miktarını izlemek için ve farklılaşmış koloniler (veya koloniler kısımlarını) kaldırmak için önemlidir. farklılaşmış hücrelerin varlığı hücreleri, hücre-dışı matrise transfer edilir, özellikle farklılaşma sürecine karmaşık hale getirebilir. farklılaşmış hücrelerin hızla CM huzurunda dışı matris üzerinde çoğalacak ve bu hücreler hızla kültürü devralmak ve hPSCs dışı yarışacak. Nedenle, ekstraselüler matriks hücreleri aktarmadan önce MEFS yetişen hPSCs sağlıklı, farklılaşmamış koloniler ile başlamak idealdir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi Bu farklılaşma protokolünü kullanırken, elde edilen trofoblast ataları hücre tipleri heterojen bir karışımıdır. Trofoblastlar villöz sitotrofoblastlar, sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous sitotrofoblastlar oluşmaktadır(EVTs) 27. Villöz sitotrofoblastlar EVTs ve SYN isteklerini elde atalarıdır. BMP4 diferansiye hPSCs plasental özel markörlerin gen ya da proteinin sentezlenmesi ile tanımlanmıştır villöz sitotrofoblastlar, Syns ve EVTs 9, 15, bir karışımını oluşturur. Tat farklılaşma yolları HLA-G salgılanmasının (EVTs karakteristik) veya (Syns den), insan koriyonik gonadotropin 28, 29 ile ayırt edilebilir. Son zamanlarda, düğüm Aktivin / sinyallemesinin engellenmesi hESC EVT farklılaşmasını yana ve bu inhibisyon çıkarılması SYN 17 farklılaşmasını yana olduğu gösterilmiştir. Nitekim, bir önceki yayın hESC ayırt etmek tek başına BMP4 kullanarak SYN hücreleri 26 çoğunlukla üretir bulundu. BMP4 / A / P ve klimalı ortam (B-FGF eksik) kullanarak veriler, oradaEVT ve farklılaşma 5. günde, saf EVT ya EŞZ popülasyonları EVTs izolasyonu için boncuk konjüge edilmiş HLA-G gibi hücre yüzeyi işaretçileri kullanılarak ilave saflaştırma arzu edilirse, 29 mümkün göre, mevcut EŞZ hücreleri her ikisi de. Sonuç olarak, burada tarif edilen kültür yöntemi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir hPSCs gelen trofoblastik hücrelerin önemli miktarlarda üretmek için etkili bir yoldur. Bu protokol, SYN isteklerini ve EVTs hem ürettiğinden erken insan plasenta incelenmesi için uygun bir model sistem. Bu hücreler, ilaç keşfi ve genetik mühendisliği de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Plasenta gebelik sırasında fetusun büyüme ve hayatta kalmak için gerekli ve maternal ve fetal dolaşıma arasında gaz, besin, atık ürünleri ve hormonların alışverişini kolaylaştırır. Memeli Embriyogenez sırasında oluşan ilk organ 6-7 days insanlarda post-anlayışı ve fareler 1, 2, 3, 4 3,5-4,5 gün geliştirmeye başladı plasenta vardır. Trofoblastik hücreler plasenta en önemli hücrelerdir ve bu hücreler memeli embriyosunun ilk soy farklılaşma olaylardan biri temsil etmektedir. Onlar preimplantasyon blastosist dış ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerden kaynaklanır. plasenta gelişiminin erken aşamalarında bilgimiz erken insani gelişme modelleme etik ve lojistik kısıtlamalar ile sınırlıdır. embriyonik implantasyon, trofoblastlar sırasındaanne epitel istila ve özel progenitör hücrelerin 5 farklılaşırlar. Sitotrofoblastlar (CTBS) sigorta ve sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous invaziv trofoblastlar (EVTs) içine ayırt, farklılaşmamış atalarıdır, tek çekirdekli hangi çapa rahim plasenta. SYNs, gebeliği sürdürme için gerekli hormonları sentezlemek terminal açıdan farklılaşmış hücreleri çok çekirdekli edilir. Trofoblastik hücrelerde bozukluklar düşük, pre-eklampsi ve intrauterin gelişme geriliği, 1 sonuçlanır olarak EVTs ve SYN isteklerini oluşturmak erken farklılaşma olayları, plasental oluşumu için gereklidir. Geliştirilen insan trofoblast hücre hatları tipleri CTBS ve plasental hormonlar ve ekran invaziv özellikleri 6 üretmek koryokarsi-, ölümsüzleşti içerir. İnsan ilk trimester plasenta primer trofoblastik hücreler izole ama hücreler hızla dif olabilirfarklılaştıran ve in vitro çoğalan dur. Önemlisi, dönüştürülmüş ve birincil hücre hatları tümörijenik ve ölümsüzleştirdi trofoblast hücre hatları doğru birincil trofoblast 7 temsil edemez belirten farklı gen ekspresyon profillerini var. Ayrıca, bu çizgiler üçüncü trimesterde üzerinden ilk sonra aşamalı türetilen çünkü plasental