We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

<ol>
	<li>Irisawa, H., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+currents+in+mammalian+nodal+cells.">Pacemaker currents in mammalian nodal cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).</li><li>DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+mechanisms+in+cardiac+tissue.">Pacemaker mechanisms in cardiac tissue.</a> Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+regulation+of+the+heart+automaticity.">Genesis and regulation of the heart automaticity.</a> Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).</li><li>Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+keeps+us+ticking:+a+funny+current,+a+calcium+clock,+or+both.">What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).</li><li>Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+modulation+of+hyperpolarization-activated+HCN4+channels+by+protein+kinase+A+in+the+mouse+sinoatrial+node.">Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node.</a> J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).</li><li>Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myristoylated+peptides+potentiate+the+funny+current+(I(f))+in+sinoatrial+myocytes.">Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes.</a> Channels. 5 (2), 115-119 (2011).</li><li>Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+pacemaker+activity+of+sinoatrial+node+myocytes+contributes+to+the+age-dependent+decline+in+maximum+heart+rate.">Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate.</a> Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA-independent+activation+of+I(f)+by+cAMP+in+mouse+sinoatrial+myocytes.">PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes.</a> Channels. 7 (4), 318-321 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+sinoatrial+node+myocytes+from+adult+mice.">Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).</li><li>Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+delayed+rectifier+K++current+regulates+pacemaker+activity+in+adult+mouse+sinoatrial+node+cells.">A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+hyperpolarization-activated+current+(I(f))+in+isolated+mouse+sino-atrial+cells.">Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).</li><li>Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+properties+of+spontaneously+beating+pacemaker+cells+isolated+from+mouse+sinoatrial+node.">The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node.</a> J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).</li><li>Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+C-type+natriuretic+peptide+on+ionic+currents+in+mouse+sinoatrial+node:+a+role+for+the+NPR-C+receptor.">Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).</li><li>Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Heart+Rate+and+Sinoatrial+Node+Function+in+Mice+Lacking+the+cAMP+Regulator+Phosphoinositide+3-Kinase-\gamma\.">Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\.</a> Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).</li><li>Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+constitutive+phosphodiesterase+activity+in+mouse+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium.">Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium.</a> PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).</li><li>Groenke, S., Larson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+atrial-specific+knockout+of+sodium-calcium+exchange+eliminates+sinoatrial+node+pacemaker+activity.">Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity.</a> PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).