Name: preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug micelles
Uploaded: 2016-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles at JoVE.com

This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.

DOX-PA 1. Sentezi <ol><li> Doksorubisinin 390 mg ve palmitik asit hidrazid 243 mg ağırlığında ve yuvarlak dipli bir şişeye aktarın. </li><li> cam şırınga ile şişeye susuz metanol 150 ml ekleyin. bir pipet ile trifloroasetik asit (TFA) 39 ul ekle. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak, karanlıkta, oda sıcaklığında 18 saat boyunca reaksiyon karışımının karıştırın. NOT: Reaksiyon malzemelerin miktarları kadar ölçeklendirilebilir veya aşağı DOX-PA farklı miktarlarda elde etmek için. reaktiflerin oranı, aynı oranlarda muhafaza edilmelidir. 78 mg 1.170 mg aralığında DOX miktarlar kullanılarak reaksiyonlar düzenli kimya laboratuvar gerçekleştirilebilir. </li><li> Bir silika jel kolonu kullanılarak DOX-PA ile saflaştırılması. 17. <ol><li> Bir dönen buharlaştıncı ile reaksiyon karışımında çözücüyü çıkarın. Karışımın hacmi yaklaşık 20 ml azaltılmış sonra, silika jel, 3 g ekleyin. kuru tozlar elde etmek için döner buharlaştırma devam edin ve t sağlamak içinO silika jel üzerine ürünlerin adsorplanmadan. Kuru tozlar oluştuktan sonra ilave bir 30 dakika boyunca vakum altında örnek tutun. </li><li> bir çözücü olarak diklorometan kullanılarak bir sütun halinde, silika jel 50 g paketleyin. Dikkatle kolonuna adsorbe ürün silika jel içeren bir örnek ilave edin. </li><li> Yavaş yavaş ve böylece çözücünün polaritesi (Tablo 1), artan metanol yüzdesi artırırken, bir diklorometan ve metanol karışımı ile sütun yıkayın. </li><li> Test tüpleri içinde eluent fraksiyonlar (25 mi / tüp) toplayın ve ince tabaka kromatografisi (TLC) ile ilerlemesini izlemek. </li><li> Saf DOX-PA içeren tüm fraksiyonlar birleştirilir ve kuru toz elde edilinceye kadar, bir döner evaporatör kullanılarak solvent çıkartılmıştır. Bundan başka, bir vakum O / N ve ürünle kurutun. </li></ol></li><li> TLC ile DOX-PA analizi. <ol><li> TLC plakası bir 4 cm x 8 cm uzunluğunda kesilir. TLC tespit kılcal damarların ile plakanın alt spot örnek çözümler 0.5 cm buluştu kullanarakçözücü olarak HANOL. </li><li> diklorometan ve metanol karışımı içeren bir geliştirme odasına TLC plakasını (3/1, hac / hac). Çözücünün derinliği 0.5 cm sadece az olmalıdır. </li><li> Çözücü ön plaka üst ulaştığında gelişmekte odasından plakasını sökün. Bir kalemle çözücü ön yerini işaretlemek ve plaka kurumasını bekleyin. örnekleri görselleştirmek için doymuş iyodin buharı ihtiva eden bir boyama odasına TLC plakasını. </li></ol></li><li> 1H-Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (1 &#39;H-NMR) ile DOX-PA analizi. 18 <ol><li> metil sülfoksit-d6 (DMSO) içinde 1 ml DOX-PS 15 mg çözülür ve bir NMR tüpü içine örnek aktarmak. </li><li> NMR aracın cazibe merkezi haline NMR tüpü yerleştirin. Bir çözücü olarak DMSO seçilmesi, proton spektrumunun ölçün. mıknatıstan NMR tüpü çıkarın. NMR sonucu 18 analiz edin. </li></ol></li></ol> 2. Film dağıtım metodu ile DOX-PA miseller hazırlanması <ol><li> DSPE-PEG (40 mg) ve DOX-PA (4 mg), 10 ml bir cam şişe içinde, 2 ml metanol ile çözülür. </li><li> şişede ince bir film oluşana kadar bir döner buharlaştırıcı kullanılarak vakum altında organik çözücüyü çıkarın. Alternatif olarak, (örneğin, argon veya azot gazı), bir film oluşturmak ve daha fazla kalan solventin çıkması için bir vakum desikatörde flakon tutmak için atıl gaz altında, organik çözücüler buharlaştırılmış: NOT. </li><li> Aktarım cam şişeye Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (pH 7.4, DPBS) içinde 2 mi. </li><li> miseller oluşturmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ultrasonik bir banyoda şişe yerleştirin. NOT: Ultrasonik güç ultrasonik banyolarda farklı modeller arasında değişir. ince polimer / ilaç filmi dağıtmak için yeterli ultrasonik güç üretebilir bir birimi seçin. Bu protokolde kullanılan ultrasonik banyosunun çıkış gücü 110 W olan </li><li> Kısa süreli depolama için 4 ° C&#39;de miseller tutmak ve -20 ° C de, uzunuzun dönem depolama. Not: Alternatif olarak, misellerin dondurularak kurutulmuş ve kullanımdan önce su ile yeniden oluşturulabilir. Genellikle, herhangi bir dondurarak saklama koruyucusu ve liyoprotektan, bu formülasyon için gereklidir. </li></ol> DOX-PA misellerin 3. karakterizasyonu <ol><li> Miseller ve ilaç kapsülleme verimliliği DOX-PA konsantrasyonunun belirlenmesi <ol><li> 1 ug / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml ve 100 ug / ml: DOX-PA beş farklı konsantrasyonlarda DOX-PA çözeltiler hazırlanması DMSO içinde bir önceki adımda sentezlenmiştir çözülür. 490 nm&#39;de bir UV-VIS spektrometresi ile DOX-PA çözeltiler emilimini belirlemek. DOX-PA madde konsantrasyonları ve 490 nm&#39;de bunların karşılık gelen emme göre bir standart eğri oluşturur. </li><li> DMSO, 500 ul ilaç yüklü misel 25 ul seyreltilir. Bir UV-VIS spektrometresi ile 490 nm&#39;de emilim ölçülür. 3.1.1 oluşturulan standart eğri ile ilaç konsantrasyonlarını hesaplayın. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak Kapsülleme verimliliği hesaplayın: İlaç Kapsülleme verimliliği (%) = (miseller ilaç miktarı) / (ilave ilaç miktarı) x% 100 </li></ol></li><li> Dinamik ışık dağılımı ile parçacık boyutunun Karakterizasyonu (DLS) <ol><li> 1 mg / ml&#39;lik bir son DSPE-PEG konsantrasyonuna DPBS (pH 7.4) ile miseller seyreltilir. Z-ortalama boyutu ve çok yönlü dağılma indeksi (PDI) elde etmek için bir parçacık boyutu analiz cihazı ile, 2 ml lik bir numuneyi analiz edin. </li></ol></li><li> In vitro anti-kanser etkinliğinin değerlendirilmesi NOT: Uygun steril tekniği kullanın ve bir biyogüvenlik kabini içinde çalışırlar. <ol><li> Bir hücre kültür şişesine (örn, T25) ihtiva eden, DU-145, insan prostat kanseri hücreleri, hücre kültürü ortamının çıkarın ve DPBS, 2 ml (pH 7.4) ile hücrelerin yıkayın. </li><li> Aspire DPBS, tripsin solüsyonu (% 0.25) 1 ml ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C&#39;de 2 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 10 m eklehücre kültürü aracı maddesi (RPMI 1640 +% 10 cenin sığır serumu +% 1 antibiyotik antimikotik), hücrelerin en şişeden çözülmüş olduğunda. 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de hücreleri hücreleri aktarın. </li><li> Hücre kültür ortamı, 5 ml hücre pelet yeniden askıya ve bir hemositometrede hücre adedini saymak için bir örnek çıkarın. 