yazının eleştirel okuma Dr. Benedikt Steuten özel teşekkürler. kitinazlarve orijinal eser Dr. Thorsten Langner tarafından yürütülmüştür. VG laboratuvar Bitki Bilimleri Mükemmellik (CEPLAS, DFG EXC 1028) ve BioSC ve Cluster tarafından desteklenen, KS laboratuvar BioSC tarafından desteklenmektedir. KB BioSC tarafından desteklenmektedir. Bioeconomy Bilim Merkezi (BioSC) bilimsel faaliyetleri maddi NRW Strategieprojekt BioSC (No 313 / 323-400-00213) çerçevesinde Yenilik, Bilim ve Araştırma Bakanlığı tarafından desteklendi. LF DFG Uluslararası Araştırma Eğitim Grubu 1525 iGRADplant bir doktora burs tarafından desteklenmektedir.

Silinti yapılan, 1. Üretim <ol><li> Ilgili bir 1 kb yukan kanadını (UF) ve alt kanadı (DF), her ve keskin kesme kısıtlama sahaları ile çevrili, uygun direnç kasedi içeren silinmesi yapısı (Şekil 1) ihtiva eden bir plasmid oluşturur. NOT: Herhangi bir klonlama stratejisi bu tür plazmidler 9 Golden Gate klonlama tavsiye (klonlama için referans 22) kullanılabilir. </li><li> Silme 9 inşa silme 1 ug DNA elde etmek için bir künt kesici kullanılarak plazmid gelen inşa tüketim. Enzim ortadan kaldırmak ve ticari reaktifler kullanılarak 22 örneğin tampon ve üreticinin talimatlarına uyun için silme yapı arındırın. NOT: vektör omurga dönüşüm karışımı kalabilir. </li></ol> Protoplast 2. Hazırlık NOT: e tüm zamanlarda steril koşullar tutunXperiment. Hücre duvarı plazma zarına moleküllerin erişimi sınırlayan güçlü bir koruyucu engeldir. Silme yapısını içeren DNA alımını sağlamak için, hücre çeperi, bir protoplasting reaksiyonunda bozundurucu enzimler, hücre duvarı ile kaldırılması gerekir. protoplast hazırlanmasında kritik adımlar ortamın 1) ozmotik stabilizasyon ve 2) protoplastlar mekanik stres kaçınarak. <ol><li> Mark 2 protoplast dondurmak ve -20 ° C&#39;de onları soğumasını yuvarlak dipli ml&#39;lik tüpler. arzu edilen genetik kökenli soyunun taze plakadan 3 ml YEPS-Light bir ön kültür başlatın. 28 ° C&#39;de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. NOT: zorlanma solopathogenic gerilme SG200 10, yabanıl tip suşları gibi AB33 23, ya da çift mutantların nesil için herhangi bir mutant arka plan olarak test suşları olabilir. suşu istenilen direnç serbest olduğundan emin olun. </li><li> Bir şaşkın flas 50 ml YEPS-Light kültür seyreltink ve 200 rpm&#39;de 28 ° C&#39;de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. NOT: katlama zaman vahşi tipli suşları için yaklaşık 2 saattir. Üç duplikasyonlar az bekleyin. </li><li> üstel faz kadar büyütün. (1.0 olarak kabul edilebilir olan 0.6) 600 nm&#39;de (OD600) arasında bir dalga boyunda ölçülen optik yoğunluk, yaklaşık 0.8 olduğundan emin olun. OD 1.0 600 1 U. 7 10 ila 2 x tekabül ml başına hücreler maydis. </li><li> Bir mikroskop altında kirlenme hücreleri kontrol edin. 40x büyütme kullanın. 5 dakika, 1.500 xg için tam 50 ml kültür hücreleri Pelet ve supernatant atın. 25 ml sodyum sitrat, sorbitol çözeltisi (SCS), santrifüj 5 dakika, 1.500 xg pelletini tekrar ve supernatant atın. Not: Bakteriyel kirlilikler, küçük ve çoğu zaman hareket eden hücreler olarak tespit edilebilir. Mantar kontaminasyonlar U. sigara şeklinde hücrelere göre farklı bir hücre şekil ya da boyutta göre tespit edilebilir maydis. </li><li> cen sırasındatrifugation protoplasting solüsyon hazırlanır (12.5 mg / ml, Trichoderma SCS enzimler, lize hücre pelet başına 3 ml hazırlanması, filtre 22 um&#39;lik bir filtreden steril, çözelti, uygun enzimatik aktivitesi için taze olmalıdır). SCS hücre duvarının kaldırılması üzerine protoplast delinmesine engel olmak için bir ozmotik dengeleyicidir. </li><li> çözelti protoplasting 2 ml pelletini. Oda sıcaklığında 5 ila 20 dakika süreyle inkübe ve hücrelerin 30 ila 40% yuvarlak veya iğne topuzlarında gibi (Şekil 2) kadar mikroskop altında kontrol edin. NOT: Bundan sonra buz üzerinde tüm adımları uygulayın ve dikkatle protoplast ele! </li><li> 10 ml soğuk (4 ° C) SCS yıkayın 3x, 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatan atılır, 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de soğuk sorbitol TrisHCl, CaCl2 çözeltisi (STC) sıkma 10 ml pelletini. , 1 ml soğuk STC pelletini tekrar soğutulmuş tüplerde 100 ul alikotları olun. sonraki kullanıma kadar -80 ° C&#39;de alikot dondurun.</li></ol> U. 3. dönüştürülmesi maydis Not: U. dönüşümü maydis protoplastlar teknik olarak basit ve özel ekipman gerektirmez elektroporasyon ya biolistik transformasyon karşı olan polietilen glikol (PEG) aracılı dönüştürme yöntemi, dayanır. <ol><li> İki katmanlı seçme plakaları (transformasyon reaksiyon başına 2 levha) hazırlayın. buradaki alt kat, kat konsantrasyonda antibiyotik içerir. 400 ug / ml higromisin içeren RegLight pipetleyin 12 mi (ya da 300 ug / ml nourseothricin veya 4 ug / ml karboksin ya da 1 mg / ml G418), bir Petri kutusu içine. kabarcıkları kaçının. Not: Taban tabaka levhaları (aşağıya bakınız), 4 ° C de bir kaç gün saklanan ama dönüşümü sırasında taze üst tabaka hazırlamak olabilir. </li><li> buz üzerinde çözülme protoplastlar (1 tüp / transformasyon). 1 ul heparin (15 mg / ml) eklenir. 1 ug DNA (doğrusallaştırılmış yapı) ya da 10 ul H 2 Ekle </sub&gt; O (su kontrolü). Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Bu süre boyunca üst tabaka için RegLight taban plakası üzerine (60 ° C kaynama ve serin) RegLight sıvılaştırılmış 12 ml yayıldı. NOT: Bu katman antibiyotik içermez. </li><li> dönüşüm tüp (3. 2) 500 ul STC / PEG (polietilen glikol) ekleyin ve tersini tüp dikkatlice karıştırın. Buz üzerinde 15 dakika kuluçkalayın. </li><li> İki tabakalı RegLight plakaların ikisinin her dönüşüm reaksiyonu dağıtın. . Bir cam pipet ile dikkatlice ve yavaşça yayılır transformantlar koloniler olarak büyümeye kadar 5 ila 7 gün süreyle 28 ° C&#39;de dik inkübe edin. plaka başına yaklaşık 100-200 koloniler elde edin. NOT: Düşük sayılar ya çok fazla hücre duvarını içeren ve bu nedenle DNA&#39;yı alamaz ya da yeniden edemez &quot;kötü&quot; protoplastlar neden olabilir. Eski kendi kendini kopyalayan bir plazmid, antibiyotikler olmadan plakalar üzerine rejenerasyonu test ederek ikinci ile dönüştürme ile test edilebilir. </li> &lt;li&gt; / ml higromisin 200 ug uygun antibiyotiği içeren YEPS Işık tabak hazırlayın (ya da 150 ug / ml nourseothricin ya da 2 ug / ml karboksin veya 500 ug / ml G418, bu konsantrasyonlar alt plakalar için kullanılan bir eşit yarısı). Bu plakalar üzerinde en az 24 varsayılan transformant koloniler yeniden arındırmak. Tek tek koloniler elde edilmelidir. seçici olmayan medya üzerinde orijinal zorlanma dışarı Aynı zamanda çizgi at. Not: Plakalar 1-2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Doğru Silme Olaylar 4. Doğrulama Not: mutasyonlar üç aşamalı bir prosedürde doğrulanır (Şekil 1). İlk olarak, genin vahşi tip kopyasını içeren adaylar PCR ile dışlanır. İkinci olarak, lokusuna direnç kasetinin entegre PCR ile doğrulanır. Üçüncü olarak, sadece arzu edilen lokusuna direnç kasetinin entegre Southern blot analizi ile doğrulanmıştır. Dikkatli gerilme doğrulama esse olduğununtial mutant fenotip gerçekten silinmesi ile ilişkili böylece. <ol><li> İlk Teşhis PCR 20 <ol><li> Geninde tasarım primerler eşleştirme 250-600 bp (Şekil 1) sahip bir ürün ile sonuçlanan silinir. Böyle küçük ürünler bir koloni PCR yükseltmek kolay ve standart jel elektroforezinde tespiti için yeterince uzun olan. </li><li> Her aday ve bir pozitif kontrol olarak, orijinal suşu için, 20 ul 0.02 M NaOH içinde bir kürdan ile tek bir koloni hücre malzemesinin biraz (bir toplu iğne başı miktarı) yeniden süspanse edin. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Taze koloniler kullanın. Plakalar 1 hafta yeniden çizgi daha eski ise yeni bir koloni elde etmek. </li><li> Hemen PCR için hücre süspansiyonu 1 ul kullanın. Standart bir PCR reaksiyonu ve elde edilen fragmanlar analiz eder. NOT: Bu örnekler saklanamaz. Not: bu şekilde Bu PCR vahşi tipli geninin varlığı için test negatif cand hızla belirlenmesini sağlarilgi gen yerini henüz hangi idates. Bu PCR reaksiyonunda bantlar elde klonlar atılır. Bu tür bir negatif klon yine ek bir negatif kontrol olarak birlikte gerçekleştirilmelidir. Bir PCR ürünü olmayan adaylar daha analiz edilmesi gerekir. diğer yarısı bir bant neden olmamalıdır ise zarar vermeden gen adaylarından yaklaşık olarak yarısı, vahşi tipli genini içermelidir. Bu,% 50 homolog bir rekombinasyon oranına karşılık gelir. </li></ol></li><li> İkinci teşhissel PCR <ol><li> Genomik DNA hazırlanması. Not: Genomik DNA (gDNA), iki farklı protokolü kullanarak hazırlanabilir. İlk fenol ve kloroform ve dolayısıyla, sadece ikinci de 4.2 4.2.1.6 açıklanan az deneyimli öğrenciler (tarafından ele alınabilir ise (4.2.1.5 için 4.2.1.1 anlatılmıştır) deneyimli araştırmacılar tarafından ele alınmalıdır gibi toksik reaktif içerir. 1.11). Her iki protokol güvenilir çalışıyoruz. Aşama 4.2.1.1 iki protoc için aynıdırols. <ol><li> her bir aday ile 5 mi YEPS Işık inoküle ve 28 ° C&#39;de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Bir CM plaka üzerinde kültürün 2 ul bırakın. Steril kültür tutun. NOT: Aşağıdaki standart protokolü (: toksik adımlar DİKKAT) &#39;dir. </li><li> 2 ml tüpler için 1 kepçe HCI yıkanmış cam boncuklar (~ 200 ul) yerleştirin. U. 2 ml ilave edilir maydis kültürü. 