This work was partly supported by NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759, and Byars-Tarnay Endowment. We gratefully acknowledge use of the West Virginia University Shared Research Facilities which are supported, in part, by NSF EPS-1003907.

Bir EBL Kalıp PDMS Kalıpları 1. çoğaltma <ol><li> 29 Silikon kalıp fabricate <ol><li> Spin kat 200 ul polimetil metakrilat (PMMA), 1 dakika boyunca 2500 rpm&#39;de 1 x 1 cm, silikon (Si) alt tabaka üzerinde çözelti ince bir film meydana getirmek üzere. </li><li> 2 dakika boyunca 180 ° C&#39;de Si alt-tabaka üzerinde PMMA filmi fırında. </li><li> 300 MCU / cm2 bir alan dozunda odaklanmış bir elektron ışını ile PMMA film tasarlanmıştır nanopattern yaz. </li><li> 80 saniye geliştirici PMMA nanopattern geliştirin. </li><li> 10 kV, 0.5 mA emisyon akımı ve 0.5 a / sn&#39;lik bir depozisyon oranının bir çıkış voltajı bir E-ışın demeti buharlaştırıcı kullanılarak kalınlığı 50 nm bir nikel tabaka ile PMMA nanopattern bırakın. </li><li> 20 dakika boyunca, 80 ° C&#39;de 20 mi çıkarıcı PMMA parçası kaldırın. </li><li> Reaktif iyon aşındırma (RIE) Si substrat içine nanopattern istenen derinlik Si kalıp almak için. NOT: tetraklorohidreks Gaz karışımıafluoromethane (KF 4), 150 W, 400 W ve RIE bir güç indüktif olarak birleştirilmiş plasma (ICP) güçte / oksijen (O2) (% 90 /% 10), 560 nm&#39;lik bir derinliğe kadar Si alt-tabakanın etch için kullanılır. </li></ol></li><li> Silanize Si kalıp <ol><li> 100 mm PS Petri kabı bir cam lamel Si kalıp koyun ve bir çeker ocak içinde bulunan cam bir kurutucuda aktarın. </li><li> lamel 10 ul 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane bırakın. Dikkat: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane cilt korozyon ve ciddi göz hasarına neden olabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li><li> Kısmen Petri kabı örtün. </li><li> Si kalıp silanizasyondan tamamlamak için bir duman başlığı içinde, 5 saat boyunca vakum altında desikatörde tutun. </li></ol></li><li> PDMS ön-polimerin hazırlanması <ol><li> tek kullanımlık bir tartım kabı 10 gr PDMS reçine ve 1.05 g sertleştirme ajanı tartılır. </li><li> Bir plastik kaşık kullanarak iyice PDMS prepolimeri karıştırın. </li><li> daha berrak bir karışım görülmektedir kadar yaklaşık 20 dakika boyunca vakum altında plastik bir desikatör içinde PDMS prepolimer gaz çıkışına. </li></ol></li><li> PDMS kalıpları çoğaltmak <ol><li> 60 mm Petri kabındaki Silanlanmış Si kalıp koyun. </li><li> Petri kabındaki Si kalıp üzerine PDMS prepolimeri dökün. </li><li> tüm kabarcıklar kaybolur dek yaklaşık 10 dakika süreyle bir plastik desikatörde ve gazını Petri kabı yerleştirin. </li><li> Bir ocak petri aktarın ve 4 saat 70 ° C&#39;de PDMS prepolimeri tedavi. </li><li> dikkatle cımbız kullanarak Si kalıp PDMS kalıp soyulabilir. Not: PDMS kalıplar bir haftaya kadar çevre şartlarında muhafaza edilebilir. Kür sonra, PDMS kalıplar 30 bazı çapraz bağlanmamış PDMS reçine molekülleri ve artık sertleştirme ajanı vardır. düşük molekül ağırlıklı moleküller yavaş yavaş nüfuz ve zaman içinde yüzeyde birikebilir. Bu PDMS yüzeyi 31 topografik ve mekanik özelliklerini etkiler. difFüzyon bir hafta içinde çok önemli değildir. </li></ol></li></ol> Büyük Bir, Tek Kalıp içine PDMS Kalıpları 2. Dikiş <ol><li> Adım 1.4 tekrarlayarak birden PDMS kalıplar hazırlayın. NOT: PDMS karışımın aynı miktarda aynı kalınlıkta PDMS kalıpları elde etmek için her zaman tartın. </li><li> Böyle bir optik mikroskop altında nanogratings olarak anizotropik PDMS nanopatterns yönünü belirlemek ve bir marker kalem ile PDMS kalıp ters işaretleyin. NOT: Bu nanopillars izotrop nanotopography yönünü işaretlemek için gerekli değildir. </li><li> Davlumbaz etanol ile Si substratı temizlemek ve basınçlı hava ile kurutun. </li><li> Bir bıçak ile her PDMS kalıp desensiz alanları keserek. NOT: dikişli kalıp çevresine alınacaktır PDMS kalıplar için, başkaları ile temas halinde sadece desensiz alanlar kapalı kesilmiş olmalıdır. </li><li> üzerinde nanopattern yüzü aşağı ile kesilmiş PDMS kalıp yerleştirinAyna Si substrat yan ve daha sonra yakın ama çevredeki kalıp (ler) temas etmeyen diğer kalıpları hizalayın. </li><li> PDMS yapışkan tabakanın hazırlanması <ol><li> 0.5 mm kalınlıkta