We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

NOT: Hastalar Hücre Komitesi çalışmayı onayladı Kök Kurumsal Değerlendirme Kurulu ve insan pluripotent katılmak için bilgilendirilmiş onam vermelidir. 1. İzolasyon ve Kültürü TILS <ol><li> patoloji servisi / doku tedarik çekirdekten histopatolojik tanı için gerekli değildir tümör materyal elde. 30 mi, tümör toplama ortamı (Tablo 1) 50 ml bir tüp içinde tümör numunelerinin 20-100 g yerleştirin. </li><li> Katı, sert, makas kullanarak kırılgan ve / veya kanlı nekrotik alanlar tümör örneğinin normal doku teşrih. nekrotik doku çıkarıldıktan sonra, mümkün olduğu kadar küçük örnek kıymaya makas kullanın. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir ayıracı ve tümör ayrılma kiti (insan) ile tek bir hücre süspansiyonu içine kıyılmış örnek ayrıştırmaları. 50 ml&#39;lik bir tüp ayarlanır 70 mikron hücre süzgecinden ile süspansiyonu Filtre ve süzgeç 2 kez yıkayınRPMI 1640 2 mi. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve T hücre ortamı (Tablo 1), 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Bu Ficoll% 100 gradyan çözeltisi, 10 ml daha düşük bir adımı ve Dulbecco fosfat- ile seyreltildi% 75 gradyan çözeltisi 30 ml&#39;lik bir orta aşama ile 50 ml bir tüp içinde (gradyan çözeltisi) gibi bir iki-aşamalı gradyan çözeltisi hazırlayın tamponlu tuzlu su, herhangi bir kalsiyum, Resim magnezyum (D-PBS (-)). </li><li> (Adım 1.5 dan itibaren) gradyan çözümü (Adım 1.4) hücre süspansiyonu Katman. 45 dakika boyunca 20 ° C&#39;de 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> % 100 gradyan çözeltisi ve 50 ml&#39;lik bir tüp içinde% 75 gradyan çözeltisi arasında arayüzde zenginleştirilmiş TILS içeren tabakayı toplayın. D-PBS 20-30 ml ekleyerek zenginleştirilmiş TILS çözelti tabakası seyreltilmiş (-). </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atın ve 10 ml TIL zenginleştirilmiş fraksiyonu tekrar süspansiyonT hücre ortamı. </li><li> Kültür, 37 ° C &#39;de 6-çukurlu plaka içindeki 2 T hücre ortamı ml ve 6.000 lU / ml rekombinant insan (rh), IL-2 ile (Aşama 1.8) fraksiyonu,% 5 CO2. </li><li> Kültür başlangıcından 5 gün sonra yarım medya değiştirin ve daha sonra her 2-3 günde bir. </li><li> 1 oranında hücreleri bölme: 2 trypsinization olmadan usulca% 80-90 confluency ulaştığında kuyu sayısını iki katına, askıya sonra. 6000 lU / ml taze T hücresi ortam ve rhlL-2 yarım hacmi (1 mi) eklenir. </li></ol> Mitomisin-C ile tedavi edilen SNL Besleyici Hücre Plate 2. Hazırlık <ol><li> % 80-90 (3-4 x 10 6 hücre) kadar% 0.1 jelatin kaplı 10 cm tabak üzerine SNL besleme hücre ortamı (Tablo 1) 10 ml kültür SNL besleme hücreleri ulaşılır. </li><li> Şirketinden SNL besleyici hücre kültürü çanağı içinde 0.4 mg / ml mitomisin C çözeltisi 310 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de 2 saat ve 15 dakika için,% 5 CO2 inkübe edilir. medya a aspireND, 5 ml D-PBS ile iki kez yıkama hücreleri (-). </li><li> 0.5 mi% 0.25 tripsin / 1 mM EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edin. nötralize etmek SNL besleyici hücre medya 4,5 ml ekleyin ve bir tek süspansiyon içine hücreleri yeniden askıya. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri aktarın. ortamı aspire ve SNL besleyici hücre ortamının 10 ml&#39;si içinde tekrar süspansiyon haline sonra hemasitometre ile hücre sayımı. </li><li> Plaka 1.5 x 10 6, 10 cm tabak üzerine SNL besleyici hücreler göz başına hücre ve 37 ° C&#39;de inkübe,% 5 CO2. 