5 dakika boyunca 12.000 xg Spin. (Pelet, bu aşamada dondurulabilir) süpernatant atılır. (: 24: 1, 25) pelet 500 ul fenol / kloroform / izoamilalkol ekleyin. DİKKAT! PHENOL ZEHİRLİ IS! </li><li> 1000 rpm&#39;de bir Vibrax 500 ul Usti-lisis tampon 6 dakika 10 1. çalkalayın ekleyin. Hücre topağı tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun, ama gDNA ve kesme önlemek için sallayarak genişletilmiş kaçının. 15 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de Spin. Yeni reaksiyon tüpüne sulu fazın 400 ul aktarın (interfaz dokunmayın). </li><li> 1 mi, 100% (v / v) etanol ekleyin. c gözlemlemek, mix tüp 3x haricindekilerikısa bir süre görünen DNA&#39;nın yüksek sesle. 5 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de Spin. Süpernatantı ve 200 ul% 70 EtOH ile yıkayın. Bu aşamada pelletini etmeyin. </li><li> (Pelet tamamen kurumasını izin vermeyin) tamamen süpernatantı. 50 ul TE / RNAaz ari ekleyin. 10 dakika boyunca 50 ° C&#39;de 400 rpm&#39;de çalkalanarak gDNA&#39;sından eritin. % 0.8 agaroz jeli 20 gDNA 2 ul analiz edin. Not: Aşağıdaki adımlar, alternatif bir toksik-olmayan protokol içermektedir. </li></ol></li><li> Genomik DNA Alternatif Hazırlanması <ol><li> HCI 2 ml tüpler cam boncuk yıkanmış 1 kepçe (~ 200 ul) yerleştirin. U. 2 ml ilave edilir 5 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de maydis kültür ve spin. (Granüller bu aşamada dondurulabilir) süpernatant atın. </li><li> pelet 500 ul liziz tamponu Usti 2 ekleyin. 1000 rpm&#39;de bir Vibrax ile 5 ila 15 dakika boyunca çalkalayın. Hücre topağı tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olun. </li><li> 15 ila 20 dakika boyunca, 65 ° C&#39;de inkübe edin. beğenme kullanma2 ml tüpler barındırmak için tasarlanmış zemelerle kuluçka önemlidir. Daha sonra, 5 dakika buz üzerine yerleştirin. </li><li> 100 ul 8 M potasyum asetat, vorteks ekleyin ya da 8 ila 10 kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 15 dakika için 12,000 xg dönerler. </li><li> Aktarım 500 yeni bir 1.5 ml&#39;lik tübe süpernatan ul 400 ul izopropanol ekleyin. Vortex veya invert 8 ila 10 kat. 15 dakika için 12,000 xg dönerler. Süpernatantı ve 500 ul% 70 EtOH ile yıkayın. 5 dakika boyunca 12.000 xg Spin. </li><li> tamamen süpernatant emmek! Sonuç olarak, artık sıvıyı ortadan kaldırmak için kısa bir sıkma (10 sn) ekleyin. 3 ila 5 dakika süreyle DNA pelet kurumasını bekleyin. 50 ul TE / RNAaz ekleyin ve 400 rpm hızda 10 dakika 15 için 50 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> Tasarım bunlardan biri (UF-f, RC-R, RC-f DF-R, Şekil 1) dış yan yüzleri dışında bağlanması ve direnç kaseti içinde bağlayıcı bir karşılık gelen iki primer çiftleri 9. </li><li> Her c gDNA 1:10 seyreltmesinin 1 ul kullanınandidate 2 PCR reaksiyonlarında şablon olarak yukarı ve aşağı doğru 9 doğru takılmasını teyit etti. </li><li> Her bir aday için standart PCR reaksiyonları kullanın ve parçaları 22 sonuçlanan analiz eder. NOT: Bu PCR doğru genomik direnç kasetinin eklenmesi için test edin. ürünler her iki taraf için elde edildiği takdirde, adayın doğru yerleştirilmesidir. Bununla birlikte, (alt yukan ya da) sadece bir tarafı teyit edilebilir da aday PCR reaksiyonları sadece tek bir kanat için başarısız olması durumunda, daha fazla analiz için birlikte gerçekleştirilmelidir. </li></ol></li></ol></li><li> Southern Blot Analizi 22 tarafından doğru Genomik Takma doğrulanması <ol><li> geninde veya açıkça dist yol açan direnç kaseti ya keser, inşa ve ek olarak / lokus dışında keser uygun bir enzim ile 15 mutant adayların gDNA ul (4.2.1) ve ilgili wild tip / progenitör gerginlik Digestinguishable desenler (Şekil 1) 8. NOT: sindirilmemiş DNA açıkça ayırdedilebilmektedir böylece, beklenen şeritleri hiçbiri, daha büyük olan 10 kb olmalıdır. </li><li> kaynak tarafı ve sondalar olarak aşağı kanadını kullanın. örnek PCR DIG etiketleme Kit veya benzeri bir standart yöntemi kullanmak için onları etiketlemek için. 1 etiketli problar karıştırın: 1 moleküler oranına ve Güney leke yürütmek. en az iki bağımsız doğru transformantları tutun. NOT: Vahşi tipli model orijinal zorlanma açıkça tespit olmalı ve doğru klonlar sadece beklenen bantları içermelidir. adayların sadece mevcut ek bantları yanlış lokusunda yapının diğer eklemeleri göstermektedir. Bu gibi klonlar atılmalıdır. İlk tanı PCR tanımlanan olumsuz aday yanlış entegre silme yapısının wild tip bantları ve (boyut olarak öngörülemeyen) bantlar içermelidir. </li></ol></li><li> gliserol stokları NOT: Gliserol stokları Strain collections&#39;da yıllardır klonlar muhafaza ederler. en azından iki bağımsız transformant, her mutant için tutulmalıdır. Bu aynı olmalıdır karşılaştırarak fenotipi sağlar. <ol><li> 500 ul NSY-gliserin-ortamı her kültür 28 ° C Karışım 500 ul 24 saat süre ile dönen bir tekerlek üzerinde YEPS-Light teyit mutant 5 ml kültür büyütün. Kültür ve orta iyice karıştırılır kadar Tüpü ters çevirin. ortam içinde gliserol, buz kristallerinin oluşmasını önler. </li><li> -80 ° C&#39;de dondurun. stok fonksiyonel olup olmadığını yeniden çizgi dondurulmuş kültürünün bir parçası test etmek. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskobik fenotipler <ol><li> 28 ° C&#39;de 12 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde YEPS-Işık vahşi tip ve mutant 5 ml kültür büyütün. </li><li> Ertesi gün, yaklaşık 0.1 OD 600 kültür sulandırarak 0.5 ve 0.7 arasında bir OD 600 kadar büyümek. 1.0 Nominal değerden uygun bir OD 600İlik yaklaşık 1 7 10 x 2 U. ml başına hücreler maydis. </li><li> mikroskobik hücre morfolojisi kontrol edin. NOT: Sağlıklı hücreler puro biçimli (Şekil 4, WT) görünür. Seslendirilmiş vakuoller veya filament oluşum hücreleri vurguladı olduğunu göstermektedir. Not: haberci soylarının Uygun tahlil bu aşamada gerçekleştirilebilir kullanıldığında beklenen mutant fenotipinin bağlı olarak, analiz, örneğin, adapte edilebilir. Hücre morfolojisi değişti istatistiksel analiz yapılmalıdır ise, örneğin, ortalama hücre uzunluğunu belirlemek için. </li></ol> 6. Enfeksiyon Deneyi NOT: fide enfeksiyon tahlil bu dergide 11 daha önce görüntülenmiştir edilmiştir. Bu Ya örneğin SG200 10 veya her iki mutasyonu taşıyan uyumlu geçme karışım eşleri, bir haploid, solopathogenic suş zemini kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> başına en az 40 mısır fideleri büyütün16 saat, 200 μE / 22 ° C (gündüz / gece) 28 ° C&#39;lik bir ışık döngüsü 7 gün boyunca soyu. Bu 3-yaprak aşamalı ve 10-15 cm enfeksiyonun gün boyunda olmalıdır. </li><li> Enfeksiyondan iki gün önce, 28 ° C&#39;de 24 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde, 5 ml YEPS ışıkta suşlarının kültür öncesi başlar. YEPS Işık 600 = 1.0 OD 50 ml bir ana kültür büyütün (hücre bölünmesi oranı = 2 ila 3 saat bölümler en az izin O / N yapılabilir). </li><li> 5 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de 50 ml kültür hücreleri aşağı Spin ve süpernatant atın. Steril H 2 O ile yıkayın 3x OD 3,0 600 steril H 2 O hücreleri tekrar süspansiyon. Gerekirse, çiftleşme ortakları karıştırın. </li><li> küçük bir şırınga ile 7 gün eski mısır fidelerinin kök içine hücre süspansiyonları 500 ul - 250 enjekte edilir. Bir kontrol olarak steril H 2 O kullanın. aynı ışık ve ısı koşullarında, ek 7-14 gün boyunca enfekte fide tutun. Her bitki a fenotip PuanSağlıklı, kloroz, antosiyanin oluşumu, küçük tümörler, büyük tümörler, ölü bitki 10 şeklinizi ona göre. NOT: Puanlama gibi erken 7 gün olarak yapılır ve zamanla enfeksiyon takip 14 gün tekrar edilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).</li><li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+development+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis.</a> Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).</li><li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ustilago+maydis,+the+delightful+blight.">Ustilago maydis, the delightful blight.</a> Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).</li><li>Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homologous+recombination+system+of+Ustilago+maydis.">The homologous recombination system of Ustilago maydis.</a> Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).</li><li>Feldbr&#252;gge, M., K&#228;mper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mating+and+pathogenic+development+in+Ustilago+maydis.">Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis.</a> Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).</li><li>&#214;kmen, B., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+plant:+Biotrophic+strategies+to+modulate+host+immunity+and+metabolism.">Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism.</a> Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).</li><li>Brachmann, A., K&#246;nig, J., Julius, C., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+for+generating+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis.">A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).</li><li>K&#228;mper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+system+for+highly+efficient+generation+of+gene+replacement+mutants+in+Ustilago+maydis.">A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis.</a> Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).</li><li>Terfr&#252;chte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+versatile+Golden+Gate+cloning+system+for+genetic+engineering+in+fungi.">Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi.</a> Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).