50,000 hücre / ml&#39;lik bir yoğunluğa kadar hücre kültürü ortamı ile hücreleri seyreltilir. Bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasının seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin (100 ul / oyuk). Bir hücre kültür inkübatörü içinde inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 CO2) 18 saat hücre tutunmasını sağlar. </li><li> sırasıyla, 0.1 uM ve 0.5 uM, 2 uM, 5 uM ve 10 uM nihai ilaç konsantrasyonlarını elde etmek için hücre kültürü ortamı ile DOX dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisi ve DOX-PA DMSO çözeltisi ile seyreltilir. % 0.5 her şeyden örneklerde nihai DMSO konsantrasyonu muhafaza edin. nihai ilaç CO elde etmek için hücre kültürü ortamı ile DOX-PA misel seyreltin0.1 uM ncentrations sırasıyla 0.5 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM,. Boş hücre kültürü ortamında bir denetimi kullanın. </li><li> inkübatör 96 oyuklu hücre kültürü plakasının çıkarın ve (her bir grup için n = 4) adım 3.3.5 hazırlandı, farklı işleme maddeleri içeren ortama, 100 ul hücre kültür ortamı yerine. (2, 37 ° C,% 5 CO) ek 72 saat için hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri. </li><li> orta aspire ve 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) ve 0.5 mg / ml ihtiva eden ortam 100 ul -2,5-difenil tetrazolyum bromid (MTT) ilave edin. </li><li> 2 saat daha, hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri. Dikkatle orta kaldırmak ve formazan kristalleri eritmek için DMSO 100 ul ekleyin. </li><li> 570 nm&#39;lik bir dalga boyu ve 670 nm&#39;lik bir referans dalga boyu mikroplaka spektrofotometresiyle absorbansı ölçülür. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması: <strong&gt; Hücre Canlılığı (%) = (A Testi / bir kontrol) x% 100 NOT: varyans (ANOVA) istatistik testi, tek-yönlü analizi kullanılarak farklı gruplar arasında hücre canlılığı karşılaştır. Ilaç konsantrasyon verileri vs hücre canlılığı dayalı IC 50 hesaplayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hennenfent, K. L., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+formulations+of+taxanes:+a+review.+Old+wine+in+a+new+bottle?.">Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?.</a> ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).</li><li>Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+nanomedicine+for+breast+cancer+therapy.">Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy.</a> Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).</li><li>Mahapatro, A., Singh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+are+excellent+vehicle+for+site+directed+in+vivo+delivery+of+drugs+and+vaccines.">Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines.</a> J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).</li><li>Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd, ., D, D., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micellar+delivery+of+bicalutamide+and+embelin+for+treating+prostate+cancer.">Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer.</a> Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).</li><li>Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+amphiphilic+lipopolymers+for+micellar+drug+delivery.">Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery.</a> Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).</li><li>Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel-+and+lapatinib-loaded+lipopolymer+micelles+overcome+multidrug+resistance+in+prostate+cancer.">Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer.</a> Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).</li><li>Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+formulation+and+in+vitro+evaluation+of+a+novel+microtubule+destabilizer,+SMART-100.">Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100.</a> J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).</li><li>Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPMA+copolymer+bound+adriamycin+overcomes+MDR1+gene+encoded+resistance+in+a+human+ovarian+carcinoma+cell+line.">HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line.</a> J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).</li><li>Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+in+targeted+cancer+therapy:+mesoporous+silica+nanoparticles+entering+preclinical+development+stage.">Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage.</a> Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).</li><li>Kaur, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+concerns+in+nanotech+product+development+and+its+commercialization.">Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization.</a> J Control Release. 193, 51-62 (2014).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin+and+lapatinib+combination+nanomedicine+for+treating+resistant+breast+cancer.">Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer.</a> Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).</li><li>Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Behenoyl-paclitaxel+conjugate+containing+lipid+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+breast+cancer.">2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer.</a> Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).</li><li>Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipophilic+paclitaxel+derivative+incorporated+in+a+lipid+emulsion+for+parenteral+administration.">A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration.</a> J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).</li><li>Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+and+toxicity+of+antibody-targeted+doxorubicin-loaded+PEG-PE+micelles+in+ovarian+cancer+cell+spheroid+model.">Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model.</a> J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).</li><li>Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+micelles+of+PEG(2000)-DSPE+and+vitamin-E+TPGS+for+concurrent+delivery+of+paclitaxel+and+parthenolide:+enhanced+chemosenstization+and+antitumor+efficacy+against+non-small+cell+lung+cancer+(NSCLC)+cell+lines.">Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines.</a> Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).</li><li>Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Chromatographic+Technique+for+Preparative+Separations+with+Moderate+Resolution.">Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution.</a> J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).