Yazarlar, decellularized iskeleler sağlamaktan Guanhao Biotech&#39;ten Wei Zhang&#39;a teşekkür etmek istiyorlar. Yardımcı tartışmalar için Xiao-hong Peng&#39;e teşekkür ediyoruz. Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından maddi olarak desteklendi (Proje No: 31322021).

Tüm deneyler Pekin Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC, IACUC no. COE-LuoY-1) tarafından onaylandı. 1. Islet İzolasyonu <ol><li> Reaktiflerin ve ekipmanın hazırlanması. <ol><li> HBSS&#39;de 5 mg / mL&#39;lik bir solüsyon yapmak için kollajenaz P tozunu (2 U / mg) yeniden yapılandırın ve bakterileri çıkarmak için 0.22 μm&#39;lik bir filtreyle filtreleyin. 15 mL konik tüplerde 0.6 mL&#39;lik kolajenaz P çözeltileri hazırlayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. NOT: Kullanım esnasında, her alikot, 0.5 mg / mL veya 1 U / mL nihai konsantrasyonları olan 6 mL çalışma solüsyonları vermek üzere HBSS ile seyreltilir (3 farenin tedavisi için yeterlidir). Çalışma solüsyonu 1 saat içinde hemen kullanım için buzda tutulur. Ek bir kullanım için çalışma solüsyonu geri getirilmemeli veya tekrar dondurulmamalıdır. </li><li> HBSS içine FBS (% 2.5) ve P / S (% 1) ekleyerek nötralizasyon çözeltisi hazırlayın; Çözümü buzda tutun. Trea&#39;ya 60 mL nötrleştirme solüsyonu hazırlayınT 6 fareleri. </li><li> Ada kültür ortamı için RPMI 1640 ortamına D-glukoz (7 mM), FBS (% 10) ve P / S (% 1) ilave edin. </li><li> Ameliyat aletlerini 115 ° C&#39;de 30 dakika ve 15 psi basınç altında otoklavlayın. </li></ol></li><li> Pankreasın şişmesi. <ol><li> 6 fareler için (12 haftalık) adım 1.1.1&#39;de belirtildiği gibi 12 mL kolajenaz çalışma solüsyonu hazırlayın. 10 mL şırıngayı 9 mL çalışma solüsyonuyla doldurun ve şırıngayı 27 G intravenöz iğneye bağlayın. Şırıngayı buz üzerinde saklayın ve çözeltiyi 1 saat içinde kullanın. </li><li> Fareyi rahim ağzı çıkığıyla euthanize edin. Fareyi, kuyruk operatöre doğru bakacak şekilde kağıt havlu üzerine yatar konuma getirin. Tüm vücudu% 70 etanol ile püskürterek tamamen ıslak hale getirir. </li><li> Disital makas ve forseps kullanarak genital bölgede başlayan ve diyafragma uzanan bir V-insizyon yapın. Karın boşluğunu tamamen açığa çıkarmak için cildi göğsünüzden geçirin. </li><li> HareketBağırsağın sağ tarafına gelin ve pankreas ve ortak safra kanalı ortaya çıkar. Duodenumu forsepsle dikkatli tutun ve safra kanalı gerginleşene kadar çekin ( Şekil 1A -1 ve A-2 ). </li><li> Karaciğere yönelen portal damarı ve safra kanalını bulun. Portal damarı ve safra kanalını mikroskopik bir hemostatik kelepçe ile sıkıştırın. NOT: Sıkıştırma, aşırı kanamanın ve kolajenazın karaciğere girmesini önler. </li><li> Bağırsağı hala forsepsle tutarken safra kanalını ve duodenumu birleştiren ampulanın yerini bulun. 27G damar içi iğne, ampulla ( Şekil 1B- 1 ve B-2 ) yoluyla ortak safra kanalına yerleştirilir. </li><li> Kanülasyonun safra kanalından geçip geçmediğini kontrol etmek için yaklaşık 200 mcL kollajenaz solüsyonu dağıtın. Kollajenaz çözeltisi kanalın içine dolmaya başlarsa ( 1 ve C2 ), iğne kanalın lümenindedir; Iğneyi içeren kanal segmentini bir arter hemostatik kelepçe kullanarak sıkıştırın ve 2 mL&#39;lik solüsyonun geri kalanını 1 dakika içinde yavaş ve sabit bir hızda boşaltın ( Şekil 2A -1 , A-2 ve B-1 ). NOT: Kanalı çevreleyen doku şişirmeye başlarsa ( Şekil 2B -2 ), iğne safra kanalının duvarı boyunca itilir ve iğneyi yeniden konumlandırması ve safra kanalı tekrar kanülasyon yapmayı dener. Benzer şekilde, duodenum şişirmeye başlarsa ( Şekil 2C- 1 ve C-2 ), arter hemostatik kelepçesi ayarlanmalı ve safra kanalı yeniden kanüle edilmelidir. Kollajenaz çözelti pankreasın tamamını doldurduktan sonra, duodenum yakınındaki doku şişirilir, ardından bölgeN pankreas kuyruğunun yakınında. Pankreas kuyruğunun (dalak lobu) perfüzyonu, adacık verimi maksimize etmek için önemlidir. </li><li> Pankreastın enflasyondan sonra ( Şekil 2C -1 ) bağırsak faresinin sol tarafına itin ve aşağı doğru iki nokta üstüste başlayarak pankreası çıkartın. Bağırsak kaldırmak için forseps kullanın ve başka bir çift forseps ile pankreas ayırın. Midenin üstünden bağlanıncaya kadar pankreası çıkarmaya devam edin. Son olarak, pankreasları karından çıkarın ve kalan dalaktan ayırın. NOT: Çıkarma işlemi sırasında sindirim devam ettiği için tüm ayrılma işlemi hızla gerçekleştirilmelidir. </li><li> Pankreas boş bir 15 mL konik tüp içine yerleştirin ve buz üzerinde bırakın. Kalan fareler için yukarıdaki prosedürü tekrarlayın. Tüm pankreas, kollajenaz P ile aşırı sindirimi önlemek için, adım 1.3&#39;ü takiben 1 saat içinde daha fazla işlenmelidir. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol><img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54995/54995fig1.jpg" /> Şekil 1: Safra oluğunun kanülasyonunu ve pankreasın kollajenaz çözeltileri ile perfüzyonunu gösteren fotoğraflar. ( A1 ) Safra kanalı gerginleşene dek duodenum çekilir. (Ampulla: duodenum yüzeyindeki üçgen, sütlü alan; safra kanalı: yüzeydeki kordon benzeri sütlü yapı). ( B1 ) İğneyi ampulla safra kanalına sokmak. ( C1 ) Pankreasın enzim enjekte edilerek şişirilmesi. ( A2, B2 ve C2 ) Sırasıyla A1, B1 ve C1&#39;de gösterilen prosedürlerin karikatür görüntüleri. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54995/54995fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Şekil 2: Kanülasyon için sorun giderme. ( A1 ) İğne ucu safra kanalının lümenine sokulmuştur. ( A2 ) Kanal, enzim çözeltileri ile doldurulmuştur. ( B1 ) İğne safra kanalının lümenine sokuldu ve kanal mavi bir boya ile dolduruldu. ( B2 ) Uygun olmayan kanülasyon nedeni ile iğne safra kanalının altında ve mavi boyayı verdikten sonra sadece şişirilmiş bir kapsül görülür. ( C1 ) Başarılı bir kanülasyon pankreas distansiyonu ile kanıtlanmaktadır. ( C2 ) Uygun olmayan sıkıştırma nedeniyle mavi boya duodenuma girer ve şişmeye neden olur. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54995/54995fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> &lt;Strong&gt; Adaların sindirimi ve saflaştırılması. <ol><li> Perfüze pankreas içeren konik tüpleri 37 ° C&#39;de 17 dakika inkübe edin. NOT: Kuluçka süresi, hayvanın yaşına ve türüne göre değişebilir. </li><li> 7 mL nötrleştirme solüsyonu ilave ederek ve tüpleri buz üzerine koyarak sindirimi sona erdirin. </li><li> İnce doku parçacıkları elde edilinceye kadar tüpleri şiddetle ( örn . 