trofoblast kök hücre atalarıdır benzemeye olası değildir. Plasenta oluşumu ve işlevi erken olayları incelemek için başlangıç aşamasında, insan trofoblast in vitro kültür sistemi içinde sağlam bir ihtiyaç vardır. preimplantasyon embriyo iç hücre kütlesi ile özelliklerini paylaşan İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC), sıklıkla erken plasenta oluşumu da dahil olmak üzere, erken insan gelişimi modellemek için kullanılır. Hem insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) ve HESC Kemik Mor kullanılarak in vitro trofoblast olarak ayırt edilebilirphogenic Proteinler 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4 kullanarak trofoblastik hücrelerin pluripotent hücrelerin Bu dönüşüm, insan hücreleri için özeldir ve erken insan embriyosunun 9, 16 erişimi gerektirmez, çünkü yaygın erken insan plasenta gelişimini incelemek için kullanılır. Son zamanlarda, keşfedildi inhibitörleri çok A83-01 (A) ve SMAD2 / 3 ve MEK1 / 2 sinyal yollarının bloke PD173074 (P), trofoektoderm benzeri progenitörleri, esas olarak Syns halinde hPSC farklılaşma verimini artırır ve mezoderm, endoderm, ya da ektoderm hücreleri 9, 17 kapsamlı nesil olmadan EVTs, </sus&gt;. 12 gün, insan blastosist aşamasında embriyoların izole tropo-ektoderm hücrelerini benzer gen ekspresyon profillerine sahip ve çeşitli plasental spesifik büyüme hormonu salgılayan bu ortam şartları kullanılarak, HESC Bu in vitro model sistemi 9, 11 geçerliliğini destekleyen farklı. Burada, BMP4 / A / P kültür ortamı kullanılarak insan trofoblast progenitörlerde hPSCs in vitro farklılaşması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu koşullar, lipofeksiyon aracılı transfeksiyon kullanılarak RNA sekanslama, gen bozulması siRNA&#39;lar kullanılarak patojen enfeksiyonu ve genetik modifikasyonunu da içeren uygulamalarda, çok çeşitli hücrelerin, bol sayıları üretir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>This is referred to as &#34;serum replacement&#34; in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-FGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated CF1 MEFs</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>6001G</td>
			<td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i low oxygen incubator</td>
			<td>Heracell/VWR</td>
			<td>89187-192</td>
			<td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD173074</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3044/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol is used to isolate total RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365779001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>This is referred to as &#34;extracellular matrix&#34; in this protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

Plasenta embriyogenez sırasında geliştirmek için ilk organdır ve gelişmekte olan embriyonun yaşam için gereklidir. Plasenta preimplantasyon blastosist ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerinden ayırt çeşitli trofoblastik hücrelerin oluşur. Bu nedenle, insan plasenta erken farklılaşma olayları anlayışımız nedeniyle insan embriyogenez izolasyon ve manipülasyon etik ve yasal kısıtlamaların sınırlıdır. Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insani gelişmeyi araştırmak için sağlam bir model sistem ve aynı zamanda çeşitli trofoblastik hücre tiplerinin işaretleri ifade trofoblastik hücrelerin içine in vitro ayırt edilebilir. Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının inhibitörleri kullanan trofoblastik hücrelerin içine hPSCs ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol, siRNA&#39;lar ile transfekte edilebilir, çeşitli trofoblastik hücre tipleri oluştururkayıp-fonksiyon fenotipleri soruşturma veya patojenler ile enfekte olabilir için. Ayrıca, hPSCs genetiği değiştirilmiş olabilir ve daha sonra fonksiyon-kazanç analizleri için trofoblast atalarıdır ayrışmıştır. HPSCs başlayarak insan trofoblast üretmek için bu in vitro farklılaştırma yöntemi erken insan embriyosunun ile çalışma etik ve yasal kısıtlamalar üstesinden gelir ve bu sistem ilaç keşfi ve kök hücre araştırmaları da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir.