</li><li>Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constant+pressure-controlled+extrusion+method+for+the+preparation+of+Nano-sized+lipid+vesicles.">Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPMA+copolymers+with+pH-controlled+release+of+doxorubicin:+in+vitro+cytotoxicity+and+in+vivo+antitumor+activity.">HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity.</a> J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).</li><li>Patil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Delivery+of+Doxorubicin+via+pH-Controlled+Hydrazone+Linkage+Using+Multifunctional+Nano+Vehicle+Based+on+Poly(beta-L-Malic+Acid).">Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid).</a> Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).</li><li>Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+block+copolymer-doxorubicin+conjugates+via+different+linkages:+preparation,+characterization,+and+in+vitro+evaluation.">Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation.</a> Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).</li><li>Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+approaches+to+the+rational+design+of+nanoemulsions,+polymeric+micelles,+and+dendrimers+for+drug+delivery.">Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery.</a> Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drug-specific+nanocarrier+design+for+efficient+anticancer+therapy.">A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy.</a> Nat Commun. 6, 7449 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada, miseller hazırlanması için basit ve hızlı bir film-dispersiyon bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir amfifilik polimerin kendinden montaj özelliklerinden istifade (örneğin, DSPE-PEG) sulu bir ortamda çekirdek-kabuk yapılı miseller oluşturmak için. Bu misel hazırlama yöntemi birçok avantaja sahiptir. 1. Genellikle lipozom, nanopartiküller ve nanoemülsiyonlar. 19 2 hazırlanmasında kullanılan (örneğin, haddeleme ya da homojenizasyon gibi) karışık büyüklük azaltma adımlarının kullanımı önler, basit bir formülasyon işlemi içerir. İyi bir tekrarlanabilirlik vardır. Formülasyon optimize edilmiş ve kurulduktan sonra mükemmel partiden partiye tutarlılık elde edilebilir. protokol, sonikasyon gücü ve zaman olarak hazırlama prosesi değişkenlerde varyasyon, kalmaya toleranslıdır. (Örneğin, diyaliz yaklaşım ya da emülsiyon çözücü buharlaştırma yaklaşımı) için diğer yöntemler hazırlanması miseller için uygun olmasına rağmen, filmin dispersiyonyöntem daha kullanışlı ve verimli. Bu nedenle, ilaç endüstrisinde miseller büyük ölçekli üretiminde kullanılmak üzere adapte olmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu yöntemin bir sınırlama bu tür özelliklere sahip malzemelerin sınırlandırılmıştır ve böylece taşıyıcı malzeme montajı çok durumuna bağlıdır ve olmasıdır. Polimer malzemelerin uygunsuz seçimi tatmin edici misel formülasyonları üreten yetmezliğine yol açabilir. Buna ek olarak, hazırlama yöntemi, polimer / ilaç filmi dağılmasını ve misellerin oluşumunu kolaylaştırmak üzere ultrasonikasyon dayanır. sadece zayıf bir ultrasonik güç miselleri meydana getirmek üzere gerekli olan, çünkü çoğu ticari olarak temin edilebilen ultrasonik küvet uygundur. Çok zayıf bir güç ile bir ultrasonik banyoda kullanılan, ancak, bu bir sorun olabilir. Kötü ilaç yükleme ve erken ilaç salım misel ilaç dağıtımı için önemli endişeleri vardır. Bu protokol, biz yükü geliştirmek için bir lipofilik ön-ilaç stratejisi geliştirdiDSPE-PEG miseller içine doksorubisin ing. lipidler ile doksorubisin çekimi anlamlı DSPE-PEG misellerin lipid çekirdeği ile ilacın uyumluluk ve etkileşim düzeldi. ön-ilaç, DOX-PA, bir asidik pH değerine duyarlı hidrazon bağ maddesi vasıtası ile lipid ile doksorubisin konjuge edilmesi yoluyla sentezlendi. Bu bağlayıcı. Bu nedenle, stabil bir şekilde DOX nötr pH&#39;ta bir ön-ilaç olarak DSPE-PEG miseller yüklenen 20,21 asidik pH değerinde, nötr pH değerinde sabit ve ayrılabilen ve depolama sırasında ve kan dolaşım boyunca çok az ilaç kaçak var. DOX-PA misellerin endositoz yoluyla tümör hücrelerinin girdikten sonra, DOX-PA ön-ilaç ayrıldı ve asidik endozom ortamında (pH 5-6) karşılık olarak serbest DOX dönüştürülecektir. DOX DOX-PA &#39;den daha hidrofilik olduğu için, bu dönüşüm DOX miselin hidrofobik çekirdek arasında etkileşimlere müdahale, ve böylece misellerin gelen DOX hızlı salınmasını kolaylaştırmak olacaktır. Bu yenilikçi tasarım özelliği eksik ilaç salımı, önlemek hangiparçalanamayan ya da yavaş-yaran bağlayıcılar kullanılarak ilaç konjugatları ile ilişkili önemli bir sorun değildir. 22. Bu yaklaşım, diğer ilaçların verilmesinde uygulanabilir. Uygun bir bağlayıcı seçimi bu yaklaşımın başarı için önemlidir. bağlayıcılar, formülasyonun stabilitesini maksimize etmek için fizyolojik bir ortamda kararlı olmalıdır. Bağlayıcılar, aynı zamanda etkin bir şekilde ana ilacı serbest bırakmak için tümörün mikro (örneğin, pH, enzimler, vs.) tetikler yanıt olarak ayrılabilir olmalıdır. Bu protokol, DOX-PA verimli yüksek bir kapsülleme etkinliği (~% 100) miseller içine yüklendi. misel Formülasyon daha yüksek kararlılık göstermiştir ve ilaç çökeltme veya ilaç konsantrasyonundaki azalma olmaksızın en az üç hafta boyunca bozulmadan kalmıştır. Bu ön-ilaç lipid parçacıkları arasındaki etkileşim ve DSPE-PEG miseller lipid çekirdeği kaynaklanmaktadır. compatibi mühendisliketkileşimlerini arttırmak için ilaç taşıyıcı moleküllerin vasıflı miseller ve nanocarriers performansının geliştirilmesi için ümit verici bir stratejidir. Bu yaklaşım, ilaç yükleme geliştirmek ve bu nanocarriers öncesi olgun ilaç salınımını en aza indirebilirsiniz. 23 uygun bir ilaç / polimer çiftinin seçimi misel formülasyonu tasarımında önemli bir adımdır. Ilaç moleküllerinin yapısı değiştirilebilir (ön-ilaç yaklaşım) veya taşıyıcı materyallerin tasarım uyumluluğunu geliştirmek ve ilaç / taşıyıcı etkileşimleri geliştirmek amacıyla optimize edilebilir. Buna ek olarak 23 24, sayısal modelleme yardımcı olmak için yararlı bir araç olabilir ve nanocarriers optimizasyonu mümkün özgü belirli bir ilaç için özel tasarlanmış tasarlanmış nanocarrier hazırlamak için yapmak. Özet olarak, burada doksorubisinin lipofilik ön-ilaç sentez etmek için bir yöntem tarif eder. ilaç yüklü misellerin hazırlanması ve karakterizasyonu için protokoller de descr vardırIBED. film dağıtım metodu nano ölçekli montajı çok verme sistemleri bir dizi hazırlamak için basit ve gelecek vaat eden bir yöntemdir. Burada açıklanan karakterizasyon yöntemleri formülasyon ve ürün geliştirme işlemlerinin optimizasyonu kolaylaştırabilir ve böylece, nanomedicines özelliklerini belirlemek amacıyla in vitro deneyler, standart olarak kullanılabilir.