10 saniye içinde 20 kez) sallayarak dokuyu çözün. NOT: Pankreasın tamamen ayrışması başarısız olursa adacık verimi düşük olacaktır. </li><li> Sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için 0.5 mm tel örgü vasıtasıyla sindirilmiş doku örneklerini filtreleyin. Adacık süspansiyonlarını yeni bir 50 mL konik tüpe toplayın. </li><li> Tüpleri 230 xg ve 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve doku peletlerini bozmadan süpernatantı dikkatlice boşaltın. </li><li> Nazikçe veya p vortekslenerek 4 ml&#39;lik polisükroz yoğunluk gradyanındaki 3 fareden peletleri tekrar süspanse edinSüspansiyon birkaç kez yukarı ve aşağı ipekleme. Tüpün kenarından polisükroz solüsyonlarının tepesine 4 mL HBSS&#39;ye yavaş yavaş pipetle alın. NOT: İki çözüm keskin arayüzü olan iyi ayrılmış katmanlar olmalıdır. NOT: HBSS&#39;nin ilavesi, tabandaki polisükroz yoğunluğu değişimini bozmadan özenle yapılmalıdır. </li><li> Süspansiyonu, çok yavaş bir hızlanma oranı seçerek 900 x g&#39;de ve 4 ° C&#39;de 20 dakika santrifüjleyin. Santrifüjü fren olmadan sonlandırın. NOT: Adacıkların çoğunun polisükroz ve HBSS tabakaları arasındaki ara yüze göç ettiği ve altta yerleşen ekzokrin hücrelerin tamamı ile birlikte adacıkların ekzokrin hücrelerden saflaştırılması için bir adımdır. </li><li> Büyük çapta 15 mL&#39;lik bir pipet kullanarak 8 mL&#39;lik süpernatan solüsyonlarının tamamını çıkarın. Çözeltileri, ters çevrilmiş 70 μm&#39;lik bir süzgeçten geçirin. NOT: Adacıklar süzgeç tarafından daha da arıtılıp tutulurken ekzokrin hücrelerFiltreyi geçecektir. Dikkat: Polisukor yoğunluk derecesi hücre toksiktir; Filtrasyon adacıkların polisükrozdan kurtulmasına yardımcı olur. </li><li> 35 mL&#39;lik bir Petri kabına 2 mL soğuk nötrleştirme solüsyonu pipetleyin. Hücre süzgeçini sağ tarafı yukarı çevirin, adacıkları çözeltide tutan yüzeyi daldırın ve adacıkları serbestçe sallayın. </li><li> Elle beyaz bir uçlu bir 20-μL pipet kullanarak bir mikroskop altında adacıkları seçin. NOT: Adacıklar sarımtırak, kompakt hücre agregalarıdır ( Şekil 3A ), buna karşın kirletici ekzokrin doku veya hücreler mikroskop altında siyahımsı ve gevşek bir yapıya sahiptir. </li><li> 2 ml kültür ortamı ile 35 ml&#39;lik bir çanakta yaklaşık 200 adacık yerleştirin ve 37 ° C&#39;de% 12 CO 2 ile sağlanan inkübatöre 12 saat boyunca inkübe edin. NOT: Genellikle 150-300 adacık, 12 haftalık bir C57BL / 6J fareden hasat edilebilir. Adalar kültür sırasında agrega oluşturmaya eğilimli,Ve büyük adacıklar (&gt; 300 μm) merkezi nekroza duyarlıdır ( Şekil 1B , inset). Adacıkların çanakta eşit şekilde dağıtılması ve yığılmayı azaltmak için süspansiyonu iyice çalkalayın. </li></ol></li></ol> 2. Iskele Kültür İskele Üzerinde NOT: DCS, yaklaşık% 79 gözeneklilik, yaklaşık 0.6 mm kalınlık ve 12-300 um aralığında gözenek boyutuna sahiptir. <ol><li> İskeleleri 7 mm&#39;lik disklere kesin,% 70 etanol içinde bekletin ve HBSS ile yıkayın. İskeleleri 24-kuyucuklu doku kültür eklerine yerleştirin. NOT: Gecelik kültürden sonra taze adacıklar toplandığında, adacıklar düzgün kenarlı parlak ve sıkı görünür ( Şekil 3B ). </li><li> Çanağı döndürünüz ve beyaz bir uçlu 20 mcL&#39;lik bir pipet kullanarak çanak merkezinden adacıklar topla. Adacıkları bir pipet kullanarak iskelelere (250 adacık / iskele) aktarın ve 2 mL kültür ortamı ekleyin.Kuyu. Adaları, nakilden 12 saat önce kültürleyin. </li></ol> 3. Adalar EFP Yerinde Transplantasyon <ol><li> Alıcı farelerde diyabet indüksiyonu. <ol><li> C57BL / 6J farelerini (10 haftalıktan fazla) bir su kaynağına sahip fakat yiyecekleri olmayan yeni bir kafese yerleştirin. Diyabet indüksiyonu başlamadan önce fareleri hızlıca 10 saat hızlandırın. </li><li> 0.1 M sitrik asit ile 0.1 M sodyum sitrat karıştırılarak pH değerleri 4.2-4.5 olan tampon çözeltileri hazırlayın. Yeni hazırlanmış tamponda STZ&#39;yi (10 mg / mL) eritin ve çözeltiyi 0.22 um&#39;lik bir filtreden geçerek sterilize edin. NOT: STZ ışığa duyarlıdır ve 10 dakika içinde aktivite kaybeder; Enjeksiyondan hemen önce taze STZ solüsyonunu daima hazırlayın. </li><li> Her fare C57BL / 6J fare başına 140-150 mg / kg dozunda STZ ile intraperitonal olarak enjekte edin. NOT: Doz, hayvanın yaşına ve türüne bağlı olarak değişir. Küçük ölçekli bir doz optimizasyonu gerçekleştirilmelidir.Resmi deney başlamadan önce verilen türler için st. </li><li> Kuyruk damarı kanını toplayın ve STZ enjeksiyonundan 2, 3 ve 4. günlerde bir glikoz sayıcısı ile kan glikozunu izleyin. NOT: Hayvanlar ard arda iki gün boyunca hiperglisemik (açlık-kan şekeri&gt; 16.7 mM) olduğunda, adacık nakli için hazırdırlar. </li></ol></li><li> Adacıkların EFP bölgesine nakli. <ol><li> Fareler intraperitoneal olarak verilen pentobarbital ile anestezi altına alın (50 mg / kg). Fareyi, kuyruk operatöre doğru bakacak şekilde kağıt havlu üzerine yatar konuma getirin. Kesi bölgesinden kürkü çıkarmak için karın tıraş edin. Dört eklemi bantlayın ve cildinizi tamamen alkol ve iyodofor mendil ile tamamen sürünüz, kesi bölgesini sterilize etmek için dairesel bir tarzda hareket ettirin. Fareyi steril bir örtüyle örtün, ancak insizyon alanına erişime izin verin. Peritoneal duvar boyunca 7 mm&#39;lik bir kesi yapın.Orta hat, genital bölgeye yakın. NOT: Ameliyat sırasında eldivenler de dahil olmak üzere kullanılan tüm araçlar steril olmalıdır. </li><li> Forseps kullanarak karın boşluğundan hafifçe tutun ve EFP çıkarın. Islak steril gazlı bezin üzerine EFP yayıldı. Adaları içeren iskeleti EFP&#39;ye yerleştirin ve EFP&#39;yi transplantayı saracak şekilde katlayın. Adacıklar ve EFP arasındaki doğrudan temasın emilebilir 6-0 sütürler ile EFP dikilmesi ile sabitleyin. EFP&#39;nin kurumasını önlemek için batırılmış pamuk çubuk kullanarak steril salinle EFP yüzeyini ıslatın. </li><li> EFP&#39;yi karın boşluğuna hafifçe yerleştirin. Peritoneal duvarı dikerek ve deri tabakasını yara klipsleriyle sıkarak insizyonu kapatın. </li><li> Buprenorfin (0.1 mg / kg) subkutanöz analjezik olarak enjekte edin. </li><li> Dehidrasyonu önlemek için 1 mL serum fizyolojik alt deri enjekte edin. </li><li> Fare, anesteziden kurtuluncaya dek ısıtma pedindeki bir kafese yerleştirin. </li><li> Açlık-karşı glikoz le kontrol edinVels iki gün sonra kuyruk damarından kan toplarken. Greft alınıyorsa, yukarıdaki transplantasyon prosedürlerini tekrar edin, hafifçe EFP&#39;yi çekin, epididime bitişik yağ pedinin sonuna bağlamak, kan damarlarını tıkamak, EFP greftini eksprese etmek ve histoloji için korumak için 3-0 sütür kullanın . NOT: Adacıkların eksprese edilmesi alıcı fareleri 3 gün içinde tekrar hiperglisemik hale getirmelidir, böylece greftin fonksiyonu teyit edilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Shapiro, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+Islet+Transplantation.">International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation.</a> N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).