</li><li>K&#228;mper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis.">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li><li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Efficient+Method+for+Assessing+Pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+Maize+and+Teosinte+Lines.">A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50712 (2014).</li><li>Khrunyk, Y., M&#252;nch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+FLP-mediated+recombination+for+the+functional+analysis+of+an+effector+gene+family+in+the+biotrophic+smut+fungus+Ustilago+maydis.">The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis.</a> New Phytologist. 187, 957-968 (2010).</li><li>van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., W&#246;sten, H. A. B., Lugones, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phleomycin+Increases+Transformation+Efficiency+and+Promotes+Single+Integrations+in+Schizophyllum+commune.">Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune.</a> Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).</li><li>Sarkari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+expression+of+single-chain+antibodies+in+Ustilago+maydis.">Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).</li><li>Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+loci+of+Sporisorium+reilianum:+Novel+pattern+with+three+a+and+multiple+b+specificities.">Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities.</a> Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).</li><li>Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+Environmental+Stresses,+Cell-wall+Integrity,+and+Virulence+Are+Orchestrated+Through+the+Calcineurin+Pathway+in+Ustilago+hordei.">Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei.</a> Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).</li><li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+genetic+manipulation+protocol+for+Ustilago+esculenta.">An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta.</a> FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).</li><li>Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+replacements+in+Neurospora+strains+deficient+for+nonhomologous+end-joining.">Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining.</a> P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).</li><li>Colot, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+knockout+procedure+for+Neurospora+reveals+functions+for+multiple+transcription+factors.">A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).</li><li>Langner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases+Are+Essential+for+Cell+Separation+in+Ustilago+maydis.">Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis.</a> Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).</li><li>Langner, T., G&#246;hre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+chitinases:+function,+regulation,+and+potential+roles+in+plant/pathogen+interactions.">Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions.</a> Current Genetics. , (2015).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloining: a laboratry manual. , (1989).</li><li>Brachmann, A., Weinzierl, G., K&#228;mper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+in+the+bW/bE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis.">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).</li><li>Becht, P., Vollmeister, E., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+RNA-binding+proteins+implicated+in+pathogenic+development+of+Ustilago+maydis.">Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis.</a> Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).</li><li>Vollmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+KH+domains+of+Khd4+recognize+AUACCC+and+are+essential+for+regulation+of+morphology+as+well+as+pathogenicity+in+Ustilago+maydis.">Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis.</a> RNA. 15, 2206-2218 (2009).</li><li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis.">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li><li>Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-3+and+dynein+mediate+microtubule-dependent+co-transport+of+mRNPs+and+endosomes.">Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes.</a> Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).</li><li>Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbr&#252;gge, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FYVE+zinc+finger+domain+protein+specifically+links+mRNA+transport+to+endosome+trafficking.">A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Kronstad, J. W., Leong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+Alleles+of+the+b-Locus+of+Ustilago.">Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago.</a> P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).</li><li>Koepke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+Rrm4+is+essential+for+efficient+secretion+of+endochitinase+Cts1.">The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1.</a> Molecular &amp; cellular proteomics. 10, (2011).</li><li>Schuler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hxt1,+a+monosaccharide+transporter+and+sensor+required+for+virulence+of+the+maize+pathogen+Ustilago+maydis.">Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis.</a> New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).</li><li>Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+in+Ustilago+maydis+using+the+CRISPR-Cas+system.">Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system.</a> Fungal Genetics and Biology. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol U ters genetik çalışmalar için silme mutantlar oluşturmak açıklamaktadır maydis. Başlangıç noktası bir önceki 7,9 optimize gen-faiz 1 başlangıç yukan ve durdurma kodonundan aşağı doğru kb olarak uygun bir direnç kaseti sekanslarını ihtiva eden kuşatıcı sekanslar içeren bir silme konstruktu olup . yapıları tek tek her gen için oluşturulan ve dikkatle geni silmeden önce dizi hatalar için doğrulanacak var. dış yan yüzleri komşu gen içine ulaşmak veya mutasyon düzenleyici elemanları değiştirmesi durumunda kanatların nokta mutasyonlar, özellikle de genomik sekans istenmeyen değişikliklere yol açabilir. Bu, tüm transformantlar etkileyecek ve istenen gen silme olmayan fenotipleri ve yan etkilere neden olabilir. silme stratejisini planlarken, beklenen fenotip genetik arka plan seçmek için dikkate alınmalıdır. Mevcut durumda, AB33 23 ve SG200 10 morfolojik anahtarı ve bitki enfeksiyonunda fenotipleri test etmek için izin seçildi. Benzer şekilde, diğer birçok okuma-çıkışları ilgisini çekebilir, cts1 örn füzyonlar heterolog proteinlerin 14,26 ihracat istihdam edilmektedir ve floresan ile bir suş arka plan rrm4 etiketli endosomes 27,28 üzerinde RNA taşıma analiz sağlar. streyn onaylanması sırasında, yüksek verimli teşhis PCR aday sayısının hızlı bir azalma oldukça zahmetli Southern blot ile test edilmesini sağlar. Özellikle, ilk tanı PCR hala genin vahşi tipli kopyasını içeren adayların dışlanmasını izin verir ve böylece gDNA hazırlıkları toksik fenol kitlesel kullanımını engeller. Bir gerekli olmayan gen ile bir standart durumda, kolonilerin yaklaşık yarısı vahşi tipli genini içerebilir. Bu ön-eleme genleri için büyük ilgi olabilir<html> Potansiyel zararlı büyüme fenotipleri ile. adayların yüzlerce hızla taranabilir. tüm adayların wild tip kopya içeriyorsa, gen silme büyük olasılıkla ölümcül olanıdır. Bu teliospore çimlenme 29 sonra ayrışmanın diploid gerginlik arka plan (örneğin d132) ve analiz bir kopya silerek teyit edilebilir. Seçenek olarak ise, uyarılabilir bir promoter kullanılarak bir koşullu silinmesi stratejisi mutant fenotipi takip seçilebilir. Ancak, gDNA hazırlanması için ham NaOH tabanlı yöntemle elde edilen de kirlenme PCR müdahale ve yanlış negatif adaylar geni içeren olsa bile tutulur nedenle bir grup göstermek ve yok yani yol açabilir. Bu daha büyük bir fragman neden kontrol geni için, iki gen spesifik primer ve primerler ile bağımsız bir PCR reaksiyonunda veya çoklu-PCR ile benzer bir boyutun ürünün bir kontrol geni test dışlanabilir. İçerik &quot;&gt; zaten ör cts1 Δ 30 veya rrm4 Δ, etiketli tipleri şekil değiştirme üretimi, örneğin, ihtiva eden yeni bir yapı ile genomuna gen silinmesi direnç kasedi (örneğin hygR) değiştirerek kullanılabilir hızlandırılabilir mutant halinde floresan etiketli rrm4 ve farklı bir direnç işareti (örneğin NATR). Bu durumda, transformantlar doğru adaylar bu antibiyotik (nourseothricin) karşı dirençlidir. ilk direnç markeri 9 kaybı taranabilir ve ilk direnç (higromisin kaybetmiş ). Ayrıca, trans mutant fenotip tamamlama levhası &#39;yapıları 30,31 işlevselliğini doğrulamak için yapılabilir. Burada tarif edilen gen silme ve değiştirme stratejisi U. genetik analiz güvenilir ve kesin bir araç sunar maydis. Ancak birden silme işlemleri için, gerilme gedeğişiklikler sırayla yapılmalıdır beri lendirme, zaman alıcı alabilirsiniz. Bu nedenle, tamamlayıcı bir araç olarak, geçen yıl CRISPR-Cas sistemi U. için kurulmuştur 32 Maydis&#39;in. Aynı anda birden fazla gen bozmaya imkanı sunuyor ve U. genetik alet mükemmel bir ektir maydis. Genetik manipülasyon ve U. için Özetle, protokol Burada anlatılan Maydis suşu üretimi yaygın yıllardır toplumda kullanılmakta olan sağlam bir yöntemdir. Birlikte ilgili direnç kaset modüllerinin kapsamlı koleksiyonu ile temel uygulanan araştırmaya değişen çeşitli sorulara yanıt, bu mantar genetik mühendisliğinin her türlü izin verir.