3 gün içinde SNL besleyici hücreler kullanın. </li></ol> Sendai Virüs kullanılması iPSCs 3. Nesil (SeV) Vektör <ol><li> Hasat TILS ve plaka bağlı fare anti-insan CD3 (1 ug / ml) ile TILS 5 x 10 5 hücre aktive ve çözünebilir fare anti-insan CD28 (ug / ml 5 ug) (Kademe 1.11 arasında), rhlL-2 3 &#39;ucunda bir 6-yuvalı plaka içinde, T hücre ortamı 2 ml (6.000 lU / ml)7 ° C, 5 gün süreyle% 5 CO 2. </li><li> bir pipet kullanılarak 15 ml bir tüp içinde (Kademe 3.1) TILS hasat ve bir hemositometrede hücre sayısını. </li><li> 500 ul rhlL-2 ile 1 tabak bağlı fare anti-insan CD3 (1 ug / ml) ile TILS x 10 5 hücre ve çözünebilir fare anti-insan CD28 (5 ug / ml), (60 lU / ml) Yeniden 37 ° C&#39;de 24 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına yeniden programlama ortamı (Tablo 1), 24 saat boyunca% 5 CO2. SeV enfeksiyonu 3 kuyu hazırlayın: OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc (1 de); SeV enfeksiyonu (GFP: yeşil floresan protein) (1 kuyu); ve hücre sayımı (1 kuyu). </li><li> (Kademe 3,3) 24 saat sonra, bir hemasitometre hücre sayısını ve enfeksiyonun çeşitli (3-20) çokluklar (İB) için her virüsün hacmini belirler. -80 ° C depolama Sendai virüsü vektörü tüpler bir set çıkarın. su banyosunda (37 ° C) hızla SeV vektörleri çözülme ve buz üzerine koyun. Virüsün hacmi (ul)= İçişleri Bakanlığı (UKÜ / hücre) virüsünün / titre hücrelerinin sayısı x (UKÜ / ml) x 10-3 (ul / ml) </li><li> aktif TILS de dahil olmak üzere ortam içine 10-20 MOI&#39;da SeV vektörlerinin bir karışımın ilave edilmesiyle tek tek OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc taşıyan dört Sendai virüsü vektörü tüplerinin her hesaplanan miktarlar ekleyin. </li><li> transdüksiyon etkinliğini belirlemek için, aktive edilmiş TILS bir kuyuya SeV-GFP hesaplanan miktarlar ekleyin. </li><li> (Kademe 3.5 ila 3.6 adım) tabağına yerleştirin, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübatörde. 24 saat sonra, floresan mikroskobu altında sev-GFP ile enfekte edilmiş TILS kullanılarak enfeksiyonun etkinliğini tahmin ediyoruz. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde (Kademe 3.5 ila) hücreler toplanır. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant atılır ve primat ES hücre ortamı ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile HESC ortamın 0.5 ml pelletini. </li><li> Conta 10 cm çanak içine süspansiyon aktarınINS HESC ortam, 10 ml SNL besleyici hücreler mitomisin C ile muamele edilmiş. koloniler yetiştirilen kadar her gün HESC ortamı değiştirmek. </li><li> 21 gün 18 civarında, temiz tezgah 10 ul ucu kullanarak bir mikroskop altında koloniler etrafında SNL besleyici hücreleri çıkarmak. </li><li> 10 ul ucu ile koloniler kazıyın ve 96 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna iPSCs ortam 100 ul bir 200 ul ucu kullanarak transfer edin. Pipet yukarı ve 2-3 kez aşağı 50-100 mikron ortalama boyutu küçük kümeleri içine koloniler kırmak için. </li><li> Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF, 4 ng / ml) ile iPSCs ortam oyuk başına 2 ml (Kademe 2 de) mitomisin C ile muamele edilmiş SNL besleyici hücreler 6 oyuklu doku kültürü plakaları halinde küçük öbekler aktarın. Her gün iPSCs ortamı değiştirmek. </li><li> 5-6 gün 1 mg / ml kollajenaz IV, taze, mitomisin-C ile tedavi edilen SNL besleyici hücreler 6 oyuklu doku kültür plakalarına iPSCs aktarın. Immun her klon plakaları başına 2 kuyu hazırlayınostaining. </li><li> Pluripotency belirteçlerinin (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 ve Zeiss OCT3 / 4) 1 immünohistokimyasal boyama ile her klon tam yeniden programlanması belirleyin. NOT: Pluripotency potansiyelinin daha fazla değerlendirilmesi için, tam yeniden programlanması iPSC