</li><li>Ryan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-year+follow-up+after+clinical+islet+transplantation.">Five-year follow-up after clinical islet transplantation.</a> Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).</li><li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation.">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).</li><li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum.">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).</li><li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ectopic+site+for+islet+transplantation,+using+biodegradable+scaffolds.">Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds.</a> Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).</li><li>Weaver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Release+of+Dexamethasone+from+Organosilicone+Constructs+for+Local+Modulation+of+Inflammation+in+Islet+Transplantation.">Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation.</a> Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Micro+to+Macro:+The+Hierarchical+Design+in+a+Micropatterned+Scaffold+for+Cell+Assembling+and+Transplantation.">From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation.</a> Adv Mater. 29, (2017).</li><li>Blomeier, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Scaffolds+as+Synthetic+Microenvironments+for+Extrahepatic+Islet+Transplantation.">Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation.</a> Transplantation. 82, 452-459 (2006).</li><li>Gibly, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+islet+transplantation+with+microporous+polymer+scaffolds+in+syngeneic+mouse+and+allogeneic+porcine+models.">Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models.</a> Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).</li><li>Moskalewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+the+Islets+of+Langerhans+of+the+Guinea+Pig.">Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig.</a> Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).</li><li>Lacy, P. E., Kostianovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+isolation+of+intact+islets+of+Langerhans+from+the+rat+pancreas.">Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas.</a> Diabetes. 16, 35-39 (1967).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Murine+Islet+Isolation+and+Subcapsular+Kidney+Transplantation.">A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Islet+of+Langerhans+Isolation+using+a+Combination+of+Purified+Collagenase+and+Neutral+Protease.">Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+diabetes+mellitus+for+islet+transplantation.">Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation.</a> Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).</li><li>Schmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islets+find+a+new+transplant+home+in+the+omentum.">Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum.</a> Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).</li><li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine:+mechanisms+of+in+vivo+remodeling.">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Pankreas perfüzyonu ve sindirim zamanı, adacık verimi ve kalitesini etkileyen iki önemli parametredir. Moskalewski ilk olarak kıyılmış kobay pankreasını 11 sindirmek için ham kollajenaz karışımı kullanımını bildirdi. Lacy ve ark. , Adacık verimi 12&#39;yi büyük ölçüde arttıran pankreaları perfüze için kanal sistemine enzim enjeksiyonu yaptığını bildirdi. Enzim duktal perfüzyon daha homojen bir sindirim ve pankreas 13 kıyılmış parçalanmasından karşılaştırıldığında, bozulmamış adacıklardaki daha büyük bir ayrılma neden olarak enzime pankreas yüzey alanının maksimum maruz sağlar. Deneyimlerimize göre, safra yolunun başarılı kanülasyonu ve tüm pankreasın perfüzyonu, yüksek adacık verimleri için ön şarttır. Bunun nedeni, pankreas kuyruğu (dalak lobu) aslında adacıkların çoğunu duodenuma yakın pankreas dokusuyla karşılaştırıldığında içerir. Kanun yapmak için iki yol vardır<html> i), enzimin girişini bloke ederken oniki parmak 13, 14, enzimin girişini bloke edilmesi ve ii) on iki parmak bağırsağı yakın iğne sokulması sırasında karaciğer bölgesine yakın iğne sokulması: literatürde rapor edilmiştir safra kanalı Karaciğer 15 . Burada, iğneyi bükme veya fareyi yeniden konumlandırmayı gerektirmeyen ikinci tekniği uyguladık. İyi eğitim almış bir araştırmacı, protokolümüzü izlerken 40 dakika içinde 10 fare kanülasyonunu gerçekleştirebilir. Pankreasın sindirim zamanı, farelerin yaşı ve türüne göre değişir. Aşırı sindirilmiş pankreas küçük adacıklar üretir ve az sindirilmiş pankreas adacıklara asinar hücreler bağlıdır. Bu nedenle sağlıklı adacıkların yüksek verimi elde etmek için sindirim süresinin optimize edilmesi önemlidir. STZ, beta hücrelerini özel olarak yok eden ve farelerde 3 gün içinde diyabet oluşturan bir antibiyotik bileşiktirSs = &quot;xref&quot;&gt; 16. Dozaj, belirli fare türü ve yaşına göre değişir ve deney öncesi deneylerle belirlenmelidir. Bildiğimiz kadarıyla, C57BL / 6J fareleri, Balb / C farelerine kıyasla daha düşük dozda STZ gerektirir. STZ doz aşımı şiddetli hiperglisemiye neden olur ve yetersiz bir STZ dozu diyabet insidans hızını düşürürken hayvanların bir hafta içinde ölümüne neden olur. EFP&#39;ler vaskülarize dokulardır ve ameliyat için minimal invaziv prosedürlerle rahatça erişilebilir durumdadır. Adacıkların EFP&#39;ye transplantasyonu, genellikle fare modellerinde adacık nakli için yaygın olarak bildirilen bir alan olan böbrek kapsülüne kıyasla daha kolay ve daha güvenlidir. Özellikle, böbrek önemli bir organdır ve ele alınması hassasdır; Adacıkların transplantasyonu başarısız olabilir veya hayvanlar ameliyattan sağ kalamayabilir 4 . Farelerdeki EFP&#39;ler, insanlardaki omental kese ile benzerdir. EFP&#39;deki transplantasyon çalışması sadece bizimAdacık sağkalımı / fonksiyonu için önkoşullu doku ortamının anlaşılması, aynı zamanda klinik nakil prosedürlerinin geliştirilmesi için temel oluşturması 17 . Bu çalışmada kullanılan DCS sığır perikardından türetildi ve esas olarak kollajenden yapıldı. Desellüler hale getirilmiş maddeler, immünojeniklik göstermeyebilir ve sadece in vivo hafif derecede inflamatuar tepkilere neden olabilir 18 . Adacıklar DCS&#39;nin gözenekleri içine ekildiğinde, iskele mekanik korumayı önerdi ve adacıkların birbirine yapışmasını önledi ki bu da adacıkların nekrozuna neden olabilir. Adaları içeren DCS iskelesi, forseps kullanılarak direkt olarak ele alınabilir, böylelikle nakil kolaylıkla yapılabilir. İskeleleri EFP içine yerleştirmek, iskeletsiz olarak nakledilen serbest adacıkların aksine, adacıkların periton içerisine sızmasını azalttı 8 . Bu nedenle, DCS, distinc&#39;iAdacık transplantasyonu için avantajlar.