Kemoterapi genellikle çeşitli kanser tiplerini tedavi etmek için kullanılır. hepsi değilse de çoğu, kemoterapi ilaçları daha fazla yaşamı tehdit eden koşullara, bulantı ve ishal gibi yönetilebilir küçük koşullar değişebilir toksik yan etkileri vardır. En antikanser ilaçların toksik olduğundan, normal dokuya bu ilaçların seçici olmayan maruz kaçınılmaz toksisiteye neden olur. Bu nedenle, seçici bir şekilde kanser hücrelerine ilaç teslim bir terapötik yaklaşım için büyük bir ihtiyaç vardır. antikanser ilaçların verilmesi ile diğer zorluk da kötü su çözünürlüğü olduğunu. Genellikle, çözündürücü maddeler, bu az çözünen ilaçların formüle edilmesi gereklidir. Bununla birlikte, dimetil sülfoksit gibi en çözündürücü maddeler, (DMSO), Cremophor EL, ve polisorbat 80 (Tween 80), karaciğer ve böbrek toksisitesi, hemoliz, akut yüksek tansiyon tepkilerine ve periferal nöropatiler neden olabilir. 1 Bu nedenle, güvenli ve biyo-uyumlu formülasyonlar için gerekli olan yoksul klinik kullanımıly çözünür antikanser ilaçlar. Nanocarriers yukarıdaki zorlukları ele almak için ilaç taşıyıcı sistemleri umut vericidir. Bu nanocarriers lipozomlar, 2 nano-tanecikleri, 3 miseller, 4-7, polimer-ilaç konjügatları, 8 ve inorganik malzemeler bulunmaktadır. 9 Çeşitli Nanomedicine ürünleri (örneğin, Doxil, Abraxane ve Genexol) kanser hastalarının tedavisinde düzenleyici kurumlar tarafından onaylanmıştır. 10 Polimerik miseller başarılı antikanser ilaçların verilmesi için kullanılan nano ölçekli ilaç verme taşıyıcılar, umut vericidir. 4-7,11,12 tipik bir polimerik miseller kendinden montaj işlemi boyunca amfifil polimerlerle hazırlanır. Çekirdek-kabuk yapılı polimer miseller bir hidrofilik ve bir hidrofobik kabuk çekirdek bulunmaktadır. hidrofil kabuk sterik miseller stabilize ve kanda kendi dolaşımını uzatabilir. hidrofobik çekirdek etkin bir şekilde hidrofobik d sarabilirizkilim. Çünkü miseller (tipik olarak en az 200 nm) ve uzun sirkülasyon özelliklerinin küçük boyutu, polimerik miseller gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkileri (pasif tümör hedefleme) ile hedef tümör elde inanılmaktadır. İlaç yükü stabilite miseller yeteneğini hedef tümör için önemlidir. Optimal tümör hedefleme ulaşmak için, misel tümör sitesine ulaşmadan önce en az ilaç sızıntısı, henüz hızlı bir şekilde kanser hücrelerini girdikten sonra ilacı tahliye edilmelidir. formülasyon istikrar ürün geliştirme fizibilite yanı sıra geliştirilen ürünlerin raf ömrünü belirler, çünkü ek olarak, formülasyon stabilitesi, aynı zamanda ürün geliştirme için temel bir gerekliliktir. Son zamanlarda, çok çaba dağıtım taşıyıcılara ilaçların yükleme geliştirmek için yapılmıştır. Lipofilik ön-ilaç bir yaklaşım lipit nanopartiküller ve emülsiyonlar halinde ilaç yüklemesine geliştirmek için araştırılmaktadır bir stratejidir. 13,14 conjilaçlarla lipidlerin ugation önemli ölçüde iyileştirmek ve lipofilliğini nanocarriers lipofilik bileşenleri yükleme ve tutma artırabilir. Burada, lipofilik doksorubisin yanlısı ilaç yüklü miseller hazırlamak için bir protokol açıklar. İlk olarak, lipofilik yanlısı ilaç doksorubisin için sentez prosedürü tarif edilmektedir. Daha sonra, bir film-dispersiyon yöntemi ile miseller oluşturmak için bir protokol verilmektedir. Bu yöntem, başarılı bir şekilde daha önceki çalışmalarda kullanılmıştır. 5 DSPE-PEG başarıyla misel ilaç verilmesi için kullanılmıştır, çünkü miseller hazırlanması için taşıyıcı malzeme olarak seçilmiştir. 15,16 Son olarak, misel karakterize etmek için kullanılan çeşitli in vitro analizler açıklanmaktadır formülasyonlar ve antikanser aktivitesini değerlendirmek için.