hatları bir embriyoid vücut oluşumu ve farklılaşma tahlil ya da bir teratom oluşum deneyi 16 tarafından üç germ içine ayırt edebilirsiniz onaylayın. </li><li> Tam yeniden programlanması iPSC hatları sitogenetik analizi ile normal karyotipe göstermek onaylayın. </li><li> Teratom oluşumu için, farklılaşmamış bir TIL türetilmiş IPSC DMEM 6-8 haftalık dişi NOD / SCID farelerinin deri altı doku içine% 10 FCS içeren 100 ul (1 x 10 6) süspansiyonu enjekte edilir. hematoksilen ve eozin ile leke teratom bölümleri. </li></ol> SSEA3, SSEA4, TRA1-60 ve TRA1-81 için iPSCs 4. immünofloresan boyama <ol><li> Yıkama 1 ml PBS ile iPSCs ve% 4 pa 1 ml iPSCs gidermek10 dakika boyunca raformaldehyde çözeltisi. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve PBS 3 kez 1 ml iPSCs yıkayın. NOT: toksik olduğu için paraformaldehid kullanırken dikkatli olun. </li><li> 30 dakika süre ile tampon (Tablo 1) engelleme iPSCs ön muamele. Bu arada, PBS ve Triton® X ile seyreltildi primer antikor (fare anti-insan SSEA3, fare anti-insan SSEA4, fare anti-insan TRA1-60 ve fare anti-insan TRA1-81) 01:50 1.5% keçi serumu çözeltisi seyreltilmiş -100 (toplam hacim: 1 ml). </li><li> Engelleme tampon (Tablo 1) sökün. seyreltilmiş birincil antikor solüsyonu ilave edildi ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Diğer taraftan, ikincil antikor (anti-fare IgG ve IgM veya anti-sıçan IgM) 01:50% 1.5 keçi serumu çözeltisi seyreltilir. </li><li> seyreltilmiş primer antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika için 1 ml PBS 3 kez, her biri iPSCs yıkayın. seyreltilmiş sekonder antikor solüsyonu eklenir ve karanlık bir odada, oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir. </li&gt; <li> seyreltilmiş sekonder antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS 3 kez 1 ml, her biri iPSCs yıkayın. mikroskobik inceleme ile iPSCs gözlemleyin. </li></ol> Oct3 için iPSCs 5. İmmünofloresan Boyama / 4 <ol><li> Yıkama 1 ml PBS ile iPSCs ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 ml iPSCs düzeltin. % 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve PBS ile 3 kez iPSCs yıkayın. </li><li> Permeabilizasyon tamponu (Tablo 1) ilave edilir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Permeabilizasyon tamponu çıkarın ve tampon (Tablo 1) bloke ekleyin. </li><li> 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu arada bloklama tamponunu birincil antikor (fare anti-insan Oct3 / 4) 1:50 seyreltin. </li><li> seyreltilmiş birincil antikor solüsyonu eklenir ve gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> seyreltilmiş primer antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS ile 1 ml 3 kez, her biri iPSCs yıkayın. Bu arada, di(Anti-fare IgG / IgM keçi) Ud ikincil antikor 1: 100 blokaj tamponunda. </li><li> seyreltilmiş sekonder antikor solüsyonu ilave edin ve 45 dakika için karanlık bir odada, oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> seyreltilmiş ikincil çözelti çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS 3 kez 1 ml, her biri iPSCs yıkayın. mikroskobik inceleme altında iPSCs uyun. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8(+)+T+Cells.">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li><li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li><li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients.">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li><li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8(+)+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors.">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy.">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11 (2016).