This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant n&#186; 32003B_127619).

1. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür, insan hepatomu HepG2 hücreleri 6 cm 25 bir inkübatör (% 5 CO, 37 ° C &#39;de,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren Dulbecco Değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 hücre kültürü şişeleri 2,% 95 hava) (ekim yoğunluğu: 1 x 10 6 hücre başına 25 cm 2 hücre kültürü şişesi, 37 ° C inkübatör inkübasyon süresi: 48 saat, confluency hücre yoğunluğu: 25 cm başına 4-5 x 10 6 hücre 2 hücre kültürü şişesi). </li><li> Hücreler% 90,% 95 konfluent olduğunda deneyleri. </li></ol> Polarografik Oksijen Sensörleri 2. Yüksek çözünürlüklü Solunum Kalibrasyon <ol><li> Pipet 2.1 bir Oksigraf odası içine solunum ml tampon sürekli kararlı bir oksijen akışının sinyaline kadar 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak tampon karışmayapolarografik oksijen sensörü elde edilir. NOT: Her Oksigraf odası ölçü oksijen konsantrasyonu içinde Polarografik oksijen elektrotları ve her odasının içinde oksijen tüketimini (akı) hesaplayın. oksijen konsantrasyonu ve oksijen tüketim oranları (akı) veri toplama ve analiz yazılımı kullanarak bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir. </li><li> Üreticinin protokollerine 14&#39;e göre polarografik oksijen sensörünün bir hava kalibrasyonunu gerçekleştirin. Not: hava doygunluğu deney sıcaklığında ortam solunum ortam ve oksijen konsantrasyonunda polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu yalnızca günde bir kez sabah gerçekleştirilir. Daha sonra ortam odası ve yeni bir solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline hücrelerden çıkarılabilir bir Oksigraf bölmeye ilave edilir ve solunum hızları ölçülür. İlk deneyin ardından, oda yıkanabilir ve deneyler ilave serisi t gerçekleştirilebilirDaha fazla kalibrasyon olmadan aynı bölme. </li></ol> Yapışık hücreler, Sayma Hücreleri 3. trypsinization <ol><li> Deney gününde, 25 cm 2 hücre kültür şişesi DMEM aspire. </li><li> fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) ile kültür şişelerinde hücre kültürü tek tabaka durulayın. </li><li> Pipet 0.5 kültür şişelerinde hücre tek içine (37 ° C su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış) Tripsin çözeltisi 25 mg / ml ile yıkanır ve bir inkübatör (% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe % 95 hava). </li><li> DMEM hücre kültür şişesi içinde müstakil hücreler içine,% 10 FBS ihtiva eden ve pipetleme hücrelerin süspansiyonu Pipet 5 mi. </li><li> Aktarım, oda sıcaklığında 350 xg 5 dakika boyunca 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücreler yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve süpernatantı süzün. </li><li> Solunum tamponu 13 (t mümkün 1) 1 ml hücre pelletini. </li><l<html> i&gt; hücre sayacı kullanılarak hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir son yoğunluğa solunum tampon bunları tekrar süspansiyon. hücresel solunum oranları hücre sayısı normalize olacağından, doğru ve kesin hücre sayacı ile hücreleri saymak. </li></ol> 4. Yüksek çözünürlüklü Solunum <ol><li> Hava kalibrasyon (sadece günde bir kez uygulandı, 2.1-2.2 adım) eklendikten sonra, Oksigraf bir bölmeden solunum orta aspire ve odanın adım 3,7 hücre süspansiyonu (1 x 10 6 hücre / ml) 2.1 ml. </li><li> durdurucunun sokulmasıyla Oksigraf odası kapatın. </li><li> Sürekli 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak hücreler ilave edin ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: oksijen konsantrasyonu ve oksijen akı sinyal veri toplama ve analizi için yazılım kullanan bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterildis = &quot;xref&quot;&gt; 14. </li><li> Daha sonra, aşağıdaki protokollerini kullanarak stoper titanyum enjeksiyon portu üzerinden mitokondriyal solunum için alt tabakaların ve inhibitörlerin enjekte edin. </li></ol> Respirometrik tarafından sağlam hücrelerde 5. Digitonin Titrasyon <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın. </li><li> bir şırınga kullanılarak odası stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) &#39;DİKKAT&#39; 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilene kadar 5-10 dakika hücresel solunum kayıt . NOT: Aşağıdaki adımlarda tüm enjeksiyonlar şırıngalar kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portları aracılığıyla yapılmaktadır. rotenone eklenmesi isteğe bağlıdır (ters elektron akışı engeller) ve digitonin titrasyon deneyleri için göz ardı edilebilir, bakınız6.3 adım. </li><li> Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Oksigraf odasına 2 mM digitonin (2 uM) 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen sinyali elde edilene kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Yine Digitonin Oksigraf odası içine 2 mm kadar 2 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen sinyali elde edilinceye kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: hücrelerine digitonin Basamakları eklenmesi hücresel oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır. </li><li> odasına 2 mM digitonin kademeli (2-4 uM her adımı) 2-4 ul enjekte devam edin. Her adımdan sonra, 2-5 m hücresel solunum kayıtistikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilinceye kadar içinde. NOT: Oksijen akı sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve digitonin daha enjeksiyonları solunum oranını artırmak olmadığında digitonin enjekte durdurun. okuyucular adım 6.2 ve deneyler için aşağıdaki protokollerden 7.2 kendi reaktifleri ve kullanım elde edilen optimal digitonin konsantrasyonu kullanılarak kendi laboratuarlarında optimal digitonin konsantrasyonunu belirlemek gerekir. </li></ol> Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü 6. Değerlendirme: Sitokrom C <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın. </li><li> Hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) ihtiva eden Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği. </li><li> Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve hücresel Respirat kayıtsabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca iyon. </li><li> Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: hücrelerine ADP eklenmesi karmaşık I teşvik ve oksijen tüketiminde artışa neden ve oksijen akı sinyali artırmak ve stabilize edecek olacaktır. </li><li> Oksigraf odası içine 4 mM sitokrom c (10 uM) ve 5 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Son olarak, 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar hücresel solunum kaydedin. </li></ol> 7. Maksimal ADP ile uyarılmış Solunum permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Eyalet 3) <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın.</li><li> Hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği. </li><li> malat 0.8 M (5 mM), 12.5 ul Oksigraf odası içine glutamat 2 M (10 mM), 10 ul enjekte edilir. istikrarlı bir oksijen akı sinyaline kadar rekor hücresel solunum elde edilir. </li><li> Oksigraf odasına 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. NOT: hücrelerine ADP eklenmesi oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır. </li><li> Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) &#39;DİKKAT&#39; 2 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Daha sonra, Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal artışları kadar hücresel solunum kayıtve sabitler. </li><li> Ardından, Oksigraf odasına A (5 mcM) &#39;DİKKAT&#39; antimycin 5 mM 2 ul enjekte ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Daha sonra 0.8 mM askorbat (1 mM) 2.5 ul enjekte etmek ve hemen ardından Oksigraf odası içine 0.2 mM TMPD (0.25 mM) 2.5 ul enjekte oksijen akı sinyali artışları kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder. </li><li> Son olarak Oksigraf odası içine 1 M sodyum azit (5 mM), &quot;Dikkat&quot; 10 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal düşene kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder. </li></ol> Bozulmamış Hücre 8. Oksijen Tüketimi <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın. </li><li> Oksigraf odası içeren hücre süspansiyonu içine 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekteistikrarlı bir oksijen akı sinyali gelene kadar d rekor hücresel solunum elde edilir. </li><li> Daha sonra Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.1 uM) &#39;DİKKAT&#39; 1 ul enjekte ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.4 uM) 3 ul enjekte edilir ve daha fazla oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Oksijen akı sinyali daha sonra maksimal seviyeleri ve hiçbir daha da artar ve ulaşıncaya kadar Oksigraf odasına (odasında 0,1-2 uM son konsantrasyon) 0,2 1 mM FCCP için 1-3 ul enjekte edilerek 0.1 mM 0.3 adımlarla FCCP titre azalan başlar. NOT: Oksijen sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve azalan başladığında FCCP enjekte durdurun. </li><li> Daha sonra, 0.2 mM rotenone (0.2 uM) ve hazneye A (5 um) antimycin 5 mM 2 ul 2 ul enjekte edilir. Kayıt solunum t kadaro oksijen akı sinyali azalır ve dengeler. </li></ol>