<table><tbody><tr><td>DSPE-PEG2K</td><td>Cordenpharm</td><td>LP-R4-039</td><td>&gt;95%</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>LC Laboratories</td><td>D-4000</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>Palmitic Acid Hydrazide</td><td>TCI AMERICA&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P000425G</td><td>&gt;98.0%</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ACROS Organics</td><td>610981000</td><td>Anhydrous</td></tr><tr><td>Methylene chloride&amp;nbsp;</td><td>FISHER&amp;nbsp;</td><td>D151-4</td><td>99.90%</td></tr><tr><td>Methyl sulfoxide-d&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>ACROS Organics</td><td>AC320760075</td><td>NMR solvent</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic Acid&amp;nbsp;</td><td>ACROS Organics</td><td>AC293811000</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>Silica Gel</td><td>FISHER&amp;nbsp;</td><td>L-7446</td><td>230-400 mesh</td></tr><tr><td>Baker Flex TLC Plates</td><td>FISHER&amp;nbsp;</td><td>NC9990129</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DU 145&amp;nbsp; Prostate Cancer Cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>ACROS Organics</td><td>158990050</td><td>98%</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>MEDIATECH INC&amp;nbsp;</td><td>10041CV</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>LIFE TECHNOLOGIES&amp;nbsp;</td><td>15240062</td><td>100x stock solution</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>LIFE TECHNOLOGIES&amp;nbsp;</td><td>10437077</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy</td><td>Varian, Inc</td><td></td><td>300 NMR&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi R-3 Rotavapor</td><td>Buchi</td><td>1103022V1&amp;nbsp;</td><td>Rotary evaporator</td></tr><tr><td>Ultrasonic Bath</td><td>BRANSON ULTRASONICS CORPORATION&amp;nbsp;</td><td>CPX952318R</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS spectrometer Biomate 3</td><td>Thermo Spectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS90&amp;nbsp;</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>Particle Size Analyer</td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Rio-Rad</td><td>Benchmark Plus&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Incubator</td><td>Napco</td><td>CO2 6000</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot&amp;nbsp;</td><td>Systat Software, Inc.</td><td></td><td>Analytical Software</td></tr><tr><td>96-Well Cell Culture Plate</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp; 0.25%</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and characterization of lipophilic doxorubicin pro-drug micelles