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+(iPSCs)+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors.">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li><li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood.">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada, OCT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc, dört transkripsiyon SeV aracılı transdüksiyonu ile iPSCs için melanom TILS yeniden programlanması için bir protokol faktörleri gösterdi. Bu yaklaşım, T hücrelerini yeniden programlamak için SeV sistemi kullanılarak olmayan bir entegre yöntem 7 olanaklar sunar. Bir önceki çalışma SeV yeniden programlama sistemi fibroblastlar değil, aynı zamanda periferik kan T hücrelerini 7,17 sadece yeniden programlamak yüksek verimli ve güvenilir olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, son zamanlarda daha farklılaşmış ve Pd-1, SeV 16 vektörleri kullanılarak yeniden olabilir periferal kan T-hücreleri daha inhibitör reseptörleri yüksek seviyelerde ifade eden bu melanom TILS göstermiştir. SeV vektörü ile, anti-CD3 / CD28 ile uyarım ve sepsis yeniden programlama TILS kritik olmuştur. Periferal kan T-hücreleri, konu 7 whil gelen hasat hemen sonra yeniden programlanması için anti-CD3 ve IL-2 ile uyarılan edilebilire TILS uyarılmadan önce, IL-2, 3-4 hafta içinde kültüre edilmesi gerekebilir. TILS fazla% 99 CD8 T hücreleri, IL-2 ve anti-CD3 ile aktivasyon kültür 3-4 hafta sonra rağmen / CD28 16 biz iPSCs TCR düzenlenmesi analizi iPSCs TILS vardır oluşturulan onaylamak için önerilmiştir (Şekil 5). Unutmayın ki, bizimki de dahil olmak üzere önceki çalışmalarda her iPSCs periferik kan mononükleer hücrelerinden sev kullanılarak oluşturulan belirtti veya TILS TCR yeniden düzenlenmesi 7,16 vardı. Melanom TILS gelen iPSCs üretimi mümkün olmasına rağmen, periferik kan T-hücrelerinin (% 0.1) 7 daha 16 melanom TILS yeniden programlanması verimi düşük (0.01-0.05%) olduğu bulunmuştur. Bunun nedeni belirsizliğini koruyor, ancak inhibitör reseptörlerin yüksek ifadesi veya TILS 13,16 farklılaşan T-hücre alt daha fazla sayıda ile ilişkili olabilir. Son önemli bir ilerlemeyeniden programlama tekniği TIL-iPSCs üretimi için yeniden programlama verimini arttırabilir. İkinci nesil SeV vektörü TS12KOS, önceki çalışmada 18,19 kullanılan geleneksel SeV vektörü daha iPSC nesil daha yüksek verimine sahip olduğu görülmüştür. Bir SeV yeniden programlama sistemi ile insan iPSCs türetilmesi mümkün olmasına rağmen, bu protokolde dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. Biz bu protokolü SeV enfeksiyonu sırasında fetal sığır serumu kullanın. Biz TILS benzer proliferasyonu rağmen fetal bovin serumu ile bir oranla SeV enfeksiyonu sırasında insan serumu ile ortam kullanılıyorsa, melanom TILS yeniden programlanması etkinliği önemli ölçüde daha düşük olduğu bulunmuştur. Biz de iPSC üretimi ve bakımı için bir fare besleyici tabaka kullanabilirsiniz, ancak tanımlanmış bir besleyici içermeyen ve xeno-free sistemi gelecekteki çalışmalarda alternatif yöntemler olabilir. Bu iPSCs üretmek için tümör hasat zamanından itibaren iki ay sürermelanom TILS dan. Buna ek olarak, bu transgen içermeyen iPSCs elde etmek için ek 1-2 ay sürer. Bu daha verimli bir virüs eliminasyon hızını 19 göstermiştir SeV vektörü, TS12KOS, yeni tip kullanımı ile kısaltılabilir. Sonuç olarak, melanom TILS insan iPSCs üretilmesi mümkündür. Geçerli protokol adoptif T hücresi terapisi için tümöre özel T hücrelerinin sonsuz sayıda üretilmesi için önemli bir adım olabilir.

