This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

NOT: trofoblast atalarıdır içine ya hESC veya hiPSCs farklılaşma için, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) üzerinde yetiştirilen hPSCs BMP4 / A / P ile farklılaşmayı başlamadan önce iki pasaj koşullarını serbest besleyici geçişi yapılır. Bu işlem, farklılaşmış hücre MEF kontaminasyonu ortadan kaldırır. Burada, HESC farklılaşması için bir protokol mevcut ve aynı protokol hiPSCs uygulanabilir. 1. Kültür ve Işınlanmış Fare Embriyonik Fibroblastlar üzerinde hESC Kurtarma (MEFS) (preparatlar) <ol><li> MEF&#39;ler gama-radyasyon <ol><li> % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin (pen / strep) ile DMEM, ve 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) MEFS kültürlenmesi için ortam 500 ml olun. </li><li> Birincil MEFS bir şişe çözülme ve hücrelerin kültürlenmesi için MEF orta kullanın. MEF kültür ortamı kullanılarak 30 plakalara birincil MEFS genişletin. NOT: oksijen konsantrasyonları bu aşama için kritik öneme sahip değildir, bu yüzdenHer iki kuvöz içinde (% 4), fizyolojik ya da ortam (% 20) koşullar kullanılabilir. </li><li> MEFS hasat. plakalardan MEFS çıkarmak ve konik tüp hücrelerin aktarımı için% 0.25 tripsin kullanın. Bir ışınlama aracı haline MEFS yerleştirin ve 3.500 griler hücreleri maruz bırakmaktadır. NOT: süre ışınlayıcı ünitesi içindeki kaynağın etkinliği bağlıdır. </li><li> MEF kültür ortamı ile ışınlanmış MEFS tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını. </li><li> Bir santrifüj kullanılarak MEFS Pelet,% 50 MEF kültür ortamı ve ortam (% 80 FBS ve% 20 MEF kültür ortamı) dondurma% 50 hücre ilave edin. Kısım şişe başına 1 x 10 6 hücre. </li><li> bir gecede -80 ° C derin dondurucuda ışınlanmış MEF şişeleri yerleştirin ve sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen aktarabilirsiniz. </li></ol></li><li> Kültür için dondurulmuş MEFS ve hESC çözülme <ol><li> HESC ortamının 500 ml yapmak: DMEM / F-12,% 20 serum Replacası, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0.1 mM beta-merkaptoetanol ve 1 x Pen / Strep. </li><li> hESC çözülme önce MEFS bir gün bir şişe çözülme. Kat her bir 1 ml kullanılarak,% 0.1 jelatin ile bir 6 yuvalı plaka. Oda sıcaklığında, en az 20 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra jelatin çıkarın. </li><li> Sıvı azot içinde depolama MEF&#39;ler bir şişe çıkarın ve 37 ° C su banyosu içinde şişeyi bırakın. sadece küçük buz kristalleri kalır aralıklı kadar flakon izleyin. Hızla 15 ml konik tüp içinde MEF ortamın 9 ml flakon içeriğini aktarmak. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı aspire ve MEF ortamında hücre pelletini. 6 yuvalı bir plaka uzerinde eşit MEFS kısım. gece boyunca 37 ° C düşük oksijen (% 4) inkübatör içine plaka koyun. </li></ol></li><li> MEFS üzerinde hESC rutin kültür <ol><li> sıvı azot bir HESC şişe çıkarın ve hızlı bir şekilde 3 ile flakon çözülme7 ° C su banyosu. Yavaşça HESC ortamın 9 ml içeren 15 ml konik bir tüp içine hESC pipet ve 5 dakika 200 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. Ortamı çıkarın ve HESC ortamı, 1 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Aşama 1.2.4 hazırlanan levhadan MEF orta aspire ve HESC ortamının 1 ml. HESC ortamına Kaya önleyicisi Y-27632 (10 uM) ekleyin. MEFS üzerine hESC aktarın. </li><li> gece boyunca 37 ° C düşük oksijenli (% 4) inkübatör içine hücreleri yerleştirin. Günlük HESC orta yerine. 4X de dik bir mikroskop altında görüntülendi Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak. </li><li> Geçiş HESC her 4-6 günde hücre konfluent ve HESC kolonilerinin boyutuna bağlı olarak değişebilir. Pasajlanması gün önce MEFS bir tabak hazırlayın. Hücreler geçit hazır olduğunuzda, HESC orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile iyice yıkayın. </li><li> 1 mg / ml kollajenaz ekleme (37 ° C önceden ısıtılmış), 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin ve kolajenaz çıkarın. W, Hücrelerin PBS ile kül oyuk başına HESC ortamın 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak, küçük topaklar içine hücreleri kazıyın. Yeni MEF kaplı iyi (ler) içine askıya hücre kümeleri aktarın. </li></ol></li></ol> MEF&#39;lerden HESC 2. Geçiş besleyici-hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde Koşulları <ol><li> Hazırlayın MEF Orta (CM) Buzdolabı <ol><li> % 90-100 confluency T75 şişesi içinde ışınlanmış MEFS Plaka; MEF&#39;ler yoğun kaplanır önemlidir. onlar şişenin dibine bağlı olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop kullanılarak hücrelerin uyun (MEFS kaplama veya ertesi gün sonra yaklaşık 6 saat ekleyiniz). NOT: Bir mikroskop kullanılarak gözlenen Bekâr hücreler ortamda yüzer. Ertesi gün, MEF orta kaldırmak ve B-FGF eksik hESC orta 25 ml ekleyin. </li><li> inkübasyondan 24 saat sonra koşullu ortam toplanır. 