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

Şekil 1, DOX-PS sentez şemasını göstermektedir. DOX-PA pH&#39;a duyarlı hidrazon bağ yoluyla doksorubisin palmitik asit konjügasyonu sentezlendi. palmitik asit hidrazid hafif bir fazlalığı reaksiyon tamamlanmasını sağlamak için kullanılmıştır. Bu reaksiyon yöntemi çok yüksek bir etkinliğe sahip ve doksorubisinin sadece küçük bir miktar, bir 18 saat sonra (Şekil 2) ile gösterilmektedir. Verim yaklaşık% 88 idi. Reaksiyonun sonunda, DOX-PA, bir silika jel kolonu kullanılarak saflaştırılmış ve saf kırmızı bir katı ürün elde etmek için kurutulmuştur. DOX-PA saflaştırılmış DOX-PA (Şekil 2) için tek bir nokta gösterdi TLC ile analiz edildi. 3 DOX-PS 1 &#39;H-NMR spektrumunu göstermektedir. Doksorubisin ve palmitik asit hem de karakteristik NMR tepe noktaları daha konjugasyon reaksiyon başarısı doğruladı gözlendi. görünümü, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. ilaçsız boş DSPE-PEG miseller şeffaf bir sıvı olarak görünür. DOX-PA DSPE-PEG miseller kırmızı bir sıvı olarak görünür; Kırmızı renk miselleri yüklü DOX-PA kaynaklanmaktadır. Parçacık büyüklüğü analizi Örnek sonuçlar Şekil 5&#39;de gösterilmektedir. Boş DSPE-PEG miseller Z-ortalama ortalama parçacık boyutu 17.0 ± 0.5 nM (PDI = 0.034 ± 0.019) idi. DOX-PA yükleme biraz misel partikül boyutu arttı; DOX-PA DSPE-PEG miseller Z-ortalama ortalama partikül büyüklüğü 25.7 ± 1.6 nm (PDI = 0.407 ± 0.035) idi. misel formülasyonunda DOX-PA konsantrasyonu, 490 nm&#39;de absorpsiyon göre belirlenmiştir. DSPE-PEG DOX-PA konsantrasyonunun analizi müdahale etmez, böylece, bu dalga boyunda çok az absorbsiyon yapar. misel formülasyonunda DOX-PA konsantrasyonu1.99 ± 0.11 mg / ml ve ilaç yükleme verimi 99.3 ±% 5.7 olmuştur. yüksek bir kapsülleme etkinliği nedeniyle miseller hidrofobik çekirdekte tutma artırır DOX-PA, lipofilik özelliği etmektir. daha yüksek kararlılık göstermiştir. 3 hafta boyunca 4 ° C&#39;de - arasında saklandığında hiç bir görünür çökelme oluştu. ilaç konsantrasyonu önemli bir değişiklik depolama sırasında gözlenmemiştir. DU-145, insan prostat kanseri hücreleri serbest doksorubisin, farklı konsantrasyonlarda serbest DOX-PA ve DOX-PA DSPE-PEG miseller ile muamele edilmiştir. Hücre canlılığı MTT (Şekil 6) ile 72 saat muamele sonunda belirlenmiştir. Hücre canlılığı, konsantrasyona bağımlı bir azalma serbest doksorubisin (IC50 = 0.10 uM), serbest DOX-PA (IC50 = 0.33 uM) ya da DOX-PA miseller (IC50 = 0.25 uM) ile birlikte, DU145 hücreleri muamele edilmesiyle elde edilmiştir. bilgilerini doksorubisin olmasına rağmen<html> ücretsiz DOX-PA veya daha düşük konsantrasyonlarda DOX-PA miseller (0.1 uM ve 0.5 uM) daha etkili, DOX-PA grupları yüksek konsantrasyonlarda (2-10 uM) ücretsiz doksorubisin daha hücre canlılığı daha fazla azalma gösterdi. Ayrıca, hem yüksek ve düşük konsantrasyonlarda DOX-PA ve DOX-PA miseller arasında anlamlı bir fark olduğu ortaya çıktı. Boş DSPE-PEG miseller bir ilaç verme taşıyıcı malzeme olarak iyi bir biyo-uyumluluk ve DSPE-PEG güvenliğini göstermektedir (veriler gösterilmemiştir) hiç bir toksisite göstermiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig1.jpg" /> Şekil 1 doksorubisin lipofilik ön-ilaç sentezi (DOX-PA) Tepkime maddeleri ve koşullar:., Metanol içerisinde çözündürüldü doksorubisin (DOX), palmitik asit hidrazid (PA) ve trifloroasetik asit (TFA), oda sıcaklığında 18 saat karıştırılmıştır karanlık.<html> t = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54338/54338fig2.jpg" /> Şekil 2. İnce tabaka kromatografisi (TLC),. (1) doksorubisin TLC, (2) Ham reaksiyon karışımı, (3) palmitik asit hidrazid, ve (4) DOX-PA konjugatı. Numuneler diklorometan ve metanol karışımı ile geliştirilmiştir (3/1, v / v) ve iyot ile boyandı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54338/54338fig3.jpg" /> Ikincil hale getirilmiş DMSO içinde DOX-PS Şekil 3. 1 &#39;H-NMR. DOX PA ve karakteristik tepe noktası mevcudiyetiyle konjugasyon reaksiyonu başarısını ortaya koymaktadır.: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54338/54338fig4.jpg" /> Misellerin Şekil 4. hali. (A) DSPE-PEG miselleri ve (B) DOX-PA DSPE-PEG miseller. Temsili rakamlar boş DSPE-PEG miseller ve DOX-PA DSPE-PEG misellerin görünümünü göstermek için sunulmuştur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54338/54338fig5.jpg" /> Şekil 5. Partikül büyüklüğü ve misellerin boyut dağılımı. (A) DSPE-PEG miselleri ve (B) DOX<html> -PA DSPE-PEG miseller. misel boyutu, dinamik ışık saçılımı ile belirlenir. Temsili rakamlar parçacık boyutu ve boyut dağılımı göstermek için sunulmuştur. Sunulan veriler ortalama ± SD (n = 3). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54338/54338fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54338/54338fig6.jpg" /> Misel formülasyonlarının Şekil 6. Kansere aktivitesi. DU145 hücreleri, MTT deneyi kullanılarak ölçüldü 72 saat ve hücre canlılığı için muamele edilmiştir. Şekilde sunulan veriler, ortalama ± SD (n = 4) bulunmaktadır. DOX grupları tedavi için * P &lt;0.01, karşılaştırıldı. gruplar tedavi DOX-PA ve DOX-PA miseller arasında istatistiksel bir fark yoktur. IC50 ilaç konsantrasyon verileri genel hücre canlılığı ile hesaplanmıştır.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54338/54338table1.jpg" /> DOX-PA saflaştırılmasında kullanılan çözücüleri elüsyon Tablo 1. CH2C! 2 / CH3 OH.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles at JoVE.com