Transkripsiyon faktörleri, tanımlanmış bir dizi aşırı ekspresyonu ile uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretilmesini sağlar Hücresel yeniden programlama teknolojisi hücre bazlı terapiler 1,2 alanında büyük ümit vaat etmektedir. Bu iPSCs transkripsiyonel ve epigenetik özelliklerini sergilemek ve benzer embriyonik kök hücreleri (EKH) 3-5 kendini yenileme ve pluripotensin kapasitesine sahip. Geçtiğimiz on yıl içinde yeniden programlama teknolojisi yapılan kayda değer ilerleme bize bile böyle T hücreleri 6-8 olarak terminal olarak farklılaşmış hücreler, insan iPSCs oluşturmak için izin verdi. T hücresi-kaynaklı iPSCs (TiPSCs) TiPSCs 9-11 antijen-spesifik T hücrelerinin yenilenmesini sağlayan özgün T hücreleri gibi T hücresi reseptörü (TCR) zincir genlerinin aynı yeniden düzenlenmiş konfigürasyonunu muhafaza eder. melanom süzücü limfositlerin yaklaşık% 80 (TILS), bir hastanın tümör spesifik tümör bağlantılı antijenleri tanıyan eldeND, orijinal Kanser hücreleri 12 karşı sitotoksisite korumak. Özellikle, TILS ile programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) ifadesi mutasyona uğramış neoantijen özgü CD8 + 13 lenfositlerin dahil olmak üzere, otolog tümör reaktif repertuarı tespit bulunmuştur. Hazırlayıcı lymphodepleting rejimleri ve interlökin-2 (IL-2), sistemik tatbikat ile kombinasyon halinde, ex-vivo genişletilmiş otolog TILS adoptif nakli hastalarında 14 alt-metastatik melanom büyük gerilemesine neden olabilir. klinik öncesi modellerde ve hastalarda cesaret verici sonuçlar rağmen, yoksul infüzyon T hücrelerinin hayatta kalma ve bağışıklık baskılayıcı yolların varlığı evlatlık T hücre tedavisi tam potansiyelini tehlikeye görünmektedir. Mevcut klinik protokoller sayıda elde edilmesi için otolog T hücrelerinin geniş bir ex vivo işleme gerektirir. Bu sonuç, zayıf yaşam süresine sahiptir terminal olarak farklılaşmış T hücreleri, indirgenmiş Proteinlerin üretimi ile sonuçlanıriferative kapasitesi ve PD-1 15 yüksek düzeyde. adoptif T hücresi tedavisinin Bu sınırlama teorik immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız kaynağı sağlayabilir iPSCs kullanılarak aşılabilir. Son zamanlarda Sendai virüsü (sev) dört transkripsiyon faktörlerinin aracılı transdüksiyonu, OKT3 / 4, Sox2 Klf4 ve c-myc 16 PD-1 yüksek seviyede ifade eden melanoma TILS yeniden programlamayı bildirmiştir. retrovirüs vektörleri yeniden programlama genleri ifade etmek konak kromozom entegrasyonu gerektiren ederken, SeV vektörleri olmayan entegre ve sonunda sitoplazmaya çıkarılmıştır. Verimliliği yeniden programlanması lentivirüs veya retrovirüs vektörleri 6-8 ile karşılaştırıldığında SeV sistemi ile çok daha yüksektir. Lentivirüs veya retrovirüs vektörleri tarafından üretilen bazı iPSC klonlar nonlymphoid soy 6-8 arasında olabilir iken Ayrıca, SeV özel olarak ise, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) T hücreleri yeniden programlamak için. Burada, detayprosedürler insan melanoma TILS izolasyonu ve aktivasyonu için bir SeV yeniden programlama sistemi kullanılarak TIL türetilmiş iPSCs üretimi için uyguladı.