12 günlük bir süre boyunca her gün taze ortam ile değiştirin. </li&gt; <li> 0.22 um bir filtre ile toplanmıştır cm filtre. Önce kullanmak CM taze B-FGF ekleyin. Not: CM, -80 ° C&#39;de dondurulmuş ve 1 yıla kadar depolanabilir. Seçenek olarak ise, 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de CM saklayın. </li></ol></li><li> Geçiş MEFS üzerinde kültür hESC besleyici serbest hücre dışı matriks kaplı plakalar. <ol><li> Kaplama doku kültürü plakaları için hücre dışı matrisin hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde hücre dışı matrisin bir kısım (yaklaşık 3-4 saat) çözülme. buz soğukluğunda ipuçları, tek bir soğuk 50 ml konik tüp, ve DMEM / F12 ortamı transfer buz soğukluğunda DMEM 24 ml hücre dışı matrisin 2 mg kullanarak / F-12 (dilüsyon Sunucunun hücre dışı matris konsantrasyonuna bağlıdır ). </li><li> Hemen buz 50 ml konik tüp transferi ve 4 ° C&#39;de saklayın. Kaplama doku kültürü plakaları için, oyuk seyreltilmiş hücre dışı matrisin uygun miktarda (örneğin, 6-oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 1 mi). plakayı kaplamak için girdap ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> B-FGF (10 ng / ml) ihtiva eden CM kullanılarak MEF&#39;lerden (adım 1.3 gibi) Geçiş HESC. <ol><li> Aspire yeni plakadan ekstraselüler matriks kaldırmak ve B-FGF içeren CM ekleyin. Bir pipet kullanarak MEF plaka kazınmış hücresel kümeleri aktarın ve hücre dışı matriks kaplı plaka içine bölmeyin. gece boyunca 37 ° C&#39;de, düşük oksijen inkübatörde inkübe edin. </li><li> günlük B-FGF orta CM değiştirin; ortamın miktarı, kültür şişesi boyutuna bağlı olacaktır. bir 6-iyi de için orta 2 ml kullanın. Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak. </li><li> Geçiş hESC mikroskop altında bakıldığında koloniler parlak her 6-7 gün. Not: hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyütülmüş HESC koloniler, MEF-kültürlenmiş hücrelerden daha büyük bir büyür. </li><li> besleyici içermeyen hücreler geçiş hazır olduğunuzda, reklama göre yıkayın, orta kaldırmakPBS kaldırmak için bir pipet, aspirat kullanılarak PBS Ding 1 mi, ilave 0.5 mg / ml dispaz bir pipetle (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> oyuk başına 2 ml PBS ilave edilmesi ve daha sonra aspire hücrelerin PBS ile yıkayın. kuyu başına CM 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak küçük öbekler içine hücreleri kazıyın. </li><li> Yeni hücre dışı matris kaplı tabak içine askıya hücre kümeleri Plate; Hücreler 24 saat sonra uymalıdır. </li></ol></li></ol></li></ol> BMP4 / A / P Kullanma hESC 3. Farklılaşma <ol><li> farklılaşma ortamı hazırlayın. Kullanım CM (B-FGF eksik) ekleyin (taze) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) ve PD173074 (0.1 uM). kullanımdan önce CM bu inhibitörleri ekleyin. </li><li> % 4 oksijen ayarlanmış bir inkübatör içinde kültürlendi 1 geçişi için hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyüyen besleyici içermeyen hESC kullanın. hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerine ilk geçişten sonra,Hücreler 24 saat takmak edelim. Sonraki gün, farklılaşma başlatır. (B-FGF ihtiva) cm çıkarın ve BMP4 / A / P (6 çukurlu bir levha içinde çukur başına 2 mi) ihtiva eden CM ile değiştirin. % 4 oksijen seviyelerini kullanarak hücrelerin kültürlenmesi devam edin. </li><li> BMP4 / A / P ihtiva eden cm (2 ml / oyuk bir 6-yuvalı plaka) 2 günde değiştirin. Aspire eski orta kaldırmak ve bir pipet kullanarak yeni CM ekleyin. B-FGF (kabul farklılaşma gün 2) BMP4 ekleme ve kaldırdıktan sonra ikinci gününde, hücre morfolojisi, bir mikroskop kullanılarak gözlenen büyük görünen değişecektir. NOT: Parlak yuvarlak kenarları sergileyen farklılaşmamış hücreler, mevcut olmayacaktır. </li><li> İstenen zaman noktalarında hücreler toplanır. Farklılaştırılmış hücreler yaklaşık 2 hafta sonra bölünmesi durur. Bu süre içinde Transfect hücreleri (bir sonraki bölüme bakınız). </li></ol> siRNA&#39;lar veya plazmid DNA ile trofoblastik hücrelerin 4. transfeksiyonu <ol><li> Transfeksiyon için, trofoblastik hücrelerin hazırlanması </strong&gt; <ol><li> MEFS bunları aktardıktan sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın. </li><li> farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün en az% 50 confluency sağlayacak olan, iyi / yeni bir plaka üzerine 1: Yüksek hücresel confluency önemlidir, bu nedenle hücreler 1 ayrıldı. düşük oksijenli gece boyunca inkübatör içinde inkübe hücreleri. Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur. </li><li> Sonraki gün, farklılaştırma ortamının orta yerine (CM 6 plaka ml / oyuk BMP4 / A / P ihtiva eden B-FGF eksik 2 kullanılarak). Aspirasyon ile eski orta alın ve bir pipet kullanılarak, yeni, orta (2 mi) aktarın. gece boyunca, düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) hücreleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Transfections gen bozulması için siRNA&#39;lar kullanarak veya plazmid DNA kullanılarak <ol><li> İstenilen zaman-kadar hücreleri ayırt(Gün 1 ve 14 arasında) işaret etmektedir. Transfeksiyondan bir önceki gün, 5 dakika için% 0.05 tripsin kullanılarak Hücreleri tripsinize edin. Bir jelatin kaplı plaka üzerine istenen confluency (transfeksiyon reaktif protokolüne bağlı olarak) bunları Plakalı (kaldırmak için 20 dakika ve aspirat için