</li><li>Torrente, A. G., Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Denyer, J. C., Brown, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+sino-atrial+node+cells:+isolation+and+electrophysiological+properties.">Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties.</a> J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).</li><li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butanedione+monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Borlak, J., Zwadlo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+ATPase+inhibitor+2,3-butanedione+monoxime+dictates+transcriptional+activation+of+ion+channels+and+Ca(2+)-handling+proteins.">The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins.</a> Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).</li></ol>

מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים עבור הבידוד וההתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial בדיל באופן מלא מעכברים בוגרים. פרוטוקול הבידוד באופן מהימן מייצר סאמס עכבר פעיל באופן ספונטני מתאים לניתוח אלקטרו מיידי או תרבות שלאחר מכן. פרוטוקולים דומים דווחו על ידי קבוצות רבות אחרות (למשל, לראות את הפניות 11,12,10,13-17). עם זאת, הפרוטוקול שלנו לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה משמר את המורפולוגיה האופיינית, פעילות ספונטנית, ואת תכונות אלקטרו של התא ומאפשר למסירת adenoviral של חלבונים 9. עבור שינוי ופתרון בעיות של הפרוטוקולים, כמה צעדים קריטיים יש לציין. הגורם הקריטי הראשון הוא השתנות משמעותית הרבה-אל-הרבה בפעילות האנזימים לעכל (שלב 1.4), אשר יכול באופן דרמטי לשנות את מספר ואיכות סאמס מבודדת בתוך prepar נתוןation. השתנות זה נכון במיוחד עבור אלסטט, אשר בדרך כלל דורש אופטימיזציה ספציפית-הרבה, שבו פעמי ריכוז חשיפה צריכות להיות תיחום במהלך כמה הכנות (לעתים קרובות נעשה במקביל) על מנת למקסם את המספר הסלולרי ובריאות. כמה פרוטוקולים עבור הבידוד של סאמס ממינים שונים להשתמש אנזימי collagenase ו פרוטאז יחידים, ולא תערובת אנזימי פרוטאז collagenase בפרוטוקול הנוכחי. עם זאת, שונה הרבה-אל-הרבה עבור כל אחד האנזימים האלה הוא גבוה למדי (בדומה לזה של אלסטט), דבר מחייב סיבובים חוזרים ונשנים של אופטימיזציית שיתוף. שילוב האנזים מספק יותר עקבי לאורך הרבה ומחייב ביצוע צעדים אופטימיזציה פחות. שנייה קריטית, unobvious, גורם לפתרון בידוד SAM היא שלמות של פיפטה דיסוציאציה זכוכית אש מלוטש (תרשים 1C). אם שפת פיפטה מכילה כל קצוות חדים, סדקים או ג שנצברפסולת ellular, הצעד טחינה דקה מכני יכול לגרום נזק לתאים, וכתוצאה מכך רעילות סידן. פיפטה דיסוציאציה האש מלוטשת צריכה להיות מוחלפת לפחות כל 2 חודשים של שימוש קבוע, או בכל עת כי תשואת התא או האיכות יורדת באופן ניכר במהלך הכנות כמה. העיתוי ואת הכח של הניתוק המכאני הוא שלב קריטי שלישי לפתרון פרוטוקול הבידוד. הטחינה הדקה דורשת איטי (כ 0.5-1 הרץ) אבל מערבולת חזקה למשך 5-10 דקות. שיעורים מהר וזמניים מופחתים גם יכולים לשמש, אולם חשוב כדי למנוע החדרת בועות או יצירת קצף הפתרון. כאשר דגימות צומת sinoatrial כבר ניתקו לחלוטין, הרצועות הנותרות הרקמות אמורות להופיע דקיקות בצבע לבן; צביעה הוורודה-ish עדין מציינת טחינת דקה שלמה. כאשר בדקו בהגדלה 200-400X, תאי מדגימות מוכנות בצורה אופטימלית יש קרום תא חלק, ואילו memb התאRanes ממדגם יתר מתעכל או יתר triturated יש מראה מכתשים וחד. בתאים בריאים, התכווצויות הם נצפו בעיקר עוויתות עדין כמו הקצוות של התאים. גלים של התכווצות הם סימן של תאים פגומים, אשר ניתן לצפות להתכווץ בחוזקה במשך זמן קצר, לפני למעלה דופק. פיפטה דיסוציאציה סדוק הוא הגורם השכיח ביותר של נזק לתאים כאלה. בדגימות שהיו תחת מעוכל או תת triturated, תאים נוכחים כמו גושים או אגרגטים במקום תאים בודדים, ומספרים משמעותיים להידבקות סאמס ניתן לראות את נתחי רקמה הנותרות. כל משתמש יצטרך בנפרד לייעל את הניתוק. למרות העיכול אנזימטי ושעות ניתוק מכאניות הן צריכים להיות מותאמים, מומלץ בתחילה כדי לשמור על זמן עיכול אנזימטי מתמיד תוך שינוי זמן דיסוציאציה. כוונון עדין נוסף מסתמך בעיקר על היכולת של המשתמש להכיר אppearance של חתיכות הרקמה הנותרת בסיום הטחינה דק - כאשר