Ustilago maydis yıllardır 1,2 yoğun çalışılmıştır bir fitopatojenik bir model mantardır. Bu iki morfoloji, bir maya gibi, patojenik olmayan aşamasında ve filamentli, enfeksiyöz bir şekilde 3 bulunmaktadır. Örneğin homolog rekombinasyon ve DNA tamir mekanizmaları gibi evrensel atılım bulgu, bu mantar 4 maya benzeri büyüme aşamasında yapılmıştır. Ayrıca, enfeksiyon için önemli bir enfeksiyon filament ve hastalık oluşturma faktörlerinin morfolojik anahtarı 5,6, iyi karakterize edilmiştir. Bu kurum mantar biyoloji ve virülans hakkında artan moleküler bilgi mükemmel bir genom açıklama 10 ve kullanılarak ters genetik kolaylığı, örneğin, bizim enstitüsünde iyi organize plazmid toplama (http tarafından desteklenen basit bir gen değiştirme stratejisi 7-9 dayanır : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). mısır s standartlaştırılmış, hızlı enfeksiyon deneylerieedlings patojenite detaylı çalışmalar 11 faktörleri tanır. U. genomu maydis yaklaşık 6.900 gen 10 içerir. onların işlevini incelemek için, onlar nedeniyle etkin bir homolog rekombinasyon sistemi tek başına veya birlikte silinebilir. Mükemmel homolog uçlarını ihtiva eden yaklaşık 1 kb&#39;lik yanında bulunan bölgeler% 50&#39;den daha büyük, homolog rekombinasyon oranları için idealdir, ama homolog olmayan uç ile daha önce 250 bp yapının 9 doğru entegrasyon bir dereceye kadar izin verir. Şu anda, beş farklı direnç kaseti, higromisin, karboksin, nourseothricin, G418 ve fleomisin karşı direnç aracılık hygR, cbxR, NATR, G418R ve phleoR, transformantların 7,9 seçmek için kullanılır. Buna ek olarak, higromisin direnci, heterolog bir FLP yeniden bağlayıcı 12 geçici ifade ile çıkarılabilir geri dönüşümlü bir kaset (STT-hygR) olarak geliştirilmiştir. Bu direnç kasetin ve böylece teori sınırsız genetik modifikasyon olarak kaldırılmasını sağlar. Fleomisin yeni kasetler ile, geri dönüşümlü hygR kaseti, özellikle phleoR kullanımı azalmaktadır, böylece 13 mutajen. Dörtlü mutantlar, böylece, diğer dört kasetleri kullanılarak üretilebilir, ancak beşli mutantlar için, FRT-hygR sistemi 14 önerilir. Bu genel gen silme stratejisi başarıyla gibi Sporisorium reilianum 15, U. gibi diğer karalamak mantarlara devredilmiştir hordei 16 veya A.B.D. esculenta 17 ve bu nedenle verimli bir homolog rekombinasyon sistemi ile henüz genetik dirençli organizmaların daha fazla uygulamalar için potansiyel sunmaktadır. yer alan genlerin silinmesi ile örneklendiği gibi Ayrıca, homolog yeniden birleştirmeye yoksun organizmaların genetik mühendisliği geliştirmek için modifiye edilebilir homolog olmayan-enD-katılmadan Neurospora crassa 18,19 yılında. Burada U. için yayınlanan gen silme stratejisini açıklamak adayların hızlı ve doğru doğrulama odaklanarak deneysel detaylı 7,9 Maydis&#39;in. Bir örnek olarak, mantar şitinaz Tek ve mutantların üretilmesinden oluşmaktadır ve birden fazla silme 20,21 suşları tasvir etmektedir. Onlar sert hücre duvarında kitin üzerinde hareket çünkü kitinazlarve ilginç örneklerdir. Hücre duvarı yeniden şekillenme hücre bölünmesi sırasında morfolojik değişiklikler için gerekli olan, ipliksi büyüme ve spor oluşumuna geçin. Dolayısıyla, silme mutantlar süresi boyunca fenotipleri beklenebilir.