bir doku kültürü plakası% 0.1 jelatin ekleyin). (B-FGF eksik) BMP4 / A / P içeren CM ekleyin ve gece inkübe edin. </li><li> Sonraki gün, hücrelere taze farklılaşma orta ekleyin. Bir siRNA transfeksiyon ayıracı kullanılarak transfeksiyonu siRNA&#39;lar. Plazmid DNA, bir uygun lipofektamin reaktif kullanın. </li><li> Her transfeksiyon reaktifi için tarif edildiği gibi ürün, protokol takip edin. düşük oksijen inkübatör içinde gece boyunca hücrelerin, hücrelerin her bir / plaka siRNA lipofektamin kompleksleri transfer yavaşça karıştırın ve kültür. NOT: Bazı transfeksiyon ayıraçları CM Kalem / Strep eksik gerektiren antibiyotikler tarafından inhibe edilir. </li><li> Ertesi gün, taze farklılaşma medya ile değiştirin. </li><li> arzu hücreleri Hasatd zaman noktaları (örneğin, 24 saat, 48 saat ve 72 saat) kantitatif RT-PCR kullanılarak gen bozulması verimliliğini kontrol etmek. hasat hücreleri için, oyuk başına 1 ml ilave edilmesi ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca inkübe,% 0.05 tripsin kullanın. Tripsin nötralize etmek için, göz başına MEF ortamın 5 ml ekleyin. 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri Spin ve RNA izolasyonu için hücre pelletini kullanın. </li></ol></li></ol> Trofoblastik Hücreleri 5. Patojen Enfeksiyon: Sendai Viral Enfeksiyon <ol><li> Farklılaşması için hESC hazırlanması <ol><li> MEF&#39;lerden transferinden sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın. </li><li> farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün, en az% 50 konfluent sağlayacak yeni bir plaka / çukur üzerine 1: Yüksek hücre birbirine karışmaya önemli için ayrı hücreler 1 olduğu. düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) &#39;de bir gece boyunca inkübe hücreleri. &lt;Br /&gt; Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur. </li><li> Sonraki gün, düşük oksijenli bir inkübatör (% 4 oksijen) farklılaşma madde (ihtiva BMP4 / A / P ve eksik B-FGF) ve gece boyunca kültür ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Trofoblastik hücrelerin Sendai viral enfeksiyon <ol><li> Bir gün istenen farklılaşma bir gün önce, 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin kullanılarak (tek hücre) ayırt Hücreleri tripsinize edin ve jelatin kaplı plaka aktarın. farklılaşma ortamı ilave edin ve düşük oksijenli inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Sonraki gün, (bu virüs ile ilgili olarak değişir), enfeksiyon için orta ekleyin. 6 oyuklu plakanın bir kuyu için 0.5 ml kullanılarak BMP4 / A / P ihtiva eden Pen / Strep eksik kullanımı CM. MOI, düşük oksijen inkübatör 8 saat 1. inkübe for = Sendai virüsü ekleyin. </li><li> ek zaman noktaları gerekli ise, 4 saat sonra virüs içeren orta kaldırmak ve BMP4 / A / P CM ile değiştirin. hücreleri toplayınRNA izolasyonu için bir hücre kazıyıcı kullanarak. </li><li> Viral cevap 18 yer alan genlerin QRT-PCR gerçekleştirilerek viral enfeksiyonun etkinliğini belirler. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast.">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-four+fertilized+human+ova,+good,+bad+and+indifferent,+recovered+from+210+women+of+known+fertility;+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy.">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li><li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blastocysts+grown+in+culture.">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li><li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections.">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes:+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma.">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li><li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast.">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li><li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4.">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li><li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion.">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li><li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model.">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li><li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages.">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li><li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events.">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li><li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li><li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li><li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells:+to+be+or+not+to+be?.">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?.</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li><li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin/nodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts.">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages.">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li><li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways.">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082 (2009).