הוא החתיכות דלילות לבנבן בצבע, אז הטחינה הדקה צריכה להיפסק. אופטימיזציה היא גם צורך להתאים וריאציות צומת sinoatrial שמלוות הבדלי גיל, מין, או זן של עכברים. לדוגמא, דיסוציאציה של תאים מבעלי חיים מבוגרים 7 דורשת הפחתה בשני עיכול אנזימטי ושעות ניתוק מכאניות. כהנחיה כללית, הכנה אופיינית עכבר C57BL גבר בן 2-3 חודשים / 6 תשואות בערך 50-200 סאמס קיימא, מתוכם אולי 5-10 יכול להיות בהצלחה-הדק תיקון בפגישה של יום טוב, תלוי הניסויים . התשואה משמעותית (~ 30%) נמוכה יותר כאשר עכברי מבוגרים משמשים 7. ההצלחה של פרוטוקול התרבות גם מסתמכת על כמה שלבים עיקריים. בראש ובראשונה, את ההצלחה של תרבית תאים ראשונית דורש ניתוק באיכות גבוהה, כפי שפורט לעיל. מומלץ העל הכנת התא המבודדת בחריפות להיות מותאם לפני שתנסה לשמור על התאים בתרבית. גורם קריטי שני עבור תאים בתרבית טמון בבחירה של תאים עבור קלטות אלקטרו. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סאמס תרבותי שנבחר להקלטות צריך להפגין התכווצויות ספונטניות מייד עם כישלון של מדיום התרבות המכיל BDM. התפרצות איטית של התכווצויות ספונטניות על שטיפה-אאוט של BDM היא סימן של תאים בריאים. מערכת התרבות SAM יש מספר מגבלות, בעיקר בגודל קטן מאוד של העכבר SAN. בעוד השיטות הפגינו כאן לאפשר מספרים סלולריים מספיק מחקרי אלקטרו הדמיה, הכמות המוגבלת של רקמות מונעת ניתוחים ביוכימיים של בתרבית סאמס. מגבלה נוספת של הטכניקה היא כי סאמס חייב להיות מתורבת בנוכחות המעכבת ATPase השרירן ההפיך, BDM. זוהי דאגת פוטנציאל בגלל BDM יש השפעות תאיות אחרות, לרבותהלא ספציפית phosphatase פעילות, עיכוב של שעתוק לב גורמי 19, ועיכוב של תעלות נתרן, ערוצי סידן קולטנים ryanodine 20. עם זאת, הנתונים מראים כי יש BDM אפקטים מינימלי על תכונות מורפולוגיות אלקטרו של סאמס assayed כאן. ביישומים עתידיים, נראה סביר כי מהשיטות המתוארות כאן יכולות להיות מותאמות כדי להכין תרבויות SAM מיונקים גדול יותר. בשילוב עם העברת גני adenoviral, תרבויות כאלה עלולות לאפשר מניפולציות גנטיות של pacemaking במודלים של בעלי חיים גדולים. היכולת להציג חלבוני העניין מספקת גם עבור יישומים עתידיים שבו מקודד גנטי מולקולות כתב יכולות לשמש כדי לחקור מסלולי איתות תאיים סאמס.

מיוציטים קוצבים צומת sinoatrial של הלב (myocytes sinoatrial, &quot;סאמס&quot;) ליצור פוטנציאל פעולה ספונטני, אומנותי (APS) כי להפיץ דרך שריר הלב ליזום כל לב. ניסויים באמצעות סאמס מבודד בחריפויות ממינים רבים היו חיוניים לגיבוש מבהיר המנגנונים לתרום לדור של פעילות קוצבת. סאמס הוא מאוד cardiomyocytes מיוחד שונה באופן מהותי מן עמיתיהם שריר לב הפרוזדורים חדרית מבחינת מורפולוגיה, פונקציה, ביטוי חלבון. המאפיין העיקרי של נקודות גישה ספונטנית סאמס היא שלילת קוטביות ספונטנית במהלך דיאסטולה שמניע את פוטנציאל הממברנה אל סף כדי לעורר את הבא AP 1,2. זה &quot;פוטנציאל קוצב לב&quot; תלוי בפעילות המתואמת של זרמי קרום שונים כולל &quot;הנוכחי המצחיק&quot; (אני F), T-וזרמי סידן L-סוג, ואת curr מחליף נתרן-סידןאף אוזן גרון (אני NCX), אשר מונע על ידי שחרור 2 + Ca מן הרטיקולום sarcoplasmic 3,4. בעוד סאמס העכבר מבודדים בחריפות מהווים הכנה ניסיוני חיוני לחקר pacemaking, בידודה של סאמס מעכברים יכולה להיות שיטה מאתגר לאמץ בגלל האנטומיה ברור וגודל קטן של SAN העכבר דורש microdissection ניואנסים ואת האנזימטית בשילוב מכני דיסוציאציה של תאים דורש אופטימיזציה זהיר. אנו מספקים כאן הפגנת וידאו מפורטת של פרוטוקול נוצל בהצלחה לבודדת סאמס מעכברים בוגרים עבור צמד תיקון הקלטות 5-8. למיטב ידיעתנו, אין הפגנה ויזואלית כגון זמינה מכל מקור אחר. בנוסף, שיטה חדשה מודגמת שבודד סאמס מעכברים בוגרים יכול להישמר במבחנה במשך מספר ימים, ובכך לאפשר הכניסה של חלבונים, מקודד גנטימולקולות כתב או RNAi באמצעות זיהום adenoviral 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="649">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Sylgruard/Elastomer Kit</td>
			<td style="width:167px;">Dow Corning</td>
