Bu çalışma Leverhulme Güven, Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi hibe ile desteklenmiştir [EP / H018301 / 1, EP / G037221 / 1]; Alzheimer Araştırma UK [aruk-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703 / Z / 09 / Z] ve Tıbbi Araştırma Konseyi [MR / K015850 / 1, MR / K02292X / 1]. Biz HEK293 kültürünün hazırlanması için sırasıyla LifeAct-GFP transfeksiyonu ve sitozolik-GFP hücrelerinin E. Avezov ve M. Lu teşekkür ve W. Chen. Biz de yararlı tartışmalar ve öneriler için mikroskop tasarımı ile yardım için K. O&#39;Holleran teşekkür ve L. Shao ve R. Heintzmann.

1. düzenlenmesi ve Uyarma Yolu hizalama <ol><li> Optik masaya bileşenlerin konumlarını işaretleyin (optik kurulum genel bir bakış için bakınız Şekil 1). hedefi ayırın, objektifler L3, L4, L5 ve SLM SLM yüzey hedefi odak düzlemi üzerine geçirilen olacak şekilde kendi odak uzunlukları toplamı her. </li><li> mikroskop karesinin filtre küp taret içine çok kenarlı dikroik ayna dm4 yerleştirin. </li><li> mount 1 &quot;kare kinetik aynaya ikinci dikroik ayna DM3 takın ve bir odak uzaklığı uzak kondenser mercek L5 onu getirin. Not: Bu uyarım yolu tasarımı iki özdeş dikroik aynı üretim partisinden alınır DM3 ve DM4 özdeş optik özellikleri sağlamak için aynalar içermektedir. s- ve p- eksenleri mikroskobu (DM3) bulunan dikroik kıyasla açık olduğunu dikroik ayna (DM4) ve böylece herhangi bir iptal gibi konumlandırılmışpolarizasyon elipsliği kendi çift kırılma tarafından tanıtıldı (Şekil 1). Bu tazminat, her aydınlatma dalga boyu için eşit derecede iyi çalışır. Bu aşama, yüksek modülasyon kontrast sağlamak için gereklidir. </li><li> uyarma yoluna her türlü merceği takmadan önce, doğru sistem için optik eksen tanımlar. <ol><li> kulesinden objektif lens (OB) çıkartın ve bir hizalama aracı vida yerine. Bu her iki uçta iki hizalama diskler ile 500 mm uzunluğunda bir optik kafes sisteminden oluşur. </li><li> iki hizalama diskler deliklerden merkezinden Lazer 1 bir paralel referans ışını yönlendirmek için dikroik ayna DM3 ve SLM yaklaşık sonraki bir konumda yerleştirilmiş geçici bir hizalama ayna kullanın. Üç aynalar ve dikroik ayna dm2 kullanılarak Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi geçici ayna Lazer 1&#39;den ışını doğrudan. SLM pozisyonunda geçici ayna optik eksene dik yakın olmalıdır. <li> o mikroskopi vücuda girmeden önce kaba optik eksen determined.Insert ışın yoluna bir iris olmuştur kez hizalama aracı kaldırmak ve kiriş üzerinde ortalamak. iris.Reinsert objektif lens (OB) merkezli küçük bir deliği olan, beyaz bir marka kartı takın. hedefi bırakarak ışın şimdi çok farklı olacak, ama beyaz kartta görünür olacak lensin arka yüzeyinden çok zayıf bir yansıması olacaktır: Not. Tüm lensler, bu kaplanmış anti yansıtma bile, koaksiyel hizalamayı sağlamak için kullanılabilir, zayıf arka yansımaları olacaktır. kiriş tam objektif dik ise, arka yansıma iris merkezi aracılığıyla geri döner </li><li> (SLM konumunda DM3 ve hizalama ayna) iteratif açısal iki ayna ayarlamalar yapmak geri yansıma merkeziGelen ışın ile kart. Geçici objektif lens (OB) kaldırmak ve bir referans noktası oluşturmak için tavana lazer nokta işaretleyin. </li><li> Tablonun dişli deliklere boyunca referans kiriş yükseklikte süsen bir çift takın. ışınlı optik tablo yüzeyine paralel olmalıdır. optik eksen şimdi tanımlanır. </li></ol></li><li> kondenser mercek (L5) uzak objektif kabaca bir odak uzunluğunu takın. Referans ışınının yönünde çevirmek için bir doğrusal çeviri sahne sette bu lensi monte edin. </li><li> hedefi terk ışın collimated ve tavana referans nokta vurur şekilde yoğunlaştırıcı mercek konumunu ve açısını ayarlayın. Lens tekrar iris ve beyaz kart ile geri yansıma kontrol ederek kirişe dik olup olmadığını kontrol edin. objektif lens (OB) çıkartın ve görüntü röle teleskop (L4) ikinci lensi yerleştirin. Not: olması doğru kolimasyon ve non-saptırma sağlanmasıışın yolu lenslerin bir çift sayı olduğunda AM kolaylaştırılmıştır. </li><li> kolimasyon korumak ve referans ışını hala tavana belirgin tatmin edecek sağlamak için doğrusal bir çeviri aşamasında kullanarak bu lensin konumunu ve açısını ayarlayın. </li><li> objektif lens (OB) değiştirin ve teleskop (L3) ilk lensi yerleştirin. Önceki adımda tarif edildiği gibi, kolimasyon olmayan sapma sağlamak için bu lens konumunu ve açısını ayarlamak. </li><li> çip yüzeyinin merkezi etrafında çeviri olmadan dönüşü sağlayan montaj bir oynak üzerinde SLM çip monte edin. Not: Belirli montaj tasarım kullanılan SLM bağlıdır. SLM bir montaj olmadan verilirse, o zaman bir lens pusula montaj bağlı bir özel işlenmiş alüminyum levhaya sabit olmalıdır. </li><li> lensler hizalanmış ile, aynanın yerine SLM yerleştirin. referans ışını SLM çip merkezinde yer almaktadır şekilde SLM konumunu ayarlamak, ve An ayarlamakkiriş iki röle lens (L3 ve L4) üzerinden geçtiği bir şekilde Gle. referans ışını hala belirgin noktada merkezli olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Genişletin ve Kepler ışın genişletici kullanarak referans ışını .birleştirecek. <ol><li> ayarlanmasının kolaylığı için bir kafes sisteminde iki lens (L1 ve L2) monte edin. </li><li> Merkezi lensleri çıkarmadan ve süsen ile değiştirerek referans kiriş üzerinde kafes sistemi. </li><li> İki lens takın ve bir kesme girişimölçer kullanan genişletilmiş ışın .birleştirecek şekilde L2 eksenel konumunu ayarlamak. L2 bir odak uzunluğu uzak SLM yüzeyinden olmalıdır. </li><li> genişletilmiş ışın hala iki röle lensler L3 ve L4 sonra collimated olup olmadığını kontrol edin. kolimasyonu kontrol etmek için sadece DM3 sonra kesme interferometre kullanın. </li></ol></li><li> uyarma yolu, tek bir dalga boyu, çift ışın yoluna, diğer iki lazerler için hizalanmış edildikten sonra. kullanarak uyarma yolunda merkez iki süsen ile her kiriş Steerışın birleştirerek dikroik aynalar (DM1 ve DM2). </li></ol> Polarizasyon Rotator 2. Hizalama <ol><li> Olay kutuplaşmaya 45 ° onun hızlı ekseni LCVR monte edin. </li><li> Hwp ve çapraz polarize arasındaki LCVR takarak bir akromatik yarım dalga plakası (HWP) kullanarak LCVR kiriş olayın İnce ayar polarizasyon açısı. iletilen güç en aza indirmek için hwp döndürün. Not: Bir değişken polarizasyon rotator olarak hareket etmek amacıyla, sıvı kristal geciktirici (LCVR) hızlı ekseni tam olay dikey ışın kutuplaşmaya 45 ° aynı hizada olmalıdır. LCVR fiziksel 45 ° monte edilir, ancak bu sadece iri hizalanmasıdır. HWP LCVR hızlı eksenine göre olay polarizasyon mükemmel 45 ° hizalamayı sağlamak için kullanılır. Çeyrek dalga plakası (QWP) uygulanan gerilim ile kontrol edilen bir açıyla geri doğrusal kutuplaşma LCVR tarafından uyarılan eğimli eliptik polarizasyon dönüştürür24. </li><li> LCVR sonra QWP takın ve çapraz polarize arasında iletilen gücü minimize ederek gelen kutuplaşma yavaş ekseni hizalamak için döndürün. </li></ol> Emisyon Yolu 