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Lipofilik doksorubisin ön-ilacın hazırlanması ve tanımlanması için bir protokol, 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- N yüklü - [amino (polietilen glikol) -2000] (DSPE-PEG) miseller anlatılmıştır.

Lipofilik Doksorubisin Pro-ilaç misellerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

preparation-characterization-lipophilic-doxorubicin-pro-drug

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Görüntüleme.  Hampton University.  Lipofilik doksorubisin ön-ilacın hazırlanması ve tanımlanması için bir protokol, 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- N yüklü - [amino (polietilen glikol) -2000] (DSPE-PEG) miseller anlatılmıştır. 

Video: Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Biyokimya

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its therapeutic benefit. Nanoparticle-based drug combination has been shown to mitigate the problems encountered by free drug combination therapy. Our previous studies have shown that the combination of two anticancer drugs, doxorubicin (DOX) and mitomycin C (MMC), produced a synergistic effect against both murine and human breast cancer cells in vitro. DOX and MMC co-loaded polymer-lipid hybrid nanoparticles (DMPLN) bypassed various efflux transporter pumps that confer multidrug resistance and demonstrated enhanced efficacy in breast tumor models. Compared to conventional solution forms, such superior efficacy of DMPLN was attributed to the synchronized pharmacokinetics of DOX and MMC and increased intracellular drug bioavailability within tumor cells enabled by the nanocarrier PLN. 
To evaluate the pharmacokinetics and bio-distribution of co-administered DOX and MMC in both free solution and nanoparticle forms, a simple and efficient multi-drug analysis method using reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. In contrast to previously reported methods that analyzed DOX or MMC individually in the plasma, this new HPLC method is able to simultaneously quantitate DOX, MMC and a major cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in various biological matrices (e.g., whole blood, breast tumor, and heart). A dual fluorescent and ultraviolet absorbent probe 4-methylumbelliferone (4-MU) was used as an internal standard (I.S.) for one-step detection of multiple drug analysis with different detection wavelengths. This method was successfully applied to determine the concentrations of DOX and MMC delivered by both nanoparticle and solution approaches in whole blood and various tissues in an orthotopic breast tumor murine model. The analytical method presented is a useful tool for pre-clinical analysis of nanoparticle-based delivery of drug combinations.

This protocol describes an efficient and convenient analytical process of sample extraction and simultaneous determination of multiple drugs, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) and a cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in the biological samples from a preclinical breast tumor model treated with nanoparticle formulations of synergistic drug combination.