HPSCs İn Vitro Farklılaşma Bakış Bu in vitro farklılaştırma protokolü bir pasaj (Şekil 1A) şartlarını serbest besleyici geçişi yapılır MEFS yetişen farklılaşmamış hESC ile başlar. Bu protokolde hESC farklılaşma tarif ederken, başarılı trofoblastik hücrelerin içine hiPSCs ayırt etmek için bu protokolü kullanılır. ekstraselüler matriks geçiş insan trofoblastik hücrelerin saf popülasyonları gerektiren analizler için istenmemektedir ışınlanmış MEFS, çoğunluğu kaldırır. Ayrım hPSCs hücre dışı matris üzerinde büyütülmüş ve koloniler pasajlarının (yaklaşık bir haftalık) için hazır olana kadar CM B-FGF içeren kültürlenmiştir. Bu BMP4 / A / P-aracılı farklılaşma uyaran önce pluripotent durumunu korur. koloniler ~ kümeleri içine 50-100 hücreleri bozulurdispaz kullanarak bir hücre dışı matris kaplı plaka üzerine bir kez pasajlandı. Pasajlanması gün sonra, yapışan hücreler farklılaşma ikna etmek için hazırız ve orta B-FGF eksik BMP4 / A / P içermesi geçer. farklılaşmış hücreler hücre RNA izolasyonu için toplanır ve transfeksiyon deneyleri için de kullanılabilir ve bu süre içinde, yaklaşık 2 hafta, çoğalır. Morfolojik değişiklikler farklılaşmadan sonra 1-2 gün başlatılmıştır ve temsilci bir deneyden elde edilen sonuçlar, Şekil 1 B &#39;de gösterilmiştir görünür. Farklılaşma günlerde 1-2 hücreleri gün 0 (Şekil 1B) hücrelerin daha büyük boyutta olduğuna dikkat edin. farklılaşmış hücre kolonisi hızla büyüyor ve bu değişiklik her gün belirgindir. Farklılaşma ilerledikçe, hücre bölünmeleri ve dışarıya doğru büyüyen, koloninin merkezinden dışarı genişletmek (Şekil 1B günler 3-5). koloninin dış kısmı t kıyasla daha büyük hücreleri içerenkoloninin merkezinde o hücreleri. ayırt hücrelerin ekstrasellüler matriks üzerinde kültüre pluripotent kök hücrelerden daha koyu ve düz hale; Rutin Hücre kültürü için kullanılan dik bir mikroskop ile hücrelerin görüntülerken, hücre parlaklık değişiklikler daha belirgindir. Bireysel koloniler hücre birbirinin üzerinde büyüyen, farklılaşma 5 gün (Şekil 1B) ile birbirine birleştirilir. Farklılaşma günde 4-5 sonra birden fazla çekirdek içeren hücreleri (Şekil 1B), mevcut (gösterilmemiştir) bulunmaktadır. BMP4 / A / P Trofoblast Markerlerinin Farklılaşma ve Anlatım İndükler Biz kantitatif RT-PCR (QRT-PCR) kullanılarak BMP4 / A / P farklılaşma ilk üç gün boyunca gen ifadesi değişikliklerini inceledik. RNA, farklılaşma gün 1, 2 izole ve 3 ve cDNA&#39;ya dönüştürülmüştür. pluripotent kök hücrelerin yok olması, hem b değerlendirilebilirY morfolojisi, bir mikroskopla görsel olarak ve QRT-PCR ile, pluripotense genler için primerler kullanılarak. NANOG, pluripotent kök hücrelerin bir markeri, bağıl ifade seviyelerinin azaltılır ~% 75 hücreleri BMP4 ile kültürlenmiştir ve seviyeleri (BMP4 / A / P mevcudiyetinde ~% 90 oranında azaltılır farklılaşma bir gün sonra Şekil 2). Farklılaşma 2 gün olarak, Nanog&#39;un seviyeleri (B-FGF ihtiva eden) HESC CM ortamı içinde kıyasla BMP4 tek başına ya da BMP4 / A / P kültürlenmiş hücreler için çok düşüktür. Biz daha parlak ve farklılaşmış hücrelere göre daha küçük boyutlu olan farklılaşma iki gün (Şekil 1B), sonra farklılaşmamış hücreler gözlemlemek yok, çünkü bu, beklenen bir sonuçtur. KRT7 ve CDX2: trofoblastik hücrelerin BMP4 aracılı farklılaşma etkinliği, doğrudan iki trofoblast edilen markerler için spesifik primerler kullanılarak QRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu genlerin her ikisi de, insan pluripotent kök olarak ifade edilmezHücreler ve BMP4 tedavi 2-3 gün sonra sentezleme artar (Şekil 2). Burada tarif edilen koşullar kullanılarak, KRT7 transkript seviyeleri (Şekil 2) BMP4 / A / P ortamı içinde farklılaşma günde 1 geliştirmek ve farklılaşmasının ilk 3 gün sabit kalır. Yalnız BMP4 kullanarak KRT7 ifade Aktivin / Düğüm inhibitörleri hESC 9 farklılaşması oranını artırmak önceki gözlemlerle uyumludur 2 gün kadar gecikmiş bir artış vardır. Bu inhibitörlerin kullanılmasının etkinliğini değerlendirmek için başka bir yol, tek başına