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>human AB serum</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus vector</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL feeder cells</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycin C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>soluble in water (0.5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gelatin</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes

Ex vivo Evlatlık transferi metastatik melanom hastalarında önemli alt gruplarında dayanıklı ve tam yanıtlara aracılık edebilir otolog tümör infiltre lenfositleri (TILS) genişletti. Bu yaklaşımın en önemli engeller telomerik kaynaklanan transfer T hücrelerinin, azalmış canlılığı, ve TILS sınırlı sayıda hastadan elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu daha az farklılaşmış T hücrelerinin çok sayıda üretilmesi problemlidir, uzun telomerlerin ile daha az farklılaşmış T hücreleri adoptif T hücresi terapisi için ideal bir T hücresi alt kümesi olabilir. adoptif T hücresi tedavisinin bu sınırlama teorik kullanılarak uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) aşılabilir, kendi kendini yenileme pluripotense, uzamış telomer korumak ve immünoterapi için otolog T hücrelerinin sınırsız bir kaynak sağlar. Burada, TILS içine yeniden programlama faktörleri iletimi için Sendai virüsü vektörleri kullanılarak iPSCs üretmek için bir protokol mevcut. Bu protokol oluşturmakTamamen yeniden programlanması, vektör ücretsiz klonlar s. Bu TIL türetilmiş iPSCs adoptif T hücre tedavisi için daha az farklılaşmış hastaya ve tümör-spesifik T hücrelerini elde etmek mümkün olabilir.

Şekil 1, anti-CD3 / CD28 ile aktivasyon ve TILS için OKT3 / 4, Klf4 Sox2 ve c-myc gen transferi takip etmektedir rhlL-2 melanom TILS, ilk genişleme içerir prosedür genel görünüşünü göstermektedir iPSCs üretimi için. Genellikle, rhIL-2 başlaması ile birlikte kültür üzerine TILS küreler kültür başlandıktan sonra 21-28 gün oluşturmak için. Bu noktada, TILS anti-CD3 ile aktif hale hazırız / CD28. Şekil 2A kültürü TILS, rhIL-2 günde 21 ile aktive edilecek hazır gösterileri, anti-CD3 / CD28. Şekil 2B GFP giriş gösterir 20 transfekte Sendai virüsü (SeV) tarafından İçişleri Bakanlığı. Şekil 2C 18-21 gün SeV enfeksiyondan sonra görüntülenen SNL besleyici hücreler üzerinde tipik bir pluripotent klon gösterir. Şekil 2B oluşturulan TIL türetilmiş iPSCs normal karyotipe sahip olduğunu göstermektedir. 3 gösterileri Şekil immunofluorescent boyama p onaylamak içiniPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 ve OCT3 / 4) ile ilgili luripotency markör ifade. Şekil 4, melanom TILS türetilen iPSCs üç germ hücreleri, çeşitli içeren teratom oluşturabildiği gösterir (nöral doku, solunum epiteli ve kıkırdak). Til türetilmiş iPSCs TCR düzenlenmeleri korumak oluşturulan 5 gösterileri Şekil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig1.jpg" /> Şekil 1:. Melanom TILS gelen iPSCs nesil şematik genel protokolü üç aşamadan oluşur: IL-2 ile izolasyon ve TILS kültür, anti-CD3 / CD28 ve Sendai virüsü ile bir hücrenin yeniden programlanması ile T-hücresi aktivasyonu (sev) vektör kodlama Zeiss OCT3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-MYC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <p<html> keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt;: fo class = &quot;jove_content&quot; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig2.jpg" /> Şekil 2:. Melanomadan iPSCs oluşturulması TILS (A) rhlL-2 TILS morfolojisi gösteren bir görüntü de kültür başlangıcından 2-3 hafta sonra genişlemeye başladığı zaman. (B) SeV enfeksiyondan sonra TILS bir gün morfolojisi ve GFP temsil Görüntüler. (C) SeV enfeksiyonundan sonra 21. günde tipik ESC benzeri iPSC koloni. Ölçek çubukları 200 mikron =. (D) melanom TILS türetilen iPSCs birinden yirmi G-bantlı metafaz hücrelerinde sitogenetik analizi. Şekil (D) Saito ve ark 16 uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3:., Kök