We thank M.W. laboratory members for scientific discussion. This work is supported by AHA [13SDG16920099] to M.W., and by National Heart, Lung, and Blood Institute grants [R01HL121700] to M.W. Images were captured in the Imaging Core Facility at the Albany Medical College.

모든 동물 실험은 관리에 대한 NIH 가이드에와 실험 동물의 사용에 따라 올 버니 의과 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 수행 하였다. 1. 솔루션의 준비 참고 : Rosa26Cre ERT2 15 R26R - 색종이 (16)는, αMHC-Cre 호텔 (17), 및 Rosa26-mTmG (mTmG)는 20 마우스 라인은 시중에서 구입 한 cTnT를-Cre 호텔 (18)는 알라바마 대학에서 박사 지아오에서 선물했다 Nfatc1-Cre 호텔.. 의학 (19)의 알버트 아인슈타인 대학에서 박사 빈 저우에서 선물했다. 마우스는 양측 개흉술, 잘린 또는 자궁 전위에 의해 사망 ​​검증의 물리적 수단 다음에 적어도 60 초 동안 밀폐 된 챔버 내에서 이산화탄소 흡입에 의해 안락사시켰다. <ol><li> 타목시펜을 준비합니다. 해바라기 씨 OI 10ml에 타목시펜 10 ㎎을 용해엘. -20 ℃로 완전 용해 후, 분액 저장. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 나 2 HPO 4 (1.41960 g), KH 2 PO 4 (0.24496 g), 염화나트륨 (8.0669 g) 및 증류수 1 L에의 KCl (0.20129 g)을 녹이고 7.4로 pH를 조정합니다. </li><li> PBST 준비 : 0.1 % 트윈 20 용액을 PBS에서 PBS 100 ㎖의 트윈 20 100 ㎕를 용해. </li><li> 버퍼를 차단 준비합니다. 0.2 % 트윈 -20을 함유하는 PBST 100 ml의 BSA 3 g을 용해시켜 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 블로킹 용액을 만든다. </li><li> CUBIC-1 (시약 1)을 준비합니다. 25 중량 % 우레아, 25 중량 %의 N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 키스 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민 및 15 중량 %를 혼합 DH 2 O. 트리톤 X-100 </li><li> CUBIC-2 (시약 2)을 준비합니다. 50 중량 % 수 크로즈, 25 중량 % 우레아, 10 중량 %, 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;믹스 - nitrilotriethanol 0.1 % (절 / V) DH (2) O. 트리톤 X-100 </li><li> 무서 제작 A2 준비 : 4 M 우레아, w 10 % / V 글리세롤 및 / 트리톤 V X-10 w 0.1 %DH 2 O. 0 7.7로 pH를 조정합니다. </li><li> 무서 제작 : B4 준비 : 8 M 요소 및 / 트리톤 V X-100w 0.1 % DH 2 O.에서 8.7로 pH를 조정합니다. </li><li> 준비 무서 제작 : 70 : 4 M 우레아, 70 % w / v를 글리세롤과 DH 2 O.에서 / 트리톤 V X-100 w 0.1 % </li></ol> 2. 타목시펜 유도, 배아 분리 및 고정 <ol><li> 타목시펜 유도와 배아 분리 <ol><li> 배아 발달 하루 E7.75 (33)에서 타목시펜의 10 μg의 / g으로 (R26Cre ERT2 수컷 마우스에 의해 연결) 곡선 공급 튜브 승인 프로토콜 (ACUP 13-12007), 위관 여성 R26Cre ERT2 색종이 마우스를 사용. 