BMP4 ile tedavi edilen hücrelerde CDX2 ve KRT7 transkriptlerinin kararlı durum bolluk belirlemektir. Aktivin / Düğüm inhibitörleri ile birlikte tek başına BMP4 veya BMP4 ya kullanırken CDX2 seviyeleri farklılaşma gün 1-3 için benzer. Bununla birlikte, KRT7 transkript daha önerir, bu inhibitörler varlığında, farklılaşmanın bir gün sonra daha fazladırhızlı farklılaşma (Şekil 2). CDX2 sentezleme tipik haliyle her iki durum için farklılaşma 2. günde zirveleri ve 3. günde (Şekil 2) sonra azalır. Beklendiği gibi farklılaşmamış hESC, KRT7 veya CDX2 (Şekil 2) ya ifade yoktur. Sonuç olarak, BMP4 / A / P şartları hızlı hESC ayırt ve plasental markör ifade erken farklılaşma 3. gün olarak tespit edilebilir. İn Vitro Kullanımı siRNA&#39;lar ve plazmid DNA transfections ve Viral Enfeksiyonlar Trofoblastik Hücreleri -türevlenmiş İn vitro türetilmiş insan trofoblastik hücrelerin kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, ya gen ekspresyonunu bölmek için siRNA&#39;lar transfekte edilebilir. Biz, farklılaşma gün 1 ve 2 (siRNA&#39;lar 75 pmol kullanarak) siRNA transfections iki tur gerçekleştirilen BMP4 / A / P ile hESC farklılaşma başlattıve RNA izolasyonu için hücreler toplanır. Kantitatif RT-PCR kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan genlerin biri için, yok etme etkisi belirlemek için etkili bir yöntemdir. RNA lncRHOXF1 19 kodlayıcı olmayan uzun bölgelere tamamlayıcı iki siRNA&#39;lar kullanarak, lncRHOXF1 transkriptlerinin (Şekil 3A)% 80 demonte elde edilmiştir. Daha sonra, daha da farklılaşma gün 1, protein kodlayıcı gen hnRNP U, bir siRNA (25 pmol) transfekte edilmiş ve 2 iki ardışık transfections aşağıdaki hnRNP U transkript% 80 azalma gözlenmiştir. Nitro farklılaşmış trofoblast progenitör hücrelerinde doğal immün yanıtları araştırmak için kullanılabilir. Bu Sendai virüsü kullanan 2 hücreleri 1 arasında bir MOI&#39;da farklılaşma gün enfeksiyonları uygulandı ve viral inkübasyondan 8 saat sonra hücreler toplandı. QRT-PCR kullanarak, aktif viral pro işaret enfekte olmuş hücrelerde (Şekil 3B), bol miktarda virüs proteini transkript (sev-NP) tespittrofoblastik hücrelerin pagation. Önemli olarak, enfekte edilmiş hücreler (MOI kullanarak = 1) görünümünü değiştirmek ve yaşayabilir olmayan (veriler gösterilmemiştir). Nitro türevi trofoblastik hücrelerin da plazmid DNA ile transfekte edilebilir. Biz bir GFP plazmid kullanarak transfections gerçekleştirilen ve bu farklılaşma 1 gün ve günde 3 BMP4 / A / P-tedavi hücrelerin içine inşa ve GFP ertesi gün (Şekil 4) için görüntülenmiştir tanıttı. Biz genellikle 24 saat sonrası transfeksiyon de% 30-50 transfeksiyon verimliliği elde etti. Sonuç olarak, nitro türevi trofoblastik hücrelerin gain- ve zarar-fonksiyon deneyleri için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig1.jpg" /> Şekil 1: BMP4 / A / P ile erken trofoblastik hücrelerin insan pluripotent kök hücrelerinin in vitro türevleri. (A) BMP4 farklılaşma şematik<html> BMP4 / A / P ile trofoblastik hücrelerin hPSCs arasında. (B) BMP4 / A / P farklılaşma d0, d2 ve d6 sırasında HUES9 hücrelerinin Temsilcisi parlak alan görüntüler. Ölçek çubuğu = 50 uM. ok uçları ayırt edilmez tek hücreli hESC belirtir. oklar farklılaşma sırasında morfolojik özellikleri vurgulamak. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig2.jpg" /> Şekil 2: BMP4 / A / P farklılaşma hızla Pluripotency işaretleyici nanog downregüle ve trofoblast genleri CDX2 ve KRT7 upregüle. NANOG (Pluripotency işaretleyici), CDX2 ve KRT7 (trofoblast belirteçleri) için Mah-PCR analizi. değerler üçlü önlemlerinden ortalamasıdır.<html> //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55268/55268fig3.jpg" /> Şekil 3: Gen bozma ve in vitro farklılaştırılmış insan trofoblastik hücrelerin kullanılarak viral enfeksiyon. (A) hESC QRT-PCR analizi (HUES9) farklılaştırılmış ve daha sonra RNA lncRHOXF1 (solda) ya da iki gün üst üste protein kodlayıcı gen hnRNP U (sağda) kodlamayan, uzun özel siRNA&#39;lar ile transfekte. demonte verimlilik (KD), tipik olarak% 70-80, ve bir transfeksiyon deneyinde elde edilen sonuçlar gösterilmiştir. (B) 8 saat Sendai virüsü ile enfekte farklılaşma gün 2 trofoblastik hücrelerin Sendai viral protein transkript QRT-PCR analizi (İçişleri Bakanlığı 1 =). Hata çubukları SEM&#39;i belirtir.&quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55268/55268fig4.jpg" /> Şekil 4: in vitro farklılaştırılmış insan trofoblastik hücrelere giriş plazmidinin DNA. farklılaşma Gün 1 ve Gün 3 trofoektoderm projenitör hücrelerine GFP plazmidi DNA transfeksiyonu, ertesi gün görüntülendi. Ölçek çubuğu = 50 uM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

8.5K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Video: In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and iPSCs) across various lineages remain. Numerous differentiation protocols have been developed, yet variability across cell lines and low rates of differentiation impart challenges in successfully implementing these protocols. Described here is an easy and inexpensive means to enhance the differentiation capacity of PSCs. It has been previously shown that treatment of stem cells with a low concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) significantly increases the propensity of a variety of PSCs to differentiate to different cell types following directed differentiation. This technique has now been shown to be effective across different species (e.g., mouse, primate, and human) into multiple lineages, ranging from neurons and cortical spheroids to smooth muscle cells and hepatocytes. The DMSO pretreatment improves PSC differentiation by regulating the cell cycle and priming stem cells to be more responsive to differentiation signals. Provided here is the detailed methodology for using this simple tool as a reproducible and widely applicable means to more efficiently differentiate PSCs to any lineage of choice.

Generating differentiated cell types from human pluripotent stem cells (hPSCs) holds great therapeutic promise but remains challenging. PSCs often exhibit an inherent inability to differentiate even when stimulated with a proper set of signals. Described here is a simple tool to enhance multilineage differentiation across a variety of PSC lines.

Insan pluripotent kök hücrelerinin DMSO ile geçici tedavisi farklılaşma teşvik etmek

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical movement. The architecture of the NMJ structure influences the functions of the neuron, the muscle and the mutual interaction. Previous studies have reported many strategies by co-culturing the motor neurons and myotubes to generate NMJ in vitro with complex induction process and long culture period but have struggled to recapitulate mature NMJ morphology and function. Our in vitro NMJ induction system is constructed by differentiating human iPSC in a single culture dish. By switching the myogenic and neurogenic induction medium for induction, the resulting NMJ contained pre- and post- synaptic components, including motor neurons, skeletal muscle and Schwann cells in the one month culture. The functional assay of NMJ also showed that the myotubes contraction can be triggered by Ca++ then inhibited by curare, an acetylcholine receptor (AChR) inhibitor, in which the stimulating signal is transmitted through NMJ. This simple and robust approach successfully derived the complex structure of NMJ with functional connectivity. This in vitro human NMJ, with its integrated structures and function, has promising potential for studying pathological mechanisms and compound screening.

Here we provide a protocol to generate in vitro NMJs from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). This method can induce NMJs with mature morphology and function in 1 month in a single well. The resulting NMJs could potentially be used to model related diseases, to study pathological mechanisms or to screen drug compounds for therapy.