			<td colspan="2" style="width:237px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Borosilicate 9&#34; pasteur pipettes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Small, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Large, round bottomed culture tubes</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Elastase</td>
			<td style="width:167px;">Worthington Biochemical</td>
			<td style="width:175px;">LS002279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Liberase TM</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:175px;">5401119001</td>
			<td>&#160;Tissue dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Heparin</td>
			<td style="width:167px;">SAGENT Pharmaceuticals&#160;</td>
			<td style="width:175px;">NDC 25021-400-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Mouse Laminin</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:175px;">CB-354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">12 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:175px;">12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">24-well culture plate</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-mCherry</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Ad-eGFP</td>
			<td style="width:167px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:175px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">Plastic, disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Micro scissors</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:167px;">Roboz Instruments</td>
			<td style="width:175px;">RS-8164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">WPI, Inc.</td>
			<td style="width:175px;">501264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Dissecting Pins</td>
			<td style="width:167px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:175px;">26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0350500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-glutamate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K-aspartate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">creatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Amphotericin-B</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1397-89-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Isoproterenol</td>
			<td style="width:167px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:175px;">420355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Media199</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:247px;">2,3-butanedione monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">SH30071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">A5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Selenium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:175px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td style="width:175px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice

מיוציטים צומת Sinoatrial (Sams) לשמש כמנהל הקוצבים הטבעיים של הלב, לביצוע כל לב הכה על ידי יצירת פוטנציאל פעולה ספונטני (APS). נקודות גישה הקוצבות אלה משקפים את הפעילות המתואמת של זרמי קרום רבים ורכיבה על אופני סידן תוך תאים. עם זאת המנגנון המדויק אשר מוביל פעילות קוצב ספונטנית סאמס להישאר חמקמק. סאמס מבודדים בחריפות מהווים הכנה הכרחית ניסויים כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של pacemaking הלב. עם זאת, לא בוררת את האנטומיה, microdissection המורכב, ותנאי עיכול אנזימטי בררנים מנעו שימוש נרחב של סאמס בחריפות המבודדת. בנוסף, שיטות לא היו זמינות עד לאחרונה להתיר תרבות לטווח הארוך של סאמס ללימודי ביטוי חלבון. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול ווידאו הפגנה למען בידודה של סאמס מעכברים בוגרים. שיטה מודגמת גם לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה עבור expressiעל חלבונים אקסוגניים באמצעות זיהום adenoviral. בחריפות מבודדים סאמס תרבותי מוכן באמצעות שיטות אלה מתאימים מגוון רחב של מחקרים אלקטרו הדמיה.