3. Hizalama <ol><li> Kaba bir sahne mikrometre slayt ve iletilen ışık kullanılarak kamerayı yerleştirin. <ol><li> mikroskop Okülerin kullanarak dürbün ağı odaklanın ve bu pozisyonda objektif lens düzeltmek. </li><li> Kabaca kamera ortalamak ve ekrandaki görüntüyü gözlemleyerek odağa retikülün imajını getirmek için kamera konumunu taşımak. Not: Harici filtre tekerleği sonra kullanılırsa lazerler açık olduğunda filtre küp nedenle Okülerin kullanılmaması gerekir, bir emisyon filtresi içermez. </li></ol></li><li> İnce bir floresan boncuk örneği kullanarak kamera konumunu ayarlamak. <ol><li> Bir # 1.5 coverglass 100 nm çok renkli boncuklar bir damla yayarak floresan boncuk bir tek tabaka hazırlayın. d bırakınRy coverglass boncuk adsorbe ve daha sonra su içinde yeniden sokmak. </li><li> immersiyon ile objektif üzerine boncuk örnek yerleştirin. İnce floresan boncuk tabakası odakta olacak şekilde kameranın konumunu ayarlamak. Odak bulunduktan sonra objektif lens konumunu ayarlamak etmeyin. Not: SLM örnek düzlemde bir düzlem konjugat olmalıdır gibi, SLM pozisyonu, objektifler röle ve hedef tespit edilmelidir. Odağı ayarlamak için, örnek eksenel yerine piezo z sahne kullanarak hedefi taşıyın. </li></ol></li><li> bitmap dosyaları gibi uygun bir SIM ikili ızgara desenleri oluşturun. <ol><li> 3 eşit aralıklı faz vardiya ile 3 desen yönelimleri her: 2D / TIRF-SIM için 9 ikili ızgara görüntülerin bir dizi oluşturur. Daha sonra ikili görüntü elde etmek için eşikleme, uygulanan ofset bir faz ile döndürülmüş 2B sinüzoidin dan (örneğin MATLAB kullanarak) sayısal olarak bu oluşturun. örnek kod yazmak Kod Dosyaları Bkz. </li><li> Alignmen içint amaçları, aynı zamanda pencereli hizalama kafesler dışarıdan tetiklenen gerek yoktur. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, 3 yönelimleri her biri için, küçük bir dairesel delik tarafından pencereli edilmiş ızgara modellerini oluşturmak fakat el ile bir kullanıcı tarafından değiştirilebilir slm yazılımı. Not: Optimal rotasyon açıları bir tartışma ve ızgara desen oluşturma kodu 16,20 bir örnek için referanslara bakınız. </li></ol></li><li> (Örneğin MetroCon için) üreticinin yazılımını kullanarak SLM bitmap görüntüleri yükleyin. <ol><li> SLM kontrol yazılımı yükleyin ve &quot;Bağlan&quot; butonuna tıklayınız. </li><li> &quot;Repertuarı&quot; sekmesinde, repertuar dosyasını açın ve dosyanın içerdiği Siparişler Running sayısını kontrol etmek için &quot;Load&quot; tıklayın. Verilen örnek repertuar dosyasında beş Koşu Siparişler vardır. </li><li> Click SLM repertuar dosya yüklemek için &quot;Yönetim Kurulu Gönder&quot;. </li><li> bitmap görüntüleri yüklemek için bekleyinnd cihaz otomatik olarak yeniden için. Not: Izgara bitmap görüntüleri ve düzeni tanımlayan bir dosya içeren bir örnek repertuar dosyası, bir Yan Kod dosyası olarak yer almaktadır. &quot;.repz&quot; Dosya ZIP dosya sıkıştırma yazılımı kullanılarak açılabilir. </li></ol></li><li> (Örneğin 0 ° için) ilk yönlendirme için SLM üzerinde ızgara bir pencereli hizalama görüntüler. <ol><li> SLM kontrol yazılımı, &quot;Durum&quot; sekmesini seçin (bu &quot;1&quot; Sipariş Çalışıyor örnek bir dosya halinde) Running Sipariş numarasını girin. </li><li> hizalama ızgara Koşu Sipariş değiştirmek için &quot;Seç&quot; düğmesine tıklayın. Not: Bu örnek düzlemde küçük bir dairesel bölge yanacaktır. SLM yüzeyi düzgün örnek düzlemde konjuge ise o zaman bu bölgenin kenarları odakta olacak. ızgara desen L3 odak noktasında birden kırılma siparişleri üretecek: sıfır sıralı yansıma yansıtıcı arka paneldenSLM SLM cihaza özgü iç unsurların kırınımı ortaya çıktığını -1 ve ızgara, ve aynı zamanda zayıf yüksek siparişlere karşılık gelen 1 emir (örn. Piksel kenarlarında SLM piksel ve usulsüzlüklerin iç hatlar yansımaları) . Tüm ancak -1 ve +1 emir filtre edilmelidir. </li></ol></li><li> mekansal maske (SM) L3 odak pozisyonunda ışın yoluna, bir x y sahne monte yerleştirin ve sadece istenen ilk siparişler geçirilen şekilde optik eksene göre konumunu çevirmek. Doğrudan mekansal filtreden sonra, sadece iki dairesel kirişler görünür olacaktır. Not: uzamsal maske bir iğne kullanılarak alüminyum folyo içine 6 delikler açarak imal edilir. delikler tüm lazer dalga boyları için birinci dereceden kirişler geçmek için yeterli büyüklükte olmalıdır. Mekansal maske ayrıntılı bir analiz referans 20 verilmektedir. </li><li> daha sonraki hizalama ızgara yönünü (60 °, koşma sırası 2) ve DisplayGerekirse sadece ilk siparişler konumunu ayarlayarak, mekansal maske aracılığıyla izin emin olun. </li><li> Nihai oryantasyon (120 °, koşma sırası 3) için tekrarlayın. </li><li> kamerada floresan boncuk tabakasının görüntüsünü kontrol edin. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi iki dairesel kirişler üst üste değilse o zaman tekrarlanarak objektif lens ve kamera konumunu ayarlayarak örnek uçağı yeniden konumlandırmak. </li><li> odak dışında resim getirecektir iki kiriş üst üste objektif konumunu ayarlayın. durumunda geri odak ve ince ayar içine hedefi görüntüyü getirmek için fotoğraf makinesinin yerini değiştirin iki daire hala görebilir. İki kiriş üst üste ve tek bir dairesel bölge odakta kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> örnek düzlemde pozisyonu ayarlandıktan sonra, sabit objektif konumunu korumak. </li><li> Görüntü 488 nm eksitasyon dalga boyu için, örneğin flüoresan boya içeren bir çözelti, TIRF aydınlatma teyit etmek için, 10, ihtiva eden bir çözelti kullanımı81; M rodamin 6G. <ol><li> odak haline boya örneği getirin. iki ışın doğru TIRF açıda olay varsa o tek moleküller yüksek arka plan olmadan görünür olacak ve dairesel diyafram kenarları odak olacaktır. Hizalanmış ve yanlış hizalanmış TIRF kirişler örnekleri için Şekil 2B-D bakın. </li><li> sırayla pencereli ızgaralar her yönünü görüntüler ve her üç yönelimleri TIRF aydınlatma sağladığını ve iki kiriş örnek düzlemde üst üste emin olun. Kirişlerin pozisyonunda ince ayar dikroik ayna DM3 ayarlanması ile yapılabilmektedir. Not: Farklı dalga boyları renk sapması eksenel nedeniyle farklı konumlarda odaklanmış olmasına rağmen, bu kritik değildir ve uygulanması ile düzeltilebilir sabit bir ikinci dalga boyu ile uyarım önce, numune, konumuna Z uzaklığı. </li></ol></li></ol> 4. Sistemi Senkronizasyon ve Kalibrasyon <ol><li> boncuk tek tabaka s yerleştirinobjektif geniş ve odak noktası haline getirmek. </li><li> İlk model oryantasyon (0 °) için, sırayla 3 faz kaydırmalı görüntü her görüntülemek için kendi kontrol yazılımı kullanarak SLM programlayın. <ol><li> SLM kontrol yazılımı kullanarak, örnek repertuarının Sipariş 4. Koşu geçmek. </li><li> Pozitif bir küresel maruz kalma döneminde bir negatif TTL tetikleme sinyali: çıktıya iki sinyal (örneğin HCImage için) elde etme yazılımı kullanarak kamerayı yapılandırın. sırasıyla &quot;Pozlama&quot; ve Çıkış Tetik Polarite 1 ve 2 &quot;Pozitif&quot; ve &quot;Negatif&quot; kamera &quot;Advanced Camera Özellikleri&quot; altında yazılımı, set Çıktı Tetik Kind 1 ve 2. </li><li> &quot;Tetik&quot; ve koaksiyel kablo kullanarak sırasıyla SLM &quot;Finish&quot; girişlerine, kameranın Çıkışını 1. ve 2. bağlayın. SLM şimdi kameraya eşitlenir. </li></ol></li><li> 3 görüntülerin bir dizi kazanır. <ol><li> &quot;Dizi&quot; bölmesinde, &amp; seçin# 34; tarama türüne Sabit Disk Kayıt &quot;ve 3 kare sayısı olarak ayarlayın. </li><li> 3 kare elde etmek için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. SLM desen her maruziyet üzerine değişecektir. Görüntüdeki floresan boncuk 3 görüntülerin her biri arasında açık ve kapalı yanıp sönmeye görünecektir. Yanıp sönen miktarı sinüzoidal aydınlatma desen modülasyon kontrast dışında bir okuma olduğunu. </li></ol></li><li> azimuthal kutuplaşma ve verilen desen yönelimi dolayısıyla yüksek modülasyon kontrast elde etmek için özel yazılım kullanarak LCVR ile uyarma lazer polarizasyon döndürün. <ol><li> LCVR kalibrasyon yazılımı yükleyin. </li><li> sırasıyla Minimum ve Maksimum Gerilim 0 ve 8 girin. </li><li> kutuplaşma döndürmek için &quot;LCVR Gerilim Sweep&quot; tıklayın. Not: LCVR geciktirici sıcaklığının bir fonksiyonudur ve hatta sıcaklık kontrolü ile güne-gün kayması olabilir. Bu adımda, uygun azimutal polarizasyon Sweepi ampirik bulunanörnek polarizasyon olayı döner etkisine sahip olan asgari ve azami gerilim arasında uygulanan gerilimin ng. Modülasyon kontrastı Her gerilim 25 ile en üst nokta kontrast Aşağıdaki adımlarda kullanılan elde gerilim için hesaplanır. </li><li> tamamlamak için kalibrasyon işlemi için bekleyin ve ölçülen gerilim not edin. </li></ol></li><li> Kalan iki desen yönelimleri (60 ° ve 120 °) ve uyarma dalga boyları her biri için bu kalibrasyon işlemi tekrarlayın. </li><li> LCVR, lazerler, emisyon filtre tekerleği ve piezo z evre 26 ile kamera pozlama eşitleyin. Bunu başarmak için, sistemin ana saat kaynağı olarak yüksek hızlı veri toplama (DAQ) kartı kullanmak ve SLM en lazerler modüle çıkış sinyali Enable LED kullanımı (Şekil 3B). Not: özel uygulama kullanılan bileşenlerin ancak dijital TRI için, yüksek hızlı bir DAQ kartının kullanımı bağlıdırgger senkronizasyon ve yazılımı ile kontrol edilen bir analog voltaj ile LCVR kontrolü, tavsiye edilir. Bu protokolde kullanılan kontrol yazılımı istek üzerine mevcuttur. </li><li> Nedeniyle eksenel renk sapmaları, her dalga boyu için, ayrıca bir z-ofset örnek aşamasına uygulanır. <ol><li> İlk dalga boyu (örn., 488 nm) daha sonra ikinci geçiş (örn., 640 nm) çok renkli boncuk tek tabakalı örneklem üzerinde odaklanarak deneysel ofset belirleme. boncuklar artık odak dışı olacaktır. </li><li> boncuk yönlendirmesi ve gerekli z pozisyonuna değişimi ölçmek. Bu daha sonra piezo z sahneye dalgaboyu her değiştiğinde uygulanabilir ofset. </li></ol></li><li> SLM kontrol yazılımı kullanarak, TIRF-SIM için gerekli 9 ikili ızgara görüntülerin tam serisi SLM Running Sipariş geçin. Bu örnek repertuarında Sipariş 0 Running olduğunu. </li><li> kamera kontrol yazılımı kullanarak, boncuk örnek 9 görüntü kazanır. <ol&gt; <li> Kamera yazılımı &quot;Dizi&quot; bölmesinde, tarama türü olarak &quot;Sabit Disk Kaydı&quot; seçeneğini seçin ve 9 kare sayısı değiştirin. </li><li> görüntüler elde etmek için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> &quot;Kaydet Tamponlu Görüntüler&quot; penceresinde görüntü türü olarak &quot;TIFF&quot; seçerek ve OK tıklayarak TIFF dosyaları olarak elde edilen görüntüleri kaydedin. </li></ol></li><li> Standart TIRF üzerinde çözünürlükte iyileşme doğrulamak için, ticari veya özel yazılımını kullanarak ham TIFF görüntüleri süper çözünürlüklü bir görüntüyü yeniden. Not: Biz özel imar kod-house ve Dr Lin Shao 27 hem geliştirdiği kullandığımız mikroskop için. </li></ol>

<ol>
	<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+modulated+excitation+microscopy:+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li><li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level.">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li><li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement.">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li><li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation.">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121 (2015).</li><li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging.">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980 (2015).</li><li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy.">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li><li>Esbj&#246;rner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observations+of+amyloid+&#946;+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A&#946;(1-40)+and+A&#946;(1-42)+aggregation.">Direct observations of amyloid &#946; Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of A&#946;(1-40) and A&#946;(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li><li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology.">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li><li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Super-Resolution+Imaging+of+&#946;-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo:+Method+and+Techniques.">Optical Super-Resolution Imaging of &#946;-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li><li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves.">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li><li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+resolution+wide-field+optical+imaging:+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945 (2006).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li><li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination.">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li><li>Brunstein, M., Wicker, K., H&#233;rault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks.">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li><li>F&#246;rster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator.">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663 (2014).</li><li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fastSIM:+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy.">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001 (2015).</li><li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples.">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li><li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging. , (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Polarization Techniques and Devices. , (2005).</li><li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy.">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603 (2012).</li><li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera. , (2013).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space.">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692 (2013).</li><li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy.">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li><li>Str&#246;hl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data.">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002 (2015).</li><li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns.">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li><li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm.">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723 (2013).</li><li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMcheck:+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy.">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915 (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Böyle bu protokolde ayrıntılı kurulum olarak özel yapılmış TIRF-SIM sistemleri piyasada mevcut mikroskoplar ile karşılaştırıldığında yüksek hızda çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneğine sahiptirler. süper çözümün tekniğiyle, SIM artısı zamansal çözünürlüğü gibi tek bir molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM) veya uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopi gibi noktası tarama yöntemleri (ve diğer yöntemlere göre, fluorofor fotofizikten ile sınırlı değildir, yani STED). renkli görüntüleme basittir, böylece bu tekniklerin aksine, SIM photoswitchable ya tükenebilir florofor gerektirmez. Burada bildirilen 2 iyileştirme faktörü aksine SIM ve multifokal SIM kesit gibi optik olmayan TIRF-SIM sistemleri, genellikle uygulamada 1.7 kat veya daha az çözünürlüğü iyileştirmeler elde edebilirsiniz ve ticari sistemler de sistemden daha sık yavaş ve daha az esnektir Bu protokolde sundu. &quot;&gt; Bu tekniği uygulamak iki ana zorluklar öncelikle optik hizalama işlemini tüketen bir zahmetli ve zaman gerektirir objektif arka diyafram, TIR bölgesi içinde altı SIM kirişlerin hassas konumlandırma için gerekliliktir. İkincisi, yüksek model kontrast üretmek için örnek de, polarizasyon rotasyonu düşük NA 2D-SIM sistemleri için, polarizasyon rotasyonu doğrusal polarizasyon yönlendirme dikkatli seçimi ile önlenebilir. esastır, ancak bu TIRF-SIM 25 imkansız hale gelir. yüksek hızlı renkli görüntüleme için, elektro optik polarizasyon kontrolü gereklidir ve bu sistemin karmaşıklığı ve gider artırır. tekniğin sınırlamaları TIRF SIM geleneksel TIRF gibi doğal, biyolojik yapılar ve kaybolan alan 150-200 nm penetrasyon derinliği ile aydınlatılabilir bazal hücre membranında bulunan işlemlerin bir gözlem ile sınırlıdır. SüreSIM genellikle STED veya SMLM, yanal çözünürlük iki katına hala geleneksel TIRF mikroskopi ile karşılaştırıldığında en az 4 kat 5 ile fotonların gerekli sayısını artırmak değil, ya daha hücrelere daha az photodamaging olarak kote edilir. Kısa pozlama süresi ile yüksek kare hızlarında görüntüleme için, bu foton artış, aydınlatma şiddetleri kullanımını zorunlu kılmaktadır. Herhangi bir flüorofor sabit veya yavaş hareket eden numune, yüksek parlaklık fluoresan protein ya da geliştirilmiş Fotostabilitesi sonraki nesil sentetik boyaların SİM görüntüleme için kullanılabilir olsa da canlı hücre görüntüleme için tavsiye edilir. Bu uygulama, 20 Hz fazla SIM kare hızlarında tek bir renk görüntüleme kapasitesine sahip olsa da, sunulan sisteme çok renkli görüntüleme motorlu emisyon filtresi tekerleğin sviçleme zaman ile sınırlıdır. Nedeniyle sCMOS kamera çipi büyük boyutu, bir çok bantlı emisyon filtresi ve görüntü bölme optik kullanılması mümkün ve eşzamanlı i izin verecekHiçbir hız cezası anda birden fazla dalga boyları ile maging. Bir başka olasılık farklı uyarma lazerler alternatif ve ikaz ışığı reddetmek için bir çok bantlı çentik filtresi kullanmak olacaktır. Bu uygulamada, bir ikili ferroelektrik SLM kullanımı da uygun değildir. gelen ışık en mekansal maske ile filtrelenir sıfır sıralı yansıması olduğu şekilde bu tür bir SLM sapma verimliliği, son derece düşüktür. Çok yüksek kare hızı gerektiren uygulamalar için, bir görüntüleme hızı, bu nedenle, lazer diyotları çıkış gücü ile sınırlıdır. SLM da uzak piksel olarak ideal bir yarım dalga plakaları faaliyet yok 550 nm dalga boyunda tasarım gelen dalga boyları için kutuplaşma bazı ekliptiğinde tanıtır. Bu ek bir LCVR kullanılarak telafi edilebilir olsa da, ideal bir çözüm desen jeneratör olarak bir dijital mikro-ayna cihazı (DMD) kullanımı olabilir. Olası değişiklikler kurulum preseBurada nted esnek ve daha kolay gibi 3D-SIM, hızlı 2D-SIM, multifokal SIM (MSIM) ve non-lineer SIM (NL-SİM) kadar diğer görüntüleme yöntemleri 21,34,35 uygulanabilir ticari araçların daha değiştirilmiş olduğunu. 2D-SIM hızlı periferik endoplazmik retikulum gibi yapılar hareketli, nispeten düz görüntüleme için uygun olabilir. periferik ER nedeniyle düz yapıya TIRF kaybolan alan, ancak kullanılarak aydınlatılabilir daha hücre içinde derin yatıyor önemsiz out-of-odak arka plan ile standart 2D-SIM kullanılarak görüntülenebilir. Ayrıca, geliştirilmiş optik kesit rekonstrüksiyon algoritmaları kullanılması ışığı optik kalın örnekleri, olsa eksenel çözünürlük iki katına 21 gerekmez 2D-SIM kullanımını genişletmek out-of-odak bastırmak için. MSIM, örnek uyarma odaklarının 36 seyrek kafes ile aydınlatılmıştır. Bu yöntem SM (sadece mekansal maske kaldırarak uygulanabilir) Ve polarize bunu yerine. SLM şimdi bir genlik modülatörü olarak faaliyet göstermektedir. SLM görüntülenen dijital SIM ızgaralar görüntü düzleminde bir kırınım sınırlı odak boyutuna eşit olacak şekilde seçilmiştir noktalar boyutu ile, noktalar 2B kafes ile ikame edilmiş olabilir. Şekil 7A, 4 x 4 piksel kareler kafes 13.62 um fiziksel SLM piksel büyüklüğü göz önüne alındığında, numune üzerine demagnified zaman 150 x 150 nm kırınım sınırlı odakları oluşturur SLM (ek) görüntülenir. uyarma odakları sonra SLM üzerinde kafes deseni kaydırarak tercüme edilebilir ve bu görüş tüm alanını aydınlatmak için birden çok kez tekrarlanır. Görüntüler her tercüme desen pozisyon için edinilen ve yığını olan bir faktör kadar geliştirilmiş çözünürlüğe sahip bir yeniden görüntü elde etmek için post-işlenmiş <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> ve düşük ışık eşdeğer widefield görüntüye göre out-of-focusKazanım süresi ham kare çok sayıda nedeniyle artan olmasına rağmen 30. Bu yöntem, standart SIM böyle lekeli kırmızı kan hücrelerinin (Şekil 7C) olarak örnek düşük kontrastlı yapılar için, elverişsiz olduğu için kalın, yoğun örnekleri görüntüleme için yararlı olabilir (Bu durumda, 168 = N cinsinden) görüş alanı başına gereken. Li ve arkadaşları tarafından en son sunulan Son olarak, kurulum, yüksek Na doğrusal TIRF-SIM veya desenli aktivasyon doğrusal olmayan bir SIM (PA NL-SIM) ya sağlamak için modifiye edilebilir. Bir ultra 1.7 NA objektif veya ilave kullanımıyla 405 nm fotoaktivasyon lazer ve SLM ızgara desen 35 dikkatli optimizasyonu. gelecek Uygulamaları SIM hala hızla gelişen bir tekniktir ve yaşam bilimleri birçok uygulama gelecekte etkin olacak. tekniğin hızı, çözünürlük ve kontrast geliştirmeleri ve standart fluorophores m kullanarak yeteneğiEAN Biyogörüntüleme için, SIM böyle konfokal ve geniş alan platformları gibi geleneksel birçok mikroskop sistemleri yerine ayarlanmış olduğundan emin olun. Ticari SIM sistemleri önemlisi, onlar değiştirilmiş ve bu alanda en son araştırma gelişmeleri uygulamak için geliştirilecek esnek olmayan, ancak, birçok araştırma laboratuvarlarının mali yetmeyeceği, üstün teknik özellikleri ile bugün zaten mevcuttur ve. Onlar da gerekli yetenek, kenar yaşam bilimleri araştırma kesme genellikle kritik bir darboğaz &#39;eldeki deney için uyarlanabilir&#39; için yoksundur. Burada anlatılan sistem özellikle de örneğin malzeme ve fiziksel bilimler, yüzey kimya okumak için, sulandırılmış iki katmanlı sistemleri in vitro çalışmalar için, hücre yüzeyine yakın dinamik süreçleri incelemek için uygun olacaktır. 2B malzeme ve diğer birçok uygulama.

son yarım on yıl içinde, süper çözünürlük mikroskopi olgunlaştı ve biyolog eline uzman optik laboratuarları taşındı. Ticari mikroskop çözümleri optik süper çözünürlük elde etmek için üç ana varyantlar için mevcuttur: tek bir molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM), emisyon tükenmesi mikroskobu (STED) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) 1,2 uyarılmış. SMLM photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) gibi kolayca aşağı 20 nm, büyük ölçüde optik kurulum kolaylığı ve yüksek uzaysal çözünürlüğü vaadi, en popüler teknik olmuştur. Tek molekül yerelleştirme yoluyla Ancak süper çözünürlük mikroskopi içsel ticaret-off ile birlikte gelir: uzaysal çözünürlük ulaşılabilir dolayısıyla zamansal çözünürlüğe sınırlayan, bireysel florofor lokalizasyonu yeterli sayıda biriktirme bağlıdır. Görüntüleme dinamik bir süreçtirbir yeterli de görüntüyü yeniden oluşturmak için bu süre yeterli yerelleştirme olayları elde edilirken hareket eserler önlemek için faiz yapısının hareketini örnek gerektiği gibi canlı hücrelerde es nedenle sorunlu olur. Bu gereksinimleri karşılamak amacıyla, canlı hücre SMLM gösteriler büyük ölçüde uyarma gücünü artırarak fluorofor photoswitching oranlarında gerekli artış almış ve bu sayede örnek yaşam sürelerini ve biyolojik alaka 3 sınırlayıcı, fototoksisite ve oksidatif strese sırayla açar. SIM ve SMLM hem üzerinde STED&#39;in net bir avantajı yaklaşık 60 nm örnek yanal çözünürlük için kalın numunelerde süper çözünürlük, görüntü 120 mikron 4 derinliğe kadar Organotipik beyin dilimleri elde edildi olmasıdır. SMLM veya SIM tek objektif uygulamaları ile bu tür derinliklerde görüntüleme olanaksız olduğunu, ancak tek-molekül ışık levha veya kafes ışık levha mikrofon ile ya mümkün olurfloroskop 5. Şimdiye kadar bu bakış 6 küçük alanları görüntüleme sınırlı olmasına rağmen video oranı STED da göstermiştir ve sinaptik vezikül hareketliliğini eşleştirmek için kullanılır olmuştur. Hücre biyolojisi ve moleküler kendinden montaj reaksiyonlarında 7 uygulamalar için - belirli bir floresan Fotofiziksel özelliklerine bağlı değildir gibi birçok kez puan üzerinden yüksek zamansal çözünürlüğe sahip görüntüleme gerektiren 12, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) çok uygundur olabilir prob. SIM bu doğal avantajına rağmen, şu ana kadar kullanımı ağırlıklı olarak sabit hücreler veya yavaş hareket eden süreçleri görüntüleme sınırlı olmuştur. Bu piyasada mevcut SIM sistemleri sınırlamaları nedeniyle: Bu enstrümanların alım kare hızı gerekli sinüs aydınlatma modelleri yanı sıra optik muhafaza kutuplaşmayı üretmek için kullanılan ızgaralar dönme hızı ile sınırlı kalmıştır. Ticari SIM yeni nesilaraçlar hızlı görüntüleme yeteneğine sahip ama onlar merkezi görüntüleme tesislerine ama tüm pahalıya bulunmaktadır. Bu protokol canlı hücrelerin bazal yüzeyindeki ince örneklerinde ve yakın hızlı süreçleri görüntüleme için esnek bir SIM sisteminin inşası için bir rehber sunuyor. Bu büyük ölçüde odak background sinyalinin out azaltır numune 13 içine hiçbir derin, 150, yaklaşık nm&#39;den nüfuz bir aydınlatma deseni oluşturmak için toplam iç yansıma floresan (TIRF) kullanmaktadır. TIRF ile SIM birleştirerek fikri SIM kendisi 14 olarak neredeyse eski ama 2006 15 önce deneysel olarak fark değildi. 2009 yılında tubulin ve kinesin görselleştirmek için 11 Hz 16 ulaşmada kare hızları bildirildi TIRF-SIM ile elde edilen in vivo ilk görüntüler dinamikleri ve iki renkli TIRF-SIM sistemleri 17,18 sunulmuştur. En son olarak, bir tek renk iki ışınlı bir SIM s yapımı ve kullanımı için bir kılavuzistem 18&#39;e kadar Hz 19,20 çerçeve oranlarını içeren sunuldu. Burada sunulan kurulum TIRF-SIM çalıştırılabilir ikisi üç renk, 20 Hz SIM süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneğine sahiptir. Tüm sistem ters bir mikroskop çerçeve etrafında inşa ve bir piezo-çalıştırılan z sahne ile bir motorlu xy çeviri aşamasında kullanır. TIRF-SIM için gerekli sinüs uyarma desenleri oluşturmak için, sunulan sistem ferroelektrik uzaysal ışık modülatörü (SLM) kullanır. İkili ızgara desenler SLM görüntülenir ve ortaya çıkan ± 1 kırınım emirleri, süzülmüş geçirilen ve objektif lens TIR halka içine duruldu. Gerekli faz kaymaları ve ızgaralar rotasyonlar görüntülenen SLM görüntüyü değiştirerek uygulanır. Bu protokol, inşa etmek ve böyle bir uyarım yolu hizalamak açıklamaktadır emisyon yolunun uyum ayrıntıları ve optimum uyum sağlamak için test örnekleri sunuyor. Ayrıca de<html> polarizasyon kontrolü ve bileşenlerinin senkronizasyonu ile ilgili sorunları ve yüksek hızlı TIRF-SIM özel zorluklar scribes. Tasarım Hususlar ve Kısıtlamalar Bu protokol sunulan TIRF-SIM sistemi monte etmeden önce, optik bileşenlerin seçimini belirleyen dikkate çeşitli tasarım kısıtlamaları vardır. Optik bileşenlerin tüm kısaltmalar Şekil 1&#39;e bakınız. Mekansal Işık Modülatör (SLM) bu alt-milisaniye desen anahtarlama yeteneğine sahip olarak bir ikili ferroelektrik SLM Bu kurulum kullanılır. Gri Ölçeği nematik SLM&#39;ler kullanılabilir ancak bu geçiş zamanlarını büyük ölçüde teklif azalttı. veya piksel kapalı her bir ikili fazda SLM periyodik ızgara deseni o ızgara bir faz difraksiyonu olarak çalışacaktır SLM görüntülenen nedenle eğer olay düzlem wavefront ofset ya π ya da 0 faz vermek olacaktır. ent &quot;&gt; Toplam İç Yansıma (TIR) TIR elde etmek ve genliği azalan bir alan üretmek için, cam numunesi arayüzü uyarma kirişlerin gelme açısı önemli açıdan daha büyük olmalıdır <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> . Bu fani aydınlatma desen gerekli minimum olay açısı ve dolayısıyla aynı zamanda maksimum boşluk veya dönem, ayarlar. Maksimum olay açısı <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (Kabul açısı) tanımı hesaplanabilir objektif merceğinin sayısal açıklık (NA) ile sınırlıdır <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> . Bu Abbe formülüne göre elde aralığı, minimum kalıp belirler <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> NA ve dalga boyunu bağlayan <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> minimum desen aralığına <imgalt = &quot;Denklem&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;. Pratikte, 1.49 NA yağ daldırma TIRF amacı yaklaşık 79 ° insidansı ve 488 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu kullanılarak 164 nm örnek en az model süresinin maksimum açı elde edilir. Bu iki açı gösterge TIR aydınlatma (yani. TIR halka) ve burada iki uyarım odakları doğru konumlandırılmalıdır elde ve her bir aydınlatma desen oluşturmak için döndürülür, üzerinde amacı arka açıklığı bir halka tanımlar. TIRF-SIM görüntülerin İmar deseni dönme başına üç faz kaymaları minimum satın alınması dolayısıyla SLM desen süresi 3 ile bölünebilir olmalıdır gerektirir (Şekil 1). Örneğin, 488 nm aydınlatma 9 piksel ve 640 nm aydınlatma için 12 piksel bir dönem. makaslanmış ızgaralar kullanılarak aralık desenin alt piksel optimizasyonu dahil SLM desen tasarım kapsamlı bir tartışma içinSLM dalga boyudur gelen, tüm dalga boyları için TIR halkasının içinde olmalıdır ± 1 siparişlerin ancak sapma açısını iki uyarım odaklarının KNER ve ark., 16 ve Lu-Walther ve ark., 20 pozisyonun önceki iş görmek bağımlı. Standart SİM için çok renkli görüntüleme uzun dalga boyu için ızgara periyoduna optimize edilmesi ve daha kısa kanallar için bir performans kaybına tolere ile elde edilebilir. TIRF-SIM için, ancak, bir dalga boyu için optimize Diğer dalga boyu odakları artık TIR halka içinde olduğu anlamına gelir. odakları arka diyafram ve TIR halka içinde çapının% 95 altındadır Örneğin, 9 piksel ızgara periyoduna kullanılarak 488 Nm TIRF sağlamak için yeterli olmakla birlikte, 640 nm, bu dönem dışında odak konumu olacaktır açıklık. Bu nedenle, farklı piksel paterni aralıkları, her uyarım dalga boyu için kullanılmalıdır. TIRF-SIM uyarma yolu hizalamaSon derece mikroskop gövdesinde (Şekil 1 &#39;de DM4) dikroik aynanın pozisyonda küçük değişikliklere karşı duyarlı, çok daha çok geleneksel SİM bulunmaktadır. Dönen filtre küp taret kullanımı yerine kullanılan uyarma dalga boyları için özel bir sabit bir pozisyonda tutulur ve tasarlanmış bir tek, çok bantlı dikroik ayna kullanın, tavsiye edilmez. Sadece yüksek kalitede dikroik aynalar kullanılır esastır. Bunlar en az 3 mm kalınlığında substratlar gerektirir ve genellikle üreticiler tarafından &quot;görüntüleme düz&quot; olarak nitelendirilmektedir. Diğer tüm yüzeyler TIRF-SIM dayanılmaz sapması ve görüntü bozulmasına yol açar. Polarizasyon Kontrol TIRF-SIM ulaşmak için o optik eksene göre objektif öğrenci düzleminde azimut polarize kalacak şekilde aydınlatma deseni ile eşzamanlılık içinde uyarma ışık polarizasyon durumunu döndürmek için gerekli (yani. s-polarize). Polarizasyon kontrol optik hizalama motorlu bir dönme platformu 22, örneğin, kullanılan spesifik optik eleman üzerinde Pockel hücre 21 ya da bir yarım dalga plakası bağlıdır. Bu protokolde özel bir sıvı kristal değişken geciktirici (LCVR), kullanılan dalga boyu aralığında tam dalga (2π) geciktirici sağlamak için tasarlanmıştır 488 hızlı (~ msn) anahtarlama izin verdiği nm 640. sıvı kristal geciktirici kullanılıyorsa bir yüksek kaliteli bileşeni kullanmak esastır: standart bileşenler genellikle yol açar kamera maruz kalma süresi uzunluğu boyunca sabit bir geciktirici vermek için yeteri kadar sabit değildir, bir aydınlatma desen ve düşük modülasyon kontrast dışarı bulanıklık . Sıvı kristal geciktiriciler da güçlü sıcaklığa bağlıdır ve sıcaklık kontrolü inşa gerektirir. senkronizasyon lazerler SLM ile senkronize olması gerekir. İkili ferroelektrik SLM&#39;ler dahili s tarafından dengelenirdevlete ve devlet dışı bir arasındaki büyüleyici. piksel sadece ya onların ya da devlet dışı değil interframe anahtarlama süre içinde yarım dalga plakaları hareket ederler. Bu nedenle lazerler nedeniyle sadece piksel ara durumuna desen aksine bir azalma engellemek için SLM sinyal Enable LED üzerinden açma / kapama durumlarında devreye sokulmalıdır. lazerler dijital şekilde modüle edilmiş olamaz bir akusto-optik modülatör (AOM) alternatif olarak bir hızlı çekim olarak kullanılabilir. Lensler seçimi Bu kısıtlamaları dayanarak, örnek düzlemde üzerine SLM uçağın gerekli demagnification istenen aydınlatma modelleri tespit edilebilir üretmek. Bu görüntü röle teleskop ve uyarma kondenser mercek L5 iki lensler L3 ve L4 odak uzunlukları hesaplanmasını sağlar. Bu sistemde bir 100X / 1.49NA yağ daldırma objektif lens 488 nm ve 640 nm uyarma ile kullanıldığında, bu nedenle 300 ve 140 mm odak uzunlukları kullanırL4 ve L3 ve örnek düzlemde 38 nm&#39;lik bir SLM piksel büyüklüğüne eşittir 357X toplam demagnification vererek L5 için 300 mm, için. lenslerin bu arada kullanarak, SLM sırasıyla 70 ° ve 67 ° lik açılarda karşılık, 488 nm aydınlatma ve örnek 172 ve 229 nm desen aralıklarını vermek nm 640 için 12 piksel 9 dönemleri ızgara. Cam suyu arabirimi için, kritik açı Bu nedenle, bu iki desen aralıkları, her iki dalga boyları için TIRF uyarma izin 61 °, ve dalga boyu bağımsızdır. 37 ° C üzerinde ya da, eğer, bir düzeltme yaka ile donatılmış bir objektif lens lamel kalınlığı varyasyonları getirdiği küresel sapmaları düzeltilmesi için yararlıdır. görüntü İmar Ham SIM veri elde edildikten sonra bu iki aşamalı bir süreç içinde süper çözülmesi görüntüler oluşturmak için hesaplamalı çaba meselesidir. İlk olarak, aydınlatma patern belirlenmelidirHer görüntü ve ikinci SIM spektrumunun bileşenleri ayrılmalıdır ve etkili OTF desteği (-parçalar Şekil 6) çift olarak uygun recombined. süper çözülmesi frekans bileşenleri örtüşen bileşenlerin kalıntı parçalarının neden olduğu eserler önlemek için karışmamış kadar doğru mümkün olması olarak öngörülen aydınlatma desen kesin bilgi, her şeyden önemlidir. Biz aydınlatma desen her biri için bulunacak olan Gustafsson ve ark. Kısacası 23, normalize iki boyutlu sinüzoid açıklar aydınlatma parametreleri bir dizi ile getirilen prosedür izlenerek ham görüntü verilerinden bir posteriori parametreleri belirlemek <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> uyarma desenleri <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> : <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" /> Bu vesile ile <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> ve <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> saçak kontrast ve sırasıyla her görüntü m cafeye desen açıklar. dalga vektörü bileşenleri, <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> ve <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> Sadece farklı yönlerde ile değiştirmek <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> desen ve tenekenin aksi sabit olduğu kabul. kaba üst üste optimize etmek için çapraz korele görüntü birine altpiksel vardiya uygulayarak rafine ham görüntü spektrumları bir çapraz korelasyon yapılır dalga vektörü, bileşenlerini belirlemek. Bu gerçek uzay faz geçişlerini çoğalması ile yapılır <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" /> Bu fre bir altpiksel kaymasını teşvikfrekans-alan. gerçek model tahmini önce dalga vektörlerin iyi bir tahmin olması yararlıdır ve bu bir floresan boncuk tabakası görüntüleme bulunabilir unutmayın. kaymıştır desenleri arasındaki faz adım olarak <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> Yani. <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> Frekans bileşenlerinin ayrılması &quot;Faz ekseni&quot; birlikte bir Fourier Dönüşümü ile gerçekleştirilebilir. küresel faz <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> ve saçak kontrast <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> Daha sonra, farklı bileşenlerin karmaşık bir doğrusal regresyon kullanılarak belirlenebilir. Bireysel ayrılmış bileşenler daha sonra genel bir Wiener filtresi kullanılarak birleştirilir. genelleştirilmiş Wiener filtrenin her iki parametre çıkarma ve uygulama ayrıntılı bir açıklama için biz Gustafsson okuyucu bakınve ark., 23, aynı algoritma kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1149">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Toptica</td>
			<td style="width:181px;">iBeam SMART</td>
			<td style="width:535px;">with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">561 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Coherent</td>
			<td style="width:181px;">OBIS LS</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">640 nm laser</td>
			<td style="width:143px;">Cobolt</td>
			<td style="width:181px;">MLD</td>
			<td>with digital modulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Long-pass dichroic mirrors&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td>for combining excitation beams</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Quad band dichroic mirror</td>
			<td style="width:143px;">Chroma</td>
			<td style="width:181px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>From same batch as above, 25 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">1&#34; square kinematic mount</td>
			<td style="width:143px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:181px;">58-860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor calcite polarizers</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GT5-A</td>
			<td>For alignment of LCVR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Glan-Taylor mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM05PM5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic half wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AHWP05M-600</td>
			<td>400 - 800 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>For HWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Liquid Crystal Variable Retarder</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">SWIFT</td>
			<td>Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">LCVR controller</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">D3060HV</td>
			<td>Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Achromatic quarter wave plate</td>
			<td style="width:143px;">Meadowlark Optics</td>
			<td style="width:181px;">AQM-100-0545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1P/M</td>
			<td>For QWP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">10 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC080-010-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">200 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Cage XY Translators</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Ferroelectric spatial light modulator</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-00249&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">SLM mounting frame</td>
			<td style="width:143px;">Forth Dimension Displays</td>
			<td style="width:181px;">M0787-10014</td>
			<td>Fixed to custom built aluminium mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">&#216;50.8 mm Gimbal Mirror Mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">GM200/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">XYR1/M</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rail carrier</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">M-PRC-3</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision Optical Rail</td>
			<td style="width:143px;">Newport</td>
			<td style="width:181px;">PRL-6</td>
			<td>For SLM mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 273 322&#160;</td>
			<td>f = 300 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">140 mm achromatic doublet lens</td>
			<td style="width:143px;">Qioptiq</td>
			<td style="width:181px;">G322 239 322</td>
			<td>f = 140 mm, 31.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Precision XY Translation Mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">LM2XY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Lens Mounting Adapters</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SM2AD32</td>
			<td>For mounting 31.5 mm lenses in 2&#34; mounts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Translation stages</td>
			<td style="width:143px;">Comar</td>
			<td style="width:181px;">12XT65</td>
			<td>Dovetail, side drive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">XY Translator with Differential Drives</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">ST1XY-D/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rotation cage mount</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">CRM1/M</td>
			<td>for spatial filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">300 mm achromatic doublet</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">AC508-300-A-ML</td>
			<td>Excitation tube lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Automated XY stage with Z-piezo top plate</td>
			<td style="width:143px;">ASI</td>
			<td style="width:181px;">PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&#160;</td>
			<td>with MS-2000 controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Inverted microscope frame</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">IX-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Objective lens</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:181px;">UAPON100XOTIRF</td>
			<td>100X/1.49NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">High speed filter wheel</td>
			<td style="width:143px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:181px;">HF110A</td>
			<td>with Prior ProScan III controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bandpass emission filters</td>
			<td style="width:143px;">Semrock</td>
			<td style="width:181px;">FF01-525/30, FF01-676/29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:143px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:181px;">ORCA Flash v4.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stage top incubator</td>
			<td style="width:143px;">OKO Lab</td>
			<td style="width:181px;">H301-K-FRAME</td>
			<td>For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Stainless steel optical posts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">TR series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Post holders</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">PH series</td>
			<td>for mounting optical components</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Kinematic mirror mounts</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">KM100</td>
			<td>for mounting 1&#34; mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:143px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:181px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">100 nm fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">T-7279</td>
			<td>Tetraspeck</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Rhodamine 6G</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">83697-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">8 well glass bottom dishes</td>
			<td style="width:143px;">ibidi</td>
			<td style="width:181px;">80827</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">155409</td>
			<td>with #1.5 coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">0.01mm microscope reticle slide</td>
			<td style="width:143px;">EMS</td>
			<td style="width:181px;">68039-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:291px;">CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:181px;">C10613</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to structured illumination tirf microscopy at high speed with multiple colors

yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile optik süper çözünürlüklü görüntüleme kimyasal ve biyomedikal bilimlerde moleküler düzeyde süreçlerin görselleştirme için önemli bir teknolojidir. Ticari SIM sistemleri mevcut olmakla birlikte, özel ticaret sistemler daha iyi performans laboratuvar tasarlanmış sistemler, ikincisi genellikle görüntüleme sadakat ve hız açısından hem de kullanım ve genel amaçlı uygulamalar kolaylığı için tasarlanmıştır. Bu makale toplam iç yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanır ve 100 nm ulaşan bir çözünürlükte üç renk 10 Hz kadar az görüntüleme yeteneğine sahip bir SIM sistemi inşa etmek derinlemesine bir rehber sunuyor. Nedeniyle SIM ve TIRF kombinasyonu, sistem rakip teknolojilere daha iyi görüntü kontrast sağlar. Bu özelliklere ulaşmak için, birkaç optik elemanlar mevcut tüm uyarma wav için aydınlatma ışık polarizasyon durumu ve mekansal yapısı üzerinde otomatik denetimini etkinleştirmek için kullanılırelengths. Donanım uygulanması ve denetimi tüm ayrıntılar maksimum kazanım kare hızını elde bir vurgu ile uyarma ışık deseni üretimi, dalga boyu, polarizasyon devlet ve kamera kontrolü arasındaki senkronizasyon sağlamak için verilmiştir. Sistem hizalama ve kalibrasyon için bir adım-adım protokolü sunulmuştur ve ulaşılabilir çözünürlük iyileştirme ideal bir test örnekleri üzerinde doğrulanmıştır. video oranı süper çözünürlüklü görüntüleme için yeteneği canlı hücreler ile gösterilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors at JoVE.com

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

a-guide-to-structured-illumination-tirf-microscopy-at-high-speed-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.0K Görüntüleme.  University of Cambridge. This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Video: A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gümüş Tohum aracılığı Büyüme Yöntemi ile Altın Nanostar Sentezi

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Biyomühendislik

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, enabling the visualization of large macromolecular machines, such as adhesion complexes, as well as higher-order structures, such as the cytoskeleton and cellular organelles in their respective cell and tissue context. Given the inherent complexity of cellular volumes, it is essential to first extract the features of interest in order to allow visualization, quantification, and therefore comprehension of their 3D organization. Each data set is defined by distinct characteristics, e.g., signal-to-noise ratio, crispness (sharpness) of the data, heterogeneity of its features, crowdedness of features, presence or absence of characteristic shapes that allow for easy identification, and the percentage of the entire volume that a specific region of interest occupies. All these characteristics need to be considered when deciding on which approach to take for segmentation.
The six different 3D ultrastructural data sets presented were obtained by three different imaging approaches: resin embedded stained electron tomography, focused ion beam- and serial block face- scanning electron microscopy (FIB-SEM, SBF-SEM) of mildly stained and heavily stained samples, respectively. For these data sets, four different segmentation approaches have been applied: (1) fully manual model building followed solely by visualization of the model, (2) manual tracing segmentation of the data followed by surface rendering, (3) semi-automated approaches followed by surface rendering, or (4) automated custom-designed segmentation algorithms followed by surface rendering and quantitative analysis. Depending on the combination of data set characteristics, it was found that typically one of these four categorical approaches outperforms the others, but depending on the exact sequence of criteria, more than one approach may be successful. Based on these data, we propose a triage scheme that categorizes both objective data set characteristics and subjective personal criteria for the analysis of the different data sets.

The bottleneck for cellular 3D electron microscopy is feature extraction (segmentation) in highly complex 3D density maps. We have developed a set of criteria, which provides guidance regarding which segmentation approach (manual, semi-automated, or automated) is best suited for different data types, thus providing a starting point for effective segmentation.

Voksellerden Gönderen Bilgi için: Kompleks Elektron Mikroskopi 3D-Data Bölümlere Göre Pratik Rehber

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Brillouin Saçılma Analiz Yüksek Hızlı Alt GHz Spektrometre

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

Mikroorganizmaların düşük konsantrasyonlarda dijital holografik mikroskobu (DHM) kullanarak miktarının

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...