<table><tbody><tr><td>Aminobenzoeic acid (Free Acid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>214010</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Bacto yeast extract&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Gr&amp;uuml;ssing GmbH</td><td>10234</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. salt)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2250</td><td></td></tr><tr><td>Carboxin&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45371</td><td></td></tr><tr><td>Casamino acids&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>223050</td><td></td></tr><tr><td>Cholinchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-1879</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>ChemSolute</td><td>24,321,000</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fluka</td><td>61240</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>D(+)Sucrose&amp;nbsp;</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>DNA degr. free acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-3159</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;*6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Gr&amp;uuml;ssing GmbH</td><td>10288</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Geneticin (G418) disulfate salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma lysing enzymes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glucose</td><td>Caelo</td><td>2580</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Glycerin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G065015</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td>Dangerous substance. Please check manufacturer&#039;s safety instructions.</td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B-solution</td><td>Roth</td><td>1287.2</td><td>Dangerous substance.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>26764298</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A3620</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; waterfree</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td><td>Water free is critical. Alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A2087</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Roth</td><td>0274.2</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Gr&amp;uuml;ssing GmbH</td><td>12174</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S316060</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ChemSolute</td><td>13,751,000</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Roth</td><td>K299.1</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Nicotinic acid (Free acid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Nourseothricin dihydrogen sulfate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Werner BioAgents</td><td>5,001,000</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient broth&amp;nbsp;</td><td>Difco</td><td></td><td>local suppliers</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) pH 6.7</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803</td><td>Dangerous substance. Please check manufacturer&#039;s safety instructions.</td></tr><tr><td>polyethylene glycol (PEG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>AppliChem</td><td>121479</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Pyridoxin (monohydrochlorid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-9755</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R5503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>Cn30.3</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>small syringe</td><td>BD</td><td>300300</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>sterile filter, 22 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Thiamin-hydrochloride</td><td>Serva</td><td>36020.02</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>tri-Na-Citrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S332060</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Tris- (hydroxymethyl) aminomethane</td><td>VWR</td><td>103156X</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Roth</td><td>9090.4</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Serva&amp;nbsp;</td><td>37240</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>96470</td><td>alternatively use local supplier</td></tr><tr><td>Composition of solutions/preparation of material</td><td></td><td></td><td>Composition of solutions</td></tr><tr><td>Carboxin</td><td></td><td></td><td>Stock: 5 mg/ml in methanol, final concentration: 2 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>CM plates</td><td></td><td></td><td>0.25 % (w/v) Casamino acids, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 1.0 % (v/v) Holliday vitamin solution, 6.25 % (v/v); Holliday salt solution, 0.05 % (w/v) DNA degr. free acid, 0.15 % (w/v) NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 2.0 % (w/v) Bacto Agar; adjust to pH 7.0 using 5 M NaOH; after autoclaving add 1 % glucose&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td></td><td></td><td>Stock: 50 mg/ml in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, final concentration: 500 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>HCl-washed glass beads (0.35-0.45 mm)</td><td></td><td></td><td>Cover glass beads with concentrated HCl (25 %, 7.8 M) and incubate for 60 min. Sway several times. Decant HCl (keep decanted liquid) and wash glass beads with 3 M HCl (keep decanted liquid). Wash glass beads several times with double distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O until the pH is 7 (the liquid should not be yellow-green anymore). Aliquot the glass beads and dry them at 180 &amp;deg;C. The decanted HCl has to be neutralized before disposal.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Stock: 15 mg/ml</td></tr><tr><td>Holliday salt solution</td><td></td><td></td><td>16.0 &amp;permil; (w/v) KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 4.0 &amp;permil; (w/v) Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 8.0 &amp;permil; (w/v) KCl, 1.32 &amp;permil; (w/v) CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 8.0 &amp;permil; (v/v) trace elements, 2.0 &amp;permil; (w/v) MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;; sterile filtrate</td></tr><tr><td>Holliday vitamin solution&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1&amp;permil; (w/v) Thiamin, 0.05&amp;permil; (w/v) Riboflavin, 0.05&amp;permil; (w/v) Pyridoxin, 0.2&amp;permil; (w/v) Ca-Pantothenat, (0.05&amp;permil; (w/v) Aminobenzoeic acid, 0.2&amp;permil; (w/v) Nicotinic acid, 0.2&amp;permil; (w/v) Cholinchlorid, 1.0&amp;permil; (w/v) myo-Inositol; may be stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td></td><td></td><td>Stock: 50 mg/ml in PBS, final concentration: 200 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td></td><td></td><td>Stock: 200 mg/ml in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, final concentration: 150 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>NSY-glycerol-medium</td><td></td><td></td><td>0.8 % (w/v) Nutrient Broth, 0.1 % (w/v) Yeast Extract, 0.5 % (w/v) Sucrose,&amp;nbsp; 80.0 % (v/v) 87% Glycerin (f.c. 69.6%)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RegLight</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) Yeast Extract&amp;nbsp; 0.4 % (w/v) Bacto Peptone, 0.4 % (w/v) Sucrose, 18.22 % (w/v) Sorbitol, 1.5 % (w/v) Agar</td></tr><tr><td>SCS, pH 5.8</td><td></td><td></td><td>Solution 1: 20 mM tri-Na-citrate, 1 M Sorbitol; colution 2: 20 mM Citric acid, 1 M Sorbitol, add solution 2 into solution 1 until pH 5.8 is reached; autoclave</td></tr><tr><td>STC, pH 8</td><td></td><td></td><td>1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; filter sterile</td></tr><tr><td>STC/PEG</td><td></td><td></td><td>40 % (v/v) PEG in STC-buffer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TE buffer, pH 8</td><td></td><td></td><td>1.31 mM Tris-Base, 8.69 mM Tris-HCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>TE/RNase</td><td></td><td></td><td>10 &amp;micro;g/ml RNaseA in TE buffer</td></tr><tr><td>Trace elements</td><td></td><td></td><td>0.06&amp;permil; (w/v) H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0.14&amp;permil; (w/v) MnCl*4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.4 &amp;permil; (w/v) ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.4 &amp;permil; (w/v) Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*H2O:2, 0.1 &amp;permil; (w/v) FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;*6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.04&amp;permil; (w/v) CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Trichoderma lysing enzymes solution</td><td></td><td></td><td>12.5 mg/ml SCS; filter sterile; prepare shortly before use</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.5</td><td></td><td></td><td>806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; check the pH and if necessary adjust with HCl; autoclave</td></tr><tr><td>Usti-lysis buffer 1, pH 8</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Do not measure pH using pH meter.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Usti-lysis buffer 2</td><td></td><td></td><td>mix Usti lysis buffer 1 with 1x TE in a 1:1 ratio</td></tr><tr><td>YEPS-Light medium</td><td></td><td></td><td>1.0% (w/v) Yeast Extract, 0.4% (w/v) Bacto Peptone, 0.4% (w/v) Sucrose, for plates: 1.5% (w/v) Bacto Agar</td></tr></tbody></table>