배아 일 9.5 (E9.5) 또는 E10.5에서, CO 2, 자궁 경부 전위와 여성의 쥐를 안락사. </li><li> 마우스 사망 확인 후, 가위 마우스 복강을 열고 자궁 경적을 해부, (제 1 주 참조) 가위와 핀셋, 다시의 도움으로 자궁 튜브 층을 제거자궁 관 (23, 24)에서 배아를 임대. <ol><li> PBS (산도 7.4)를 포함하는 페트리 접시에 배아를 전송합니다. 해부 현미경, 핀셋의 도움으로 비 배아 층 (융모막, 난황과 양막)를 제거합니다. </li></ol></li><li> 이전에 22을보고 집게와 가위를 사용하여 유전자형의 여성 마우스와 배아의 꼬리 샘플을 수집합니다. 플라스틱 피펫을 사용하여, 1X PBS 1 ㎖를 함유하는 48 웰 플레이트의 각 웰에 배아를 옮긴다. </li><li> 형광 현미경, 카메라와 거꾸로 현미경을 통해 GFP / RFP / CFP 긍정적 인 배아를 식별합니다. 멀리 껍질 핀셋을 사용하여 심낭과는 GFP / RFP / CFP 필터와 심장의 양쪽에 형광 클론의 수를 결정하는 곡선 핀셋의 도움으로 마음 / 배아를 돌립니다. 어떤 컷은 필요하지 않습니다. </li></ol></li><li> GFP / RFP / CFP 긍정적 인 배아를 식별 한 후, 신속하게 일에 1X PBS로 두 번 (2 분 각각) 배아를 씻어전자 48 실온 (RT)에서 판 쉐이커에 잘 판. 이 여분의 혈액을 제거합니다. </li><li> RT에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 태아 / 배아의 마음을 수정합니다. 고정 시간은 배아 나이와 조직의 크기에 따라 달라집니다. E9.5의 경우 실온에서 2 시간 동안 배아를 수정합니다. 늦은 배아 단계의 배아도 출생 후 심장에 대한 24 시간으로 연장 할 수 있습니다 더 이상 고정 시간을 필요로합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성, 피부, 눈 및 점막과의 접촉을 피하십시오. </li><li> 고정 후, 실온에서 접시 쉐이커에 두 번 48 잘 접시에 1X PBS로 (10 분 각각) 배아 / 마음을 씻는다. 이 배아 / 마음에서 과잉 PFA를 제거합니다. 배아는 또한 전체 마운트 염색 및 조직 청산을 위해 처리됩니다. </li></ol> 3. 전체 마운트 얼룩 참고 : 다음과 같이 PFA 고정 후 배아 / 마음은 전체 마운트 염색을 실시한다. <ol><li> 1m를 사용하여 48 잘 플레이트에서 배아 / 마음을 Permeabilize 하시려면실온에서 플레이트 통에 2 시간 동안 0.1 % PBST의 리터. </li><li> permeabilization 후, 4 ºC에서 접시 통에 2 시간 또는 밤새 차단 버퍼 1 ml의 배아 / 마음을 몰입. </li><li> 4 ºC에서 판 통에 48 시간 동안 버퍼를 차단 0.3 ml의 : (100 1) 희석 내피 세포 특이 적 항체 PECAM (CD31)에 배아 / 마음을 담가. </li><li> 판 통에 실온에서 PBST 5 회, 30 분 각각을 사용하여 배아 / 마음을 씻으십시오. 이 조직에서 과량의 비 특이 결합 된 차 항체를 제거합니다. </li><li> 4 ºC에서 판 통에 48 시간 동안 버퍼를 차단 1 ㎖에 (1000 1) 희석 알렉사 플 루어 647 염소 항 - 쥐 이차 항체에 배아 / 마음을 담가. </li><li> 단계를 반복 3.4 이차 항체를 씻어. </li><li> 판 통에 실온에서 1 시간 동안 4 % PFA와 배아 / 마음을 포스트 - 수정하고 PBS 5 분마다 두 번 씻는다. </li><li> 승낙에 PBST에 희석 핵 얼룩 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) (와 배아 / 마음을 얼룩실온에서 플레이트 통에 10 분 동안 0.01 ㎎ / ㎖)의 배급. 5 분 각각 두 PBS 세척에 따릅니다. </li></ol> 4. 