<ol>
	<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro.">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li><li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+mitochondrial+and+cellular+respiration+by+oxygen.">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li><li>Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+remifentanil+on+mitochondrial+oxygen+consumption+of+cultured+human+hepatocytes.">Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes.</a> PLoS One. 7 (9), e45195 (2012).</li><li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging.">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binding+to+enzymes+and+membranes.">Cytochrome c binding to enzymes and membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).</li><li>Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+conformations+of+physiological+membrane-bound+cytochrome+c.">Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c.</a> Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).</li><li>Gorbenko, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+cytochrome+c+complexes+with+phospholipids+as+revealed+by+resonance+energy+transfer.">Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer.</a> Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Pathways+and+Respiratory+Control.+An+Introduction+to+OXPHOS+Analysis.">Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis.</a> Mitochondr Physiol Network 17.18. , (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mevcut protokolün amacı mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri &#39;(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron taşıma sistemi kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ölçmek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanımı idi. Mevcut protokolde içinde bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, selüler oksijen tüketim oranları genellikle hücrelerin sayısı normalize edilir (pmol / [hücre sn x sayıda]). Bu nedenle, hücre oksijen tüketimini takip etmeden önce, hücre sayısının doğru ve güvenilir ölçümler sağlayan bir cihaz kullanmak için çok önemlidir. Mevcut protokolde otomatik hücre sayacı (adım malzemelerin protokol ve tablo 3.7) kullanılmıştır. Özellikle permeabilize hücreleri ikinci kritik bir adım, hücreler (adım protokolünün 3.6) yeniden süspanse Permeabilize olan solunum tampon seçimdir. Hücresel permeabilization intracellula kaybını tetikleyebilir berir iyonlar, permeabilization sırasında kullanılan orta içi çevre ile uyumlu olması çok önemlidir. Bu nedenle, solunum tamponu hücre içi ve hücre dışı ortamı (Tablo 1) 13 yansıtan bir bileşim ve osmolarite içermelidir. Buna ek olarak, en iyi ve etkin bir hücre geçirgenliği için, optimum ve en etkili konsantrasyonu belirlemek için, her hücre türü için değil, aynı zamanda her bir hücre yoğunluğu için, sadece konsantrasyon Digitonin titre için çok önemlidir. Digitonin konsantrasyonu çok düşük ise, hücre geçirgen edilmez. Buna karşılık, digitonin büyük miktarda hücrelerin maruz mitokondrial dış membran zarar verecektir. Bu nedenle, bir başka önemli nokta mitokondrial dış membran bütünlüğünü araştırmaktır. Hücresel solunum kapasitesini hafife etmemek için, Solunum deneyleri fizyolojik sıcaklıkta gerçekleştirilir da çok önemlidir (37 ° C). Dikkate alınacak diğer bir önemli nokta nedeniyle maksimal solunum akı elde etmek için permeabilize hücreleri ve yeterli alt tabaka seviyelerine oksijen karşı ADP difüzyon sınırlaması nedeniyle, ADP miktarda doyurarak kullanılmasıdır. permeabilize hücrelerin bazı deneylerde, bu dışsal alt tabakalar eklenmesinin meydana gelebilir ve ADP solunum hızı önemli bir artışa yol açmaz. Bu birkaç etkene neden olabilir. Örneğin, hücre geçirgenliği digitonin yüksek konsantrasyonlarda kullanılması mitokondriyal dış membran zarar verebilir. Bu nedenle, her biri hücre tipi ve yoğunluğu için optimal konsantrasyonunu belirlemek için digitonin titre edilmelidir. Bundan başka, digitonin saflığı çok kritik ve hücresel nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonlarını belirlemek için titre edilmelidir saflık ve satın alınan digitonin yeni toplu olarak önemli ölçüde değişebilir digitonin ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, gözenek oluşturucu hücre, plazma zarının birçok türü vardırfarklı özelliklere sahip maddeler. Örneğin, saponin Digitonin&#39;dir daha hafif deterjan ve hücre tipine bağlı olarak, uygun bir hücre geçirimli hale reaktifi seçilmelidir. Bu rotenon antimisin olarak Solunum deneylerde, kullanılan mitokondriyal fonksiyonun en inhibitörleri, sadece etanol içinde çözünür olan ve hücresel solunum inhibe Oksigraf odası ve stoper sopa. Bu sorunu önlemek için, Oksigraf odaları ve tapalar her deneyde sonra% 95 etanol ile iyice yıkanır olması gerekir. Dikkate alınacak diğer bir önemli nokta hem sağlam ve geçirgen hücresel solunum testleri için, hücre yoğunluğu, tipi ve hücre kültürü izdiham solunum oranları etkileyebilir olmasıdır. Örneğin, HepG2 hücreleri ile, genellikle bölme başına 1.000.000 2 hücrelerin bir hücre yoğunluğuna kullanımı. Respirometrik sırasında çok düşük hücre yoğunluğu kullanılarak, çok zayıf bir sinyal ortaya çıkmasına neden olabilir. Biz de hücre kültür confluency solunum oranları etkileyebilir gözlenmiştir. EXA içinHepG2 hücreleri (% 100&#39;den fazla) çok konfluent yetiştirilen mple, onlar çok daha az oksijen tüketir. Deneyler sırasında istikrarlı ve tekrarlanabilir oksijen akışını elde etmek için bir başka önemli nokta Araca yani polarografik oksijen sensörü membranlar ve enstrümantal arka plan düzeltmeleri düzenli değişimi yüksek çözünürlüklü Respirometrik korunmasıdır. uncoupler FCCP ile deneyler için, hücresel solunum ve maksimal akış elde edilmez, ancak bunun yerine, hücresel solunum inhibe teşvik etmez hücrelere FCCP bu ilaveli olabilir. FCCP ilavesi üzerine hücresel oksijen tüketiminin önlenmesi FCCP konsantrasyonu optimal değildir ve çok yüksek olduğunu gösteriyor olabilir. Bu deneyler için, her bir deney için, dikkatli maksimum akı elde etmek üzere FCCP konsantrasyonu titre için gereklidir. yüksek çözünürlüklü Respirometrik bir sınırlaması, kurulması, bu yüksek verimli tarama olduğudoz-yanıt eğrileri ve biyolojik örnekler sınırlı miktarda Zaman serisi deneyleri mümkün değildir. Bu deneyler için, böyle bir hücre dışı akı analizörü gibi diğer araçlar kullanabilirsiniz. Diğer sınırlamalar i) cihaz otomatik değil ve bir operatörün sürekli varlığını gerektirir, ii) zaman enstrümanın, iii) bir seferde çalıştırmak olabilir sadece iki odadan ve sadece iki deneyleri vardır, iv) bakım alıcı bu tür membranlar ve kalibrasyonları değiştirme gibi, çok zaman gerektirir ve v) odaları tek kullanımlık değildir ve inhibitörleri ile kontamine olabilir. Geleneksel polarografik oksijen elektrot cihazlar üzerinden yüksek çözünürlüklü Oksigraf avantajları i) yüksek hassasiyet, ii) biyolojik örneklerin daha az sayıda gerekli iii) solunum oranları iki odalarında aynı anda ölçülebilir ve iv) cihazı, oksijen kaçağı azalttı vardır. Hücre dışı akı analizörü üzerinde yüksek çözünürlüklü Oksigraf bazı avantajları i) daha düşük maliyetler vardırCihaz ve sarf malzemeleri ve yüzey-uncoupler-inhibitör titrasyon protokolleri ii) fizibilite. Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamalar veya yön, H 2 hücresel solunum, mitokondriyal membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler O 2, aynı odasında optik sensörler kullanılarak ATP ve kalsiyum düzeyleri.