genetic manipulation of the plant pathogen ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions

Gen silinmesi gen fonksiyonu analizi önemli bir rol oynar. hedefli bir şekilde genlerin bozmaya en etkin yöntemlerden biri, homolog rekombinasyon yoluyla bir seçilebilir marker ile bütün gen yerine geçer. Homolog rekombinasyon sırasında DNA değişimi, yüksek benzerliğe sahip sekanslar arasında yer alır. Bu nedenle, hedef gene komşu lineer genomik diziler spesifik olarak arzu edilen entegrasyon sitesine bir seçilebilir işaret doğrudan kullanılabilir. Silme yapısının kör uçlar hücrenin DNA onarım sistemleri aktive edebilir ve böylece homolog rekombinasyon yoluyla ya da homolog olmayan uca birleştirilmesi yoluyla yapının entegrasyonu teşvik. verimli homolog rekombinasyon ile organizmalar, başarılı gen silme oranı% 50&#39;den fazla, bu strateji değerli bir gen bozulması sistemi yapım ulaşabilir. Ustilago Maydis&#39;in rastık mantarı gibi verimli homolog Rekombinant gösteren bir ökaryotik bir model mikroorganizmadıriyon. Bunu yaklaşık 6.900 gen dışında, bir çok işlevsel silme mutantları yardımıyla karakterize edilmiştir, ve gen temel işlevi de gen değiştirme girişimleri Puan yetmezliği tekrarladı. floresan işaretleri veya tahmin etki mutasyonlar ile etiketleyerek gen işlevi sonraki karakterizasyonu da homolog rekombinasyon yoluyla DNA değişimine dayanır. Burada, biz U. sunuyoruz En basit örnek, gen silme işlemini kullanarak detaylı Maydis zorlanma nesil stratejisi.