bir tabaka oluşturmak için temiz bir cam slayt (2.5 cm x 7.5 cm), 1 g PDMS prepolimer (1.05: 10: PDMS reçine ve sertleştirici oranı) karışımının gazı alınır Dökme. </li><li> 3-5 dakika boyunca bir sıcak plaka üzerinde 100 ° C&#39;de PDMS tabakanın fırında. katmanı dokunun ve katman kısmen değil tamamen tedavi olduğundan emin olmak için bir iğne kullanın. NOT: Kısmen tedavi PDMS sertleşmemiş PDMS prepolimer gibi akamaz, ancak tedavi PDMS ile karşılaştırıldığında yapışkan. </li></ol></li><li> hizalanmış PDMS kalıp ters PDMS katmanı yerleştirin ve hızlı bir şekilde bu derleme ters ve ocak transfer. </li><li> PDMS yapışkan tabaka ve PDMS kalıpların ters arasında iyi bir temas sağlamak, ve 1 saat 100 ° C&#39;de PDMS yapışkan tabakanın tedavi tertibatının üst kısmında bir metal bloğu kullanarak sıkıştırma kuvveti (5 kPa) uygulanır. &lt;br /&gt; Not: dikkatlice montaj eğimini önlemek için, metal bloğun konumunu ayarlamak. </li><li> Metal bloğunu çıkarın ve Si alt tabakadan tek dikişli PDMS kalıp soyulabilir. </li></ol> PS Yüzeyler üzerinde master Kalıp 3. Nesil Not: cam slayt üzerinde immobilize dikişli PDMS kalıp PS plaka ya da çalışma nano substratlar üretilebilir olan PS ince film, bir ana kalıp oluşturmak için de kullanılabilir. <ol><li> PS plaka üzerinde bir ana kalıp oluşturmak <ol><li> PS tabak hazırlayın <ol><li> İki gün süre ile, 80 ° C&#39;de vakumlu bir fırında PS pelet kurutulur. </li><li> 230 ° C&#39;de, bir pres makinesi önceden ısıtın. </li><li> alttan üste doğru sırayla bir alüminyum plaka, bir politetrafloroetilen (PTFE) levha ve alüminyum ayırıcı birleştirin. </li><li> 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0.3 cm (H) bir kare açılışı ile alüminyum ayırıcı yük 3.5 g PS pelet. NOT: boşluk yaklaşık 0&#39;dır.1 PDMS kalıp daha kalın cm ve bu yüzden son nano PS alt-tabaka, yaklaşık 0.1 cm kalınlığındadır. </li><li> Alüminyum ayırıcı başka PTFE levha ve sonra başka bir alüminyum plaka koyun. </li><li> pres makinesinde aksamını yerleştirin. </li><li> 30 dakika boyunca 230 ° C &#39;de PS pelet ısıtın. </li><li> 5 dakika montaj üzerinde bir sıkıştırma basıncı (0,1 Mpa) uygulayın. </li><li> basıncı bırakın ve daha sonra montaj 0.5 MPa basınç basınç yeniden uygulayın. </li><li> 1.5 MPa istenen basınç kadar 0.5 MPa&#39;lık bir basınç artışı ile tekrarlayın Adım 3.1.1.9 ulaşılır. </li><li> pres makinesinin ısıtıcı kapatın ve 1.5 MPa&#39;lık bir sabit basınçta 70 ° C&#39;nin altında soğumasını. </li><li> takımını çıkarın ve PS levha yeniden nem girmesini önlemek için 80 ° C&#39;de vakumlu bir fırında PS plaka saklayın. </li></ol></li><li> PS levha haline Nanoimprint dikişli PDMS kalıp <ol><li> bir alüminyum aralama PS plaka koyun3-inç Si gofret ayarlanır. Not: ara parçasının iç boyutları PS levha ile aynıdır, böylece PS levha doğru aralama uyar. </li><li> 30 dakika boyunca 250 ° C&#39;de bir sıcak plaka üzerinde PS levha ısıtın. </li><li> Erimiş PS plaka üzerinde nanopatterns yüzü aşağı dikişli PDMS kalıp koyun. Not: PDMS kalıp bir tarafı birinci PS levha yüzeyi ile temas halinde yerleştirilir ve başka bir yan arayüzü, hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için PS yüzey ile temas halinde yavaş yavaş indirilir. Dikkat: ocak yüzeyi sıcak. nanoimprinting işlemi sırasında thermogloves kullanın. </li><li> dikişli PDMS kalıp cam slayt bir alüminyum plaka koyun. </li><li> Alüminyum levha metal bloklar kullanılarak bir sıkıştırma basıncı (12.5 kPa) uygulayın ve 3 dakika boyunca bekleyin. NOT: alüminyum levha eğik olmadığından emin olun. </li><li> Kaldırın ve alüminyum plaka metal bloğunu değiştirin ve ben25 kPa basınç basınç arttırın. </li><li> basınçla Adımı tekrarlayın 3.1.2.6 kPa 50 arttı. Not: Bu adım PDMS kalıp ve PS levha arasında sıkışan havayı kaldırmaktır. </li><li> 15 dakika boyunca 50 kPa tutarlı basınç altında 240 ile 250 ° C arasında sıcak plaka sıcaklığı muhafaza edin. </li><li> ocak gözünü kapatın ve tüm kurulum soğumasını. NOT: Bir fan soğutma sürecini hızlandırmak için kullanılabilir. </li><li> PS levha dikişli PDMS kalıp kalkmasına dikkatle sıcaklığı 50 ° C&#39;nin altında sonra metal blokları kaldırmak ve. NOT: PS alt-tabaka ters nanopatterns sahiptir ve çalışma PDMS tabakaları üretmek için bir mastar kalıp