Örnek çıkarma ve eşzamanlı Kromatografik Nefelometri doksorubisin ve ilaç kombinasyonu dağıtımında nano tanecikleri tümörü taşıyan fareler takip Mitomycin C

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Kanser Araştırmaları

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar concentration forming hydrophobic cores surrounded by hydrophilic shells in aqueous environments. The core of these micelles can be utilized to load hydrophobic, poorly water soluble drugs like docetaxel (DTX) and everolimus (EVR). Systematic characterization of the micelle structure and drug loading capabilities are important before in vitro and in vivo studies can be conducted. The goal of the protocol described herein is to provide the necessary characterization steps to achieve standardized micellar products. DTX and EVR have intrinsic solubilities of 1.9 and 9.6 &#181;g/ml respectively Preparation of these micelles can be achieved through solvent casting which increases the aqueous solubility of DTX and EVR to 1.86 and 1.85 mg/ml, respectively. Drug stability in micelles evaluated at room temperature over 48 hr indicates that 97% or more of the drugs are retained in solution. Micelle size was assessed using dynamic light scattering and indicated that the size of these micelles was below 50 nm and depended on the molecular weight of the polymer. Drug release from the micelles was assessed using dialysis under sink conditions at pH 7.4 at 37 oC over 48 hr. Curve fitting results indicate that drug release is driven by a first order process indicating that it is diffusion driven.

The goal of this protocol is to describe the preparation and characterization of physically entrapped, poorly water soluble drugs in micellar drug delivery systems composed of amphiphilic block copolymers.

Hazırlanması ve Bireysel Karakterizasyonu ve Multi-ilaç Fiziksel, polimerik misellerin Entrapped Loaded

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Kimya

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

Karbon Nanotüpler tarafından Stabilize İçeriden Kendinden monte Lipid Parçacıklar uyduruk hazırlanması

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl glycidyl ether (PheGE) on methoxy-polyethylene glycol (mPEG-b-PPheGE). Characterization of the copolymer revealed a narrow molecular distribution (PDI &#60; 1.03) and confirmed the degree of polymerization of mPEG122-b-(PheGE)15. The critical micelle concentration of the copolymer was evaluated using an established fluorescence method with the aggregation behavior evaluated by dynamic light scattering and transmission electronic microscopy. The potential of the copolymer for use in drug delivery applications was evaluated in a preliminary manner including in vitro biocompatibility, loading and release of the hydrophobic anti-cancer drug doxorubicin (DOX). A stable micelle formulation of DOX was prepared with drug loading levels up to 14% (wt%), drug loading efficiencies &#62; 60% (w/w) and sustained release of drug over 4 days under physiologically relevant conditions (acidic and neutral pH, presence of albumin). The high drug loading level and sustained release is attributed to stabilizing &#960;-&#960; interactions between DOX and the core-forming block of the micelles.

The key steps of living anionic polymerization of phenyl glycidyl ether (PheGE) on methoxy-polyethylene glycol (mPEG-b-PPheGE) are described. The resulting block copolymer micelles (BCMs) were loaded with doxorubicin 14% (wt%) and sustained release of drug over 4 days under physiologically relevant conditions was obtained.

π-π İstifleme etkileşimlerle Stabilize blok kopolimer miselleri hazırlanması için bir amfifilik kopolimerin anyonik polimerizasyonu

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Hedeflenen İlaç Teslimatı için Doxorubicin Yüklü Aptamer-PEI-g-PEG Modifiye Altın Nanopartiküllerinin Sentezi

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Phase Change Dimethyldioctadecylammonium-Shelled Microdroplets as a Promising Drug Delivery System: Results on 3D Spheroids of Mammalian Tumor Cells

Significant improvement of phase-change perfluorocarbon microdroplets (MDs) in the vast theranostic scenario passes through the optimization of the MDs composition with respect to synthesis efficiency, stability, and drug delivery capability. To this aim, decafluoropentane (DFP) MDs stabilized by a shell of dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) cationic surfactant were designed. A high concentration of DDAB-MDs was readily obtained within a few seconds by pulsed high-power insonation, resulting in low polydisperse 1 &#181;m size droplets. Highly positive &#950;-potential, together with a long, saturated hydrocarbon chains of the DDAB shell, are key factors to stabilize the droplet and the drug cargo therein. The high affinity of the DDAB shell with cell plasma membrane allows for localized chemotherapeutics delivery by increasing the drug concentration at the tumor cell interface and boosting the uptake. This would turn DDAB-MDs into a relevant drug delivery tool exhibiting high antitumor activity at very low drug doses.
In this work, the efficacy of such an approach is shown to dramatically improve the effect of doxorubicin against 3D spheroids of mammalian tumor cells, MDA-MB-231. The use of&#160;three-dimensional (3D) cell cultures developed in the form of multicellular tumor spheroids (i.e., densely packed cells in a spherical shape) has numerous advantages compared to 2D cell cultures: in addition to have the potential to bridge the gap between conventional in vitro studies and animal testing, it will improve the ability to perform more predictive in vitro screening assays for preclinical drug development or evaluate the potential of off-label drugs and new co-targeting strategies.

Decafluoropentane microdroplets developed with a shell of dimethyldioctadecylammonium bromide exhibited an exceptional colloidal stability and an actractive biointerface. DDAB-MDs proved to be efficient drug reservoirs characterized by a high affinity to plasma membranes together with enhanced uptake and antitumor activity of Doxorubicin against human triple-negative breast cancer (MDA-MB-231) 3D model.

Significant improvement of phase-change perfluorocarbon microdroplets (MDs) in the vast theranostic scenario passes through the optimization of the MDs ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Biyomühendislik

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

Lysolipid İçeren Sıcaklığa Duyarlı Lipozomların Mikroakışkan Üretimi

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...