U. kodlanmış dört chitinolytic genler için silinti yapılan, Maydis genom cts1 silinmesi için hygR kaseti kullanarak Golden Gate klonlama tarafından oluşturulan, NATR cts2 silinmesi için, cts3 silinmesi ve cts4 20 silinmesi için cbxR için G418R kaseti. Gen değiştirme stratejisinin genel bir bakış cts3 silinmesi (Şekil 1) ile tarif edilmektedir. Ikinci chitinolytic gen ile cts1 Tek ve çift mutantlar hastalık oluşturma etkenin kitinazlar rolünü analiz için iki farklı genetik geçmişlerde aynı konstraktlarla sekans oluşturulmuştur. İki farklı gerilme arka istihdam edildi: AB33 ipliksi büyüme indüksiyon sağlar patojenitesine 23 yolunda ilk adım, SG200 10 puanlama hızlı hastalığı sağlayan bir solo patojen türdür </&gt; Sup. Cts3 transformasyonu uygun olan streyn arka plana inşa -deletion sonra ikinci seçim levhasının tek koloniler tanısal PCR&#39;ler (Tablo 1) ve Southern blot (Şekil 3) doğru silinmesi için test edildi. İlginçtir ki, homolog rekombinasyon oranı cts3 için AB33 daha SG200 çok daha yüksek oldu, ama bu fark sürekli diğer kitinazlarve silmeleri gözlenmedi. sıkı gerilme doğrulama silme tek ekleme istenilen konumda inşa sağlar. Ancak, nokta mutasyonlar gibi ek modifikasyon fenotipleri yorumunu yanıltmak olabilir tespit edilmeyebilir. Bu nedenle, en azından iki bağımsız transformant fenotiplenir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54522/54522fig1.jpg" /> incir </strong&gt; cts3 ile örneklenen silme stratejisinin ure 1. Genel. Bu şematik genel (silme yukarı kanadı (UF), aşağı kanat (DF) ve genetisin direnç kaseti (G418R), vahşi tipli genomik odağı ile inşa WT içerir ) cts3 silme mutant ve tüm primerler yanı sıra suş doğrulama kullanılan kısıtlama siteleri ve. Vahşi tipli geni kopya varsa direnç kaseti doğru entegre edilmiştir, bir ürünün ilk teşhissel PCR sonuçları, yalnızca iki adet ikinci tanılama PCR ürünler ile sonuçlanabilmektedir. Genomik DNA, PstI ile sindirilir Güney lekesi için, sondalar UF ve DF (kırmızı bar) yabantipte 6.7 kb bant tespiti için önde gelen ve 5.6 kb iki bantları ve mutant 2.0 kb kapsar. Buna ek olarak, DF prob zayıf bir 2.6 kb ürünü tanır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54522/54522fig1large.jpg" target="_blank">Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54522/54522fig2.jpg" /> Şekil 2. reaksiyonu protoplasting mikroskopik doğrulama. (A) İşlenmemiş wild tip hücreleri (fb2) puro şeklinde görünür. Hücre duvarı (30 dakika için için) bozundurucu enzimler ile muamele üzerine (B), yapılar gibi bir ucunda (ler) ve bar-çan yuvarlak küre görünümü, (b) hücre duvarının parçalanması başladığını gösterir. Nihayet protoplastlar hücre duvarının olmaması nedeniyle, hangi tamamen yuvarlak (r) &#39;dir. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54522/54522fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54522/54522fig3.jpg" /> Şekil ure 3. Cts3 silme. Genomik DNA Güney benek Pstl ile parçalanmıştır. Her iki yan yüzler, eşit molar oranlarda karıştırılır ve tek bir prob olarak kullanılır, etiketlenmiştir. Vahşi tipli SG200 ve kitinazlar cts1 ve cts2 kromozom içinde, 6.7 kb&#39;lik bir tek bant tespit edilir. Cts3 silmeler (g ve k), 5.6 kb iki şeritler ve 2.0 kb içinde cts3 doğru silinmesi göstergesidir görebilir. 2.6 kb ek bir bant masif overexposure tarafından görüntülenmiştir olabilir. Bu aşağı kanat prob sadece 100 bp bir çakışma tarafından tanınan bir parçasına tekabül etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54522/54522fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bazı mutasyonlar mikroskobik tespit edilebilir bariz büyüme kusurlarına yol açar. chitinase silmeler olarak, tek mutantlar gösterilecek vermediherhangi bir açık kusur, cts1 iken / 2 çift mutantlar kusur 20 belirgin bir hücre ayırma gösterdi. Septa lekelenmesi sitokinez tamamlandığını gösterdi ama hücreler (Langner ve ark., 2015, Şekil 4) bakiye kitin ile olası bağlı kalmıştır. Benzer bir mikroskopik bir büyüme fenotipi khd4 24 silinmesi için bilinen, morfoloji ve patojenisite 25 yer alan genlerin transkripsiyon sonrası, RNA ciro aracılık bir RNA bağlayıcı proteini kodlayan bir geni içerir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54522/54522fig4.jpg" /> Silme mutantları Şekil 4. mikroskobik analizi. Kitinaz silinmesi soylarının hücre morfolojisi ve septum oluşumu. Cts1 / 2 Δ soyları bir hücre ayırma kusur sergiler ve septum oluşumu olmaması nedeniyle değil büyük topaklar oluşturur. Birincil ve ikincilsepta (ilavelerde 5x büyütme bakınız) Kalkoflor Beyaz (CW) mikroskop önce ile boyandı. Ölçek çubukları 10 mikron =. Bu rakam Langner ve ark., 2015 Ökaryotik Hücre 20 izniyle edilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54522/54522fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> virülansa kitinazlar katkısı test etmek için, Tohum enfeksiyonları deneyleri SG200 streyn arka mutantları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Khd4 yılında mutantlar virülans azalmış iken, kitinazlarve silinmesi (Şekil 5) 20,25 mısır fidelerinin enfeksiyonu etkilemedi. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54522/54522fig5.jpg" /> Silme mutantların Şekil 5. Enfeksiyon tahlil. Hastalık değerlendirmesimısır fideleri 9 gün ilgili U. ile enfeksiyondan sonra suşları Maydis&#39;in. (A) Hastalık puanlama için kullanılan makroskobik belirtiler. (B) iki bağımsız transformant, her bir suş (N&gt; 100) için test edilmiştir. Tüm kitinaz eksikliği mutantları (1/2 / 3Δ: üçlü mutan endochitinases, 4Δ: tekil mutant K-asetilglukozamınıdaz 1/2/3 / 4Δ: dörtlü mutantı) ile vahşi tip enfeksiyonlarda görülen ağır tümör oluşumuna yol açan ana bitki ile enfekte solopathogenic gerilme SG200. Daha önce belirtildiği gibi, 24 aksine, bir RNA-bağlayıcı protein Khd4 kodlayan genin çıkarılması taşıyan bir soy virülans indirgendi. Hata çubukları, üç bağımsız deneyin standart sapma gösterir. Bu rakam Langner ark izni ile değiştirilir. 2015 Ökaryotik Hücre 20. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54522/54522fig5large.jpg" target="_blank">Büyük görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın r sürümü. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> genetik arka plan </td><td> 1. diagnostik. PCR (hariç / test) </td><td> 2. diagnostik. PCR (teyit / test) </td><td> Güney (teyit / test) </td><td> % Recomb. </td></tr><tr><td> AB33 </td><td> 7/22 </td><td> - </td><td> 7/15 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> AB33 cts1 Δ </td><td> 19/24 </td><td> - </td><td> 5/5 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> SG200 </td><td> 0/10 </td><td> 8/10 </td><td> 7/8 </td><td> 70 </td></tr><tr><td> SG200 cts1 Δ </td><td> 0/20 </td><td> 19/20 </td><td> 14/19 </td><td> 70 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Cts3 silme işlemleri için gerilme doğrulama kitinaz geni cts3 tekli ve çoklu silmeler filamentöz büyüme (AB33) ve enfeksiyon (SG200) çalışmalarını sağlamak için, dört farklı genetik geçmişlerde silindi.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions at JoVE.com

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetik Ustilago Maydis&#39;in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

genetic-manipulation-plant-pathogen-ustilago-maydis-to-study-fungal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

14.4K Görüntüleme.  Heinrich-Heine University Düsseldorf.  Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir. 