olarak kullanılabilir. </li></ol></li></ol></li><li> PS ince film üzerinde bir ana kalıp oluşturmak <ol><li> PS ince film hazırlayın <ol><li> Bir çeker ocak içinde 10 mi toluen içinde 1 g PS çözülür. Dikkat: Toluen Cilt İrritatio neden olabilirn ve ciddi göz hasarı ve uzun süre veya tekrarlanan maruz kalmalar organlara zarar verebilir. Uygun PPE giyin. </li><li> 1 dakika için 2500 rpm&#39;de bir gofret 2-in spin-kaplama 1 mi PS solüsyon 1 mikron kalınlığında PS ince bir film meydana getirmek üzere. </li><li> 3 gün boyunca bir davlumbaz Si gofret PS filmi ayarlayarak film toluen buharlaşır. </li><li> gece boyunca 80 ° C&#39;de bir vakum fırın içinde PS ince film tavlanması. </li></ol></li><li> Nanoimprint PS ince film üzerinde PDMS kalıp <ol><li> bir ocak yer almaktadır PS ince film üzerinde nanotopography yüzü aşağı dikişli PDMS kalıp koyun. </li><li> PDMS kalıp cam tarafındaki metal blokları kullanarak PDMS kalıp 12 kPa basınç basınç uygulayın. </li><li> 180 ° C sıcak plaka sıcaklığı artırmak ve 15 dakika için muhafaza. Dikkat: Erimiş PS filmi yağlayıcı olarak işlev görebilir. kaymasını metal blokları önlemek için dikkat edin. </li><li> ocak gözünü kapatınve tüm kurulum soğumasını. NOT: Bir fan soğutma sürecini hızlandırmak için kullanılabilir. </li><li> PS filmden dikişli PDMS kalıp kalkmasına dikkatle sıcaklığı 50 ° C&#39;nin altına düştüğünde sonra metal blokları kaldırmak ve. NOT: nano PS filmi çalışma PDMS yüzeyler üretmek için bir ana kalıp olarak görev yapacak. </li></ol></li></ol></li></ol> Hücre Davranış 4. Nanotopographical modülasyonu Not: temsilci nanotopographies hücre yayma nanotopographical modülasyonu göstermek için İnsan epitel hücreleri kültür. <ol><li> Uygulamaya bağlı olarak Adım 3.1 veya 3.2 birinden oluşturulan master kalıp PDMS çalışma substratları Cast. </li><li> Içi boş bir çelik kemer zımbası kullanılarak, belirli bir çok-çukurlu plaka (örneğin, 24-çukurlu plaka) konfigürasyonunu uyacak diskler içine nano PDMS substratlar kesti. </li><li> o kuyuların içine PDMS diskleri yerleştirmek için cımbız kullanınFA çok-yuvalı plaka. </li><li> % 70 etanol ve UV ışınlarına maruz kalma, 30 dakika boyunca, her kullanarak PDMS substratlar sterilize edin. </li><li> 1x steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez PDMS substratlar yıkayın. </li><li> Kat, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücre dışı matris proteini (yani, 20 ug / ml fibronektin) PDMS alt-tabakalar. </li><li> 5 dakika boyunca PDMS alt tabakaları steril PBS ile üç kez, her durulama. </li><li> % 10 cenin sığır serumu ile Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde, insan akciğer kanseri hücre A549 askıya alma ve hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. </li><li> Bir gün için% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C &#39;de PDMS substratlar ve kültür bunları 2,000 hücre / cm2 bir tohumlama yoğunluğunda hücreler plaka. </li><li> PBS ile üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> 4 saat süreyle PBS içinde% 4 paraformaldehid ve% 2 gluteraldehit oluşan bir karışım içinde hücreleri saptamak ve bir CO2 kritik po kullanarak hücrelerin suyunuElektronik mikroskobik gözlem 29 tarama için int kurutma makinası. Dikkat: Paraformaldehyde ve glutaraldehit Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olabilir. Bir kimyasal kaput İşlet ve uygun KKE giyerler. </li></ol>

<ol>
	<li>Silva, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers.">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303 (5662), 1352-1355 (2004).</li><li>Yim, E. K. F., Pang, S. W., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Nanostructures+Inducing+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+into+Neuronal+Lineage.">Synthetic Nanostructures Inducing Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Neuronal Lineage.</a> Exp. Cell Res. 313 (9), 1820-1829 (2007).</li><li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder.">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6 (12), 997-1003 (2007).</li><li>Oh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Fate+Dictated+Solely+by+Altered+Nanotube+Dimension.">Stem Cell Fate Dictated Solely by Altered Nanotube Dimension.