Mitokondri, özellikle adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksijen ile, hücresel enerji metabolizmasında önemli rolleri üstlenirler. Bu hücre ölümü ve çeşitli insan hastalıklarında implike edilmiştir. Mitokondrial oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) oksijen tüketimi ve ATP sentezi ile elektron taşıma zinciri boyunca elektron taşıma birleştirir. Mitokondriyal trikarboksilik asit (TCA) döngüsü nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin dinükleotit enerji bakımından zengin bileşimler (FADH 2) içine protein, karbonhidrat ve yağ arasında dönüşüm yer almaktadır. NADH ve FADH 2 elektronlar solunum elektron taşıma zinciri protein kompleksleri aktarılır (I IV), iç mitokondriyal zarın yer. Buna ek olarak, diğer iki redoks yolları ulaşım zinciri elektron elektron aktarabilirsiniz: i) mitokondriyal elektron-transfer flavoprotein (ETF), iç mito matris yüzünde yer almaktadıryağ asidi β-oksidasyon chondrial membran ve malzemeleri elektronlar; ve ii) dihidroksiaseton fosfat gliserofosfat oksitlenir ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri elektronları besleyen mitokondriyal gliserofosfat dehidrojenaz. Kompleks IV (elektron kabul eden) su, iki molekül oksijen dönüştürülmesi, tek bir oksijen molekülüne transfer eder. I&#39;den IV&#39;e kadar solunum elektron taşıma zinciri kompleksi elektron taşıma mitokondriyal iç membran boyunca bir elektrokimyasal gradyanı oluşturur arası boşluğa mitokondriyal matris proton akışı ile birleştirilir. Daha sonra, mitokondriyal kompleks V (ATP sentaz) geri mitokondrial matriks içine hidrojen iyonlarını mekik ve ATP molekülleri sentezler. OXPHOS fonksiyonu elde edilebilir çeşitli teknikler ve çeşitli mitokondriyal solunum durumları kullanılarak in vivo ve in vitro olarak değerlendirilebilir. İzole mitokondri aşağıdaki respirato içindeRy Devletler ölçülebilir: i) taban mitokondriyal solunum (durum 1) mitokondriyal solunum zinciri kompleksi, belirli alt-tabakaların ilave edildikten sonra, ii) oksijen tüketimi (durum 2), III) maksimal mitokondriyal oksijen tüketimi doyurucu konsantrasyonlarının ilave edildikten sonra adenozin difosfat (ADP) (devlet 3) ve ATP dönüştürülür ADP tüketimi (sonra iv) istirahat solunum) (devlet 4). sağlam hücrelerde takiben solunum durumları ölçülebilir: i) taban hücresel oksijen tüketimi endojen substratları ve ADP mevcudiyetinde, ii) oligomycin varlığında bazal hücre oksijen tüketimi (oligomycin hassas olmayan solunum) ve oligomycin duyarlı solunum (ATP kaybı) antimisin ve rotenone ilave edilmesinden sonra, iii) FCCP bağlanmamış solunum, ve iv) olmayan mitokondriyal solunum. permeabilize hücrelerde, elektron taşıma zinciri kompleksleri ve ADP özel substratlar eklendi ve maksimal kompleks bağımlı solunum hızları ler olabiliruch gibi karmaşık I-, II- ve IV-bağımlı solunum oranları ölçülebilir. Hücresel solunum ölçümleri kompleksleri I-IV, mitokondriyal bütünlüğü ve enerji metabolizması 1, 2, 3 özel mitokondriyal solunum kapasitesi önemli bilgiler sağlamaktadır. Yüksek doğruluk, çözünürlük ve hassasiyet ile mitokondriyal oksijen tüketimi ölçümleri sağlayacak cihazlardan biri yüksek çözünürlüklü Oksigraf 4&#39;tür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf cihaz enjeksiyon portu ile iki bölmeyi içerir ve her bölme bir polarografik oksijen sensörü ile donatılmıştır. Hücresel ya da izole mitokondriyal süspansiyonlar respirometredeki sürekli karıştırılır. mitokondriyal kompleks aktivitesi için mitokondriyal fonksiyon, alt tabakaların ve inhibitörlerin değerlendirmek için standart protokoller izlenerek eklenebilir. Alt tabakaların ve inhibitörlerin enjeksiyon int ile titre edilebilirOksigraf odaları ve oksijen tüketimi oranları o yazılımı kullanılarak hesaplanır ve hücrelerin sayısı başına saniyede pikomol olarak ifade edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Solunum artan hassasiyet ve sağlam veya permeabilize hücrelerin biyolojik numunelerin az sayıda çalışma yeteneği de dahil olmak üzere, geleneksel ve konvansiyonel polarografik oksijen elektrod cihazlar fazla birkaç avantaj sunar. Buna ek olarak, her bir cihaz iki odayı içeriyor ve solunum hızları, oksijen konsantrasyonlarının karşılaştırmalar için eş zamanlı olarak kaydedilebilir. yüksek çözünürlüklü Oksigraf geleneksel polarografik oksijen elektrod cihazlara kıyasla aygıt odalardan oksijen azalma sızıntı avantajı vardır. Son zamanlarda hücresel oksijen tüketimini ölçmek için geliştirilen başka bir aygıt 96-iyi hücre dışı akı analiz 5&#39;tir. Hücre dışı akı analizörü yerine polarografik sensörler floresan ile donatılmıştır. hücre dışı avantajlarıyüksek çözünürlüklü Oksigraf I olan) bu ii) 24 ve yüksek verimli tarama için 96-yuvalı plakalar içinde oksijen tüketimini ölçmek mümkündür, büyük ölçüde otomatik bir cihaz ile karşılaştırıldığında akış Analiz Cihazı, Bu nedenle, biyolojik numunelerin düşük miktarda gerektiren ve iii) hücresel glikolitik akı ilave ölçüm mümkündür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf kıyasla dışı akı analizörü dezavantajları) cihazın ve olmayan tekrar kullanılabilir floresan plakalar gibi sarf yüksek maliyetler i, ve ii) tahlil başına sadece dört bileşikler / kuyu enjektabl vardır için, sistem Alt tabaka uncoupler inhibitörü titrasyon protokolleri için uygun değildir. Bu çalışmada, biz mitokondriyal solunum belirlemek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanın. Hücresel oksijen tüketimi deneyler için hücreler complexe elektronları beslenmesi için eksojen ADP ve okside mitokondriyal substratların girişine izin permeabilizeSolunum sistemi s. Bu yaklaşım, (çok yüzeye