Tip 1 diabetes mellitus (T1D) adacık hücrelerinin bağışıklık sistemi tarafından ablasyona uğramış olduğu hastaları, tüm yaşamları boyunca eksojen insülin enjeksiyonuna bağımlı kılan bir otoimmün endokrin bozukluktur. Edmonton protokolü adacık transplantasyonunun klinik çalışmalarında bir kilometre taşı temsil eder; Adacıklar portal ven yoluyla infüze edildi ve intrahepatik bölgeye nakledildi 1 . Bununla birlikte, donör adacıklarının yetersiz kaynakları ve zayıf adacık engrafmanı olmak üzere iki ana engel, adacık transplantasyonunun geniş başarısını engellemektedir 2 . Genellikle, bir hastanın hiperglisemik durumunu tersine çevirmek için üç kadavradan donörden adacıklar toplanmalıdır; Bunun nedeni, düşük adacık yalıtım prosedürleri ve transplantasyondan sonraki adacık kaybıdır. Özellikle, transplantasyon sonrası adacıklar oksijen açısından zengin kanla ıslatılmış olsalar da, kanla doğrudan temas çoğu zaman kan yoluyla dolaştırılan inflamamayı uyandırırAdacıkların akut şekilde kaybedilmesine neden olabilecek toory reaction (IBMIR). Uzun vadede, hastalardaki adacıkların kademeli olarak kaybedilmesi, birinci yılda% 90&#39;a ulaşabilen ve 2 ve 5 oranında% 30&#39;a ve% 10&#39;a düşebilecek klinik gruplarda diyabetin tersine dönme oranlarının düşmesine neden oldu- ğu düşünülmektedir Transplantasyon sonrası yıllar sırasıyla 3 . Ekstrahepatik bölgelerdeki adacık transplantasyonu, adacıkların kanla doğrudan temasını azaltmak, intrahepatik infüzyona kıyasla transplantları daha tanımlanabilir yerlere kısıtlamak için çekici bir strateji olmuştur. Geçtiğimiz yıllar boyunca böbrek kapsülü, göz, kas, yağ yastıkları ve subkutanöz alanlarda çalışmalar yapıldı ve bu bölgelerdeki adacıkların normoglisemi 4&#39;ü geri kazanmak için ayakta kalabildiklerini ve işlev gösterebildiklerini gösterdi. Buna ek olarak, bu bölgelerdeki adacıklar geri alınabilir, böylece biyopsi veya daha başka değiştirme prosedürleri mümkündür. Ekstrahepatik sBu nedenle, klinik transplantasyon için büyük bir potansiyel ortaya koymaktadır 5 . Biyolojik materyal tabanlı iskeleler hücre nakli ve doku mühendisliği için yoğun şekilde araştırıldı. Üç boyutlu (3D) iskele genellikle gözenekli yapılar içerir ve hücrelerin mekansal yapısını / organizasyonunu oluşturmak için hücresel şablonlar olarak veya biyoaktif ipuçlarının kontrollü salımını sağlamak için rezervuar olarak işlev görebilir. İskele ayrıca EFP&#39;deki adacıkları nakletmek için poli (glikolid-L-laktit) 6 , poli (dimetilsiloksan) 7 ve termoplastik poli (üretan) 8 gibi polimerik malzemelerden imal edilmiştir. Adacıkların doğrudan transplantasyonu ile karşılaştırıldığında, iskeletlerin adacıkların intraperitoneal boşluğa 9 , 10 sızıntısını önleyerek adacık kaybını azalttığı ve mekanik korumanın sağlandığı ve modülLokal inflamatuar reaksiyonu önleme. İskele böylece, transplantasyon bölgelerinde 7 adacık engraftmanını geliştirmek için geliştirilebilir. Bu çalışmada, bir DCS kullanarak farelerin modellerinde gerçekleştirilen, EFP&#39;deki adacık nakli paradigmasını göstermek istiyoruz. Ekstraselüler matristen türetilen iskeleler, sentetik ürünlerle karşılaştırıldığında üstün biyouyumluluk ve daha doğal gözenekli yapılar nedeniyle son yıllarda büyük ilgi gördü. Burada, C57BL / 6J farelerden yüksek verimle pankreatik adacıklar elde etmek için sağlam bir izolasyon protokolü açıklanmaktadır. Sığır perikardından işlenen DCS&#39;lere daha sonra adacıklar ekildi ve greftler, eşzamanlı diyabetik modellerde EFP&#39;ye nakledildi. Farelerde normoglisemi, 10 gün içinde elde edildi ve greftlerin çıkarılıncaya kadar 100 güne kadar tutuldu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="364">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Dissecting scissor</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Forceps</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">0.5 mm diameter wire mesh</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">70 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:63px;">Falcon</td>
			<td style="width:91px;">352350</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Artery hemostatic clamp</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Microscopic hemostatic clamp</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Hemostatic forceps</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Absorbable 6-0 PGLA sutures&#160;</td>
			<td style="width:63px;">JINHUAN</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;">With needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Wound clip</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Cotton swab</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Gauze</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">10mL syringe</td>
			<td style="width:63px;">JINGHUAN</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:63px;">JINGHUAN</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">27G intravenous needle</td>
			<td style="width:63px;">JINGHUAN</td>
			<td style="width:91px;">0.45x15 RWSB</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td style="width:63px;">Axygen</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">15mL conical tube</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">430791</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">430829</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">35mm Non-treated&#160; Peri-dishes</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">430588</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Transwell</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">3422</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">0.22 &#956;m filter</td>
			<td style="width:63px;">Pall</td>
			<td style="width:91px;">PN4612</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:63px;">Corning</td>
			<td style="width:91px;">4488</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Pipet filler S1</td>
			<td style="width:63px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:91px;">9501</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:127px;">Pipette (2-20&#956;L)</td>
			<td style="width:63px;">Axygen</td>
			<td style="width:91px;">AP-20</td>
			<td style="width:87px;">AXYPETTM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:63px;">Olympus</td>
			<td style="width:91px;">SZ61</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:63px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:91px;">5810R</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">C14175500CP</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:63px;">Roche</td>
			<td style="width:91px;">COLLP-RO</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Histopaque 1077</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">10771</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">11879-20</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">FBS</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">16000-044</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">D-glucose</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">A24940-01</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Glucose meter</td>
			<td style="width:63px;">Roche</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;">ACCU-CHEK</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:63px;">Gibco</td>
			<td style="width:91px;">15140-122</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:127px;">Streptozotocin</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">V900890</td>
			<td style="width:87px;">VetecTM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Chloral hydrate</td>
			<td style="width:63px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:91px;">C0073</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">71497</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:127px;">Citric acid</td>
			<td style="width:63px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">C2404</td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">Iodophors</td>
			<td style="width:63px;">Ningbo Medical</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:127px;">C57BL/6J, 10-12 weeks old</td>
			<td style="width:63px;">VitalRiver</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:87px;">Beijing, China</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:127px;">Decellularized scaffold</td>
			<td style="width:63px;">Guanhao Biotec</td>
			<td style="width:91px;">131102</td>
			<td style="width:87px;">Guangzhou, China</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scaffold-supported transplantation of islets in the epididymal fat pad of diabetic mice