</li><li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+(FGF)+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development.">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li><li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li><li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast.">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li><li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotrophoblastic+cell,+a+mononuclear+chameleon.">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li><li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biz trofoblast atalarıdır içine hESC ayırt etmek için temel adımları sundu. Bu protokol, en son trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını arttırmak ve tipik haliyle, tek başına BMP4 tedavisi ile gözlenir mezoderm progenitörlerle üretilmesini önlemek hızla Aktivin / Düğüm sinyal inhibitörleri ilavesiyle hESC ayırt etmek için optimize edilmiştir. BMP4 model sistem insan trofoblast soy şartname ve genişleme erken aşamalarında incelenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bu BMP4 modeli sistemi, koryokarsinom hücre hatları ve extravillous trofoblast hücre çizgileri kullanılarak mümkün değildir belirli alt soy e trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını araştırmak için yararlıdır. Nitro türevi trofoblastik hücrelerin, aynı zamanda siRNA&#39;lar 19 ile zarar-fonksiyon deneyleri için de kullanılabilir. Buna ek olarak, HESC ya hiPSCs genetik transgen endüklenebilir ifadesi için değiştirilebilir<html> ES 19 ya da endojen loci 20 de haberci genlerin sokulması için ve bu hücreler de burada tarif edilen koşullar kullanılarak trofoblastik hücrelerin içine ayırt edilebilir. Protokol çerçevesinde kritik adımlar HESC trofoblastik progenitör hücreleri elde etmek CM farklılaşma ortamından B-FGF (FGF2) atlamak için zorunludur. Kültür ortamı içinde BMP4 ile birlikte B-FGF varlığı mezoderm ve endoderm atalarıdır 16 ifadesini artırır. Trofoblast farklılaşma ortamında B-FGF dahil güncel bir çalışmada BMP4 aracılı farklılaşma yerine trofoblastlar 21 mezoderm ve endoderm hücreleri üretir bulundu açıklamak inanılmaktadır. Birlikte Aktivin A ve BMP4 B-FGF endoderm ve mezoderm farklılaşma doza bağımlı bir şekilde 22 teşvik o, köklü birs = &quot;xref&quot;&gt; 23. Fare, epiblast, ilkel trofoblast gelişimi ve ilkel endoderm soylar FGF sinyal yollarının 24 bağlıdır. BMP4 farklılaşma 21, 25 sağlamak için kullanıldığı zaman hESC ayırt olarak, B-FGF&#39;nin neden olduğu sinyal mezoderm oluşumu için gereklidir. Bunun aksine, BMP4 ile birlikte, her iki FGF ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının engellenmesi, HESC türevi trofoblast progenitörlerinin syn oluşmasını teşvik eder ve mezoderm ve ilkel endoderm progenitörlerin 26 oluşumunu önler. Tekniğin Sınırlamalar trofoblast atalarıdır için hPSC farklılaşma bu protokol ile en tipik sorun MEFS üzerinde hESC veya hiPSCs bir baskın farklılaşmamış nüfusu ile başlayan ile ilişkilidir. hPSCs hem iç hem de dış kenarlarında farklılaşmış hücreleri birikir içinKolonilerin, günlük farklılaşma miktarını izlemek için ve farklılaşmış koloniler (veya koloniler kısımlarını) kaldırmak için önemlidir. farklılaşmış hücrelerin varlığı hücreleri, hücre-dışı matrise transfer edilir, özellikle farklılaşma sürecine karmaşık hale getirebilir. farklılaşmış hücrelerin hızla CM huzurunda dışı matris üzerinde çoğalacak ve bu hücreler hızla kültürü devralmak ve hPSCs dışı yarışacak. Nedenle, ekstraselüler matriks hücreleri aktarmadan önce MEFS yetişen hPSCs sağlıklı, farklılaşmamış koloniler ile başlamak idealdir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi Bu farklılaşma protokolünü kullanırken, elde edilen trofoblast ataları hücre tipleri heterojen bir karışımıdır. Trofoblastlar villöz sitotrofoblastlar, sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous sitotrofoblastlar oluşmaktadır(EVTs) 27. Villöz sitotrofoblastlar EVTs ve SYN isteklerini elde atalarıdır. BMP4 diferansiye hPSCs plasental özel markörlerin gen ya da proteinin sentezlenmesi ile tanımlanmıştır villöz sitotrofoblastlar, Syns ve EVTs 9, 15, bir karışımını oluşturur. Tat farklılaşma yolları HLA-G salgılanmasının (EVTs karakteristik) veya (Syns den), insan koriyonik gonadotropin 28, 29 ile ayırt edilebilir. Son zamanlarda, düğüm Aktivin / sinyallemesinin engellenmesi hESC EVT farklılaşmasını yana ve bu inhibisyon çıkarılması SYN 17 farklılaşmasını yana olduğu gösterilmiştir. Nitekim, bir önceki yayın hESC ayırt etmek tek başına BMP4 kullanarak SYN hücreleri 26 çoğunlukla üretir bulundu. BMP4 / A / P ve klimalı ortam (B-FGF eksik) kullanarak veriler, oradaEVT ve farklılaşma 5. günde, saf EVT ya EŞZ popülasyonları EVTs izolasyonu için boncuk konjüge edilmiş HLA-G gibi hücre yüzeyi işaretçileri kullanılarak ilave saflaştırma arzu edilirse, 29 mümkün göre, mevcut EŞZ hücreleri her ikisi de. Sonuç olarak, burada tarif edilen kültür yöntemi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir hPSCs gelen trofoblastik hücrelerin önemli miktarlarda