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (7), 2130-2135 (2009).</li><li>Brunetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+Sense+Nanoscale+Roughness+with+Nanometer+Sensitivity.">Neurons Sense Nanoscale Roughness with Nanometer Sensitivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (14), 6264-6269 (2010).</li><li>McMurray, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+Surfaces+for+the+Long-term+Maintenance+of+Mesenchymal+Stem+Cell+Phenotype+and+Multipotency.">Nanoscale Surfaces for the Long-term Maintenance of Mesenchymal Stem Cell Phenotype and Multipotency.</a> Nat. Mater. 10 (8), 637-644 (2011).</li><li>Yim, E. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells.">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).</li><li>Gerecht, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Actin+Disrupting+Agents+on+Contact+Guidance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">The Effect of Actin Disrupting Agents on Contact Guidance of Human Embryonic Stem Cells.</a> Biomaterials. 28 (28), 4068-4077 (2007).</li><li>Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+in+vitro+Capillary+Tube+Formation+by+Substrate+Nanotopography.">Enhancement of in vitro Capillary Tube Formation by Substrate Nanotopography.</a> Adv. Mater. 20 (1), 99-103 (2008).</li><li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning.">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 307 (4), 883-890 (2003).</li><li>Lee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+selective+neurons+on+nanoscale+ridge/groove+pattern+arrays.">Direct differentiation of human embryonic stem cells into selective neurons on nanoscale ridge/groove pattern arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4360-4366 (2010).</li><li>Moe, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+with+micro-+and+nano-topographies+enables+identification+of+the+optimal+topography+for+directing+the+differentiation+of+primary+murine+neural+progenitor+cells.">Microarray with micro- and nano-topographies enables identification of the optimal topography for directing the differentiation of primary murine neural progenitor cells.</a> Small. 8 (19), 3050-3061 (2012).</li><li>Dang, J. M., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+induction+of+aligned+mesenchymal+stem+cell+sheets+by+culture+on+thermally+responsive+electrospun+nanofibers.">Myogenic induction of aligned mesenchymal stem cell sheets by culture on thermally responsive electrospun nanofibers.</a> Adv. Mater. 19 (19), 2775-2779 (2007).</li><li>Dasgupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+co-reduction+approach+to+vary+size+of+silver+nanoparticle:+its+microbial+and+cellular+toxicology.">Thermal co-reduction approach to vary size of silver nanoparticle: its microbial and cellular toxicology.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 23 (5), 4149-4163 (2016).</li><li>Ranjan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-irradiation-assisted+hybrid+chemical+approach+for+titanium+dioxide+nanoparticle+synthesis:+microbial+and+cytotoxicological+evaluation.">Microwave-irradiation-assisted hybrid chemical approach for titanium dioxide nanoparticle synthesis: microbial and cytotoxicological evaluation.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 23 (12), 12287-12302 (2016).</li><li>Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lithography.">Natural lithography.</a> Appl. Phys. Lett. 41 (4), 377-379 (1982).</li><li>Dalby, M. J., Riehle, M. O., Johnstone, H., Affrossman, S., Curtis, A. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Reaction+of+Endothelial+Cells+to+Polymer+Demixed+Nanotopography.">In vitro Reaction of Endothelial Cells to Polymer Demixed Nanotopography.</a> Biomaterials. 23 (14), 2945-2954 (2002).</li><li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+nanofabrication:+molding,+printing,+and+other+techniques.">New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).</li><li>Yin, Y., Lu, Y., Gates, B., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Assisted+Self-Assembly:+A+Practical+Route+to+Complex+Aggregates+of+Monodispersed+Colloids+with+Well-Defined+Sizes,+Shapes,+and+Structures.">Template-Assisted Self-Assembly: A Practical Route to Complex Aggregates of Monodispersed Colloids with Well-Defined Sizes, Shapes, and Structures.