הפרוטוקולים המתוארים כאן הועסקו בעבר לבודד ספונטני פעיל סאמס מעכברי בוגרים מתאימים מגוון רחב של מחקרי מהדק תיקון שונה 5-8. בנוסף, הפרוטוקולים מאפשרים סאמס מבודדים שאפשר לקיים בתרבות עד שבוע אחד. החדרת גנים לתוך תאים בתרבית יכול להתבצע באמצעות זיהום adenoviral 9. התוצאות המוצגות בסעיף זה נובעים מהעבודות הקודמות שלנו מוצגות כאן כדוגמות המאפיינים של בחריפות סאמס מבודד תרבותי. כפי שניתן לראות בתרשים 2, ספונטני פעיל סאמס יכול להישמר בתרבות עד 6 ימים. התאים בתרבית לשמר נושא מורפולוגיה הכוללת כי הוא מאוד דומה לזה של סאמס בחריפות המבודדת, ללא שינויים משמעותיים האורך, הרוחב הממוצע, אזור החתך, או קיבול הממברנה של בתרביתתאים לעומת תאים מבודדים בחריפות (תרשים 2B - E). היתה זאת התשה של מספר סאמס קיימא לאורך זמן בתרבות. לפיכך, מומלץ כי תרבויות להיות מוכנות מתאי ונקווה מחיות מרובות אם תכנון הניסוי דורש מערכי נתונים נרחבים. יעד מרכזי בפיתוח הפרוטוקול לתרבות של מיוציטים sinoatrial מעכברים בוגרים היה ליצור מערכת שתאפשר הביטוי של חלבונים אקסוגני בהקשר הסלולר היליד המבוגר סאמס. דוגמא לסוג זה של ביטוי חלבון מוצגת באיור 3 עבור המקרה של תאי שיתוף נגוע וירוסים להביע את החלבונים בסמן פלורסנטי GFP ו mCherry. מצאנו כי ביטוי חלבון ניכר בבירור בתוך 24 שעות של זיהום adenoviral, והיה מקסימאלי עבור חלבוני הבדיקה תוך 48 שעות (איור 3). משרד הפנים ויראלי של 100 הביא כמעט 100% INFיעילות השיקוף ללא עדות רעילות הסלולר. לעומת זאת, transfection באמצעות ריאגנטים שומנים מבוססים הצליח לייצר בכל העברת גנים לזיהוי לתוך המבוגר סאמס, גם לאחר 72 שעות 9. אפיון פונקציונלי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה תיקון- clamp הוא קריטי להערכה של שני 4A סאמס. האיור המבודד התרבותי בחריפות תערוכות הקלטות נוכחי מהדק טיפוסיות של פוטנציאל פעולה הספונטני רשם סאמס מבודד או מתורבת בחריפות באמצעות תצורת ההקלטה מחוררת-תיקון amphotericin. גל פוטנציאל פעולה היה דומה סאמס מבודדים תרבותיים בחריפות ולא היה הבדל בשיעור ירי AP הממוצע (האיור 4B). אני F היא סימן ההיכר של סאמס ואת ערוצי HCN4 המייצרים אני F משמשים כסמנים immunocytochemical של הצומת sinoatrial. מכאן presence של אני F בהקלטות מהדק תיקון יכול לשמש כדי לתמוך ברעיון כי התאים הם למעשה סאמס. כל סאמס החריף ותרבותי הפעיל באופן ספונטני כפי שיתואר בהמשך הציגו גם אני F&gt; 100 PA בתגובת צעד מתח 1 שניות כדי -120 mV. לקבלת התוצאות נציג המוצגים כאן, התאים היו perfused עם פתרון של Tyrode המכיל 1 מ&quot;מ BaCl 2 לחסום K + זרמים (לוח 3) והתלות במתח של הפעלת אני F היה assayed ידי 3 שניות צעדים מתח hyperpolarizing מ -60 ל -160 mV מן הפוטנציאל אחזקה של -50 mV, כפי שתיארנו קודם לכן 5-8. הצפיפות הנוכחית הוערכה בתגובת 3 פולסים שניות hyperpolarizing מבחן -150 mV מן פוטנציאל אחזקה של -50 mV. לא היו הבדלים משמעותיים בשתי תלות במתח של הפעלת אני F או אני F צפיפות זרם בין מבודדים בחריפות ו סאמס תרבותי (איור 4C - D). הקלטות שיתוף אלה של APS הספונטני ואני f מ סאמס בודד דורשים כ -9 דקות בסך הכל (כולל שטיפה ראשונית 2 דקות, 30-60 שניות של APS הספונטנית במצב מהדק נוכחי, שינוי פתרון 2 דקות, ולאחר כ -5 דקות עד לאסוף נתונים מהדקים מתח מספיק כדי לתאר את ההפעלה-תלות המתח של של אני F). לפיכך הנתונים שמוצגים באיור 4C גם להמחיש את חוסנו של הכנת התא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54555/54555fig1.jpg" /> איור 1: כלי Dissection עבור בידוד דיסוציאציה של העכבר סאמס (א) לי שתי 10 ס&quot;מ צלחות פטרי המכילות ~ 25 מ&quot;ל נרפא אלסטומר סיליקון... כל מנה היא מראש עם 6-10 סיכות לנתיחה קטנות עבור רקמות משתקות. Ii. 100 כוס מיליליטר להחזקה שלמה Tyrode של ב -35 &amp;# 176;... C אמבט מים iii Wide (~ 2 מ&quot;מ קוטר), פיפטה דיסוציאציה אש מלוטש iv צר (~ 1.5 מ&quot;מ קוטר) פיפטה העברת אש מלוטש נ פיפטה העברת פלסטיק להכנת רחצה עם השלם Tyrode של עם... הפרין. vi. עצמית פתיחת מספריים מיקרו לפרוצדורות חיתוך פנימי. vii. מלקחיים פיין (גודל טיפ 0.06 x 0.02 מ&quot;מ) עבור מניפולציה רקמות פנימיות. viii. מלקחיים רקמות, 5.5, 1 x 2 שיניים עבור מניפולציה רקמות חיצוני. ix. איריס מספרית מעוקל 4.3 לפרוצדורות חיתוך חיצוניות. (ב) צילום תקריב מדגיש סיכות לנתיחה קטנות להציב בצלחת לנתיחה. (C) תקריב צילום הדגשת פיפטה העברת צר אש מלוטשת (משמאל) אש מלוטשת פיפטה פעורה פה על טחינה דקה מכאנית (מימין). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54555/54555fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג versio גדול</a><html> n של נתון זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54555/54555fig2.jpg" /> . איור 2: מבודדים בחריפות ו סאמס בתרבית הם מורפולוגית נבדל ת:. תמונות שדה מוארת של נציג סאמס או מיד לאחר בידוד (אקוטי) או לאחר 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, או 6 ימים במבחנה B - D : ממוצע (± SEM) אורך מרבי, רוחב חתך באזור המבודד בחריפות לעומת 48 שעות בתרבית סאמס E:. הממוצע (± SEM) קיבול הממברנה מהקלטות מהדק מתח מ סאמס מבודד או מתורבת בחריפות. כל ההשוואות אינן משמעותיות: p&gt; 0.05 לעומת חריפה. מעובד מתוך התייחסות 9. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54555/54555fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> התחת = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54555/54555fig3.jpg" /> איור 3: ביטוי adenoviral של חלבונים אקסוגניים תרבותי סאמס שדה מואר ותמונות epifluorescent של סאמס התרבותי הנציג כי נדבקו ב משרד פנים של 100 עבור adenoviruses להביע eGFP (ירוק) ו mCherry (אדום), או ב 24 או 48 שעות לאחר. זיהום כפול. בר סולם = 20 מיקרומטר. לשחזרו מהתייחסות 9. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54555/54555fig4.jpg" /> איור 4: אפיון אלקטרו של A בתרבית סאמס:. קלטות מהדק נוכחיות נציגה מבודדת בחריפות (שחור) או מתורבת (האפור) סאמס בתמיסה של Tyrode המכילה 1 ננומטר isoproterenol. ברי סולם: 40 mV, 100 msec B:. ממוצע (± SEM) מיידיירי תדירות מבודד בחריפות (שחור; n = 6) או 48 שעות תרבותיות (אפור; n = 14) סאמס C:. ממוצע מנורמל (± SEM) יחסים במתח מוליך עבור אני F ב מבודד בחריפות (שחור; n = 8) או מתורבת (אפור; n = 14) סאמס ריבועים:.. משפחות נוכחיות נציג חריף (שחור) או סאמס תרבותי (אפור) שהושר על ידי פולסים בדיקה 3 שניות hyperpolarizing מ -60 ל -160 mV במרווחים של 10 mV D: ממוצע ( ± SEM) אני צפיפות זרם f ב -150 mV ב מבודדים בחריפות (שחור; n = 7) ותרבותיים (אפור; n = 8) סאמס. מעובד מתוך התייחסות 9. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54555/54555fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> שלם Tyrode של </td><td> Ca נמוך 2 + / Mg 2+ Tyrode של </td><td> KB בינוני </td><td> פתרון BSA </td><td> NaCl / CaCl 2 פתרון הסתגלות </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 140 </td><td> 140 </td><td></td><td> 140 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.4 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 5.4 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 