배아 / 무서 리터 e 또는 CUBIC 방법 심장 지우기 참고 : 전체 마운트 염색 한 후, 배아 / 마음이 무서 제작 또는 CUBIC 조직 청소 방법 중 하나를 실시한다. 방법의 선택은 티슈 크기 및 배아 나이에 따라 달라진다. E11.5 이전 연령의 배아를 사용 무서 리터 전자 조직 청소 방법에 대해서는 이전의 배아 또는 출생 후의 마음의 CUBIC 조직 청소 방법이 선호된다. <ol><li> 규모의 조직 지우기 방법 <ol><li> 부드러운 가끔 4 ℃에서 48 시간 동안 (손으로) 진탕 (알루미늄 호일에 싸서) 섬광 유리 병에 무서 리터 전자 A2 용액 1 ml의 배아 / 마음을 품어. </li><li> 무서 리터 전자의 A2 배양 한 후, 가끔 부드러운 anot 진탕와 같은 병에 4 ° C에서 무서 리터 전자 B4 용액 1 mL로 배아 / 마음을 품어그녀의 48 시간. </li><li> 가끔 부드러운 흔들림 4 ° C에서 1 ml의 무서 리터 전자 (70)와 또 다른 48 시간 동안 배아 / 마음을 품어. 90 % 글리세롤을 사용하여 마운트 배아 (5.1 절 참조). </li></ol></li><li> CUBIC 조직 지우기 방법 <ol><li> 전체 배아 / 마음 CUBIC 지우기를 들어, 부드러운 가끔 37 ºC 7에서 48 시간 동안 진탕 CUBIC-1의 1 ml의 각 배아 / 마음을 몰입. 48 시간 후, 신선한 CUBIC 시약 (1)의 동일한 양을 가진 용액을 교체하고 가끔 손으로 진탕하면서 37 ℃에서 추가로 48 시간 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 부드러운 손으로 흔들어 실온에서 1X PBS 여러 번 함께 CUBIC-1 처리 심장 / 배아를 씻으십시오. 이것은 과잉 CUBIC-1 솔루션을 제거합니다. </li><li> PBS로 CUBIC-1을 세척 한 후, 가끔 부드러운 손으로 흔들어 37 ºC에서 48 시간 동안 CUBIC-2 용액 (배아 / 심장 당 1g)에 배아 / 마음을 몰입. 이 글리세롤을 이용하여 장착 배아 / 마음을 다음 (섹션 5 참조0.2). </li></ol></li></ol> 5. 샘플 장착 및 이미지 참고 무서 리터 예 70 CUBIC-2 용액의 클리어 배아 또는 기관 각각 촬상 매체로서 스케일 70 CUBIC-2 용액으로 직접 영상화 할 수있다. 샘플 아래의 프로토콜 다음 90 % 글리세롤의 샘플을 저장하는 즉시 촬상하지만, 장기간 저장되지 않은 경우에는 클리어 시약 배아 샘플의 취약성을 고려하여. <ol><li> 직접 무서 르 이미징 때까지 4 ℃에서 90 % 글리세롤 및 저장 1 ml의 샘플을 삭제 몰입. </li><li> 회 1X PBS로 5 분간 각각 입방 처리 된 샘플을 세척하고, 30 분 동안 연속적으로 30 %, 50 %, 70 %, 90 % 글리세롤 용액을 각각 1ml의 시료를 배양한다. </li><li> 이미징을위한 두 개의 광자 기능을 구비 한 공 초점 현미경으로 90 % 글리세롤 및 화상 클론 최소량 유리 바닥 페트리 접시에 시료를 옮긴다. </li><li> 이미지 심장이나 배 10 배 / 0.3 NA와 글리세롤에서, 25X / 0.8 NA 침지, 또는 40X / 1.2 NA 물 교정 대물 렌즈. 이미지 DAPI는 일관된 티타늄에서 2 광자 여기를 사용하여 : 사파이어 카멜레온 레이저를. 현미경 대물 렌즈의 선택 초해 예 : 실험의 목적에 의존한다, 광 시트 형광 현미경이 이용 될 수있다. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