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (36), 8718-8729 (2001).</li><li>Tada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Self-Assembly+of+Diblock+Copolymer+Thin+Films+on+Chemically-Patterned+Substrates+for+Defect-Free+Nano-Patterning.">Directed Self-Assembly of Diblock Copolymer Thin Films on Chemically-Patterned Substrates for Defect-Free Nano-Patterning.</a> Macromolecules. 41 (23), 9267-9276 (2008).</li><li>Cheng, J. Y., Rettner, C. T., Sanders, D. P., Kim, H. C., Hinsberg, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+self-assembly+on+sparse+chemical+patterns:+rectifying+and+multiplying+lithographic+patterns+using+block+copolymers.">Dense self-assembly on sparse chemical patterns: rectifying and multiplying lithographic patterns using block copolymers.</a> Adv. Mater. 20 (16), 3155-3158 (2008).</li><li>Colburn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+and+flash+imprint+lithography:+a+new+approach+to+high-resolution+patterning.">Step and flash imprint lithography: a new approach to high-resolution patterning.</a> Proc. SPIE. 3676 ((Pt. 1, Emerging Lithographic Technologies III)), 379-389 (1999).</li><li>Ahn, S. H., Guo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+roll-to-roll+nanoimprint+lithography+on+flexible+plastic+substrates.">High-speed roll-to-roll nanoimprint lithography on flexible plastic substrates.</a> Adv. Mater. 20 (11), 2044-2049 (2008).</li><li>Vieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+beam+lithography:+resolution+limits+and+applications.">Electron beam lithography: resolution limits and applications.</a> Appl. Surf. Sci. 164, 111-117 (2000).</li><li>Nagase, T., Gamo, K., Kubota, T., Mashiko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+fabrication+of+nano-gap+electrodes+by+focused+ion+beam+etching.">Direct fabrication of nano-gap electrodes by focused ion beam etching.</a> Thin Solid Films. 499 (1-2), 279-284 (2006).</li><li>Juodkazis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+lithography+of+nanorods+in+SU-8+photoresist.">Two-photon lithography of nanorods in SU-8 photoresist.</a> Nanotechnology. 16 (6), 846 (2005).</li><li>Yang, Y., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surfacing+for+regenerative+medicine.">Nanoscale surfacing for regenerative medicine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2 (5), 478-495 (2010).</li><li>Yang, Y., Kulangara, K., Sia, J., Wang, L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+Microfluidic+Cell+Culture+Platform+Embedded+with+Nanoscale+Features.">Engineering of a Microfluidic Cell Culture Platform Embedded with Nanoscale Features.</a> Lab Chip. 11 (9), 1638-1646 (2011).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotopographical+modulation+of+cell+function+through+nuclear+deformation.">Nanotopographical modulation of cell function through nuclear deformation.</a> Acs Appl. Mater. Inter. 8 (8), 5082-5092 (2016).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Yang, Y., Kulangara, K., Lam, R. T. S., Dharmawan, R., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Topographical+and+Mechanical+Property+Alterations+Induced+by+Oxygen+Plasma+Modification+on+Stem+Cell+Behavior.">Effects of Topographical and Mechanical Property Alterations Induced by Oxygen Plasma Modification on Stem Cell Behavior.</a> ACS Nano. 6 (10), 8591-8598 (2012).</li><li>Hua, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Imprint+Lithography+with+Molecular-Scale+Resolution.">Polymer Imprint Lithography with Molecular-Scale Resolution.</a> Nano Lett. 4 (12), 2467-2471 (2004).</li><li>Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+molded+polydimethylsiloxane+microstructures.">Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures.</a> Adv. Mater. 