5.55 </td><td> 18.5 </td><td> 20 </td><td> 5.55 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1.8 </td<html> &gt; <td> 0.066 </td><td></td><td> 1.8 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> טאורין </td><td></td><td> 50 </td><td> 20 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td></td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> K-גלוטמט </td><td></td><td></td><td> 100 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> K-aspartate </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קריאטין </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pH מותאם </td><td> 7.4 עם NaOH </td><td> 6.9 עם NaOH </td><td> 7.2 עם KOH </td><td> 7.4 עם NaOH </td><td></td></tr></tbody></table>ילדה = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; טבלה 1:. פתרונות דיסוציאציה יצירות של פתרונות המשמשים דיסוציאציה של מיוציטים הצומת sinoatrial. ריכוזים ניתנים מ&quot;מ אלא אם צוין אחרת. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ציפוי בינוני </td><td> מדיום התרבות </td></tr><tr><td> Media199 </td><td> בסיס </td><td> בסיס </td></tr><tr><td> 2,3-butanedione monoxime (BDM) </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> עוברי שור סרום (FBS) </td><td> 5% </td><td> - </td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין (BSA) </td><td></td><td> 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אִינסוּלִין </td><td></td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> transferrin </td><td></td><td> 5.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סֵלֶנִיוּם </td><td></td><td> 5 ng / ml </td></tr><tr><td> פֵּנִיצִילִין </td><td> 100 U / ml </td><td> 100 U / ml </td></tr><tr><td> סטרפטומיצין </td><td> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2: ציפוי ופתרונות תרבות יצירות של פתרונות המשמשים ציפוי והתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial.. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> Tyrode של </td><td> PP תאי </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 140 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5.4 </td><td> 135 </td></tr><tr><td> ח 2 PO 4 </td><td> 1.2 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 5.55 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </tד&gt; <td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 10 </td></tr><tr><td> Mg-ATP </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Amphotericin-B </td><td></td><td> 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לפי הצורך </td></tr><tr><td> isoproterenol </td><td colspan="2"> 1 ננומטר לפי הצורך </td></tr><tr><td> pH מותאם </td><td> 7.4 עם NaOH </td><td> 7.2 עם KOH </td></tr></tbody></table> טבלה 3: פתרונות הקלטת Electrophysiology יצירות של תאית (של Tyrode) ו תאי (PP) פתרונות המשמשים להקלטות מחוררות-תיקון amphotericin מ מיוציטים צומת sinoatrial..

Watch this Scientific Journal Video about Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice at JoVE.com

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

methods-for-isolation-culture-functional-characterization-sinoatrial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית. 

Video: Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...