üretmek için etkili bir yoldur. Bu protokol, SYN isteklerini ve EVTs hem ürettiğinden erken insan plasenta incelenmesi için uygun bir model sistem. Bu hücreler, ilaç keşfi ve genetik mühendisliği de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Plasenta gebelik sırasında fetusun büyüme ve hayatta kalmak için gerekli ve maternal ve fetal dolaşıma arasında gaz, besin, atık ürünleri ve hormonların alışverişini kolaylaştırır. Memeli Embriyogenez sırasında oluşan ilk organ 6-7 days insanlarda post-anlayışı ve fareler 1, 2, 3, 4 3,5-4,5 gün geliştirmeye başladı plasenta vardır. Trofoblastik hücreler plasenta en önemli hücrelerdir ve bu hücreler memeli embriyosunun ilk soy farklılaşma olaylardan biri temsil etmektedir. Onlar preimplantasyon blastosist dış ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerden kaynaklanır. plasenta gelişiminin erken aşamalarında bilgimiz erken insani gelişme modelleme etik ve lojistik kısıtlamalar ile sınırlıdır. embriyonik implantasyon, trofoblastlar sırasındaanne epitel istila ve özel progenitör hücrelerin 5 farklılaşırlar. Sitotrofoblastlar (CTBS) sigorta ve sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous invaziv trofoblastlar (EVTs) içine ayırt, farklılaşmamış atalarıdır, tek çekirdekli hangi çapa rahim plasenta. SYNs, gebeliği sürdürme için gerekli hormonları sentezlemek terminal açıdan farklılaşmış hücreleri çok çekirdekli edilir. Trofoblastik hücrelerde bozukluklar düşük, pre-eklampsi ve intrauterin gelişme geriliği, 1 sonuçlanır olarak EVTs ve SYN isteklerini oluşturmak erken farklılaşma olayları, plasental oluşumu için gereklidir. Geliştirilen insan trofoblast hücre hatları tipleri CTBS ve plasental hormonlar ve ekran invaziv özellikleri 6 üretmek koryokarsi-, ölümsüzleşti içerir. İnsan ilk trimester plasenta primer trofoblastik hücreler izole ama hücreler hızla dif olabilirfarklılaştıran ve in vitro çoğalan dur. Önemlisi, dönüştürülmüş ve birincil hücre hatları tümörijenik ve ölümsüzleştirdi trofoblast hücre hatları doğru birincil trofoblast 7 temsil edemez belirten farklı gen ekspresyon profillerini var. Ayrıca, bu çizgiler üçüncü trimesterde üzerinden ilk sonra aşamalı türetilen çünkü plasental trofoblast kök hücre atalarıdır benzemeye olası değildir. Plasenta oluşumu ve işlevi erken olayları incelemek için başlangıç aşamasında, insan trofoblast in vitro kültür sistemi içinde sağlam bir ihtiyaç vardır. preimplantasyon embriyo iç hücre kütlesi ile özelliklerini paylaşan İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC), sıklıkla erken plasenta oluşumu da dahil olmak üzere, erken insan gelişimi modellemek için kullanılır. Hem insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) ve HESC Kemik Mor kullanılarak in vitro trofoblast olarak ayırt edilebilirphogenic Proteinler 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4 kullanarak trofoblastik hücrelerin pluripotent hücrelerin Bu dönüşüm, insan hücreleri için özeldir ve erken insan embriyosunun 9, 16 erişimi gerektirmez, çünkü yaygın erken insan plasenta gelişimini incelemek için kullanılır. Son zamanlarda, keşfedildi inhibitörleri çok A83-01 (A) ve SMAD2 / 3 ve MEK1 / 2 sinyal yollarının bloke PD173074 (P), trofoektoderm benzeri progenitörleri, esas olarak Syns halinde hPSC farklılaşma verimini artırır ve mezoderm, endoderm, ya da ektoderm hücreleri 9, 17 kapsamlı nesil olmadan EVTs, </sus&gt;. 12 gün, insan blastosist aşamasında embriyoların izole tropo-ektoderm hücrelerini benzer gen ekspresyon profillerine sahip ve çeşitli plasental spesifik büyüme hormonu salgılayan bu ortam şartları kullanılarak, HESC Bu in vitro model sistemi 9, 11 geçerliliğini destekleyen farklı. Burada, BMP4 / A / P kültür ortamı kullanılarak insan trofoblast progenitörlerde hPSCs in vitro farklılaşması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu koşullar, lipofeksiyon aracılı transfeksiyon kullanılarak RNA sekanslama, gen bozulması siRNA&#39;lar kullanılarak patojen enfeksiyonu ve genetik modifikasyonunu da içeren uygulamalarda, çok çeşitli hücrelerin, bol sayıları üretir.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>This is referred to as &quot;serum replacement&quot; in this protocol.</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-155</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>B-FGF</td><td>Millipore</td><td>GF-003</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Rock inhibitor Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem</td><td>6001G</td><td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i low oxygen incubator</td><td>Heracell/VWR</td><td>89187-192</td><td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>PD173074</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3044/10</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td>Trizol is used to isolate total RNA.</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>This is referred to as &quot;extracellular matrix&quot; in this protocol.</td></tr></tbody></table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