Adacık transplantasyonunun klinik olarak tip 1 diyabet tedavisinde etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, mevcut intrahepatik transplantasyon stratejisi akut tam kan reaksiyonlarına neden olabilir ve kötü adacık engraftmanına neden olabilir. Burada, ekstrahepatik transplantasyon alanındaki adacıkların transplantasyonu için sağlam bir protokol bildirdik, diyabetik bir fare modelinde epididimal yağ bandı (EFP). Adacıkların C57BL / 6J farelerden yüksek verimle izole edilmesi ve saflaştırılması için bir protokolün yanı sıra, bir desellüler hale getirilmiş iskelete (DCS) adacıkların ekilmesi ve diyabetik hale getirilen eş merkezli C57BL / 6J farelerindeki EFP alanına implante edilmesiyle gerçekleştirilen bir transplantasyon yöntemi anlatılmıştır Streptozotosin. DCS olmayan serbest adacıklar en az 30 gün süre ederken, 500 adacık içeren DCS grefti, hiperglisemik durumu 10 gün içinde tersine çevirdi. Normoglisemi, greft eksplantlana kadar 3 aya kadar sürdürüldü. Sonuç olarak, DCS adacıkların engraftsını tO ekstrahepatik EFP sitesinde bulunabilir ve bu iskelet materyallerini araştırmak için tekrarlanabilir ve yararlı bir platform sunabilir ve başarılı bir adacık yerleşimi için gereken diğer transplantasyon parametrelerini sağlayabilir.