Video: Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is a biotrophic fungal pathogen and the causal agent of corn smut on maize. This disease is responsible for significant yield losses of approximately $1.0 billion annually in the U.S.1 Several methods including crop rotation, fungicide application and seed treatments are currently used to control corn smut2. However, host resistance is the only practical method for managing corn smut. Identification of crop plants including maize, wheat, and rice that are resistant to various biotrophic pathogens has significantly decreased yield losses annually3-5. Therefore, the use of a pathogen inoculation method that efficiently and reproducibly delivers the pathogen in between the plant leaves, would facilitate the rapid identification of maize lines that are resistant to U. maydis. As, a first step toward indentifying maize lines that are resistant to U. maydis, a needle injection inoculation method and a resistance reaction screening method was utilized to inoculate maize, teosinte, and maize x teosinte introgression lines with a U. maydis strain and to select resistant plants.
Maize, teosinte and maize x teosinte introgression lines, consisting of about 700 plants, were planted, inoculated with a strain of U. maydis, and screened for resistance. The inoculation and screening methods successfully identified three teosinte lines resistant to U. maydis. Here a detailed needle injection inoculation and resistance reaction screening protocol for maize, teosinte, and maize x teosinte introgression lines is presented. This study demonstrates that needle injection inoculation is an invaluable tool in agriculture that can efficiently deliver U. maydis in between the plant leaves and has provided plant lines that are resistant to U. maydis that can now be combined and tested in breeding programs for improved disease resistance.

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

The use of a needle injection method to inoculate maize and teosinte plants with the biotrophic pathogen Ustilago maydis is described. The needle injection inoculation method facilitates the controlled delivery of the fungal pathogen in between the plant leaves where the pathogen enters the plant through the formation of appresoria. This method is highly efficient, enabling reproducible inoculations with U. maydis.

Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Çevre

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular gene&#39;s function in the living organism. In this protocol the OSCAR method of precise and rapid deletion plasmid construction is described. OSCAR relies on the cloning system in which a single recombinase reaction is carried out containing the purified PCR-amplified 5&#39; and 3&#39; flanks of the gene of interest and two plasmids, pA-Hyg OSCAR (the marker vector) and pOSCAR (the assembly vector). Confirmation of the correctly assembled deletion vector is carried out by restriction digestion mapping followed by sequencing. Agrobacterium tumefaciens is then used to mediate introduction of the deletion construct into fungal spores (referred to as ATMT). Finally, a PCR assay is described to determine if the deletion construct integrated by homologous or non-homologous recombination, indicating gene deletion or ectopic integration, respectively. This approach has been successfully used for deletion of numerous genes in Verticillium dahliae and in Fusarium verticillioides among other species.

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Gene deletion mutants generated through homologous recombination are the gold standard for gene function studies. The OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) method for rapid generation of deletion constructs is described. Agrobacterium mediated fungal transformation follows. Finally, a PCR based confirmation method of gene deletions in fungal transformants is presented.

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi<em&gt; Agrobacterium</em&gt; OSCAR Silme Yapılarının Aracı Dönüştürülmesi

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

Genetik

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast permitting in vivo phenotypic analysis. This method does not rely on maize transformation but exploits microbial genetics and secretory capabilities of pathogens. Herein, it allows inspection of in vivo delivered secreted proteins with high spatiotemporal resolution at different kinds of infection sites and tissues. The Trojan horse strategy can be utilized to transiently complement maize loss-of-function phenotypes, to functionally characterize protein domains, to analyze off-target protein effects, or to study onside protein overdosage, making it a powerful tool for protein studies in the maize crop system. This work contains a precise protocol on how to generate a Trojan horse strain followed by standardized infection protocols to apply this method to three different maize tissue types.

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

This work describes the cloning of an Ustilago maydis Trojan horse strain for the in situ delivery of secreted maize proteins into three different types of maize tissues.

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are potent carcinogens that substantially reduce crop value in maize and other oil rich crops like peanut besides posing serious threat to human and animal health. Different approaches, including traditional breeding, transgenic expression of resistance associated proteins, and RNA interference (RNAi)-based host-induced gene silencing of critical A. flavus gene targets, are being evaluated to increase aflatoxin resistance in susceptible crops. Past studies have shown an important role of &#945;-amylase in A. flavus pathogenesis and aflatoxin production, suggesting this gene/enzyme is a potential target to reduce both A. flavus growth and aflatoxin production. In this regard, the current study was undertaken to evaluate heterologous expression (under control of the constitutive CaMV 35S promoter) of a Lablab purpureus L. &#945;-amylase inhibitor-like protein (AILP) in maize against A. flavus. AILP is a 36-kDa protein, which is a competitive inhibitor of A. flavus &#945;-amylase enzyme and belongs to the lectin&#8211;arcelin&#8211;&#945;-amylase inhibitor protein family in common bean. In vitro studies prior to the current work had demonstrated the role of AILP in inhibition of A. flavus &#945;-amylase activity and fungal growth. Fungal growth and aflatoxin production in mature kernels were monitored in real time using a GFP-expressing A. flavus strain. This kernel screening assay (KSA) is very simple to set up and provides reliable and reproducible data on infection and the extent of spread that could be quantified for evaluation of germplasm and transgenic lines. The fluorescence from the GFP strain is closely correlated to fungal growth and, by extension, it is well-correlated to aflatoxin values.&#160; The goal of the current work was to implement this previous knowledge in a commercially important crop like maize to increase aflatoxin resistance. Our results show a 35%&#8211;72% reduction in A. flavus growth in AILP-expressing transgenic maize kernels which, in turn, translated into a 62%&#8211;88% reduction in aflatoxin levels.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Here we present a protocol to analyze Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in maize kernels expressing an antifungal protein.&#160; Using a GFP-expressing A. flavus strain we monitored the infection and spread of the fungus in mature kernels in real time. The assay is rapid, reliable, and reproducible.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

Aspergillus oryzae, a filamentous fungus, is one of the most widely used hosts for industrial applications including large-scale production of proteins. A polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation method is generally used for the introduction of heterologous genes into A. oryzae. The conventional method typically requires three weeks for the screening of favorable transformants. Here, a new technique, the direct liquid-culture (DLC) screening method, is introduced which reduces the screening time to six days in a 200 mL flask format or to 10 days in a 24 well microplate format. The DLC screening method ensures the acquisition of positive transformants and evaluation of the secretory production of heterologous proteins in a single step, unlike the conventional screening method where two separate steps are required for the same. The protocol for PEG-mediated protoplast transformation of A. oryzae is described, which consists of five steps: preparation of fresh spore suspension, preculture, preparation of protoplasts, introduction of DNA, and DLC screening. For successful results in DLC screening, it is critical to use a nutrient-rich medium with optimized osmotic pressure. The protocol should further popularize the use of A. oryzae as a host of choice in the industrial production of proteins.

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

A direct liquid-culture (DLC) screening method has been developed which significantly reduces the time required for polyethylene glycol (PEG)-mediated protoplast transformation of the filamentous fungus, Aspergillus oryzae, when employed for evaluation of the secretory production of heterologous proteins. This method dramatically increases the throughput of the evaluation protocol.

Aspergillus oryzae, a filamentous fungus, is one of the most widely used hosts for industrial applications including large-scale production of proteins. A ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Biyomühendislik

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Yoluyla mantarlarda hızlı Silme Üretimi

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Genetik Manipülasyon

Direct Liquid-Culture Screening for Evaluating the Production of Heterologous Proteins Using an Auxotrophic Mutant of Aspergillus Oryzae

Filamentöz Ascomycete Huntiella omanensis'te CRISPR-Cas9 Aracılı Genom Düzenleme

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme