We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

Tüm hayvan deneyleri Bakımı NIH Kılavuzu&#39;na ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı göre Albany Medical College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. 1. solüsyon preparasyonlarda NOT: Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Konfeti 16, αMHC-Cre 17 ve Rosa26-mTmG (mTmG) 20 fare hatları ticari satın alındı cTnT-Cre 18 Alabama Üniversitesi&#39;nden Dr. Jiao bir hediye oldu Nfatc1-Cre.. Tıp 19 Albert Einstein College of Dr. Bin Zhou bir hediye oldu. Fareler bilateral torakotomi kesilerek ya da servikal bozma ile ölüm doğrulama fiziksel yollarla ve ardından en az 60 saniye boyunca kapalı bir odada, karbon dioksit inhalasyonu ile ötenazi uygulandı. <ol><li> Tamoksifen hazırlayın. ayçiçeği oi, 10 ml Tamoksifen 10 mg çözülürl. -20 ° C de tamamen çözüldükten sonra, kısım ve mağaza. </li><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlayın. Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) ve damıtılmış su, 1 L KCl (0,20129 g) çözülür ve pH 7.4 ayarlanır. </li><li> PBST hazırlanması:% 0.1 Tween-20 çözeltisi PBS içinde PBS, 100 ml Tween-20, 100 ul çözülmesiyle. </li><li> tampon engelleme hazırlayın. % 0.2 Tween-20 içeren PBST 100 ml BSA, 3 g çözülmesiyle% 3 sığır serum albümini (BSA) Bloklama çözeltisi, sağlayın. </li><li> CUBIC-1 (reaktif 1) hazırlayın. Ağırlıkça% 25 üre, ağırlıkça% 25 N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin 15 ağırlık% Karışım dH 2 O Triton X-100 </li><li> CUBIC-2 (reaktif 2) hazırlayın. Ağırlıkça% 50 sakaroz, ağırlık olarak% 25 üre, ağırlıkça% 10 oranında 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;karıştırın - nitrilotriethanol ve% 0.1 (v / v) dH 2 O Triton X-100 </li><li> Sca Le A2 hazırlanması: 4 M üre,% 10 w / v gliserol ve / Triton V X-10,% 0.1DH 2 O. 0 7.7 pH ayarlayın. </li><li> Sca le B4 hazırlayın: 8 M üre ve / Triton v X-100 w% 0.1 dH 2 O. 8.7 pH ayarlayın. </li><li> Hazırlama Sca Le 70: 4 M üre,% 70 ağırlık / hacim gliserol ve DH 2 O. / Triton v X-100% 0.1 </li></ol> 2. Tamoksifen İndüksiyon, Embriyo İzolasyon ve Fiksasyon <ol><li> Tamoksifen İndüksiyon ve Embriyo İzolasyonu <ol><li> Embriyonik gelişim günde E7.75 33. Tamoksifen 10 ug / g (R26Cre ERT2 erkek fareler tarafından takılı) kavisli bir beslenme tüpü onaylanan protokole (ACUP 13-12007), sonda kadın R26Cre ERT2 Confetti fareler kullanma. Embriyonik gün 9.5 (E9.5) veya E10.5 anda, CO 2 ve servikal dislokasyon ile dişi farelerin euthanize. </li><li> Fare ölüm doğrulanmasının ardından, makasla fare karın boşluğu açın ve uterin boynuz teşrih (Bölüm 1 Not bakınız) makas ve cımbız ve yeniden yardımıyla rahim tüp katmanlarını kaldırmakrahim tüp 23,24 embriyolar kira. <ol><li> PBS (pH 7.4) ihtiva eden bir petri embriyolar aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, cımbız yardımı ile embriyonik olmayan katmanları (koryon, yolk kesesi ve amniyon) çıkarın. </li></ol></li><li> Daha önce 22 bildirildiği gibi cımbız ve makas kullanarak, genotipleme için dişi fare ve embriyo kuyruk örnekleri toplamak. Bir pipet kullanarak, 1x PBS 1 ml içeren 48 çukurlu bir levhanın bir kuyucuğuna, her embriyo transferi. </li><li> Bir floresan mikroskop altında, bir kamera ile bir inverted mikroskop aracılığıyla GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar tespit. uzakta Peel cımbız kullanarak perikard ve GFP / RFP / OBP filtreleri ile kalbin her iki tarafında floresan klonların sayısını belirlemek için kavisli cımbız yardımı ile kalp / embriyo döndürün. Hiçbir kesikler ihtiyaç vardır. </li></ol></li><li> GFP / RFP / CFP pozitif embriyolar belirledikten sonra, hızlı bir şekilde th 1x PBS ile iki kez (2 dk her biri) embriyolar yıkayınE 48, oda sıcaklığında (RT), bir plaka karıştırıcısı üzerinde iyi plaka. Bu aşırı kan kaldıracaktır. </li><li> Oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid (PFA) kullanılarak embriyo / embriyonik kalbini düzelt. sabitleme süresi embriyonik yaş ve doku büyüklüğüne bağlıdır. E9.5 oda sıcaklığında 2 st için embriyo düzeltin. Geç embriyonik evre embriyolar bile doğum sonrası kalp için 24 saat için uzatılabilir uzun fiksasyon süresi gerektirir. UYARI: Paraformaldehyde toksik, deri, göz ve mukoza zarı ile temasından kaçının. </li><li> Tespit edildikten sonra, oda sıcaklığında, bir plaka karıştırıcısı üzerinde iki kez 48 çukurlu plaka içinde 1x PBS (10 dk) embriyo / kalp yıkayın. Bu embriyo / kalp aşırı PFA kaldırır. Embriyolar daha sonra tüm montaj boyama ve doku temizlenmesi için işlenir. </li></ol> 3. Tüm Dağı Boyama NOT: aşağıdaki gibi PFA Tespit edildikten sonra embriyo / kalp tüm montaj boyama tabi tutulur. <ol><li> 1 m kullanarak bir 48 iyi plaka embriyo / kalbi permeabilizeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat boyunca% 0.1 PBST l. </li><li> geçirgenliği sonra, 4 ° C&#39;de bir plaka karıştırıcısı üzerinde 2 saat veya gece boyunca bloke tamponu 1 ml embriyo / kalp bırakın. </li><li> 4 ° C&#39;de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 0.3 ml (100 1) ile seyreltildi, endotelyal hücreye özgü antikor PECAM (CD31), embriyo / kalp bırakın. </li><li> plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında PBST 5 kez, 30 dakika her kullanılarak embriyo / kalbi yıkayın. Bu dokudan fazla spesifik olmayan bağlanmış primer antikor kaldırır. </li><li> 4 ° C&#39;de plaka karıştırıcısı üzerinde 48 saat süre ile blokaj tamponu 1 ml (1.000 1) ile seyreltildi ve Alexa Fluor 647 keçi anti-fare ikincil antikoru embriyo / kalp, bırakın. </li><li> Adımı yineleyin 3.4 ikincil antikor yıkayın. </li><li> plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4 PFA ile embriyo / kalp sonrası düzeltmek ve PBS her biri 5 dakika iki kez yıkayın. </li><li> Bir konsantrasyonlarda ise PBST içinde seyreltilmiş Nükleer soya 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (embriyo / kalp LekeOda sıcaklığında plaka karıştırıcısı üzerinde 10 dakika boyunca, 0.01 mg / mL) oranı. Her biri 5 dakika iki PBS yıkama ile takip edin. </li></ol> 4. Embriyo / Sca l e veya KÜBİK Yöntemi ile kalp Takas NOT: Bütün montaj boyamadan sonra, embriyo / kalp Sca le veya KÜBİK doku takas yöntemiyle ya tabi tutulur. Metodun seçimi dokunun büyüklüğüne ve embriyonik yaşına bağlıdır. E11.5 veya daha önceki yaş embriyolar, kullanım Sca l e doku temizleme yöntemi için eski embriyolar ya da doğum sonrası kalpler için KÜBİK doku temizleme yöntemi tercih edilir. <ol><li> Ölçek Doku Takas Yöntemi <ol><li> Yumuşak bir arada 4 ° C&#39;de 48 saat süre ile (elle) çalkalanarak (alüminyum folyo ile sarılmış) bir sintilasyon şişesine Sca l e A2 çözeltisinin 1 ml&#39;si ile embriyo / kalp inkübe edin. </li><li> Sca l e A2 inkübasyondan sonra, ara sıra nazik bir anot çalkalanarak aynı şişe içinde, 4 ° C&#39;de Sca l e B4 çözeltisi 1 mL embriyo / kalp inkübeOnu 48 saat. </li><li> Zaman zaman hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de, 1 ml Sca l e 70 sahip bir 48 saat daha embriyo / kalp inkübe edin. % 90 gliserol kullanılarak Dağı embriyo (bakınız bölüm 5.1). </li></ol></li><li> KÜBİK Doku Takas Yöntemi <ol><li> Bütün embriyo / kalp KÜBİK takas için, nazik arada 37 ºC 7&#39;de 48 saat boyunca çalkalanarak CUBIC-1 1 ml her embriyo / kalbi batırmayın. 48 saat sonra, taze, KÜP indikatör 1 aynı hacimde çözelti yerine ve zaman zaman elle çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 48 saat boyunca örnek inkübe edin. </li><li> yumuşak el ile çalkalayarak oda sıcaklığında 1 x PBS ile birkaç kez kübik 1 ile tedavi, kalp / embriyo yıkayın. Bu aşırı CUBIC-1 çözümü kaldırır. </li><li> PBS ile CUBIC-1 yıkanmasından sonra, zaman zaman nazik eliyle çalkalanarak 37 ºC&#39;de 48 saat süreyle CUBIC-2 çözeltisi (embriyo / kalp başına 1 gr) embriyolar / kalpleri batırmayın. Bu gliserol kullanarak montaj embriyo / kalbi izler (bakınız Bölüm 5.2). </li></ol></li></ol> 5. Numune Montaj ve Görüntüleme NOT: Sca l e 70 ya da CUBIC-2 çözeltisi içinde temizlenir embriyolar veya organlar sırasıyla görüntüleme aracı olarak Ölçeği 70 ve CUBIC-2 çözeltisi ile doğrudan görüntülenebilir. Numuneler aşağıda protokol izlenerek% 90 gliserol örnekleri saklamak, hemen görüntülü, ancak uzun vadeli saklanabilir değilse Ancak, takas reaktif embriyonik örneklerin açığı göz önüne alındığında. <ol><li> Doğrudan Sca Le görüntüleme kadar 4 ° C &#39;de% 90 gliserol ve deposunun 1 ml örneği temizlenir bırakın. </li><li> Iki kez 1 x PBS ile her biri 5 dakika KÜP muamele edilmiş numune yıkanır ve sırasıyla 30 dakika için% 30,% 50,% 70 ve% 90 gliserol çözeltisi, her biri 1 ml örnek inkübe edin. </li><li> Görüntüleme için, iki foton yetenekleri ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile% 90 gliserol ve görüntü klonlarının bir az miktarda cam alt Petri kabı örnek aktarmak. </li><li> Görüntü kalp ya da embriyo 10X / 0.3 NA ile gliserol, bir 25X / 0.8 NA daldırma veya 40X / 1.2 NA su düzeltici objektif lens. Görüntü DAPI tutarlı bir titanyumdan 2-foton uyarma kullanarak: safir bukalemun lazer. Mikroskop ve objektif lens seçimi süper çözünürlük için örneğin deneyler, amacına bağlı olacaktır, hafif bir tabaka floresan mikroskop yararlanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+a+heart:+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells.">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology.">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li><li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart.">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+(HREM).">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li><li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development.">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted,+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo.">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li><li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart.">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling.">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium.">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation.">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li><li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of mouse development. , (1992).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li><li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterior+heart-forming+field:+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart.">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li><li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricle,+outflow+tract,+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary/anterior+heart+field.">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li><li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia.">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li><li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS.">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse.">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li><li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+family+proteins:+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation.">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification.">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li><li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP.">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li><li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo.">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

embriyo izolasyonu çok kritik bir adımdır. E9.5 embriyolar bu yüzden ekstra bakım izolasyonu sırasında embriyo / kalp yapıları zarar vermemek için alınmalıdır, boyutu çok kırılgan ve küçük. Bütün embriyo görüntüleme sırasında embriyo / kalbi saran olmayan embriyonik ekstra katmanları dikkatlice özellikle çıkarılmalıdır. Bu embriyonik dokularda derinliklerine antikor ve takas karışımı penetrasyon sağlar ve aynı zamanda görüntüleme arka plan sinyali giderilmesinde yardımcı olur. PECAM karşı antikorlar, asetile α-tübülin ve integrin ß1 dahil olmak üzere birden antikorlar incelenmiş ve başarılı bir şekilde 33 (veriler gösterilmemiştir) tespit edilmiştir. Bu moleküler bütünlüğü, hücresel bütünlüğü ve antijen uyumluluğu bu temizleme işlemi sırasında kesintiye olmadığını göstermektedir. Geniş ağız transfer pipet (ucu kesilmiş) kullanılarak embriyo / kalbi aktarın. Bu işleme sırasında zarar görmesini engeller. GFP / YFP / RFP / CFP ifade desen ve nklonların umber dikkatlice tek yürek başına klon ya da herhangi bir diğer organlara etiket uygun dozajı belirlemek için kalbinde kaydedilmelidir. Nedeniyle Tamoksifen (10 ug / g), düşük doz, bazen kalp tüm klonlar ihtiva ya da klonları tespit etmek zor değildir. Nedenle, embriyo herhangi GFP / YFP / RFP / OBP klonlar olup olmadığını belirlemek için yolk sac kullanılması tavsiye edilir. Embriyo veya kalp tespit aşırı tespitin altında tespitin zayıf boyanma neden olurken, yüksek arka planda neden olacağı için, kritik bir adımdır. Bir plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 2 st için E8.5-E10.5 bütün embriyo düzeltmek için tavsiye edilir. E11.5-E15.5 embriyolar için de, öneri dikkatle kalbi izole ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle% 4 PFA ile bunu düzeltmek için olduğunu. Bütün embriyo işleme eğer kalbi çevreleyen katmanları kaldırmak için olduktan sonra, E11.5- E13.5 embriyolar da oda sıcaklığında 3-4 saat sabit olabilir ama bu artan doku temizleme zaman gerektirir. E16.5-P1 (postnatalGün 1) Kalpler, bir plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca sabittir. Bütün embriyo sabitleme onlar kalp görüntüleme engel olarak, ön ve arka bacaklarda çıkarılmalıdır. Örnekler Örnek Kurutma en aza indirmek için sintilasyon şişelerine le kübik ve Sca ile muamele edilmelidir. Sca le temizleme optimal 4 ° C&#39;de yapılır