Mikroskopik bir hemostatik kelepçe kullanılarak gerçekleştirilen sıkıştırma yöntemimiz, dikiş bağlantı tekniğiyle karşılaştırıldığında basit ve zaman kazandırır. 6 fareden yaklaşık 1.200 adacık izole etmek ve saflaştırmak kabaca 4 saat sürdü. Yeni izole edilen adacıklar tipik olarak optik bir mikroskop altında kaba bir çevreye sahiptir ( Şekil 3A ). Adacıklar izolasyon sürecinden kurtulduktan sonra parlak ve sıkı görünüyordu ve pürüzsüz bir yüzey elde ettiler. Bununla birlikte, stresli izolasyon hücre ölümünü indükleyebilir, bu da hücrelerin adacık yüzeylerinden ayrılmasına neden olur ve sağlıksız adacıklar genellikle karanlık bir nekrotik çekirdeği içerir ( Şekil 3B ). 5 fareden alınan 945 adacık çapını ölçtük; Hesaplanan ortalama ada çapı 130.42 ± 41.75 μm idi ( Şekil 3C ). Alıcının bağışıklığını önlemek için<html> Reddi, biz C57BL / 6J farelerde sinsik transplantasyon yaptık. Tipik olarak, 500 Adacık yüklü DCS, EFP bölgesine nakledildi ve serbest adacık grubunda gözlemlenen 30 gün ile karşılaştırıldığında, 10 gün içinde hiperglisemi tersine çevrildi. Normoglisemi, greftlerin alınmasına kadar yaklaşık 100 gün tutuldu ( Şekil 3D ). Yüklenen adacıklar DCS&#39;ye eşit olarak yayılmış ve EFP ile kaplanmıştır. Adacık yüklü DCS forseps kullanılarak da kolaylıkla işlenebilir ( Şekil 3E ve 3F ). Histolojik inceleme, eşit şekilde dağıtılan adacıkların revaskülarize edildiğini ve transplantasyondan 60 gün sonra EFP dokusu ve DCS ile çevrelendiğini gösterdi ( Şekil 3G ). İnsülininin immünolojik olarak boyanması, adacıkların başarılı şekilde engraftmanını doğrulamıştır ( Şekil 3H ). Xfigimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54995 / 54995fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: İskele destekli adacıkların EFP bölgesine transplantasyonu. ( A ) Farelerden izole edilmiş taze adacıkların temsili resimleri. ( B ) Adacıklar, ölü hücreler adacık yüzeyinden sıyrıldığı 12 saat boyunca kültürlendi. Başlangıçta: Sağlıksız adacıklar karanlık, nekrotik bir çekirdeğe sahiptir. ( C ) 5 fareden 945 adacık boyut dağılımı. ( D ) DCS destekli adacıklar ve serbest adacıklar ile nakledilen diyabetik farelerin açlık-kapanma kan şekeri seviyesi. Siyah ok greftin bu zaman noktasında alındığını gösterir. ( E ) Adacık yüklü iskeletin yayılmış bir EFP dokusunun yüzeyine aktarılmasını gösteren fotoğraf. ( F ) Adacık yüklü DCS&#39;nin temsili faz kontrast görüntüsü. Başlangıç: DCS&#39;nin optik resmi, forseps tarafından tutulur. ( G ) Temsilci histolojik H &amp; E imgesiNakledilen adacıklar, 60 gün sonra DCS ve EFP ile çevrelenmiştir. ( H ) 60 gün sonra eksprese edilen DCS destekli adacıkların immün boyası. Ölçek çubukları = 150 μm (A, B), 100 μm (F), 500 μm (G) ve 25 μm (H). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54995/54995fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice at JoVE.com