배아 분리는 매우 중요한 단계입니다. E9.5의 배아 때문에 각별한주의가 분리 동안 배아 / 심장 구조 손상되지 않도록주의해야한다, 크기가 매우 깨지기 쉬운 작은 있습니다. 전체 배아를 이미징 할 때 배아 / 마음을 포위 비 배아 여분의 층은 신중하게, 특히 제거해야합니다. 이 배아 조직 내부에 깊은 항체 및 청산 혼합물의 침투를 허용하고, 또한 이미징 때 배경 신호를 제거하는 데 도움이됩니다...

심장 형태 형성은 심장의 별개 섹터로 심장 전구 세포의 네 가지 유형의 시공간 구성을 필요로하는 일련의 이벤트이며, 또한 기능성 심장 1,2-을 형성하는이 과정을 조율하기 위해 여러 유전자 조절 네트워크를 필요로한다. 심장 사양, 차별화, 패턴, 챔버의 성숙은 심장 성 전사 인자 (3)에 의해 조절된다. 유전자 돌연변이 또는 심장 전구 세포에서 이러한 요인의 전사 후 수차는 배아 치사 또는 선천성 심장 결함 (CHD) 4 중 발생할 수 있습니다. 심장 형태 형성의 연구는 심장 형태 형성에 대한 이해를 촉진 심장 개발하는 동안 추적을 세 가지 차원 (3D) 고유의 세부 구조 및 단일 레이블 심장 전구 세포 계보의 이해를 필요로한다. 고해상도 부 기초 단층 다수의 방법 일 개발되어왔다이미지 기관 구조 5,6에 수십 년 과거 전자; 그러나, 이러한 방법은 고가의 특화된 장비 광범위한 노동력을 필요로하고, 최종 부피 화상 7,8 재구성 단일 셀 해상도의 상세한 구성 조직이 부족하다. 단일 세포 수준에서 3D 용적 촬상 생체 7 전구 세포 분화 및 세포의 거동을 연구하기위한 수단을 제공한다. 그러나 조직 광 산란 깊은 그대로 마음 안에 3D로 세포 구조를 이미징에 주요 장애물이 남아있다. 조직 투명성 8 증가 가능성 접근법 지질 광산란의 주요 원인, 지질 및 / 또는 지질 및 그 주변 영역 사이의 굴절률 차의 조정 제거되어있다. 지난 몇 년 동안, 조직 청산 방법의 수는 조직의 불투명도 및 빛의 산란을 줄일 수있는 개발되었다 BABB (벤질 알코올, 벤질 benzoat 등전자 혼합물)과 DBE (테트라 히드로 푸란 dibenzylether); 그러나이 방법에서, 형광 소광 문제 8-10 남아있다. 용매, 예를 SeeDB (과당 / 티오 글리세롤) 및 3DISCO (디클로로 메탄 / dibenzylether)와 같은 친수성 방법을 기반으로 형광 신호를 보존하지만, 7,8,11 투명 전체 기관을 렌더링하지 않습니다. 이에 비해 선명도 조직 소거 방법은 장기 투명 렌더링, 또한 하이드로 겔 7,13 매립 필요 PACT (수동 명확성 기법)처럼 그 지질 8,12을 제거 전문 전기 영동 장치를 필요로한다. 사용 가능한 모든 조직 삭제 방법에 대한 자세한 내용 등 리처드슨과 Lichtman, 표 1을 참조하십시오. 7. 2011 년, 하마는 등. serendipitously 친수성 혼합물 &#39;무서 르를&#39;발견 (우레아, 글리세롤 및 트리톤 X-100 혼합물) 마우스 뇌와 배아 transpar를 렌더링하는천만에 완전히 표시 클론 (14)로부터 형광 신호를 보존하면서. 이는 세포 내 해상도 밀리미터 및 신경 집단과 돌기의 대규모 개조의 깊이에서 뇌 손상의 이미징을 허용한다. 사키 등. 또한 아미노 알코올을 첨가하여 제작 무서에게 개선 및 인지질 용해를 증가 &#39;CUBIC&#39;(일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 조직 청소 방법, 감소 청소 시간을 개발하고, 여러 가지 빛깔의 형광 이미징 8 허용했다. 본 연구에서는 cardiogenesis 동안 심장 내부의 무서 제작의 장점과 CUBIC 조직 청소 기술과 고해상도 3D 광학 절편, 각각의 클론을 복용 Rosa26Cre ERT2 15 R26R - 색종이 (16), αMHC-Cre 호텔 17, cTnT를-Cre 호텔을 사용하여 추적했다 18 일 </strong&gt; Nfatc1-Cre 호텔 (19), 및 Rosa26-mTmG (mTmG) 20 마우스 라인. 전체 마운트 염색 (WMS) 방법의 조합은 이전에 (21, 22)를 더 표시 클론의 다른 단백질의 염색과 3 차원 체적 맥락에서 자신의 행동의 연구에 허용 조직 청산 방법과를 개발했다. 조직 및 정화 WMS의 조합은 심장 개발시 다른 유전자와 단백질의 역할을 이해하고, 선천성 심장 결함의 원인을 허용한다. 이 프로토콜 개발시 다른 전구 세포의 분화, 세포의 행동 및 장기 형태 발생 이벤트 연구에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>2,2&amp;prime;,2&amp;prime;&amp;rsquo;-nitrilotriethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde in PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP16000</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrakis(2-hydroxypropyl) ethylenediamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Sunflower seed oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nuclear stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C Incubator</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Compact Microbiological Incubators</td><td></td></tr><tr><td>48 well plates</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 confocal microscope</td><td></td></tr><tr><td>Disecting Microscope</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Glass Bead Sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 mm x15 mm&amp;nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&amp;nbsp; Platform Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Scintillating tubes</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared embryonic and postnatal hearts at single-cell resolution

전체 심장 수준에서 단일 클론 추적 및 분석 심장 개발하는 동안 심장 전구 세포의 행동과 분화를 결정하고, 정상 및 비정상 심장 형태 형성의 세포 및 분자 기초 연구를 허용 할 수 있습니다. 회고전 단일 클론 분석 최근 새로운 기술은 단일 세포 해상도에서 심장 형태 형성의 연구가 가능합니다. 그러나 조직의 불투명도 및 이미징 깊이와 마음의 빛 산란은 단일 셀 해상도을 방해 전체 심장 이미징 증가한다. 이러한 장애, 개발해야 조명 및 검출 모두 매우 투명 마음을 렌더링 할 수있는 전체 배아 청산 시스템을 극복하기 위해. 다행히 지난 몇 년 동안, 같은 CLARITY으로 전체 유기체의 청산 시스템, 무서 제작, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB 및 PACT위한 많은 방법들이보고되었다. 이 연구소는 카드의 세포 및 분자 메커니즘에 관심IAC의 형태 형성. 최근에, 우리는 ROSA26-Cre 호텔 ERT2를 통해 추적 단일 세포 계보를 설립, 드문 드문 라벨 세포에 ROSA26 - 색종이 시스템을 심장 개발하는 동안. 우리는 마음 안에 이미지 단일 클론에 전체 마운트 얼룩과 함께 배아을 취소 무서 제작 및 CUBIC (일반, 탁 트인 뇌 영상 칵테일 및 전산 분석) 등 여러 전체 배아 삭제 방법을 적용. 심장은 성공적 단세포 해상도로 촬상 하였다. 우리는 CUBIC 출생 후의 마음을 지울 수 있습니다 동안 무서 르가, 배아 심장을 취소 할 수 있지만, 효과적으로 출생 마음을 지울 수 없습니다 것을 발견하지만, 손상 조직을 용해하여 배아 마음입니다. 여기에 설명 된 방법은 차례로, 선천성 심장병의 세포 및 분자 기초를 밝힐 수 심장 형태 형성 중에 단일 클론 해상도 유전자 기능 연구를 허용한다.

지워진 배아 심장 이미징 척추 심장 형성은 시공간 규제 형태 형성 과정과 네 개의 다른 소스 (1)로부터의 조직 및 전구 세포의 분화에 따라 달라진다. 심장 초승달 제 심장 분야에서 세포 선형 심장 튜브를 형성하기 위해 복부 정중선을 향해 접어 것이다. 처음에 첫 번째 심장 필드에 dorsomedially 거주하는 두 번째 심장 ...

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Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K 조회수.  Albany Medical College. We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately. 

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Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

연구

발생학

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

생물학

포괄적인 심장 이미징을 위한 Light-Sheet Microscopy and Tissue Clearing (광시트 현미경 검사) 및 Tissue Clearing(조직 투명화)

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

저자 스포트라이트: 설치류 심장의 심근 구조를 조사하기 위한 맞춤형 광시트 이미징

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

생체공학

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

요약

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배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출