9 (9), 741-746 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz nano substratın geniş bir alana oluşturmak için basit, uygun fiyatlı, çok yönlü yöntem mevcut. sadakatle yüksek tanımlı nanopatterns genişletmek için, büyük ilgi birçok kritik adımlar dikkat edilmelidir. İlki birden PDMS kalıp Döşeme etmektir. PDMS kalıp desensiz alanlar kaldırılması gerekir. Ayrıca, kalıp yan duvarları kalıplar arasındaki boşlukları en aza indirmek için mümkün olduğunca dikey olarak mükemmel kesilmelidir. Toplu olarak, son dikiş kalıp içinde desensiz alanlarında kısmı azaltılabilir. İkinci olarak, bu PDMS kalıpların nano yüzeyi silikon substrat üzerinde herhangi bir bozulma olmadan uyumlu hale getirilmesi gerekmektedir. PDMS nano deforme eğilimli olduğundan, (PDMS kalıp ve silisyum yüzeyi arasında havanın tutulup kalması hem kaçının) yumuşak ve düzgün bir şekilde, silikon alt-tabaka bir ayna tarafına doğru nano yüzeyleri yerleştirmek önemlidir. PDMS kalıplar, ancak nei dokunmadan değil mümkün olduğunca yakın olarak aynı hizada olacakkalıpları ghboring da son dikiş kalıp desensiz kısmının en aza indirmek için. Aksi takdirde, dokundu nanoyapılar nanoimprinting sırasında deforme olacaktır. Üçüncüsü, PDMS kalıp kalınlığı partiden diğer partiye göre değişebilir ve böylece mükemmel PDMS döküm önce küçük Si kalıp tesviye her kalıp üniforma kalınlığı hale getirmenin yanı sıra kalınlık üniforma yapmak için kritik öneme sahiptir. PDMS kalıp boyunca kalınlığında değişiklik bir cam lam üzerine döküldüğünde tabaka PDMS ön-polimer (yapışkan) tabakanın kalınlığına ayarlanması ile telafi edilebilir olsa da, kalın bir ön-polimer tabakası sorunlu olabilir. ön-polimer kapiler kuvveti ile desenli yüzeye PDMS kalıplar arasındaki açıklıklara çekilir, ve sonuç olarak nanopatterns hasar olabilir. kalınlık değişimi EBL kalıptan döküm sırasında PDMS karışımın aynı miktarda hazırlanması ile en aza indirilebilir. Bunun bir sonucu olarak, bir ince PDMS ön-polimer tabakası kullanılabilir. Seçenek olarak ise, kısmen prepolyme sertleştirmeR tabakası viskozitesini artırmak ve böylece zam azaltılması ve sonunda nano yüzeylerin bir zararı ortadan kaldırır. dikiş tekniği PDMS elastomerik doğası ile sınırlıdır. Yumuşak litografi ilke olarak, daha az 0.5 nm 18 çözünürlüğe ulaşabilir küçük, 32 nm 2 olarak ve özellik boyutları çoğaltmak için uygulanan olmasına rağmen genişliğine yüksekliğinin en-boy oranı çok olduğunda, nano ölçekli PDMS özellikleri kusursuz taklit edilemeyen yüksek (&gt; 2) ya da (0.2 &lt;) çok düşük. Nanofeatures boy oranı çok yüksek olduğu zaman daraltmak veya &lt;0,2 oranında PDMS damgası 33 kullanıldığı zaman yeterli rahatlama neden olabilir. Ayrıca, birden fazla PDMS kalıplar sorunsuz için açıklıkların ve PDMS kalıp eksik kırpılması dikişli olamaz ve bu nedenle (örneğin nanogratings gibi sürekli nanopatterns özellikle de) desensiz ve yanlış hizalanmış alanları vardır. Arızalı küçük bir yüzdesi göz önüne alındığındaalan, toplam yüzey alanı üzerinde, dikiş tekniği hala nano yüzeylerde geniş bir alana üretmek için basit ve uygun fiyatlı bir yol sağlar. Buna ek olarak, dikiş kalıp polimerin alt-tabaka içine nanoimprinted olduğunda, erimiş polimer düzgün olmayan bir yüzey (Şekil 1a) sonuçlanan aralığın içine akar olabilir. pürüzlü yüzey zorlu hücresel veya moleküler biyolojik analizler için numune toplamak için yapar. mikrokanallar desenli alt tabaka karşı mühürlü zaman mikroakışkan uygulamalarda, zam da eksik sızdırmazlık neden olur. Pürüzlü yüzey problemi kolaylıkla film kalınlığı ayarlama ile zam en aza indirmek için polimer ince film tekniği uygulanarak çözülebilir (Şekil 1b). dikiş tekniği genişlemesi için tanımlanmış bir ana kalıp ihtiyacı olsa da, bu tür adım ve flaş litografi ve bir roll-to-roll nanoimprinting lithogra gibi diğer tekniklerle karşılaştırıldığında basit ve uygun fiyatlıphy. dikiş tekniği sıcak tabak ve dikiş ve nanoimprinting sürecinde basınç kuvvetleri uygulayan bir yolu, ama pahalı değil ekipman gerektirmektedir. Ayrıca, dikiş işlemi ancak zorunlu bir temiz oda, temiz bir ortamda gerçekleştirilebilir. dikiş tekniği de çok yönlüdür. geniş bir alana aynı nanopattern genişletme ek olarak, dikiş tekniği, çeşitli şekiller, boyutlar ve düzenlemelerin mikro- ve / veya nano ölçekli özellikleri oluşan kalıplar için de uygulanabilir. Bu bağlamda için mikro / nanotopographies bir kombinatoriyel kütüphane hücre topografya etkileşimlerini araştırmak için yüksek verimli bir platform sağlamak için inşa edilebilir. Bu basit, hesaplı ve çok yönlü dikiş tekniği potansiyel melez bileşenleri ile mikro / nano cihazlar oluşturmak için uzatılabilir.