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi.

Diyabetik Farenin Epididimal Yağ Tabağında Iskelelerin İskele Destekli Nakli

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

scaffold-supported-transplantation-islets-epididymal-fat-pad-diabetic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.0K Görüntüleme.  Peking University.  Bu protokol, murine iz izolasyonunu ve bir desellularize iskele üzerine tohumlamayı gösterir. İskele destekli adacıklar streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik farelerin epididimal yağ yastığı içine nakledildi. Isletler nakil alanından kurtuldu ve hiperglisemik durumu tersine çevirdi. 

Video: Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Biyomühendislik

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Genetik olarak tadil edilmiş hücre transplantasyonu için Micropatterned kültür plakalarında Sferoid hücrelere karşı gene

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Bir Salınım basınçlı perfüzyon Aygıt Sıçan karaciğerinin decellularization Prosedürü

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

An Ultrasonic Tool for Nerve Conduction Block in Diabetic Rat Models

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU can reversibly block the conduction of peripheral nerves without damaging the nerves while using an appropriate ultrasonic parameter. Temporary and partial block of the action potentials of nerves shows that HIFU has the potential to be a useful clinical treatment for pain relief. This work demonstrates the procedures for suppressing the action potentials of neuropathic nerves in diabetic rats in vivo using an HIFU transducer. The first step is to generate adult male diabetic neuropathic rats by streptozotocin (STZ) injection. The second step is to evaluate the peripheral diabetic neuropathy in STZ-induced diabetic rats by an electronic von Frey probe and a hot plate. The final step is to record in vivo extracellular action potentials of the nerve exposed to HIFU sonication. The method showed here may benefit the study of ultrasound analgesic applications.

This work presents the methodology of applying high intensity-focused ultrasound to block the action potentials of diabetic neuropathic nerves.

Sinir iletim için ultrasonik bir araç diyabetik sıçan modellerinde engelleme

Nerve conduction block with a high intensity-focused ultrasound (HIFU) transducer has been performed in normal and diabetic animal models recently. HIFU ...

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

Heparinized StarPEG Nanocoating ile pankreas adacıkları yüzey Mühendisliği

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Sıçan Vivo içinde kısmi karaciğer Dairesi'nde için bir temel olarak yeni bir cerrahi teknik

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The KYF-Pt-NE encapsulates Pt(II) at 10 wt. %, has a diameter of 107 &#177; 27 nm and a negative surface charge. The KYF-Pt-NE is stable in water and in serum, and is biologically active. The conjugation of a fluorophore to KYF allows the synthesis of a fluorescent nanoemulsion that is suitable for biological imaging. The synthesis of the nanoemulsion is performed in an aqueous environment, and the KYF-Pt-NE forms via self-assembly of a short KYF peptide and an oleic acids-platinum(II) conjugate. The self-assembly process depends on the temperature of the solution, the molar ratio of the substrates, and the flow rate of the substrate addition. Crucial steps include maintaining the optimal stirring rate during the synthesis, permitting sufficient time for self-assembly, and pre-concentrating the nanoemulsion gradually in a centrifugal concentrator.

This protocol describes an efficient method to synthesize a nanoemulsion of an oleic acids-platinum(II) conjugate stabilized with a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) tripeptide. The nanoemulsion forms under mild synthetic conditions via self-assembly of the KYF and the conjugate.

Tripeptit stabilize Nanoemulsion oleik asit

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ligation is a challenging procedure and has a high mortality rate due to its nature. We developed a method to consistently transplant bioprinted patches of cells and hydrogels onto the epicardium of an infarcted mouse heart to test their regenerative properties in a robust and feasible way. First, a deeply anesthetized mouse is carefully intubated and ventilated. Following left lateral thoracotomy (surgical opening of the chest), the exposed LAD is permanently ligated and the bioprinted patch transplanted onto the epicardium. The mouse quickly recovers from the procedure after chest closure. The advantages of this robust and quick approach include a predicted 28-day mortality rate of up to 30% (lower than the 44% reported by other studies using a similar model of permanent LAD ligation in mice). Moreover, the approach described in this protocol is versatile and could be adapted to test bioprinted patches using different cell types or hydrogels where high numbers of animals are needed to optimally power studies. Overall, we present this as an advantageous approach which may change preclinical testing in future studies for the field of cardiac regeneration and tissue engineering.

This protocol aims to transplant a 3D bioprinted patch onto the epicardium of infarcted mice modeling heart failure. It includes details regarding anesthesia, the surgical chest opening, permanent ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery and application of a bioprinted patch onto the infarcted area of the heart.

Miyokard Enfarktüsü'nün Murine Modelinde 3Boyutlu Biyobaskılı Yama Transplantasyonu

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...

Doxycycline Loaded Collagen-Chitosan Composite Scaffold for the Accelerated Healing of Diabetic Wounds

One major complication of diabetes mellitus is diabetic wounds (DW). The prolonged phase of inflammation in diabetes obstructs the further stages of an injury leading to delayed wound healing. We selected doxycycline (DOX), as a potential drug of choice, due to its anti-bacterial properties along with its reported anti-inflammatory properties. The current study aims to formulate DOX loaded collagen-chitosan non-crosslinked (NCL) &amp; crosslinked (CL) scaffolds and evaluate their healing ability in diabetic conditions. The characterization result of scaffolds reveals that the DOX-CL scaffold holds ideal porosity, a low swelling &amp; degradation rate, and a sustained release of DOX compared to the DOX-NCL scaffold. The in vitro studies reveal that the DOX-CL scaffold was biocompatible and enhanced cell growth compared with CL scaffold treated and control groups. The anti-bacterial studies have shown that the DOX-CL scaffold was more effective than the CL scaffold against the most common bacteria found in DW. Using the streptozotocin and high-fat diet-induced DW model, a significantly (p&#8804;0.05) faster rate of wound contraction in the DOX-CL scaffold treated group was observed compared to those in CL scaffold treated and control groups. The use of the DOX-CL scaffold can prove to be a promising approach for local treatment for DWs.

The prepared DOX-CL scaffold satisfied the prerequisites of an ideal DW dressing in mechanical strength, porosity, water absorption, degradation rate, sustained release, anti-bacterial, biocompatibility, and anti-inflammatory properties, which are considered to be essential for the recovery of damaged tissue in DWs.

Diyabetik Yaraların Hızlandırılmış İyileşmesi İçin Doksiksin Yüklü Kollajen-Kitosan Kompozit İskele

One major complication of diabetes mellitus is diabetic wounds (DW). The prolonged phase of inflammation in diabetes obstructs the further stages of an ...