hücre geçirgenliği olmayan olan) olduğu gibi hücrelere kıyasla belirgin bir avantajı bireysel mitokondriyal kompleksleri solunum kapasitelerinin diseksiyon sağlar. Ancak, hücre zarı permeabilization dışı ortam ile dengelenir sitozol ve hücre dışı alan ve orta (sitozolik çözünenlerin dışarı yıkama) ve hücre içi alan kompozisyonu arasındaki engeli bozacak. sağlam hücreler üzerinde permeabilize hücrelerin dezavantajlarından biri, deterjan aşırı miktarda hücre geçirgenliği esnasında kullanılan halinde mitokondriyal dış membran hasar olabilir. sağlam hücrelerde bazal, sağlam hücreler birleştirildi ve bağlanmamış solunum ölçülebilir. Bu yöntem, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen ve aynı zamanda maksimal mitokondriyal elektron transpo hakkında bilgi veren, eksojen substratları ve ADP ilavesi olmadan sağlam hücrelerin oksijen tüketimini değerlendirirrt kapasitesi 6, 7. permeabilize hücrelerin içinde sağlam hücreler avantajlarından biri, hücre ortamında bozulmaz ve mitokondri hücrelerin bütün bileşenleri ile temas halinde olmasıdır. Hücresel plazma membran geçirgenliği için, bu tür digitonin deterjanlar 8 kullanılmıştır. digitonin aşırı miktarda kullanıldığında Ancak, mitokondriyal dış membran bütünlüğünü tehlikeye girebilir. permeabilize hücrelerin bozulmamış olduğunu mitokondriyal dış membran bütünlüğünü doğrulamak için digitonin titrasyon hücre geçirgenliği için optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için hücreler solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve digitonin konsantrasyonu ölçülür mitokondriyal substratları ve ADP ve solunum oranları varlığında Respirometrik titre edilir. sağlam olmayan permeabilize hücrelerin solunum mitocho mevcudiyetinde stimule değildirndrial yüzeyler ve ADP. Bununla birlikte, daha sonra adım adım digitonin titrasyonu plazma zarlarının kademeli geçirgenliği üretebilecektir ve optimal digitonin konsantrasyonu elde edilir. Bu, tam permeabilization solunum up artış gösterilmiştir. Mitokondriyal kalite ve dış membran bütünlüğü eksojen sitokrom c 2, 9 eklenerek kontrol edilebilir. Sitokrom c mitokondrial elektron taşıma zinciri 10, 11, 12, 12 kDa elektron taşıyan proteindir. Bu mitokondriyal arası boşluğa lokalize olur, ve kompleks IV karmaşık III elektron taşıyan, oksijen tüketimi yer almaktadır. mitokondrial dış membran zarar görmüşse, sitokrom-c serbest bırakılır ve mitokondriyal oksijen tüketimi azalır. Eksojen sitokrom c eklenmesi üzerine, mitokondriyal solunum herhangi büyütme bir göstergesidirmitokondriyal dış membran bozulur. Permeabilize hücreler, yüzeyler ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri çeşitli protokolleri 3, 9, aşağıdaki eklendi edilir. mitokondriyal kompleks tahrik solunum oranları araştırmak amacıyla, örneğin, aşağıdaki protokol kullanılabilir. hücre geçirgenleştirmeden sonra birinci kompleks I solunum zinciri için alt-tabaka olarak NADH üretir ve sonra ADP ATP (durum 3, aktif bir dönüşüm için ilave kompleks I&#39;in aktivasyonunu tahrik substratlar malat ve glutamat ile uyarılır kompleks I-bağımlı solunum). Bir sabit sinyal ulaşıldıktan sonra, rotenon (mitokondriyal kompleks I inhibitörü) Rotenone FADH 2 süksinat ardından kompleks I. inhibe ettiği ve kompleks II (State 3, aktif bir kompleks II bağımlı solunum) aktif hale getirmek için tatbik edilmektedir. Karmaşık IV-bağımlı solunum, ilk kompleks III ölçmek içinbağımlı solunum antimisin (mitokondriyal kompleks III inhibitörü) eklenerek engellendi. Daha sonra kompleks IV bağlı solunum askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) uygulanması ile uyarılır. TMPD dolayısıyla maksimal kompleksi IV bağımlı solunum hızı (Durum 3) önce ve sodyum azid, mitokondriyal kompleks IV inhibitörünün eklenmesinden sonra solunum oranları çıkarılmasıyla hesaplanır, solunum tamponu otomatik oksitleyebilir. solunum deneyleri, bir kontrol (uyarılmamış hücreler) olarak hizmet eden paralel birinde Oksigraf iki odası, diğer ihtiva eden uyarılmış hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bunların oksijen tüketimi Oksigraf odası içinde ölçülmeden önce Açıkçası, hücreler, mitokondriyal fonksiyonlarını etkileyen ilaçlarla, örneğin, çeşitli şekillerde, önceden işleme tabi tutulabilir. Bu protokol, bireysel mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri fonksiyonel muayene izin verir. Buna ek olarak, tek bir maksimum ADP-uyarımlı ölçebilirsolunum palmitat şeklinde eksojen yağ asit kullanılarak permeabilize hücrelerin (devlet 3). (: 1 mol oranında palmitat: BSA 6) Bu protokol, sodyum palmitat konsantre edildi stokları derece yağlı asit içermeyen sığır serumu albümini (BSA) ile konjüge edilir. Bundan sonra birinci Digitonin ve mitokondriyal solunum ile permeabilize hücrelerin karnitin eklenmesi ile değerlendirilir ve ADP (durum 3, maksimum solunum) ilave edildi palmitat. Ardından, oligomycin durumu 4 (devlet 4o) ve solunum kontrol oranı (RCR değeri) taklit ilave edilir devlet 3 / devlet 4o olarak hesaplanmıştır. β-oksidasyon elektron transfer flavoprotein ve β-hidroksiaçil-KoA dehidrogenaz tarafından elektron taşıma zinciri geçirilen elektronlar olan FADH 2 ve NADH, bir (TCA döngüsünde girer) asetil CoA üretimini ve üretimi teşvik. Mitokondri palmitat-BSA protokolü yağ inceleyerek araştırmacılar tarafından kullanılabilir yağlı asit metabolizmasının merkezinde ve tarif edilenty asit oksidasyonu. Sağlam hücreler, aktivatörleri ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri farklı bir protokole 6, 9, aşağıdaki ilave edilir. Bu deneyler için, eksojen alt-tabakaların yokluğunda olmayan permeabilize hücrelerin birinci oksijen tüketimi (solunum oranı fosforile) ile ölçülür. Daha sonra, sigara fosforile solunum hızı mitokondriyal ATP sentazının bir inhibitörü olan oligomycin eklenmesi sonra ölçülür. Daha sonra, protonophore karbonil siyanür p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) çeşitli konsantrasyonlarda yönetilmektedir ve maksimal mitokondriyal uncoupled solunum hızı ölçülür. Böyle FCCP olarak Protonophores kemiosmotik degrade dağıtmak için protonların pasif hareket etmesine izin verir iç zarı proton geçirgenliğinin bir büyütme neden olabilir. Proton geçirgenlik artışı oksidatif solunum (ATP üretimi) birbirinden ayrılacak ve o da bir artışa neden olurxygen tüketimi. Daha sonra, rotenon ve antimisin mitokondriyal solunum inhibe etmek için ilave edilir ve olmayan mitokondriyal solunum diğer solunum hızları çıkarılır. Oksijen tüketim oranları (kapalı oksijen odasında) hacim özel oksijen akı bölünmesiyle hesaplanır IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre] (milyon hücre başına oksijen akışı), JV, O şeklinde ifade edilebilir 2 [pmol X sn-1 X mi -1] hücre konsantrasyonu hücre odası içinde (hacim başına hücre sayısı [10 6 hücre ∙ mi 1]) 15. Hücre başına kütle bölü hücre-kütle özel oksijen akı, JO 2 [pmol x saniye -1 x mg -1], hücre başına akışı, IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre], [mg ∙ 10 6 hücre]; veya hacim özgü akı, JV, O 2 [pmol x saniye -1 x ml -1], vol başına kütle bölüume [mg ∙ mi 1]. JO 2 hücre proteininin, kuru ağırlık veya hücre hacmi başına oksijen akıdır. yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak bu çalışmada, biz, iii) mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri eksojen sitokrom c kullanarak) I tam hücresel plazma zarı geçirgenliği için optimum digitonin konsantrasyonu (digitonin titrasyon deneyi), ii) mitokondrial dış membran bütünlüğü i belirlemek için protokoller tarif eksojen ADP ve mitokondriyal solunum zinciri alt tabakalar ve mevcudiyetinde Digitonin permeabilize HepG2 hücrelerinde II ve IV maksimum solunum oranları IV) bazal, eksojen alt-tabakaların eklenmeden bağlı olan ve sağlam hücreler maksimum bağlanmamış solunumu (maksimum elektron taşıma kapasitesi) ve ADP, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="415">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">ADP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 4386</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 8674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:156px;">Ascorbate</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.00127</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">BSA</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">A 6003</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FCCP</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 2920</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">Countess automated cell counter&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:75px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;">Automated cell counting instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Cytochrome c</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">C 7752</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Digitonin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">D 5628</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">31966021</td>
			<td style="width:92px;">Medium</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">EGTA</td>
			<td style="width:92px;">fluka</td>
			<td style="width:75px;">3779</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">FBS</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">26010-074</td>
			<td style="width:92px;">Medium component</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Glutamate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma,</td>
			<td style="width:75px;">G 1626</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Hepes</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">H 7523</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KCl</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04936</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:92px;">Merck</td>
			<td style="width:75px;">1.04873</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">K-lactobionate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">L 2398</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">MgCl2</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">M 9272</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td style="width:92px;">Oroboros Instruments</td>
			<td style="width:75px;">10000-02</td>
			<td style="width:92px;">High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">O 4876</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:92px;">Gibco</td>
			<td style="width:75px;">15140122</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S2002</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Rotenone</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">R 8875</td>
			<td style="width:92px;">Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Succinate</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">S 2378</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">Taurine</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 8691</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:156px;">TMPD</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td style="width:75px;">T 3134</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td style="width:92px;">Sigma</td>
			<td>T 4674</td>
			<td style="width:92px;">Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

Digitonin Titrasyon Deney: Hücresel permeabilization için Optimum Digitonin Konsantrasyon belirlenmesi Digitonin titrasyonu HepG2 hücrelerinin nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için, digitonin rotenone, süksinat (mitokondriyal kompleks II alt-tabaka) ve ADP bir doyma bir miktarının varlığında sağlam hücrelerde titre edilir, ve solunum başlangıçta ve her sonra ölçülür (karmaşık II bağımlı durumudur 3 indükleme) titrasyon (Şekil 1A ve 1B). Bu deney sonucu, digitonin yokluğunda, hücresel solunum mitokondriyal alt-tabaka ve ADP mevcudiyetinde stimule değildir, çok düşük ve bozulmamış olmayan permeabilize hücrelerin solunum olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, digitonin adım adım eklenmesi üzerine, hücresel plazma membranında geçirgenleştirildi ve mitochon olduğusüksinat ve ADP hücreleri girdiğinizde drial solunum (karmaşık II bağımlı devlet 3) tam permeabilization kadar artar. Sonuçlar 8-12 uM digitonin konsantrasyonda permeabilizasyon HepG2 hücreleri ADP-uyarımlı solunum için uygun olduğunu göstermektedir. digitonin aşırı miktarda kullanıldığında Ancak, mitokondriyal dış membran bütünlüğünü tehlikeye girebilir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, digitonin aşırı miktarda tehlikeye mitokondriyal dış membran bütünlüğünü gösteren kompleksi II bağımlı durumudur 3 solunum bir azalmaya neden. Mevcut ve aşağıdaki protokoller, tüm oksijen tüketim oranları kapalı olarak (hacim özgü oksijen akı bölünmesiyle hesaplanır IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre] (milyon hücre başına oksijen akışı) olarak ifade edilmiştir oksijen odası), JV, O 2 [pmol x saniye -1 x ml -1] hücre concentrat tarafından<html> hücre odası iyon (hacim başına hücre sayısı [10 6 hücre X mi -1]) 15. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig1.jpg" /> Şekil 1: Digitonin titrasyonu HepG2 hücrelerinin nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonunu belirlemek için. mavi çizgi oksijen konsantrasyonunu temsil eder; Kırmızı çizgi oksijen akışını (oksijen konsantrasyonu eğimi) temsil eder. Hücreler mevcut oksijeni kullanmak olarak oksijen konsantrasyonu zamanla azalır. Oksijen tüketimi pmol / (hücre sn x sayısı) olarak ifade edilir. Yüksek çözünürlüklü Respirometrik (A) iz mitokondriyal kompleks II bağımlı solunum ile ilgili (1 denemesi) için, alt-tabaka olarak ADP ve süksinat Digitonin kullanımı. SD ± aracı olarak 4 ayrı deneyler (B) Mitokondriyal solunum oranları sundu./ 54985 / 54985fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;upload&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Bir Optimal Digitonin Konsantrasyon kullanarak Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü Değerlendirilmesi dış mitokondrial membran bütünlüğü optimal digitonin konsantrasyonu (8 mcM) etkisini değerlendirmek için, hücreler digitonin ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ile permeabilize süksinat sonraki ilavesinden sonra mitokondriyal solunum ölçümü ile test edilir (mitokondriyal kompleks II bağımlı bir devlet 2 dinlenme ADP yokluğunda solunum), ADP (ADP ((ADP oligomycin ilave edilir, sitokrom c varlığında) devlet 3 solunum II bağımlı kompleks uyarılmış inhibitörü durumu 3 solunum II bağımlı) ve sitokrom C kompleksi uyarılmış Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, ATP sentaz) durumunu 4. taklit etmek için </strong&gt;, sitokrom-c var mitokondriyal dış membran sitokrom c kaybı ve mitokondriyal bütünlüğü korunur belirten digitonin ile tedavi edilen hücrelerin karmaşık II bağımlı devlet 3 solunum geliştirmek değildir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54985/54985fig2.jpg" /> Şekil 2: Sitokrom c digitonin (8 uM) ile muamele hücre solunum geliştirmez. yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak sitokrom-c testi için Temsilcisi solunum izleri. Hücreler varlığında 10 mM süksinat (devlet 2), 2.5 mM ADP (devlet 3) ve 10 uM sitokrom-c (devlet 3 sonraki ilave edildikten sonra solunum oranları ölçümü ile test edilir 8 mcM digitonin ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ile permeabilize State 4. Solunum frekansı taklit etmek için 2 ug / ml oligomycin ilave edildi sitokrom c) pmol / (sn olarak ifade edilir X million hücreleri) içerir. CII: Karmaşık II. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54985/54985fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Digitonin&#39;in bir Yüksek Konsantrasyon kullanarak Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü Değerlendirilmesi digitonin çok yüksek konsantrasyon mitokondrial dış membran bütünlüğünü tehlikeye olduğunu göstermek için, biz digitonin yüksek dozda kullanarak bir deney gerçekleştirildi. Bu deney için, hücreler 40 uM digitonin yerine 8 uM ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ile permeabilize süksinat daha sonra ilave edildikten sonra mitokondriyal solunumun ölçülmesiyle test edilir (mitokondriyal kompleks ADP yokluğunda durum 2 solunum dinlenme II bağımlı) ADP ve sitokrom c (ADP kompleksi II bağımlı bir devlet 3 solunum uyarılmış) (ADP kompleksi II-d uyarılmışoligomycin mevcudiyetinde (Şekil 3) durumunu 4 taklit etmek oligomycin ilave edilir ependent durumu sitokrom c varlığında, 3 solunum). Bu deney sonucu, sitokrom C tehlikeye mitokondriyal dış membran bütünlüğünü gösteren mitokondriyal dış membran sitokrom c&#39;nin kaybı gösteren, digitonin yüksek bir doz ile tedavi edilen hücrelerin solunum arttırdığını göstermektedir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54985/54985fig3.jpg" /> Şekil 3: digitonin Yüksek doz (40 uM) mitokondrial dış membran bütünlüğünü tehlikeye atmakta. substrat olarak süksinat kullanılarak Solunum yüksek çözünürlük iz. mavi çizgi oksijen konsantrasyonunu temsil eder; Kırmızı çizgi oksijen akışını (oksijen konsantrasyonu eğimi) temsil eder. Hücreler mevcut oksijeni kullanmak olarak oksijen konsantrasyonu zamanla azalır. Oksijen tüketimi olarak ifade edilirpmol / (sn hücrelerinin sayısı x). 40 uM digitonin, süksinat (10 mM), ADP (2.5 mM), sitokrom c (10 uM) ve oligomycin (2 ug / ml) ve ardından, gösterilir. CII: Karmaşık II. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54985/54985fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Maksimal Fazla Eksojen Alt Tabakalar kullanarak, Solunum permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Devlet 3) ADP-uyarılmış Kompleks I, geçirgen HepG2 hücreleri (1 x 10 6 hücre / ml) II ve IV-bağımlı maksimal ADP ile uyarılan solunum (durum 3) başarılı bir şekilde aşırı eksojen alt-tabakaların (Şekil 4) kullanılarak ölçülür. Bu deney için, hücreler de tarif edildiği gibi alt tabakaların ve inhibitörlerin daha sonra ilave edildikten sonra ölçülür Digitonin ve mitokondriyal oksijen tüketimi oranlarına sahip permeabilize <strong&gt; Şekil 4. alt tabaka önleyicisi titrasyon protokolü sonunda hücreler başarılı bir şekilde geçirgen ve mitokondriyal kompleks aktivite eksogen substratların ilavesi mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri bir artış I, II ve IV maksimum solunum oranları (Durum 3) indüklediğini göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54985/54985fig4.jpg" /> Şekil 4: permeabilize HepG2 hücrelerinin maksimal ADP ile uyarılmış solunum (devlet 3) Başarılı ölçümü. Solunum hızı pmol / (sn X milyon hücre) olarak ifade edilir. Hücreler 8 mcM digitonin ve mitokondriyal solunum oranları ile permeabilize bir kompleks III inhibe antimycin, karmaşık I, süksinat (devlet 3, kompleks II) inhibe etmek glutamat ve malat (devlet 3, kompleks I) rotenone sonraki ilavesinden sonra ölçülür ve askorbat / TMPD ve sodyum azit kompleksi IV inhibe etmek. Kompleks IV solunum (Eyalet 3)önce ve sodyum azid ilave edildikten sonra oksijen tüketimi çıkarılarak yorumlanır. CI: kompleks I, CII: Karmaşık II, CIV: Karmaşık IV. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54985/54985fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Maksimal ADP ile uyarılmış Solunum başarısız Ölçüm permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Eyalet 3) Kompleks I, II ve IV-bağımlı maksimal ADP ile uyarılan solunum permeabilize HepG2 hücreleri (1 x 10 6 hücre / ml) (Durum 3) başarılı bir şekilde aşırı eksojen alt-tabakaların (Şekil 5) ile ölçülmez. Bu deney için, hücreler, Şekil 5&#39;te tarif edildiği gibi alt tabakaların ve inhibitörlerin daha sonra ilave edildikten sonra ölçülür Digitonin ve mitokondriyal oksijen tüketimi oranlarına sahip permeabilize edilmiştir. Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, </sTrong&gt;, solunum oranları, Şekil 4&#39;te gösterilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında permeabilize hücrelerin içinde oldukça düşüktür. azaltılmış solunum seviyeleri için olası bir açıklama, önceki deneylerden mitokondriyal inhibitörleri ile Oksigraf odaları kirliliğidir. Böyle antimycin ve rotenone olarak Mitokondriyal inhibitörleri etanol içinde çözünür ve Oksigraf odaları ve stoper sopa olabilir. Bu nedenle Oksigraf odaları ve tapalar her deneyden sonra yoğun yıkanmalıdır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54985/54985fig5.jpg" /> Şekil 5: permeabilize HepG2 hücrelerinin maksimal ADP ile uyarılmış solunum (devlet 3) ve Başarısız ölçümü. Karmaşık I- başarısız bir denemenin Temsilcisi solunum izleri, II- ve yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak permeabilize HepG2 hücreleri maksimal ADP ile uyarılmış solunum (devlet 3) IV-güdümlü. Solunum hızı olarak ifade edilirpmol / (sn x milyon hücre). Hücreler 8 mcM digitonin ve mitokondriyal solunum oranları ile permeabilize bir kompleks III inhibe antimycin, karmaşık I, süksinat (devlet 3, kompleks II) inhibe etmek glutamat ve malat (devlet 3, kompleks I) rotenone sonraki ilavesinden sonra ölçülür ve askorbat / TMPD ve sodyum azit kompleksi IV inhibe etmek. Kompleks IV solunum (Devlet 3) öncesi ve sodyum azid ilave edildikten sonra oksijen tüketimini çıkarılarak yorumlanır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54985/54985fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bozulmamış Hücre bağlı olan ve bağlanmamış solunum HepG2 hücreleri bazal oksijen tüketim oligomycin (oligomycin hassas olmayan solunum) ve FCCP sırayla ilave (Şekil 6) mevcudiyetinde ölçülmüştür. Basal hücresel solunum hızı endojen hücresel alt tabakaların varlığı bozulmamış HepG2 hücrelerinin oksijen tüketimini temsil eder ve hücresel ATP talebine yanıt olarak değiştirebilir. Oligomycin duyarsız solunum hızı hücresel ATP ciro temsil eder ve bazal endojen solunum hızından oligomycin duyarsız solunum hızını çıkarılmasıyla hesaplanır hücresel solunum ve oligomycin duyarlı solunum hızını sızıntı temsil eder. FCCP uncoupler kimyasal ardışık kayıt farklı konsantrasyonlarda ve maksimal bağlanmamış solunum ilave edilir. Bu deneysel koşul için maksimal mitokondriyal bağlanmamış solunum hızı (maksimum elektron taşıma sistemi kapasitesi) 0,9-1,2 iM FCCP elde edilir. Sonuçlar sağlam HepG2 hücrelerinde FCCP bifazik bir aktivite gösterir. Bu nedenle, her bir deney koşulu için, FCCP maksimal bağlanmamış solunum hızı elde etmek için titre edilir. Kuplajsız Solunum kontrol oranı (uRCR) FCCP bölünmesiyle hesaplanıroligomycin varlığında solunum hızı ile Kuplajsız solunum hızı. Oligomycin duyarlı solunum (ATP ciro) oligomycin duyarsız bazal endojen solunum gelen solunum oranı çıkarılarak hesaplanır. Bazal solunum oranı ile oligomycin duyarlı solunum oranı bölünmesiyle hesaplanır ATP sentezlemek için kullanılan mitokondriyal oksijen tüketim oranını temsil etkinliğini bağlanması. Deney sonunda, olmayan mitokondriyal solunum hızını elde etmek için, mitokondriyal elektron taşıma zinciri inhibitörleri ilave edilir ve non-mitokondrial solunum hızı tüm sonuçlar çıkarılır. Şekil 6&#39;da gösterilen deney için, olmayan mitokondriyal solunum hızı 26 pmol / (sn x Milyon hücre), bazal solunum hızı 48 pmol / (sn x milyon hücre) olduğunu, oligomycin duyarsız solunum hızı 7 pmol / (sn x milyon hücre), oligomycin duyarlı solunum (ATP ciro) 41 pmol / (sn x milyon hücre) ve coupling verimi 0.85. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54985/54985fig6.jpg" /> Şekil 6: Birleştirilmiş ve sağlam hücrelerin Kuplajsız solunum. HepG2 hücreleri bazal oksijen tüketimi Örnek solunum izleri oligomycin (oligomycin hassas olmayan solunum) ve yüksek çözünürlüklü Solunum kullanılarak FCCP sırayla ilave mevcudiyetinde ölçülmüştür. istikrarlı bir sinyal ulaşıldığında Bundan sonra, solunum tüm sonuçlar çıkarılır rotenone ve antimisin eklenmesi ve kalan arka plan solunum (non-mitokondrial solunum) ile inhibe edilir. Oksijen tüketimi pmol / (hücre sn x sayısı) olarak ifade edilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54985/54985fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Solunum tamponu 13 </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> konsantrasyon </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 mM </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 3.0 mM </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 80 mM </td></tr><tr><td> K-laktobionat </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> boğa </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.0 g / l </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.1 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: solunum tampon bileşimi.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells at JoVE.com

Geçirgen ve Sağlam Hücrelerde Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri | Biyoloji | Video

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri &#39;(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

high-resolution-respirometry-to-assess-mitochondrial-function

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Cellular Processes

Cellular Respiration

SCIENTISTS IN ACTION

41.2K Görüntüleme.  University of Bern.  Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir. 

Video: High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.
Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function18. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust14. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis9. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.
Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay7, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process 4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.
A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal6. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.
The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity8,15,16,17.
In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE8 in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO2, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Mitochondrial fusion was measured by tracking the equilibration of photoconverted matrix-targeted GFP across the mitochondrial network over time. Thus far, only one cell could be subjected to an hour long kinetic analysis at a time. We present a method that simultaneously measures multiple cells, thereby speeding up the data collection process.

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Biyoloji

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurtalıklar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or enzymes are involved in the pathogenesis of several diseases. Mitochondrial substrate flux can be studied using intact cells, permeabilized cells, or isolated mitochondria. Investigating intact cells encounters several problems due to simultaneous oxidation of different substrates. Besides, several cell types contain internal stores of different substrates that complicate results interpretation. Methods such as mitochondrial isolation or using permeabilizing agents are not easily reproducible. Isolating pure mitochondria with intact membranes in sufficient amounts from small samples is problematic. Using non-selective permeabilizers causes various degrees of unavoidable mitochondrial membrane damage. Recombinant perfringolysin O (rPFO) was offered as a more appropriate permeabilizer, thanks to its ability to selectively permeabilize plasma membrane without affecting mitochondrial integrity. When used in combination with microplate respirometry, it allows testing the flux of several mitochondrial substrates with enough replicates within one experiment while using a minimal number of cells. In this work, the protocol describes a method to compare mitochondrial substrate flux of two different cellular phenotypes or genotypes and can be customized to test various mitochondrial substrates or inhibitors.

In this work, we describe a modified protocol to test mitochondrial respiratory substrate flux using recombinant perfringolysin O in combination with microplate-based respirometry. With this protocol, we show how metformin affects mitochondrial respiration of two different tumor cell lines.

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...