ederken, 37 ° C&#39;de kübik doku temizleme yöntemi ile örneklerin daha iyi temizleme gözlemledik. Görüntüleme sonra, numuneler 2-CUBIC veya Sca le 70 kısa vadeli saklanabilir. Numuneler her zaman floresan beyazlatma önlemek için alüminyum folyo ile kaplanmış olmalıdır. Embriyonik doku ve organlara daha az takas sürede sonuçlanır az lipid ve hücre dışı matriks birikimi var. Öte yandan, onlar takas reaktifleri daha yatkındır. temizleme reaktifler CFP RFP ve antikor konjugat söndürülmesi sonucu, doku yapısının ve antijen bütünlüğünü etkileyebilirkapı fluorofor. Bu nedenle, uzun fiksasyon kez söndürmeyi önlemeye olabilir. Daha önce rapor edildiği gibi 34 floresan proteinleri söndürme aynı zamanda kimyasal duyarlılık ve pH bağlı olabilir. Diğer kimyasal tarifleri, pH, fiksatif ve inkübasyon uzunluğu floresan proteinleri söndürme en aza indirmek için araştırılmalıdır. Tüm organ veya doku transparentizing temizleme yöntemi hacimsel 3D görüntü devrim yarattı. Seri bölümlerin manuel 2D veya 3D rekonstrüksiyon dahil kardiyak morfolojilerinden önceki bir görüntüleme yöntemi, zaman alıcı ve enstrüman 5,6 zorlu olduğunu. 3D modeli oluşturmayla birlikte yüksek çözünürlüklü episcopic mikroskobu (HREM) fare kalp morfonogenezi nasıl uygulanabilir ve gelişmekte olan fare embriyo 35 trabeküler mimarisinin mükemmel anatomik bilgi sağlar edilebilir. Bununla birlikte, HREM fluoresc tanımlanmasına izin vermezent proteini, etiketlenmiş hücreler veya hücre 35 geri kalanından antikoru ile boyanmış hücrelerin. En az çaba ve yüksek maliyet etkinliği ile mevcut protokol, kullanarak, başarılı Sca le veya KÜBİK doku temizleme yöntemleri (- 3 Şekil 1) ile embriyonik kalbinde floresan sinyalleri korumuşlardır. Cre rekombinasyon olayları neden ve tüm embriyo içinde ve kalbinde bir kaç klonlar oluşturmak için Tamoksifen düşük dozda kombine (10 ug / g), bu sistem iz ve tek kalp progenitör hücre farklılaşması ve hücresel davranışları incelemek için kullanılabilir in vivo (Şekil 2A) 33. Buna ek olarak, Cre aracılı gen silme veya aşırı ifadesi ve Cre aracılı tek hücre etiketi ile birlikte, bu görüntüleme sistemi, kalp morfogenez boyunca fonksiyon veya projenitör hücre farklılaşması ve hücresel davranışı üzerindeki fonksiyon kazanma genetik kaybı çalışma uygulanabilir, ve böylece sağlam bir sağlar edilebilir st aracıkonjenital kalp etyolojilerini UDY. Bu çalışmada kullanılan iki doku temizleme sistemleri Sca / e ve kübik daha embriyonik yaşta, doku kalınlığı ve doku temizleme zaman süresine dayalı sistemler ayırt olan farklı temizleme verimliliği gösterdi. Erken evre embriyolar E9.5-E10.5 için, Sca / e sistemi açık doku kılmakla kalmıyor ama KÜBİK tedavi embriyo çözülme sonuçlandı ederken de, floresan sinyalleri embriyo morfolojisi korumalı ve muhafaza. Bu ek aminoalkollerin sonucu ve kübik çözeltiler 8 Triton X-100 daha yüksek bir konsantrasyonu olabilir. Eski kalpleri için, Sca / e sistemi bile daha uzun bir kuluçka süresi ile tamamen dokuyu temizlemek için başarısız oldu. KÜBİK takas çözümü eski doku berrak (Şekil 3) render. Ancak, artan inkübasyon süresi, zayıf sinyaller ve sadece korunan endojen GFP sonuçlandı ederken RFP, OBP ve antikor konjuge sinyallerkaybolduk. Bu nedenle, kesim reaktifler ve daha inkübasyon süresi bir daha optimum tarifi floresan etiketler daha büyük bir yelpazede görüntü Kupa veya organları volümetrik için gerekli olacaktır. Bu çalışma bir gelişmekte olan kalbin endotel / endokardiyal hücre işaretleyici PECAM bir bütün montaj boyama ile birlikte, iz etiket ve görüntü tek kalp klonlar olduğunu gösterdi. Bu sistemde PECAM ve DAPI tüm montaj boyama değil sadece bir kalbin içinde işaretli hücrelerin hücre tipleri ve hücre morfolojisi belirlemeye yardımcı olur, ama aynı zamanda kalp morfolojilerinden sırasında klonal desen, göç ve davranış çalışma sağlar. Şekil 2A biz OFT 8 hücreler içeren bir klon gözlenmiştir. Etiketleme zaman referansla bu klonun hücre mevcut sayısını kullanarak, hücre çoğalması hızı kolayca hesaplanabilir. Bu aynı sistemi kullanan başka bir çalışmada odaklı hücre bölünmesi desen ve MIGR tespittrabekülasyon işlemi 33 sırasında tek kardiyomiyosit bir tirme deseni. spatiotemporally etiketli kalp progenitör hücre farklılaşması üzerine fonksiyon veya fonksiyon kazanç genetik kaybının etkilerini incelemek amacıyla bu protokolün uygulanması, klonal desen ve hücresel davranış uygulanabilir ve genetik olarak doğuştan kalp kusurları etyolojisi çalışmalarda yardımcı olacak ve 3B bağlamda moleküler seviyede. Buna ek olarak, bu protokol, organ sistemlerinde morfojenezinin çalışma uygulanabilir.

Kardiyak morphogenesis kalbin farklı sektörleri içine kalp progenitör hücrelerin dört farklı tipte zamanmekansal organizasyon gerektiren bir ardışık bir olay olduğunu ve aynı zamanda fonksiyonel kalp 1,2 oluşturmak için bu süreci düzenlemek için birden fazla genetik düzenleyici ağları gerektirir. Kardiyak şartname, farklılaşma, desenleme ve bölme olgunlaşma kardiyojenik transkripsiyon faktörleri 3 düzenlenir. Genetik mutasyon veya kardiyak progenitör hücrelerin bu faktörlerin posttranskripsiyonel sapmaları embriyonik öldürücülüğü veya konjenital kalp kusurları (KKH) 4 ya neden olabilir. Kalp morfolojilerinden çalışma kardiyak morfojenezinde anlayışı teşvik edecek kalp gelişimi sırasında izleme üç boyutlu (3D) doğasında yapısal detayları ve tek etiketli kalp progenitör hücre soyu anlamayı gerektirir. yüksek çözünürlüklü bölümü tomografi bir dizi yöntem inci geliştirilmiştirGörüntü organ yapısı 5,6 birkaç on yıl geçmiş, e; Ancak, bu yöntemler pahalı, özel araçlar, geniş emek gerektiren ve son hacimsel görüntü 7,8 yeniden tek hücreli çözünürlükte ayrıntılı yapısal organizasyon eksikliği. Tek hücre düzeyinde 3D hacimsel görüntüleme in vivo 7 progenitör hücre farklılaşması ve hücre davranışlarını incelemek için bir araç sağlar. Ancak, doku ışık saçılması derin bozulmamış kalp içinde 3D hücreleri ve yapıları görüntüleme önündeki en önemli engel olmaya devam etmektedir. Doku şeffaflığı 8 artırmak için potansiyel yaklaşımlar lipidler ışık saçılması önemli bir kaynak ve lipidler ve / veya lipidler ve çevresinde arasındaki kırılma indeksi farkı ayarlama kaldırma are. Son birkaç yıl içinde, doku temizleme bir dizi yöntem, doku donukluk ve ışık saçılması azaltan, geliştirilmiş Babb (benzil alkol ve benzil benzoat gibiE karışımı) ile DBE (tetrahidrofuran ve dibenzylether); ancak bu yöntemlerde, floresans bir sorun 8-10 devam etmektedir. Solvent gibi SeeDB (fruktoz / tiyogliserol) ve 3DISCO (diklorometan / dibenzylether) gibi hidrofilik yöntemleri, bazlı floresan sinyalleri korumak, ancak 7,8,11 şeffaf bütün organı render yoktur. Buna karşılık, CLARITY doku temizleme yöntemi organı saydam yapar, ama aynı zamanda hidrojel 7,13 gömme gerektirir PACT (pasif berraklık tekniği), yaptığı gibi, lipidler 8,12 kaldırmak için özel bir elektroforez aygıtı gerektirir. Tüm doku temizleme yöntemleri hakkında ayrıntılı bilgi için, ark Richardson ve Lichtman, Tablo 1&#39;e bakınız. 7.. 2011 yılında, Hama ve ark. Tesadüfen bir hidrofilik karışım &#39;Sca Le&#39; keşfettik (üre, gliserol ve Triton X-100 karışımı) fare beyin ve embriyo transpar hale getirdiğiKBB tamamen etiketli klonları 14 floresan sinyalleri koruyarak. Bu hücre içi çözünürlükte birkaç milimetre ve nöronal nüfus ve çıkıntılar büyük ölçekli yeniden derinlikte bozulmamış beyin görüntüleme sağlar. Susaki ve ark. ayrıca aminoalkoldür ekleyerek le SCA geliştirilmiş ve fosfolipid çözülmesini arttı &#39;CUBIC&#39; (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analiz) doku temizleme yöntemi, azaltılmış temizleme zamanı geliştirdi ve çok renkli floresan görüntüleme 8 sağladı. Bu çalışmada, cardiogenesis sırasında kalbin içinde Sca le avantajı ve KÜBİK doku takas teknikleri ve yüksek çözünürlüklü 3D optik bölümlendirilmeleri, bireysel klonlar alarak Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre kullanılarak takip edildi 18, </strong&gt; Nfatc1-Cre 19 ve Rosa26-mTmG (mTmG), 20 fare soyları. Tüm montaj boyama (WMS) yönteminin kombinasyonu, daha önce 21,22 daha etiketli klonlar diğer proteinlerin boyama ve 3D hacimsel bağlamında kendi davranış çalışma için izin verilen doku temizleme yöntemleri ile gelişti. Doku temizleme ve WMS kombinasyonu kalp gelişimi sırasında farklı genlerin ve proteinlerin rolleri daha iyi anlaşılması ve konjenital kalp etyolojisinde sağlar. Bu protokol, geliştirme sırasında diğer progenitör hücre farklılaşması, hücre davranışını ve organ morfogenez olayları incelemek için uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="950">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">2,2&#8242;,2&#8242;&#8217;-nitrilotriethanol&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">90279</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td style="width:192px;">Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:192px;">Fischer Scientific&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP16000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">122262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton&#160;X-100</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">U-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Sucrose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Glycerol</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">G8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Sunflower seed oil</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S5007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">PECAM (CD31)</td>
			<td>BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:211px;">550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">DAPI nuclear stain</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">D9542</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">37oC Incubator</td>
			<td style="width:192px;">Thermoscientific Fischer</td>
			<td style="width:211px;">Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td style="width:192px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:211px;">229148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:192px;">Metler Toledo</td>
			<td>PB153-S/FACT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zeiss 510 confocal microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Disecting Microscope</td>
			<td style="width:192px;">Unitron</td>
			<td style="width:211px;">Z850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer. Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td>
			<td style="width:192px;">CellPoint Scientific</td>
			<td style="width:211px;">GER-5287-120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Light Source</td>
			<td style="width:192px;">SCHOTT</td>
			<td style="width:211px;">ACE I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pair of Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dish 60x15mm&#160;</td>
			<td align="left">TPP Techno Plastic Products AG</td>
			<td>93060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Rocker II&#160; Platform Rocker</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td style="width:211px;">260350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scintillating tubes</td>
			<td style="width:192px;">Fischer Scientific&#160;</td>
			<td>03-337-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:192px;">Samco Scientific</td>
			<td style="width:211px;">202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

Bütün kalp seviyesinde tek klonal izleme ve analiz kalp gelişimi sırasında kalp progenitör hücre davranışını ve farklılaşmasını belirlemek ve normal ve anormal kalp morfolojilerinden hücresel ve moleküler temeli çalışması için izin verebilirsiniz. retrospektif tek klonal analizler Son gelişen teknolojiler tek bir hücre çözünürlükte kalp morfolojilerinden çalışma mümkün olun. Ancak, doku donukluk ve görüntüleme derinliği gibi kalbin ışık saçılması tek bir hücre çözünürlükte hinder bütün kalp görüntüleme artar. Bu engelleri, geliştirilmesi gerekir aydınlatma ve tespiti hem son derece şeffaf kalbi işleyebilir bir bütün embriyo takas sistemini aşmak için. Neyse ki, son birkaç yıl içinde, bu tür CLARITY olarak tüm organizma temizleme sistemleri, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, Babb ve PACT için birçok yöntemler bildirilmiştir. Bu laboratuvar kartının hücresel ve moleküler mekanizmalar ilgileniyorIAC morphogenesis. Son zamanlarda, biz ROSA26-Cre ERT2 üzerinden izleme tek bir hücre soyu kurulmuş, seyrek etiket hücrelere ROSA26-Konfeti sistemini kalp gelişimi sırasında. Biz kalp içinde görüntü tek klonlar bütün montaj boyama ile birlikte embriyo temizlemek için Sca le ve CUBIC (net, engelsiz beyin görüntüleme kokteyller ve hesaplamalı analizi) dahil olmak üzere birçok bütün embriyo-takas yöntemleri uyarladı. Kalp başarıyla tek bir hücre çözünürlükte görüntülendi. Biz CUBIC doğum sonrası kalbi temizlemek süre Sca le, embriyonik kalbi temizlemek, ancak etkili bir doğum sonrası kalbi temizlemek olamayacağını bulundu, ancak zarar dokuyu eriterek Embriyonik kalp. Burada açıklanan yöntemler sırayla, konjenital kalp defektleri hücresel ve moleküler temelini ortaya çıkarabilir, kalp morfolojilerinden sırasında tek bir klon çözünürlükte gen fonksiyonu çalışma izin verecektir.

temizlenir embriyonik kalbin görüntülenmesi Omurgalı kalp oluşumu spatiotemporally düzenlenmiş morfojenik süreçtir ve dört farklı kaynaklardan 1 organizasyon ve progenitör hücrelerin farklılaşması bağlıdır. Kalp hilalin ilk kalp alanından Hücreler doğrusal bir kalp tüp oluşturacak şekilde ventral orta hat doğru katlanır. Başlangıçta ilk kalp alanına dorsomedially ikamet eden ikinci kalp alanından hücreler, daha sonra da lineer kalp tüpü önceden varolan iskele göç yerden, farenks ve splanknik mezoderm transloke. Ikinci kalp alanının hücreleri sağ ventrikül, çıkış yolu (OFT) miyokarda ve bazı endokardiyum 25-28 katkıda bulunacaktır. Kardiyak nöral krest hücreleri (CNCC) postotic rhombomeres 6, 7 ve 8 menşeli, kaudal yutak göç ve belirgin olarak artmış katkıda bulunacakOFT düz kas tabakası ve endokardiyal minderleri derecede. Ayrıca aortikopulmoner septum 29,30 oluşumuna katkıda bulunmaktadır. Dördüncü popülasyon Pro-epikardiyal organ (PEO) türetilen epikardiyal hücrelerinden oluşur, ve fibroblastlar, düz kas hücreleri ve potansiyel olarak diğer kalp hücre tipleri 31 katkıda bulunur. Epicardium koroner damar gelişimi, kalp büyümesi ve morfolojilerinden 21 düzenlemektedir. Kalp morfolojilerinden ile ilgili en önemli kavram kalp gelişimi, anormal hücre göçü sırasında / dört progenitör hücre popülasyonlarının farklılaşma malformasyonlar veya konjenital kalp kusurları doğum kusurları bir numaralı nedeni dünyada olduğu 4,22,32, neden olacaktır . hücresel ve moleküler düzeyde kalp morfolojilerinden mekanizmalarını belirlenmesi DKH&#39;ler için tanı ve potansiyel tedaviler geliştirmek yönünde önemli bir adımdır.Bu nedenle, görüntü, tek bir hücre çözünürlükte bütün kalp seviyesinde kalp morfolojilerinden süreci önemlidir. Bunu başarmak için, biz özellikle mTmG muhabiri hattı ile kardiyomiyositlerinin 18 olarak ifade edilir kardiyak spesifik troponin T kontrolü (cTnT) altında Cre çizgisini geçerek kardiyomiyositlerde etiketli. E8.5 embriyolar hasat ve kardiyomiyositlerde gelen endokardiyal ve endotel hücrelerini ayırt etmek PECAM için boyandı. Embriyolar daha sonra Sca le tarafından temizlendi ve kalp görüntülendi. Miyokard bağlı mTmG habercisinin cTnT odaklı Cre aracılı rekombinasyon GFP tarafından etiketlenmiştir ve endokard PECAM (Şekil 1A ve Yardımcı film 1) ile işaretlenmiştir. Kardiyomiyositlerde tek bir hücre çözünürlüğü (Şekil 1A) gözlenebilir. Böyle ilkel ventrikül ve OFT olarak görüntülü kısmın kalp yapıları, açıkça 3D yeniden kullanarak 3D rekonstrüksiyon sonra tespit edilebilirinşaat yazılımı (Şekil 1B ve Ek Movie 2). temizlenir embriyonik kalp tek klonlar Görüntüleme Kardiyak morphogenesis bütün kalp düzeyinde 22 kardiyak soy farklılaşma ve bireysel hücre organizasyonu bağlıdır ve bu nedenle, farklı kardiyak hücre tiplerine görüntü tek kalp progenitör hücre farklılaşması için gereklidir ve tek bir hücre çözünürlükte aynı zamanda görüntü hücre morfolojisi için. Bunu başarmak için, Rosa26Cre ERT2 15 R26R-Confetti&#39;nin 16 çaprazlandı, ve hamile bir kadın, düşük konsantrasyonda Tamoksifen zorla ağız yolundan verilmiştir edildi. 48 saat sonra, embriyo E9.5 hasat edildi ve bütün PECAM için lekeli monte, ve sonra bütün kalp görüntülendi. Bu OFT lokalize, hücrelerin sadece bir küme olduğu bulundu ve bu klon 8 hücre göre o vardıOluşturulan görüntü ve bu hücreler, tek bir progenitör hücreden türetilen belirten ardışık bölümler (Şekil 2A, 2B ve Yardımcı Film 3), n. Böyle hücresel çoğalma ve göç gibi hücresel morfoloji ve hücresel davranış hücreleri (Şekil 2A) nihai konumlandırılması anlaşılabilir. Ayrıca veri gösterilmemiştir (E9.5 ve E10.5 embriyonik kalp temizlemek kübik bir yöntem uygulanır ve daha reaktif 1 ile inkübasyon sadece 24 saat sonra, embriyolar ustaca eritildi bulundu ve doku yapısı olumsuz etkilenmiştir ). temizlenir postnatal ve geç embriyonik kalpleri görüntüleme Biz doğum sonrası kalpleri temizlemek için Sca l e ve CUBIC hem uygulamalı. αMHC-Cre genotipi ile P2 kalpleri; mTmG (αMHC-Cre özellikle kardiyomiyositlerde ifade edilir &lt;sup&gt; 17) 48 saat boyunca Sca l e temizlendi, ancak Sca l e temizleme sonrası kalpleri için etkili olmadığını belirten, PBS ile tedavi kalpleri yalnızca (veri gösterilmemiştir) daha fazla bir şeffaflık görüntüler yoktu. P2 kalpler 48 saat ve 96 saat süreyle indikatör 2 için KÜBİK indikatör 1 ile silinmesinden, onlar çok daha şeffaf 48 saat indikatör 1 ve 48 saat indikatör 2 ile temizlenir kalpleri daha vardı. Görüntüleme derinliği belirgin KÜP reaktifler ile daha uzun inkubasyon saydamlık sağlar ve görüntüleme derinlemesine bir artış sağladığını gösterir: reaktif, 2 inkübasyondan 96 saat (Ek Film 4 ve 5) ile yükseltilmiştir. Her kardiyomiyosit şekli ve boyutu hipertrofisi tanımlamak için kullanılabilir membran lokalize GFP (Şekil 3A) ile tespit edilebilir. Nf ile takılı Konfeti (Konfeti kadın; biz de Nfatc1-Cre temizlediatc1Cre male) E17.5 Kalpler (Nfatc1-Cre 48 saat ve 48 saat süre ile reaktif 2 kübik indikatör 1 kardiyak endokardiyal hücreler 19) olarak ifade edilir. kalpleri şeffaf ve GFP, YFP, CFP ve RFP dahil floresan proteinleri endokardiyal hücreleri ve bunların türevi hücreleri etiketlemek için beklenen; Bununla birlikte, sadece GFP ve YFP bütün kalp ile görüntülenebildi (Şekil 3B, 3C ve Katkı Film 6 ve 7) ve CFP ve RFP tespit edilememiştir (veriler gösterilmemiştir). PECAM için boyama (Alexia Fluor 647) de KÜBİK reaktif CFP, RFP ve bu protokolde antikor konjuge fluorofor doyurur düşündüren, (Veriler gösterilmemiştir) tespit edilememiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54303/54303fig1.jpg" /> Şekil 1:. Sac / e embriyonik kalbi temizlenir Görüntüleme (A) Tek opBir E8.75 kalp (cTnT-Cre; mTmG) ve kortikal dilim gösterilir. V: ventrikül; OFT: çıkış yolu. (B) 110.4 mikron toplam derinliği ile 93 ardışık optik dilim yeniden kalp yapısını gösterir. A. Ölçek çubuğu = 20 mikron <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/54303fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54303/54303fig2.jpg" /> Şekil 2: Sca / e tek klon Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (A) ROSA26-Cre ERT2 genotip ile bir E9.5 kalpten bir klon bir optik bölümü;. ROSA26-Konfeti. Bir kardiyomiyosit bir hücresel çıkıntı ok işaret eder. (B) 10 optik dilimleri ve 36 mikron toplam derinliği ile E9.5 kalbin OFT bölgede yeniden klon gösterir. A. Ölçek çubuğu = 20 mikron<html> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/54303fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54303/54303fig3.jpg" /> . Şekil 3: CUBIC temizlenir postnatal ve geç embriyonik kalpleri Görüntüleme (A) αMHC-Cre genotip ile P2 kalbin bir optik bölümü gösterir; mTmG; ROSA26-Confetti, optik tüm bölümleri Ek Film 5. (B) &#39;de gösterilmiştir Nfatc1-Cre genotipine sahip bir E17.5 kalbin bir kesitini göstermektedir. (C) 630 mikron toplam derinliği 106 optik kesitlerden yeniden kalp yapısını gösterir. Ölçek çubuğu = A 20 mikron ve B&#39;de 100 mikron olan <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/54303fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;ent <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_1.mp4" target="_blank">. Ek Film 1: Sca le Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (Sağ indirmek için tıklayın)</a> ; kalp lümene kalp yüzeyinden Film 1 Sca le optik bölümleri E8.75 kalbi (mTmG cTnT-Cre) tedavi gösterir. Derinlik 110.4 mm ve toplam 93 dilim vardır. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_2.mpg" target="_blank">Ek Movie 2:. Sca le Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (Sağ indirmek için tıklayın)</a> Film 2 Film 1 yeniden kalbin 3D yüzey resmini gösterir, reconstruc3D rekonstrüksiyon yazılımı ile ted. Sarı işaretleri PECAM ifade ve yeşil etiketler tüm kardiyomiyositlerde. <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov3.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_3.mp4" target="_blank">Ek Film 3: Sca le tek bir klon Görüntüleme embriyonik kalbi temizlenir (Sağ indirmek için tıklayın).</a> Film 3 ROSA26-Cre ERT2 genotip ile bir E9.5 kalpten bir klon kesitlerini göstermektedir. <img alt="Film 4" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov4.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_4.mp4" target="_blank">Ek Film 4:. CUBIC temizlenir doğum sonrası kalpleri Görüntüleme (Sağ indirmek için tıklayın)</a> Film 4 CUBIC tedavi P2 kalbin bölümlerini gösterir (&amp; #945, kalp lümen kalp yüzeyinden mTmG) MHC-Cre. Bu P2 kalp 48 saat KÜBİK indikatör 1 ve 96 saat süreyle KÜBİK indikatör 2 ile temizlendi. <img alt="Film 5" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov5.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_5.mp4" target="_blank">Ek Film 5:. CUBIC temizlenir doğum sonrası kalpleri Görüntüleme (Sağ indirmek için tıklayın)</a> Film 5 48 saat ve 48 saat süreyle 2 KÜBİK reaktifin 1 CUBIC reaktif ile temizlendiği bir kalp gösterir. derinlik film 4 Bölüm başına 6 mikron ile 136 mikron ve kalınlığı film 5 Bölüm başına 6 mikron ile 76 mikron. <img alt="Film 6" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov6.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_6.mp4" target="_blank">Ek Film 6: CUBIC temizlenir geç Embry Görüntüleme</a>. Kalp lümen kalp yüzeyinden; onic kalp Film 6 CUBIC tedavi E17.5 kalp (ROSA26-Konfeti Nfatc1-Cre) kesitlerini göstermektedir (Sağ indirmek için tıklayın). derinlik Bölüm başına 6 mikron ile 630 mikron. <img alt="Film 7" src="/files/ftp_upload/54303/54303mov7.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54303/Suppl_Movie_7.mpg" target="_blank">Ek Film 7: CUBIC temizlenir geç embriyonik kalbi Görüntüleme (Sağ indirmek için tıklayın).</a> Film 7 3D rekonstrüksiyon yazılım aracılığıyla yeniden Movie 6 kalbin 3D yüzey resmini gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution at JoVE.com

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Görüntüleme.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

Video: Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Gelişim Biyolojisi

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Mikro-BT Görüntüleme için Erişkin ve Erken Postnatal Fare Akciğerlerinin Vasküler Döküm

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...