A number of recent findings reveal that substrate nanotopography has pronounced influence on cell behavior, from cell adhesion, spreading and migration, to proliferation and differentiation1-6. For instance, a smaller cell size and lower proliferation rate have been observed in cells cultured on deep nanogratings, even leading to apoptosis although the cell alignment, elongation and migration were enhanced, compared with the flat controls2,7-10. Moreover, nanotopography has been shown to facilitate the differentiation of stem cells into certain lineages such as neuron2,11,12, muscle13, and bone3,4. In addition, because of increasing concerns on the toxicity of engineered nanomaterials14,15, there is a need to incorporate nanotopography into physiologically relevant in vitro models for accurate risk assessment of nanomaterials. To fulfil the biochemical and molecular biology analyses, enough cells are needed to be grown on a large area of nanopatterned substrate. However, conventional nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area.
Self-assembly including colloid lithography16 and polymer demixing17 can readily generate large-area nanostructures at low costs. Because self-assembly relies on interactions between the assembling elements such as colloidal particles and macromolecules, and possible interactions between these elements and substrate, it cannot be a stand-alone method of producing nanostructures with precise spatial positioning and arbitrary shapes18. The accompanied high density of defects is also a drawback. Precise spatial control of nanopatterns can be achieved by employing templated self-assembly, which uses top-down lithographic approaches to provide the topographical and/or chemical template to guide the bottom-up assembly of the assembling elements19-21. Alternative nanofabrication techniques such as step-and-flash lithography22 and a roll-to-roll nanoimprinting lithography23 have been developed but have limited use because of their sophisticated process or the requirement of specialized equipment. Nevertheless, a template or a master mold with defined nanoscale patterns is needed for templated or alternative nanofabrication techniques. 
Such templates and master molds are conventionally generated by using focused electron, ion, or photon beam lithography. For instance, electron beam lithography (EBL)24 and focused ion beam lithography25 can generate defined patterns with a sub-5 nm resolution. Two-photon lithography has demonstrated a feature size as small as 30 nm26. Although the focused beam lithography techniques enable generation of well-defined nanoscale structures, the capital investment and the time-consuming, costly process restrict their widespread use in academic research27. Therefore, it is highly desirable to develop enabling yet affordable techniques to produce a large area of nanopatterned surfaces with high fidelity.
We have reported a simple, cost-effective stitch technique for generating a large area of nanopatterned surface from a small well-defined mold28. This protocol provides step-by-step procedure from replication of poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds using an EBL-written pattern, to assembly of multiple PDMS molds into a single large mold, to generation of a master mold on polymeric such as polystyrene (PS) substrates, to production of working substrates. With the expanded nanopatterned substrates, we demonstrated nanotopographical modulation of cell spreading.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>JEOL field emission SEM</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-7600F</td>
			<td>EBL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-beam evaporator</td>
			<td>Kurt J. Lesker</td>
			<td>Model: LAB 18 e-beam evaporator</td>
			<td>nickel deposition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trion Minilock III ICP/RIE</td>
			<td>Trion technology</td>
			<td>Model: Minilock-phantom III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press machine</td>
			<td>PHI Hydraulic Press</td>
			<td>Molde: SQ-230H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>Modle: WS-400A-6NPP-LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 critical dryer</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>Modle: Autosamdri-815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plates</td>
			<td>McMaster-carr</td>
			<td>9057K123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon sheets</td>
			<td>McMaster-carr</td>
			<td>8711K92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm petri dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable weighing boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-735-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-913-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic desiccator</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>F42025-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110049SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Ted Pella, inc.</td>
			<td>5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal blocks</td>
			<td>McMaster-carr</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch</td>
			<td>Brettuns Village Leather Craft Supplies</td>
			<td>Arch punch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(methyl methacrylate)</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>495 PMMA A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene</td>
			<td>Dow Chemical</td>
			<td>Styron 685D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>7142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>MIBK/IPA at 1: 3 ratio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remover</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td>Remover PG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T324-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microsopy Science</td>
			<td>15712-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G151-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expanding nanopatterned substrates using stitch technique for nanotopographical modulation of cell behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

<html> dikiş tekniği yüksek sadakat ile nano yüzeylerde geniş bir alanda üretebilir. Şekil 1a ve sırasıyla Si substrat PS plaka ve PS ince film dikişli PDMS kalıp aktarılan nanopatterns büyük alanı görüntülemek 1b. Orijinal EBL yazılı kalıbın (Şekil 1c) ve alt tabaka (Şekil 1d) çalışma nihai PDMS arasında karşılaştırma EBL yazılmış nanopatterns sadakatle çalışan alt tabakaya transfer edilebilir doğrulamaktadır. Çeşitli geometrisi ve boyutları Nanotopography hücre davranışını modüle edilmesi için kullanılabilir. A549, Şekil 2 de gösterildiği gibi, bir model hücreleri gibi bir adenocarcinomic bazal epitelyal hücre kuşağı, anizotropik nanogratings A549 hücreleri izotropik nanopillars görüntülemek kutuplu morfolojisi ile karşılaştırıldığında nanograting yönü boyunca hücrelerin uzayabilmesi. nt &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54840/54840fig1.jpg" /> Dikiş tekniği kullanılarak nano substratların geniş bir alanda 1. Üretimi Şekil. (A, b) sırasıyla, PS levha PS ince film transfer nanopatterns optik görüntüler. oklar dikişli PDMS kalıp çatlaklarda polimer zam göstermektedir. (C, d) EBL kalıp ve sırasıyla alt tabakayı çalışma nihai PDMS üzerinde nanopatterns SEM görüntüleri. Ölçek çubukları 1 mikron bulunmaktadır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54840/54840fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54840/54840fig2.jpg" /> Şekil 2. A549 hücrelerinin yayılmasını hücre ile modüle edilmiş Nanotopographical. </strong&gt; (A) çizgi genişliği 500 nm nanogratings, boşluk 500 nm ve yüksekliği 560 nm ve çap olarak 500 nm, (b) nanopillars, 450 nm kenardan kenara aralıkla ve yüksekliği 560 nm üzerinde büyümüş A549 hücreleri , sırasıyla. Ölçek çubukları 10 mikron bulunmaktadır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54840/54840fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior at JoVE.com

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

expanding-nanopatterned-substrates-using-stitch-technique-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.5K Görüntüleme.  West Virginia University. A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Video: Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Biyomühendislik

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Bir Yakın Kızılötesi Photoimmunotherapy Tekniği Karışık 3D Kültür seçici hücre Eliminasyon

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Keratinosit yayılması üzerine iki ve üç boyutlu değerlendirilmesi tip ı kollajen yüzeylerde

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Formulation and Acoustic Modulation of Optically Vaporized Perfluorocarbon Nanodroplets

Microbubbles are the most commonly used imaging contrast agent in ultrasound. However, due to their size, they are limited to vascular compartments. These microbubbles can be condensed or formulated as perfluorocarbon nanodroplets (PFCnDs) that are small enough to extravasate and then be triggered acoustically at the target site. These nanoparticles can be further enhanced by including an optical absorber such as near infrared organic dye or nanoparticles (e.g., copper sulfide nanoparticles or gold nanoparticles/nanorods). Optically tagged PFCnDs can be vaporized through laser irradiation in a process known as optical droplet vaporization (ODV). This process of activation enables the use of high boiling point perfluorocarbon cores, which cannot be vaporized acoustically under the maximum mechanical index threshold for diagnostic imaging. Higher boiling point cores result in droplets that will recondense after vaporization, resulting in "blinking" PFCnDs that briefly produce contrast after vaporization before condensing back into nanodroplet form. This process can be repeated to produce contrast on demand, allowing for the background free imaging, multiplexing, super-resolution, and contrast enhancement through both optical and acoustic modulation. This article will demonstrate how to synthesize optically-triggerable, lipid shell PFCnDs utilizing probe sonication, create polyacrylamide phantoms to characterize the nanodroplets, and acoustically modulate the PFCnDs after ODV to improve contrast.

Optically activated perfluorocarbon nanodroplets show promise in imaging applications outside of the vascular system. This article will demonstrate how to synthesize these particles, crosslink polyacrylamide phantoms, and modulate the droplets acoustically to enhance their signal.

Optik Olarak Buharlaştırılmış Perflorokarbon Nanodamlacıkların Formülasyonu ve Akustik Modülasyonu

Microbubbles are the most commonly used imaging contrast agent in ultrasound. However, due to their size, they are limited to vascular compartments. These ...