Plasenta embriyogenez sırasında geliştirmek için ilk organdır ve gelişmekte olan embriyonun yaşam için gereklidir. Plasenta preimplantasyon blastosist ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerinden ayırt çeşitli trofoblastik hücrelerin oluşur. Bu nedenle, insan plasenta erken farklılaşma olayları anlayışımız nedeniyle insan embriyogenez izolasyon ve manipülasyon etik ve yasal kısıtlamaların sınırlıdır. Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insani gelişmeyi araştırmak için sağlam bir model sistem ve aynı zamanda çeşitli trofoblastik hücre tiplerinin işaretleri ifade trofoblastik hücrelerin içine in vitro ayırt edilebilir. Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının inhibitörleri kullanan trofoblastik hücrelerin içine hPSCs ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol, siRNA&#39;lar ile transfekte edilebilir, çeşitli trofoblastik hücre tipleri oluştururkayıp-fonksiyon fenotipleri soruşturma veya patojenler ile enfekte olabilir için. Ayrıca, hPSCs genetiği değiştirilmiş olabilir ve daha sonra fonksiyon-kazanç analizleri için trofoblast atalarıdır ayrışmıştır. HPSCs başlayarak insan trofoblast üretmek için bu in vitro farklılaştırma yöntemi erken insan embriyosunun ile çalışma etik ve yasal kısıtlamalar üstesinden gelir ve bu sistem ilaç keşfi ve kök hücre araştırmaları da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir.

HPSCs İn Vitro Farklılaşma Bakış Bu in vitro farklılaştırma protokolü bir pasaj (Şekil 1A) şartlarını serbest besleyici geçişi yapılır MEFS yetişen farklılaşmamış hESC ile başlar. Bu protokolde hESC farklılaşma tarif ederken, başarılı trofoblastik hücrelerin içine hiPSCs ayırt etmek için bu protokolü kullanılır. ekstraselüler matriks geçiş insan trofoblastik hücrelerin saf popülasyonları gerektiren analizler için istenmemektedir ışınlanmış MEFS, çoğunluğu kaldırır. Ayrım hPSCs hücre dışı matris üzerinde büyütülmüş ve koloniler pasajlarının (yaklaşık bir haftalık) için hazır olana kadar CM B-FGF içeren kültürlenmiştir. Bu BMP4 / A / P-aracılı farklılaşma uyaran önce pluripotent durumunu korur. koloniler ~ kümeleri içine 50-100 hücreleri bozulurdispaz kullanarak bir hücre dışı matris kaplı plaka üzerine bir kez pasajlandı. Pasajlanması gün sonra, yapışan hücreler farklılaşma ikna etmek için hazırız ve orta B-FGF eksik BMP4 / A / P içermesi geçer. farklılaşmış hücreler hücre RNA izolasyonu için toplanır ve transfeksiyon deneyleri için de kullanılabilir ve bu süre içinde, yaklaşık 2 hafta, çoğalır. Morfolojik değişiklikler farklılaşmadan sonra 1-2 gün başlatılmıştır ve temsilci bir deneyden elde edilen sonuçlar, Şekil 1 B &#39;de gösterilmiştir görünür. Farklılaşma günlerde 1-2 hücreleri gün 0 (Şekil 1B) hücrelerin daha büyük boyutta olduğuna dikkat edin. farklılaşmış hücre kolonisi hızla büyüyor ve bu değişiklik her gün belirgindir. Farklılaşma ilerledikçe, hücre bölünmeleri ve dışarıya doğru büyüyen, koloninin merkezinden dışarı genişletmek (Şekil 1B günler 3-5). koloninin dış kısmı t kıyasla daha büyük hücreleri içerenkoloninin merkezinde o hücreleri. ayırt hücrelerin ekstrasellüler matriks üzerinde kültüre pluripotent kök hücrelerden daha koyu ve düz hale; Rutin Hücre kültürü için kullanılan dik bir mikroskop ile hücrelerin görüntülerken, hücre parlaklık değişiklikler daha belirgindir. Bireysel koloniler hücre birbirinin üzerinde büyüyen, farklılaşma 5 gün (Şekil 1B) ile birbirine birleştirilir. Farklılaşma günde 4-5 sonra birden fazla çekirdek içeren hücreleri (Şekil 1B), mevcut (gösterilmemiştir) bulunmaktadır. BMP4 / A / P Trofoblast Markerlerinin Farklılaşma ve Anlatım İndükler Biz kantitatif RT-PCR (QRT-PCR) kullanılarak BMP4 / A / P farklılaşma ilk üç gün boyunca gen ifadesi değişikliklerini inceledik. RNA, farklılaşma gün 1, 2 izole ve 3 ve cDNA&#39;ya dönüştürülmüştür. pluripotent kök hücrelerin yok olması, hem b değerlendirilebilirY morfolojisi, bir mikroskopla görsel olarak ve QRT-PCR ile, pluripotense genler için primerler kullanılarak. NANOG, pluripotent kök hücrelerin bir markeri, bağıl ifade seviyelerinin azaltılır ~% 75 hücreleri BMP4 ile kültürlenmiştir ve seviyeleri (BMP4 / A / P mevcudiyetinde ~% 90 oranında azaltılır farklılaşma bir gün sonra Şekil 2). Farklılaşma 2 gün olarak, Nanog&#39;un seviyeleri (B-FGF ihtiva eden) HESC CM ortamı içinde kıyasla BMP4 tek başına ya da BMP4 / A / P kültürlenmiş hücreler için çok düşüktür. Biz daha parlak ve farklılaşmış hücrelere göre daha küçük boyutlu olan farklılaşma iki gün (Şekil 1B), sonra farklılaşmamış hücreler gözlemlemek yok, çünkü bu, beklenen bir sonuçtur. KRT7 ve CDX2: trofoblastik hücrelerin BMP4 aracılı farklılaşma etkinliği, doğrudan iki trofoblast edilen markerler için spesifik primerler kullanılarak QRT-PCR ile tespit edilebilir. Bu genlerin her ikisi de, insan pluripotent kök olarak ifade edilmezHücreler ve BMP4 tedavi 2-3 gün sonra sentezleme artar (Şekil 2). Burada tarif edilen koşullar kullanılarak, KRT7 transkript seviyeleri (Şekil 2) BMP4 / A / P ortamı içinde farklılaşma günde 1 geliştirmek ve farklılaşmasının ilk 3 gün sabit kalır. Yalnız BMP4 kullanarak KRT7 ifade Aktivin / Düğüm inhibitörleri hESC 9 farklılaşması oranını artırmak önceki gözlemlerle uyumludur 2 gün kadar gecikmiş bir artış vardır. Bu inhibitörlerin kullanılmasının etkinliğini değerlendirmek için başka bir yol, tek başına BMP4 ile tedavi edilen hücrelerde CDX2 ve KRT7 transkriptlerinin kararlı durum bolluk belirlemektir. Aktivin / Düğüm inhibitörleri ile birlikte tek başına BMP4 veya BMP4 ya kullanırken CDX2 seviyeleri farklılaşma gün 1-3 için benzer. Bununla birlikte, KRT7 transkript daha önerir, bu inhibitörler varlığında, farklılaşmanın bir gün sonra daha fazladırhızlı farklılaşma (Şekil 2). CDX2 sentezleme tipik haliyle her iki durum için farklılaşma 2. günde zirveleri ve 3. günde (Şekil 2) sonra azalır. Beklendiği gibi farklılaşmamış hESC, KRT7 veya CDX2 (Şekil 2) ya ifade yoktur. Sonuç olarak, BMP4 / A / P şartları hızlı hESC ayırt ve plasental markör ifade erken farklılaşma 3. gün olarak tespit edilebilir. İn Vitro Kullanımı siRNA&#39;lar ve plazmid DNA transfections ve Viral Enfeksiyonlar Trofoblastik Hücreleri -türevlenmiş İn vitro türetilmiş insan trofoblastik hücrelerin kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, ya gen ekspresyonunu bölmek için siRNA&#39;lar transfekte edilebilir. Biz, farklılaşma gün 1 ve 2 (siRNA&#39;lar 75 pmol kullanarak) siRNA transfections iki tur gerçekleştirilen BMP4 / A / P ile hESC farklılaşma başlattıve RNA izolasyonu için hücreler toplanır. Kantitatif RT-PCR kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan genlerin biri için, yok etme etkisi belirlemek için etkili bir yöntemdir. RNA lncRHOXF1 19 kodlayıcı olmayan uzun bölgelere tamamlayıcı iki siRNA&#39;lar kullanarak, lncRHOXF1 transkriptlerinin (Şekil 3A)% 80 demonte elde edilmiştir. Daha sonra, daha da farklılaşma gün 1, protein kodlayıcı gen hnRNP U, bir siRNA (25 pmol) transfekte edilmiş ve 2 iki ardışık transfections aşağıdaki hnRNP U transkript% 80 azalma gözlenmiştir. Nitro farklılaşmış trofoblast progenitör hücrelerinde doğal immün yanıtları araştırmak için kullanılabilir. Bu Sendai virüsü kullanan 2 hücreleri 1 arasında bir MOI&#39;da farklılaşma gün enfeksiyonları uygulandı ve viral inkübasyondan 8 saat sonra hücreler toplandı. QRT-PCR kullanarak, aktif viral pro işaret enfekte olmuş hücrelerde (Şekil 3B), bol miktarda virüs proteini transkript (sev-NP) tespittrofoblastik hücrelerin pagation. Önemli olarak, enfekte edilmiş hücreler (MOI kullanarak = 1) görünümünü değiştirmek ve yaşayabilir olmayan (veriler gösterilmemiştir). Nitro türevi trofoblastik hücrelerin da plazmid DNA ile transfekte edilebilir. Biz bir GFP plazmid kullanarak transfections gerçekleştirilen ve bu farklılaşma 1 gün ve günde 3 BMP4 / A / P-tedavi hücrelerin içine inşa ve GFP ertesi gün (Şekil 4) için görüntülenmiştir tanıttı. Biz genellikle 24 saat sonrası transfeksiyon de% 30-50 transfeksiyon verimliliği elde etti. Sonuç olarak, nitro türevi trofoblastik hücrelerin gain- ve zarar-fonksiyon deneyleri için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig1.jpg" /> Şekil 1: BMP4 / A / P ile erken trofoblastik hücrelerin insan pluripotent kök hücrelerinin in vitro türevleri. (A) BMP4 farklılaşma şematik<html> BMP4 / A / P ile trofoblastik hücrelerin hPSCs arasında. (B) BMP4 / A / P farklılaşma d0, d2 ve d6 sırasında HUES9 hücrelerinin Temsilcisi parlak alan görüntüler. Ölçek çubuğu = 50 uM. ok uçları ayırt edilmez tek hücreli hESC belirtir. oklar farklılaşma sırasında morfolojik özellikleri vurgulamak. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55268/55268fig2.jpg" /> Şekil 2: BMP4 / A / P farklılaşma hızla Pluripotency işaretleyici nanog downregüle ve trofoblast genleri CDX2 ve KRT7 upregüle. NANOG (Pluripotency işaretleyici), CDX2 ve KRT7 (trofoblast belirteçleri) için Mah-PCR analizi. değerler üçlü önlemlerinden ortalamasıdır.<html> //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55268/55268fig3.jpg" /> Şekil 3: Gen bozma ve in vitro farklılaştırılmış insan trofoblastik hücrelerin kullanılarak viral enfeksiyon. (A) hESC QRT-PCR analizi (HUES9) farklılaştırılmış ve daha sonra RNA lncRHOXF1 (solda) ya da iki gün üst üste protein kodlayıcı gen hnRNP U (sağda) kodlamayan, uzun özel siRNA&#39;lar ile transfekte. demonte verimlilik (KD), tipik olarak% 70-80, ve bir transfeksiyon deneyinde elde edilen sonuçlar gösterilmiştir. (B) 8 saat Sendai virüsü ile enfekte farklılaşma gün 2 trofoblastik hücrelerin Sendai viral protein transkript QRT-PCR analizi (İçişleri Bakanlığı 1 =). Hata çubukları SEM&#39;i belirtir.&quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55268/55268fig4.jpg" /> Şekil 4: in vitro farklılaştırılmış insan trofoblastik hücrelere giriş plazmidinin DNA. farklılaşma Gün 1 ve Gün 3 trofoektoderm projenitör hücrelerine GFP plazmidi DNA transfeksiyonu, ertesi gün görüntülendi. Ölçek çubuğu = 50 uM. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55268/55268fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

8.6K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Video: In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Biyomühendislik

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Gelişim Biyolojisi

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Nörobilim

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biyoloji

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

İnsan Blastoidlerinin Modellenmesi Blastosist Gelişimi ve İmplantasyonu için Protokol

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

<meta charset="utf8"></head><body>Anjiyogenezin Analizi: BM Matrisinde Tüp Oluşumu için İn Vitro Test

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

<meta charset="utf8"></head><body>Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

İnsan Blastoidlerinin Modellenmesi Blastosist Gelişimi ve İmplantasyonu için Protokol

Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı

Farklılaşma İşaretleyici İfade Analizi için Anjiyogenez-Tüp Oluşum Testinden Trofoblast Hücre Geri Kazanımı