hücre pluripotent belirteçleri ile imuno lekeleme immünoflüoresans tahlili iki hastadan alınan TIL türetilmiş iPSCs SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 ve OCT3 / 4 pozitif olduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm.The rakam Saito ve ark 16 uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54375/54375fig4.jpg" /> Şekil 4:. (NOD / SCID farelerine 6 hafta enjeksiyon sonrası) TIL türetilmiş iPSCs klondan türetilen teratom oluşumu Hematoksilen ile iPSCs ve eozin lekeli Örnek teratom bölümleri için pluripotensin teyit gösterilmiştir. Saito ve diğ 16 uyarlanmıştır Şekil..com / files / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54375/54375fig5.jpg" /> Şekil 5:. TIL-iPSCs til-iPSCs TCR-β gen düzenlemesi TCR-β gen düzenlemesi desen çok çeşitli kapiler elektroforez ile tanımlanır. yeşil çizgi Jβ1 geni için bant elde edilir ve mavi çizgi Jβ2 geni için bant elde edilir. Şekil Saito ve ark 16 uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54375/54375tbl1.jpg" /> Tablo 1: T hücresi, yeniden programlama, t için bileşimumor SNL besleyici hücre ve iPSC medya ve permeabilization ve engelleme tamponlar, toplama. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375tbl1large.jpg" target="_blank">Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes at JoVE.com

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Görüntüleme.  University of Michigan. The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Video: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Gelişim Biyolojisi

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Kanser Araştırmaları

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Tıp

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, there is no effective long-term treatment for vitiligo. Therefore, it is imperative to develop a convenient and effective treatment for vitiligo. Regenerative medicine technology for direct reprogramming of skin cells into melanocytes seems to be a promising novel treatment of vitiligo. This involves the direct reprogramming of the patient's skin cells into functional melanocytes to help ameliorate the loss of melanocytes in patients with vitiligo. However, this method needs to be first tested on mice. Although direct reprogramming is widely used, there is no clear protocol for direct reprogramming into melanocytes. Moreover, the number of available transcription factors is overwhelming. 
Here, a concentrated lentivirus packaging system protocol is presented to produce transcription factors selected for reprogramming skin cells to melanocytes, including Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9, and Snai2. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were infected with the concentrated lentivirus for all these transcription factors for the direct reprogramming of the MEFs into induced melanocytes (iMels) in vitro. Furthermore, these transcription factors were screened, and the system was optimized for direct reprogramming to melanocytes. The expression of the characteristic markers of melanin in iMels at the gene or protein level was significantly increased. These results suggest that direct reprogramming of fibroblasts to melanocytes could be a successful new therapeutic strategy for vitiligo and confirm the mechanism of melanocyte development, which will provide the basis for further direct reprogramming of fibroblasts into melanocytes in vivo.

Here, we describe an optimized direct reprogramming system for melanocytes and a high-efficiency, concentrated virus packaging system that ensures smooth direct reprogramming.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hasta Kaynaklı Melanom Organoidleri: Kanser İmmünoterapisinde Bir Sınır

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İmmünoterapi Değerlendirmesi için Hastadan Elde Edilen Organoidlerle Melanom Karmaşıklığını Yeniden Yaratmak

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması