I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

1. Bir Yeterli Deneysel Strateji geliştirin <ol><li> Flokülasyon işlemi faktörleri flokülasyon üzerinde en güçlü etkiye sahip olan, yani kurulmuş veya optimize edilmesi için ilgili çevresel ve proses parametrelerini belirlemek. Tipik olarak, son zamanlarda 20 nedeniyle mekanik modellerin eksikliği için gerekli açıklandığı gibi bir DoE yaklaşımı yüzden birkaç tür parametre vardır. <ol><li> Literatür verilerine 12, sistem ile önceki bilgi ve deneyime dayalı Seç parametreler (faktörler). Tipik faktörler tamponu pH, tampon iletkenlik, inkübasyon süresi ve sıcaklık gibi, polimer tipi ve konsantrasyonu 15,16,27 bulunmaktadır. </li><li> kategorik faktörler için anlamlı her sayısal faktör için aralıkları ve seviyeleri tanımlamak için aynı referansları (1.1 bakınız) kullanın. </li><li> Deneysel sonuçlar (yanıt) izlenmeli ve flokülasyon etkinliğini değerlendirmek için kullanılacak tanımlar. Sisteme bağlı olarak, buSüzüntü veya süpernatant bulanıklık, çökelme hızı, toplam büyüklüğü ya da sonraki bir filtre 16,23,28-30 kapasitesi olabilir. </li><li> Elde edilen yüksek kaliteli veri sonra ya da başka bir operatör tarafından gerçekleştirilen deneyler ile artar böylece tepkileri ölçmek için kullanılan deneyler tekrarlanabilir / kantitatif sağlam ve tekrarlanabilir olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> faktörlerin sayısı araştırılacak ve bilginin derecesi zaten sistem hakkında birikmiş çalışmalardaki bir DoE türü seçin. Uygun bir DoE tipi 20 tanımlamak için kullanılabilir literatürü kullanın. <ol><li> Parametrelerin çok sayıda ekranlı olmalıdır ya da çok az parametreler için anlamlı aralıkları hakkında bilinen araştırılacak flokülasyon sistemi hakkında az bilgi varsa bir tarama tasarımı seçin. Tipik tarama tasarımları tam ve kısmi faktöryel tasarımları vardır. Parametreleri, örneğin, doğrusal olmayan bir etkisinin olması beklenmektedir eğer tasarım orta noktalarını dahil </em&gt; Belirli bir eşiğin 19 üzerinde doygunluk. </li><li> Bir cevap yüzey yöntemi (RSM), örneğin merkezi kompozit dizayn (CCD) 31 veya optimum 32,33, tanınmış aralıklar ile sadece bir kaç faktör gerekirse tam karakterize edilebilir seçin. </li></ol></li><li> DoE tasarım alanı fraksiyonu 20 karşılandığı gibi önsel kalite kriterlerinin sağlanması, uygun yazılım ile ayarlayın. </li></ol> 2. Flokülasyon Deneyler hazırlayın <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53940/53940fig1.jpg" /> Şekil 1: Bitki özü flokülasyon iş akışı: süreç ölçeği (solda) ve tezgah üstü ölçeği (sağda). Sulu tamponlar ile protein çekimini takiben, hücre enkaz dağılmış parçacıkları flokülant eklenerek toplanır. agregalar daha sonra çanta ve derinlikli filtreleme bir kademeli ve bunların kapasitesi ile çıkarılırSüzüntü türbiditelerin birlikte filtreler flokülasyon etkinliğini ölçmek için doğrudan kullanılabilir. <ol><li> Genel Deneysel İş Akışı (Şekil 1) geliştirin. <ol><li> Örneğin özel bir homojenleştirici son uygulama ölçeğinde beklenen aynı parçacık büyüklüğü dağılımı ile sonuçlanır (ya da daha önce gözlenen) bir ekstraksiyon cihazı kullanın. Mümkünse tütün homojenizasyon 10 yaprak için tarif edildiği gibi, aspiratör bir ölçek aşağı modeli tasarımı. </li><li> flokülasyon deneyleri (burada 20 ml) sırasında kullanılan özü hacimleri tanımlayın. Parçacıkların belirli bir sayısı, reaksiyon kabı içinde mevcut olması için izin veren bir ses seçin 20 mi alikotlar içinde, örneğin çökeltme deneyleri katı 34 ve parçacık boyutu ~ 0.5 [ağırlık / hacim] ~% 7 ihtiva eden tütün ekstreleri için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir sonuçlar vermiştir um ~ 3 ila 16 mm. </li><li> tüm izleme ve post-flokülasyon işlemleri Tasarım o inci böyleceey son başvuru ölçek temsilcisi, üretim ölçeğinde kullanılanlarla aynı partikül tutma davranışı ile örnek seçme filtreler. </li></ol></li><li> Özler Türetilmiş olacak hangi gelen Tesisleri geliştirin. <ol><li> Aynı bitki hattını, burada Nicotiana tabacum cv kullanın. Petit Havana SR1 ve üretim sırasında kullanılacak yetiştirme koşulları önceden 33 nitelendirdi. </li><li> Diğer yem stokları işlenecek, bunlar örneğin, nihai uygulama ölçeği temsil eden özgün tamponlar kullanın, böylece bu yem stokları hazırlamak dikkate almak herhangi bir seyreltme adımlarını sürecinde ve burada, beklenen pH ve iletkenlik, pH 7.5 sopa ve iletkenlik 30 mS cm -1. </li></ol></li><li> Filtrasyon Utilities, Bulanıklık-İzleme Cihazları ve Örnekleme gemiler hazırlayın. <ol><li> Onlar değilse, burada gerekli boyutları, 15 x 15 cm 2 filtre malzemeleri kesmek hazır bizee modülleri. Tüm izleme ve analiz cihazları işlevsel olduğundan emin olun ve tüm örnek tüplerini etiketleyin. </li><li> Bu basit görevleri olmasına rağmen, onlar gerçek flokülasyon deneyleri sürekli aksamasına neden olmayacak emin olmak için zaman içinde bu öğeleri hazırlamak. o flokülasyon verilen sonuçlar etkilediği için bu gecikmeleri önlemek zamana bağlı bir işlemdir. </li></ol></li><li> Topaklayıcı stok çözelti hazırlayın. DİKKAT: örneğin eldiven pıhtılaşmış işlerken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. malzemeler tehlikeli olabilir (Avrupa UE 67/548 / CEE göre tehlike etiketleri, 1999/45 / CE N, Xi veya Xn dahil). tozdan kaçının ve malzeme güvenlik veri sayfalarına bakın. Davlumbaz altında çalışmak. <ol><li> Burada her çökeltme için bir stok konsantrasyonu, 80.0 g L -1 kullanılan iki PEI flokkulantlarla için seçin. parçacık konsantrasyonunun azaltacak topaklaştırıcı eklerken örnek seyreltme önlemek için mümkün olduğunca yüksek Seç konsantrasyonları,yon ve böylece flokülasyon verimliliği etkiler. </li><li> Polimer daha önce sulu% 50 [ağırlık / hacim] çözelti olarak tedarik edilir ise, örneğin, polimerin üreticinin formülasyon yansıtan herhangi bir ön-seyreltme için hesap. % 4-8 arasında flokülan stok çözeltileri [ağırlık / hacim] Şimdiye kadar en uygun olduğu bulunmuştur. </li><li> akılda yukarıda tartışılan noktaları Rulman, flokülant konsantrasyonu nihai çöktürücüdür konsantrasyon doğru ayarlanmış olmadığından potansiyel hatalara neden pipetleme inhibe eden oldukça viskoz çözüm üretmek değil emin olun. </li><li> Bu nedenle hata olasılığını azaltan bir pipetleme şeması (2.5) kurulumunu kolaylaştıracak çünkü eğer mümkünse tüm flokkulantlarla için aynı stok konsantrasyonu kullanın. </li><li> Özler, burada pH 4-10 ve iletkenlik 15-55 mS cm -1 koşullara uyan her çöktürücüdür stok çözeltinin pH ve iletkenlik ayarlayın. m ise tek bir çökeltme için bireysel stokları hazırlayınpH ve / veya iletkenlik koşullarında bir dizi daha cevheri bu polimer için test edilir. </li><li> Kullanmadan önce 48 saat daha uzun, taze flokülant stok çözümleri hazırlayın. Flokülasyon fazla 4 hafta boyunca, polimer stokları ile indüklenebilir olsa da, verim, yüksek ya da düşük pH değerleri ile, polimer hidrolizine bağlıdır düşebilir. Daha fazla bilgi için üreticinin belgelerine bakın. </li><li> Burada, 4 ° C, 20 ° C ve 37 ° C inkübasyon sıcaklıkları ayarlamak için kullanılabilir ısıtma / soğutma banyoları sağlamak ör Doe için seçilen parametreler deney sırasında her bir örnek için tam olarak ayarlanabilir olduğundan emin olun. flokülasyon sırasında karıştırma deneyin bir parçası ise, karıştırma cihazı gibi güç girişi gibi kritik parametreler açısından son başvuru ölçek temsilcisi olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Bir Pipetleme Programı içine DoE Programı dönüştürün. <ol><li> tes olmak farklı Topaklayıcı konsantrasyonlarını dönüştürmeközü numuneleri eklenecektir stok solüsyonu hacimleri içine ted: stok konsantrasyonu son flocculant konsantrasyonları bölmek ve flokülasyon deneylerinde kullanılan örnek hacmi ile çarpın. Örnek 20 mi, bu 22 mi olacak 2 mi flokülan stok çözeltisi en fazla karıştırılır, eğer, örneğin büyük Nihai son hacim tanımlar. </li><li> Flokülan stokunun 0.75 mi, daha sonra tampon 1.25 mi korumak için gerekli olan bir örneğe ilave edilmesi gerekiyorsa, flokülan stokunun büyük hacmine bağlı olarak, tüm çökeltme alikotları, aynı nihai hacmi muhafaza etmek için gerekli olan hacim tampon eklenmesi, örneğin, hesaplama 22 ml&#39;lik nihai numune hacmi (2.5.1). </li><li> DOE için gerekli olan stok solüsyonu mutlak hacimlerini hesaplamak için her polimer ve flokülasyon durum için çöktürücüdür stok solüsyonu hacimleri Özetle. </li></ol></li><li> Hasat Tütün Yaprakları ve Extract hazırlayın. <ol><li> ilk altı lea kaldırBu ya bir homojenizer olarak ves (veya işlem talimatlarında belirtildiği gibi pek çok), uygun bir ekstraksiyon cihazı için uygun bir yaş, 6 haftalık ör ve transfer tütün bitkilerinden basın vidalayın. </li><li> 100 g örneğin gram biyokütle başına 300 ml ekstraksiyon tamponu üç cilt ekleyin ve 8 dakika boyunca karıştırın. </li><li> Farklı pH ve / veya iletkenlik test edilmektedir, uygun tamponlar ile tek tek ekstrelerini hazırlamak. İşte, bu bir blender 3 x 30 sn veya bir meyve sıkacağı 34 bitki materyali homojenize içerir. </li><li> Seçenek olarak ise, araştırma altındaki işlem için temsili bir şekilde özü hazırlamak. </li></ol></li><li> Özü alikotu ve Tamponu ekleyin. <ol><li> El ve iyice örnekler parçacıkların bir dağılımını homojen olmasını sağlamak için tüm işlem boyunca özü karıştırın. </li><li> Tam olarak boşaltılarak önceden etiketlenmiş reaksiyon tüpleri arasında özü dağıtmak,Her bir kap içinde buradan 20 mi. Kendi başına ayakta durabilen 50 mi tüpler kullanımı kolaylaştırmak ve 20 ml numune için idealdir. </li><li> Uygun bir pipet kullanılarak, her bir reaksiyon tüpüne sabit nihai hacmi muhafaza etmek için gerekli olan her bir ekstraksiyon tampon hacim. </li></ol></li></ol> 3. Topaklanmak Bitki Farklı Polimerler ile ayıklar <ol><li> DOE randomize çalışma düzenine gösterilen sırayla olarak örnekleri, burada, 0.1-2.0 ml flokülant stok solüsyonu gerekli hacmi pipetle. İyice hemen tam 20 saniye boyunca sallayarak yoğun manuel olarak flokülantmın eklenmesinden sonra her bir örnek karıştırın. <ol><li> Gerekirse, iyice karışmasını sağlamak için diğer yem stokları sallayarak süresini ayarlamak, ama kesinlikle tüm örnekler için tutarlı karıştırma süreleri sağlamak. flocs geri dönüşsüz bozulmasına neden olabilir karıştırma uzun ve tutarsız bir flokülasyon sonuçlarını bozabilir sallayarak sırasında uygulanan kuvveti unutmayın. </li></ol></li><li> İsteğe bağlı: iki veya daha fazla pıhtılaştırma maddelerinin aynı anda uygulama için yukarıda tarif edilen prosedür değiştirin. <ol><li> Seçenek 1: İki veya daha fazla Flokülan, burada PEI ve kitosan karışımı ekleyin yerine tek bir polimer. DOE tanımlanan flokülan kombinasyonlarını kullanarak. DoE kurulumu (1.1) sırasında oranı ve bireysel parametre olarak polimerlerin mutlak konsantrasyonlarını birleştirir. </li><li> 2. Seçenek: özü iki veya daha fazla polimer sırayla ekleyin. <ol><li> DoE kurulumu sırasında ek faktörler gibi bireysel polimer konsantrasyonları, kendi türünü ve özü her ilave arasında inkübasyon süresi kullanın. </li><li> Ayrıca, tek bir polimer tekrar eklenmesi Pıhtılaşmanın iyileştirilmesi olup olmadığını test etmek için, bu yaklaşımı kullanır. Bir pıhtılaştırma yavaş ilavesini taklit etmek için bir adım adım eklenmesini, örn dört adımda, 20 mL&#39;lik bir hacmi 4 üzerinde dakika için her ekleme 0.25 mi, 80 g L-1 flokülan hazır olan çökeltme maddesi ilave taklit edebilir0.25 mi dak-1 bir akış oranı. </li><li> Her durumda, burada, örnek hacmi hala 22 ml tüm flokülant maksimum hacimleri ekleyerek bu kurulum için yeni bir maksimum nihai örnek hacmi belirlemek ve gerekirse ses ayarı için flocculant stok solüsyonları ve tamponlar gerekli hacimleri yeniden hesaplayın. </li></ol></li></ol></li><li> topaklanma oluşumunu sağlamak için, DOE tipik olarak 3-30 dakika tanımlanan kez örnekleri inkübe edin. Diğer tüm inkübasyon koşulları emin olun örneğin sıcaklık, DOE göre ayarlanır. </li><li> Gözlemlemek ve belge floc oluşumu. Gerekli topak mm yerleşmiş katı yüksekliğini ölçerek dakika başına hesaplaşma olarak örneğin olarak topaklanma oluşumu ilerleme kaydedin. Gerekirse, örneğin gece boyunca uzun bir süre için flokülasyon uzatır. </li><li> Topaklanmış Özü Filtre. <ol><li> Daha önce hazırlanan filtre malzemelerini kullanın (2.3) uygun sonra pıhtılaşmış özü açıklığa kavuşturmak içinFiltre malzemesi ile ve temiz bir kap veya reaksiyon tüpüne pıhtılaşmış numuneler boşaltılarak inkübasyon süresi. <ol><li> Do not filtrasyon önce yerleşmiş yumakları yeniden askıya ve 20 ml&#39;lik bir örnek için 3-4 sn ~ 300 oranında sahip ml dk -1 filtreye, ilgili özü uygulayın. </li><li> Farklı malzemenin partikül tutma açısından son işleme kıyasla tezgah üstü deneylerinde kullanılan, filtreleme adımı performansının teyidi, her iki örnek tip 11, partikül boyut dağılımının ölçülmesi ile, örneğin. </li></ol></li><li> Örneğin bir türbidimetre bulanıklık ve / veya gerekli kullanılarak uygun cihazlar olarak parçacık boyutu dağılımı açısından, süzüntü analiz edin. </li><li> İsteğe bağlı: kararsız flocs oluşumunu ya da reform araştırmak için, örneğin 12-24 saat, genişletilmiş kuluçka sürelerinden sonra analiz tekrarı. </li></ol></li><li> Pr Açısından örnekleri analizE-tanımlı Cevapları (1.1.3). <ol><li> Süzüntülerden numune almak ve farklı hedef protein ya da değerli ürünlerin konsantrasyonları örneğin, ek cevabı parametreler için analiz eder. </li><li> İsteğe bağlı: sürecinin kütle dengesi kapatmak için aynı parametreler için bakiyenin (çoğunlukla katı) analiz edin. Özellikle, örnekler tedavi edilebilecek veya çökeltme ile tedavi edilmeyen sonra seri geri kalan katı karşılaştırarak sıvı kurtarma pıhtılaştırma etkisini ölçmek. </li></ol></li><li> veri kalitesini onaylamak ve DoE yazılımına sonuçlarını aktarmak. <ol><li> Toplanan cevap verilerde aşırı değerler, örneğin beklenmedik yüksek değerler için bak. </li><li> Tüm yanıt verileri doğru bunlara karşılık gelen deneysel koşullar ile uyumlu olduğundan emin olun. </li><li> DoE yazılım içine sonuçlarını aktarın ve standart ve randomize çalışma siparişleri karışık olmadığından emin olun. </li></ol></li></ol> 4. değerlendirinDoE <ol><li> Daha önce 20 açıklandığı gibi bir öngörü modeli geliştirmek için DoE yazılım yerleşik veri analizi araçlarını kullanın. <ol><li> Model bina kolaylaştırmak için gerekirse uygun bir veri dönüştürme modunu seçin, burada 10 günlük. En büyük vs küçük tepki değeri A oranı daha büyük 10 veri dönüşümü gerekli olabileceğini gösterir. Box-Cox arsa 35 örneğin, uygun istatistiksel araçları kullanarak en uygun dönüşümü belirleyin. </li><li> (I) seçilen DOE (1.2) uyan ve (ii) örn varyans (ANOVA) analizi dayalı soruşturma altında sistemi hakkında önceki bilgi DoE yazılım araçları, ikinci dereceden polinom ile kabul eder bir baz model seçti genellikle, bir birinci dereceden polinom daha inkübasyon süresi gözlenen etkisi daha iyi uyum sağlar. </li><li> Onları seçimini kaldırarak iteratif önemsiz bir model faktörleri, örneğin p&gt; 0.05, veya faktör etkileşimleri KaldırReby modeli karmaşıklığı azaltarak ve öngörü gücünü artırmak. </li><li> R 2, düzeltilmiş R2 karşılaştırarak modeli kalitesini teyit ve studentized artıklarının normal olasılık arsa ile birlikte R 2 öngörülen, artıklar-vs-run, tahmin edilen vs-fiili ve Box-Cox 36 araziler. Tüm R2 değerleri 0.2 aralığında olmalıdır. </li><li> Son model olumsuz konsantrasyonları tahmin edilen örneğin fizik ve termodinamik, temel varsayımlar kabul eder emin olun. </li></ol></li><li> Burada soruşturması kapsamında sistemin, düşük bulanıklık için en elverişli koşulları tahmin etmek modeli kullanın. <ol><li> En önemli tepkiler ve tercih ettikleri durumları seçip, en az bulanıklık örneğin. Built-in birkaç DoE yazılım paketleri 36 özellikleri bir cazibe işlevi veya benzer araçları maksimize ederek bu seçimleri birleştirin. </li><li> amaçlanan uygulama o bağlımodeli f seçin onay koşulları en uygun olduğu tahmin takip deneyler olarak onları seçin ilk DOE parçası olmasa en uygun koşulları ve / veya örneğin, genel olarak modelin öngörü gücünü doğrulamak için çalışır. </li></ol></li></ol> 5. Model geliştirin ve Tahmini Güç doğrulayın <ol><li> En çok arzu edilen çalışma koşullarına ilk tasarım alanı daraltmak 0-1.000 nefelometrik bulanıklık üniteleri (NTU) aralığında örneğin, düşük bulanıklık, model öngörüleri (4.2) dayalı. </li><li> Yeni DoE önemli ya da ilgili olarak tespit edilmiştir sadece bu faktörler de dahil olmak üzere, bu aralıklar içinde kurmak (4.1.2)). NOT: Bir faktör bir süreç için model analizi, ancak ilgisiz açısından önemli olabilir, bir yanıt üzerindeki etkisi% 1 diğer faktörlere kıyasla &lt;olduğunu yani. </li><li> Model tahminlerinin kalitesi requiremen kavuşana kadar tekrarlayın 1-5.2 adımlarıts, örneğin bir yazılım ile gösterildiği gibi modelin standart sapması amaçlanan uygulama için yeterlidir. Örneğin arıtma tek topaklaştırıcı kullanın bu tekrarlamalar için gerekirse deneysel strateji değiştirin. </li><li> Aktarın ve pilot ölçekli veya nihai üretim ölçeğine ölçek aşağı modelin sonuçlarını doğrulamaktadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Godfray, H. C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+Security:+The+Challenge+of+Feeding+9+Billion+People.">Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People.</a> Science. 327, 812-818 (2010).</li><li>Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial+aspects+of+pharmaceutical+protein+production+in+plants.">Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants.</a> Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).</li><li>Pastores, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Phase+3,+multicenter,+open-label,+switchover+trial+to+assess+the+safety+and+efficacy+of+taliglucerase+alfa,+a+plant+cell-expressed+recombinant+human+glucocerebrosidase,+in+adult+and+pediatric+patients+with+Gaucher+disease+previously+treated+with+imiglucerase.">A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase.</a> Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).</li><li>De Paepe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+between+spiral-filter+press+and+belt+press+implemented+in+a+cloudy+apple+juice+production+process.">A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process.</a> Food Chem. 173, 986-996 (2015).</li><li>Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+downstream+processing+of+plant-derived+recombinant+proteins.">Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).</li><li>Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+of+plant-made+recombinant+proteins.">Recovery and purification of plant-made recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+trategies+in+plant+molecular+farming.">Process development trategies in plant molecular farming.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).</li><li>Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakage+of+transgenic+tobacco+roots+for+monoclonal+antibody+release+in+an+ultra-scale+down+shearing+device.">Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device.</a> Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).</li><li>Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+extraction+of+monoclonal+antibodies+targeted+to+different+subcellular+compartments+in+transgenic+tobacco+plants.">Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-down+models+to+optimize+a+filter+train+for+the+downstream+purification+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco+leaves.">Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves.</a> Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants:+the+pros+and+cons+of+flocculants.">Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants.</a> Bioengineered. 5, 138-142 (2014).</li><li>Gregory, J., Barany, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+and+flocculation+by+polymers+and+polymer+mixtures.">Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures.</a> Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).</li><li>Zhou, Y., Franks, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocculation+mechanism+induced+by+cationic+polymers+investigated+by+light+scattering.">Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering.</a> Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).</li><li>Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+modeling+of+polymer-induced+flocculation+by+charge+neutralization.">Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization.</a> J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).</li><li>Hjorth, M., Jorgensen, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+flocculation+mechanism+in+animal+slurry+established+by+charge+neutralization.">Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization.</a> Water Res. 46, 1045-1051 (2012).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocculation+increases+the+efficacy+of+depth+filtration+during+the+downstream+processing+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco.">Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-based+filter+aids+increase+the+capacity+of+depth+filters+during+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins.">Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins.</a> Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).</li><li>Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Flocculation+of+Lignocellulosic+Hydrolyzates+by+Polymers.">Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers.</a> Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).</li><li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design and Analysis of Experiments. , (2007).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+complex+systems+using+the+design+of+experiments+approach:+transient+protein+expression+in+tobacco+as+a+case+study.">Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study.</a> J. Vis. Exp. , e51216 (2014).</li><li>Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-down+characterization+of+post-centrifuge+flocculation+processes+for+high-throughput+process+development.">Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development.</a> Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).</li><li>Rathore, A. S., Sofer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , (2012).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+and+Efficient+Cell+Culture+Flocculation+Process+Using+a+Stimulus+Responsive+Polymer+to+Streamline+Antibody+Purification+Processes.">Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).</li><li>Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+selection+as+a+downstream+strategy:+Polyelectrolyte+precipitation+of+beta-glucuronidase+from+plant+extracts.">Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).</li><li>Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+precipitation+versus+anion+exchange+chromatography+in+fractionating+recombinant+beta-glucuronidase+from+transgenic+tobacco+extract.">Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract.</a> J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+polymers+are+more+effective+than+natural+flocculants+for+the+clarification+of+tobacco+leaf+extracts.">Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts.</a> J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).</li><li>Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeta+potential+as+a+measure+of+polyelectrolyte+flocculation+and+the+effect+of+polymer+dosing+conditions+on+cell+removal+from+fermentation+broth.">Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth.</a> Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).</li><li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco.">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li><li>Wang, S., Liu, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+polymer+flocculants+on+coagulation-microfiltration+of+surface+water.">Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water.</a> Water Res. 47, 4538-4546 (2013).</li><li>Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyelectrolyte+flocculation+of+grain+stillage+for+improved+clarification+and+water+recovery+within+bioethanol+production+facilities.">Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities.</a> Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).</li><li>Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+functional+properties+during+preparation+of+cowpea+protein+concentrate.">Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate.</a> Food Chem. 154, 32-37 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+models+for+transient+protein+expression+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+can+optimize+process+time,+yield,+and+downstream+costs.">Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).</li><li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter/5'UTR+combination.">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers.">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, (2000).</li><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Response Surface Methods Simplified. , (2005).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+chromatography-based+purification+strategies+accelerate+the+development+of+downstream+processes+for+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants.">Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants.</a> Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).</li><li>Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , (2009).</li></ol>

Yazar ifşa herhangi bir çıkar çatışmaları vardır.

En önemli yönü parçacık topaklanmayı karakterize bir Doe kurarken tasarım prensibi örneğin pH, polimer tipi ve polimer konsantrasyonunun 16 etkisi beklenen veya olası etkileri 36,38, algılamak ve anlatmak gerekir olduğunu düşünün. Nedenle, gerçek deneyler başlamadan önce tasarım alanı (FDS) kısmını değerlendirmek önemlidir. FDS örneğin 250 bulanıklık bir fark tespit edilmesi, bilinen bir değişkenlik sistemi verilen Deney sonuçları arasındaki önceden belirlenen farkları tespit etmek mümkündür, içinde (tasarım faktörleri, örneğin pH ile örtülü) boyutlu deney alanı fraksiyonudur NTU 125 NTU bir değişkenlik verilen. FDS ek pistlere sahip tasarımı artırarak artırılabilir ve süreç kontrolü 36 yönlendirmeye yönelik tasarımlar ≥0.95 edilmelidir. Ayrıca, ishal sayısı izin vermez eğer to tüm deney, tek bir gün içinde yapılacak bloklar için hesap DOE önceden tanımlanmış olmalıdır toplu partiye ve gün-gün değişkenlik. Bitki materyali ile çalışırken, başvurular eklenmiş (örneğin kontrolleri olmayan tedavi) her blokta çalışan karşılık gelen referans çalıştırmak için her normalize birkaç çalışır elde edilen verilerin karşılaştırılması izin değişkenlik telafi etmek için yardımcı olur. Bu bağlamda, DOE, tekrarlanan çalışan sayısının artırılması de yararlıdır. Polimerlerin çok sayıda elenir, Flokülan, örneğin yük yoğunluğu ve moleküler kütlesi bireysel özelliklerini kullanmak için tavsiye edilir gibi ayrı sayısal faktörler yerine polimerler olarak kendilerini kategorik faktörler. deneysel tasarımlar genellikle sayısal faktörlerin ilave seviyeleri sadece ekstra çalışır az sayıda gerekir ise, kategorik faktörleri çoğaltılması gerekir, çünkü bu deneylerin sayısını azaltır. bilgi conDeney tert da artar ve Pıhtılaşmanın iyileştirilmesi polimer özellikleri, burada tarif edilen deneylerde bulunduğu gibi, örneğin, bir yüksek yük yoğunluğu belirlenmesini sağlar. CCD ve RSM deneysel tasarımlar sağlam işleme koşullarının belirlenmesi (örneğin rehberlik proses kontrol) sağlayan, yüksek öngörü gücüne sahip modeller kurmak için yararlıdır ve genellikle tarama tasarımları takip etmek için kullanılır. 400&#39;den fazla bireysel deneylerle DOE soruşturma sonuçlarının altında faktörleri ve faktörler düzeylerinin sayısı, faktör düzeyleri sayısını azaltmak veya diğer tasarım türlerine geçmek için tavsiye edilebilir çünkü eğer kolayca tekniği ile işlenebilir numune sayısı burada yer alan günlük 100 ° ile sınırlıdır. Bunlar düşük bir pH değerinde depolimerize olmamalıdır, örneğin bir görüş Deneysel bakış açısından, polimerler, seçilen deney koşulları altında stabil olmalıdır. çökeltme maddesi dikkatli bir hazırlıkkonsantrasyon açısından stokları tekrarlanabilir sonuçlar ve yüksek kaliteli modellerinin elde edilmesi de gereklidir. Bu bağlamda, pul, homojen bir çözelti elde etmek için ve böylece tam bir çözülmesini sağlamak için, örneğin, kitin için süre ya da pH ayarlaması şişme, ön-muamele edilmesi gerekir ve. ekstresine polimerin aktarırken bu pipetleme hatalarına neden olabilir, çünkü oldukça viskoz stokları kaçınılmalıdır. Birçok polimer güçlü bir tamponlama etkisi olabilir ve stokları aşırı pH değerlerine sahip, örneğin pH ~ 8% 9.5 PEI [w / v]. Bu hisse senetleri önceden ayarlanmış değilse özü etkileyecek pH ve deney sonuçlarını bozar. flokülasyon yüksek pH ve PEI stok ayarlanmış olmayan bir pH&#39;da daha etkili Örneğin, daha sonra bir DoE yüksek PEI konsantrasyonu daha etkili olduğunu önerebiliriz kullanılır. Bununla birlikte bu etki ilave edildi stokunun daha büyük bir hacme yol açtığı yüksek pH neden olacaktır değil, artan polimer konsantrasyonu PE tarafındanr se. Hisse senedi konsantrasyonları da parçacık konsantrasyonu ve dolayısıyla flokülasyon etkileyebilir ölçekler arasındaki seyreltme etkilerinin farklı önlemek için büyük ölçekli uygulamalarda kullanılan benzer olmalıdır kullanılır. Kaolin gibi bazı kil bazlı pıhtılaştırma flokülasyon etkisi maskeleyebilir ince parçacıkların kendilerinin çok sayıda ilk süzülmesinden sonra, örneğin, bulanıklık azalması içerir ve diğer cevaplar bu maddelerin etkinliği, örneğin, alt filtre kapasitesine değerlendirmek için seçilmelidir. Veri analizi için aşırı değerler, yanlış hizalama ve genel tutarlılık, örneğin uç değerler kopyala-yapıştır hatası, ondalık yerde bir kayma ya da ekipman / analitik cihazlar arızaya işaret edebilir açısından elde edilen sonuçların değerlendirilmesi önemlidir. Ayrıntılı bir analizi sadece yüksek kaliteli veri modeli yapımında kullanılan sağlayacaktır. model kurma sırasında sürekli th değerlendirmek önemlidirDoE yazılım tarafından sağlanan kalite göstergelerinin e geniş bir set. En temel kriter R2, düzeltilmiş R2 ve R2 değerleri, ancak normal artıklar, artıklar-vs-run ve gerçek-vs-tahmin araziler (Şekil 4) her vadede hakkında bilgi verir, çünkü daha da önemlidir tahmin bir deney yerine toplam parametresi. Ayrıca, nihai modelin tutarlılığı ve flokülasyon bilinen mekanizmaları ile tahminler her zaman araştırılmalıdır. DoE modelleri yalnızca açıklayıcı ziyade mekanik olduğu için tahminler ve bilimsel beklentileri arasında büyük farklılıklar gibi modelleri polinom uydurma algoritmaları kullanımını yansıtan bir tasarım alanı kenarlarında aşırı değerlerini tahmin edebilir, oluşabilir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53940/53940fig4.jpg" /> Şekil 4:. DoE modellerinin Kalite göstergeleri yokstudentized artıkların rmal arsa yüksek kaliteli modeller için kabul edilebilir sadece küçük sapmalara (yeşil oklar) olabildiğince yakın (A) düz bir çizgi gibi olmalıdır. İdeal hat (kırmızı) güçlü sapmalar (kırmızı oklar) ile kavisli bir görünüm (C) nedeniyle önemli faktörler eksik kötü bir model, örneğin gösterir. Sonuçta, tahmin ve deneysel (gerçek) değerleri maç (B) ve yine düz bir çizgi izlemelidir. İdeal hat (kırmızı daire ve kesikli çizgi) sapmalar kötü model tahminleri (D) gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53940/53940fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> DoE yaklaşımı hiçbir mevcut veri olmasa bile, bu tür bitki özleri gibi karmaşık yem stoklarında flokülasyon karakterize etmek yardımcı olabilir. Tütün ekstrelerinin flokülasyon 2 biz bir iş yükü ile optimize edildieks ve ~ 500 € sarf maliyetleri. Bu sarf malzemeleri maliyeti mukabil bir azalma elde% 60, bitki ekstresi ~ 800 L içeren tek bir pilot ölçekli bir grup için gerekli derinlik filtre sayısı azalır. pıhtılaştırma farklı bitki ekstreleri ve hücre kültürü homojenatlarında uygulanmıştır. Aynı flokülan Bu besleme stoklarının tüm etkili olmakla birlikte, polimer konsantrasyonu dağılmış parçacıklar farklı konsantrasyonlarda barındırmak üzere ayarlanabilir gerekiyordu. Etkili bir polimer belirlendikten sonra, buna ek olarak, süzme ve / veya santrifüj adımları farklı parçacık boyutu dağılımına 11 uyacak şekilde ayarlanması gerekebilir. Burada anlatılan yöntem kolayca diğer yem stoklarının adapte edilebilir ve aynı zamanda bu nedenle memeli hücre kültürlerinde ve gıda / yem üretim süreçleri için açıklama stratejilerinin geliştirilmesi bilim adamları ve mühendisler için geçerlidir olabilir. espbitki özleri karıştırma dinamikleri farklı çünkü mikroplak formatları 21, örneğin ile uyumsuz çapı 1 mm&#39;ye kadar olan parçacıkları içerebilir çünkü ecially bitki-temelli süreçler ara numune hacimleri yararlanacak nedeniyle damar çapı oranı bir partikül çapı burada önerdi süreç ölçeği temsil etmemektedir.

Bitkiler yaygın olarak meyve suları gibi gıda malları üretmek için kullanılır, ancak aynı zamanda daha yüksek değer biyofarmasötik ürünlerin 1-3 imalatı için platformlar olarak geliştirilebilir. Her iki durumda da, ayırma işlemleri (DSP) çoğu zaman partikül yüklü özler 4,5 açıklama takip yaprak ve meyveler gibi dokulardan sıvı ekstraksiyonu ile başlar. Biyofarmasötiklerle üretimi için, DSP maliyetleri toplam üretim maliyetlerinin 6,7 varan% 80&#39;ini ve kısmen bu tür bıçak tabanlı homojenizasyon 8,9 olarak yıkıcı yöntemlerle hazırlanan özleri yüksek parçacık yükü hediye yansıtır . Filtre tabakalarının rasyonel seçim filtre kapasitesini artırmak ve maliyetlerinden 10,11 azaltabilir özü partikül büyüklüğü dağılımını maç olmasına rağmen, iyileşme başına saklanmalıdır parçacıkların sayısına göre belirlenen mutlak kapasite tavanı aşan aslaFiltre alanının birim açıklama elde etmek. Daha az partiküller, filtrasyon tren, en iyi filtre yüzeyine ulaşması halinde tavan kaldırılabilir ve dağılmış parçacıklar geniş yumakları 12 oluşturmak üzere toplanmasını teşvik pıhtılaştırıcı maddeler olarak bilinen polimerler ile karıştırılır, bu elde edilebilir. Böyle yumaklar daha ince ve daha pahalı derinlik filtreleri ulaşan partikül yükünü azaltmak, kaba ve daha az pahalı torba filtreler daha da yukarı muhafaza edilebilir. Polimerler onlar iyi imalat uygulamaları (GMP) ile uyumlu olmalıdır biyoilaçlar için örneğin kendi uygulamaları için uygun güvenlik profiline sahip olmalı ve tipik olarak bir molar kütle&gt; 100 kDa olmalı ve nötr ya da 13 ücret ya. Nötr pıhtılaştırma genellikle agregasyonu ve çaplarda yumakların oluşumuna neden dağılmış parçacıklar çapraz bağlama ile hareket ise 1 mm 11 yüklü polimerler, d yükünü nötralize&gt;ispersed parçacıklar, bunların çözünürlüğünü azaltır ve dolayısıyla çökelmesine 14 neden olur. Flokülasyon ekstresi 15,16 özelliklerini eşleştirmek için, bir tampon, pH ve iletkenlik, ve polimer türü ya da konsantrasyon olarak parametrelerini ayarlayarak geliştirilebilir. Tütün 0.5-5.0 g L-1 polietilenimin (PEI) ile ön işleme tabi özler, derin filtre kapasitesinde daha fazla 2 misli artış için 100 L&#39;lik bir pilot ölçekli işlemde bildirilmiştir. Bu polimerin maliyeti daha az € 10 kg&#39;lık böylece sürecin içine giriş toplu 16 başına filtreleri ve sarf malzemeleri hakkında 6.000 € maliyet tasarrufu sonuçlandı hatta daha fazla zaman selüloz bazlı filtre yardımcıları 17 ile kombine -1 olduğunu. Öyle olsa bile, öngörü modellerinin içerme 15-30 dakika 16,18 arasında tutun adımlar gerektirir çünkü depolama için daha fazla yatırım maliyetlerine yol açan, flokülant a priori ekonomik yararlarını değerlendirmek için gerekli olantanklar. Ancak, flokülasyon karmaşık doğası bu tür deneylerin sonucunu tahmin edebilirsiniz hiçbir mekanik modeller şu anda vardır. Bu makalede açıklanan nedenle, daha uygun bir tasarım-of-deneyler (DoE) yaklaşımı 19 geliştirilmiştir. Genel DoE işlemi için bir protokol en son 20 yayınlanmıştır. Küçük ölçekli cihazları şimdi çökeltme şartları 21 yüksek verimli tarama için kullanılabilir. Reaksiyon kabı (~ 96 çukurlu bir levha üzerindeki kuyu 7 mm) ve parçacıklar veya yumakların boyutları birbirinden büyüklük sırasında daha az olabilir Ancak, bu cihazlar, gerçekçi bir bitkinin topaklaşma sırasında koşulların simüle edilmesi değil ayıklar. Bu nedenle desen ve model tahmin gücü karıştırma etkileyebilir. Ayrıca, bunun nedeni karıştırma davranışı ve çökelti sta doğrusal olmayan değişikliklere yağış içeren süreçleri küçültün zor olabilirbility 22. Bu nedenle, bu makale 100 L pilot ölçekli sürecine 16 ilk 20 ml&#39;lik reaksiyon hacmi ölçeklenebilir sonuçlar veren, günde 50-75 numune hacmi ile tezgah üstü ölçekli tarama sistemi özetliyor. Bir DoE yaklaşımı ile kombine edildiğinde, bu öngörü modelleri kalite-by-tasarım kavramının bir parçası olarak proses optimizasyonu ve belgeler için kullanılmasına izin verir. Aşağıda tarif edilen yöntem aynı zamanda pıhtılaştırma da maliyet tasarrufu aracı 23 olarak kabul edilmektedir hücre kültürü bazlı işlemler, üretilen biyofarmasötik adapte edilebilir. Kanola, mısır ve soya fasulyesi 24,25 üretilen β-glukuronidaz için gösterildiği gibi, aynı zamanda, bir saflaştırma stratejisinin bir parçası olarak, bir ham ekstreden hedef proteinlerin çökelmesini modellemek için de kullanılabilir. Flokülan özelliklerinin ayrıntılı bir açıklaması başka 16,26 bulunabilir ve sağlanması önemlidir polimer Concentrkus toksik olmayan ya da son ürün 11 zararlı seviyelerinin altında alınarak belirlenir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td style="width:195px;">Hach</td>
			<td style="width:119px;">4650000</td>
			<td style="width:272px;">Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2G12 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Polymun</td>
			<td style="width:119px;">AB002</td>
			<td>Reference antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">BP-410</td>
			<td style="width:195px;">Furh</td>
			<td style="width:119px;">2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Catiofast VSH</td>
			<td style="width:195px;">BASF</td>
			<td style="width:119px;">79002360</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424 000.410</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">2017106</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Chitosan</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">5375.1</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Design-Expert(R) 8</td>
			<td style="width:195px;">Stat-Ease, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">&#160;4984.3&#160;</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:195px;">Kammlott</td>
			<td style="width:119px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:195px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:195px;">Grodan</td>
			<td style="width:119px;">102446</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9105.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">K700P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">KS50P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Miracloth</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">475855-1R</td>
			<td>Filter cloth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">MultiLine Multi 3410 IDS</td>
			<td style="width:195px;">WTW</td>
			<td style="width:119px;">WTW_2020</td>
			<td>pH meter / conductivity meter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:195px;">Osram</td>
			<td style="width:119px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Phytotron</td>
			<td style="width:195px;">Ilka Zell</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Polymin P</td>
			<td style="width:195px;">BASF</td>
			<td style="width:119px;">79002360</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">POLYTRON PT 6100 D</td>
			<td style="width:195px;">Kinematica</td>
			<td style="width:119px;">11010110</td>
			<td>Homogenization device with custom blade tool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Protein A</td>
			<td style="width:195px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10-1006</td>
			<td>Antibody binding protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">P029.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Synergy HT</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SIAFRT</td>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TRIS</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">4855.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9127.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">VelaPad 60</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">ZEN3600</td>
			<td>DLS particle size distribution measurement</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Farklı polimerlerin tütün özü Flokülasyon Yukarıda tarif edilen yöntem, başarılı bir şekilde monoklonal bir antikor (HIV nötralize edici antikor 2G12) bir floresan proteini (DsRed) (Şekil 1) 16 üretimi sırasında tütün ekstraktlarının flokülasyon için bir işlem geliştirmek için kullanılmıştır, ve o zamandan beri aktarıldı lektinler, sıtma aşısı adayları ve füzyon proteinlerinin (yayınlanmamış veriler) dahil olmak üzere diğer proteinlere. Tipik olarak, pıhtılaştırma maddelerinin uygulama ~ 6,000 NTU (çekimi sonrası 10.000 NTU) için ~ 1,000 NTU torba filtreli bitki ekstresinin bulanıklık azalır. Ilk tarama deneyinde, bir 91-run IV-optimal tasarım (bu faktör flokülasyon verimliliği 13,27 etkiler çünkü) üç farklı konsantrasyonlarda 18 farklı polimerler test etmek için kullanıldı ve bir ~ 12 saat inkübasyon perio üzerinde flokülasyon gözlenenD (Şekil 2A ve B). Uzun kuluçka dönemi flokülasyon işlemi için anlamlı zaman dilimlerini belirlemek önemli olabilir. Bu gelecekteki süreçlerde ilgili olabilir, çünkü 4-8 Ayrıca pH değerleri nedeniyle belirli hedef proteinlerin 13,25,27,37 özelliklerine test edildi. 18 Test edilen polimerler arasında, altı 25 mS cm-1 arasında bir iletkenliğe sahip tipik bir ekstrelerinde torba filtre işleminden sonra ekstre bulanıklığı azaltmak için bulunmuştur. Model, 15-45 ms iletkenliği gibi ek işlem parametreleri de dahil olmak üzere daha sonra iki yineleme tüm etkili polimerler hariç ve rafine edilmiş cm-1 aralığı, 5-75 dakika ve 4-30 ° C sıcaklıkta bir kuluçka süresi, işlem şartlarının daha geniş bir aralığı için uygun modeller üretmek için. Modelin tahmin gücü son derece güvenilir bir modeli (Şekil 3A) ile sonuçlanan, her yineleme sonra artmıştır. </p<html> &gt; Dört tekrar, yüksek yüklü, katyonik ve dallı polimer PEI tütün ekstreleri içinde yayılan parçacıklar toplama için en etkili olduğu bulunmuştur. Ancak, bu polimerin verimlilik artırıcı özü iletkenlik düşmüştür. özellikleri molekül boyutu, yükü, yapı (dallı ya da doğrusal), yük yoğunluğu ve amin yer değiştirme derecesinin (primer, sekonder, tersiyer veya kuaterner) en büyük etkiye sahip DOE faktörler son iki parametre olarak test edilmiştir. Detayları başka yerlerde 16 bildirilmiştir. DoE sonuçlarından polimer özellikleri Bu bilgilere dayanarak, diğer beş polimerler, moleküler PEI benzer özelliklere (yük yoğunluğu&gt; meq g -1 ve dörtlü amin) ile seçildi. Bu beş polimerlerin bir yüksek iletkenlik (Şekil 3B) 11, daha fazla topaklaştırma verimi gösterdi. nt. &quot;fo: keep-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; DoE yaklaşımının bir parçası olarak, PEI&#39;lerin hiçbiri test koşullardan biri altında ürün kurtarma etkilenen teyit edildi Nitekim derinlik filtreleri kapasitesi sonradan kullanılan ~ ulaşan 3.2-5.7 kat artmıştır dağılmış katı maddeler geri kalan 110 LM kaldırma -2 filtre tipine bağlı olarak değişebilir. olan pıhtılaştırma maddelerinin uygulaması açıklama indirgenmiş Bu sonuçlar, aynı zamanda, bir 100 L&#39;lik bir pilot ölçekli işlemde doğrulanmıştır &gt;% 50 lı üretim maliyetleri ve ~% 20 toplam üretim maliyeti. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53940/53940fig2.jpg" /> Şekil 2: Çeşitli işlem koşulları altında farklı pıhtılaştırma maddelerinin Etkinliği (A). doğrudan flokülasyon ve çanta filtrasyon sonrası Özü örnekleri hala bulanık görünebilir. Birkaç saat yerleştikten sonra (B) türbiditesiAynı örnekler önemli ölçüde azaltılabilir. genişletilmiş tutma süreleri büyük ölçekli üretim süreçlerinde mümkün olmayabilir Ancak, filtrasyon hemen sonra elde edilen bulanıklık değerleri genellikle tercih edilir. Bunun yerine 50 ml tüpler altındaki berrak kırmızı bir sıvı ile gösterildiği gibi bir karıştırıcıda bir vidalı pres oluşturulacak bitki ekstreleri uygulandığında (C) Flokülasyon de etkilidir (kırmızı renk floresan protein DsRed varlığı nedeniyle ). Farklı pıhtılaştırma maddelerinin (D) karışımları da flokülasyon indükleyebilir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53940/53940fig3.jpg" /> Şekil 3:. Bir DoE yaklaşım kullanarak flokülasyon Modelleme (A) tahminler modeli polimerlerin sayısı arttıkça modelin doğruluğu işlem parametrelerinin sayısı t yükselmiştir rağmen arıtma için ilk tarama indirilmiştirbeş WO. Işlem parametrelerindeki bir değişikliği (on iletkenlik) bir sonucu olarak (b) (başka burada bir PEI) tipi polimer geçiş etkin partikül flokülasyon ve işlenmemiş kontrol özü (sabit kırmızı çizgi) göre düşük süzüntü, bulanıklık gelen tutar. A ve B Hata çubukları öngörüleri standart sapmalarını gösterir. Kesik kırmızı çizgiler olmayan işlemden geçirilmiş ekstraktı (n = 10) standart sapmalarını göstermektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53940/53940fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> tütün flokülasyon vidalı pres ile hazırlanan özleri Flokülasyon sonuçları mm boyutu aralığı içinde daha fazla, daha az dağılmış parçacıklar oluşturulan bir vida-baskı, ile hazırlanmış olan bir homojenleştirici ile hazırlanan tütün ekstreleri aktarılmıştırum büyüklük aralığı içindeki parçacıklar. 29 işletilen IV uygun tasarımda, PEI de benzer bir konsantrasyon aralığında, ekstrenin bu tür hedef proteinlerin geri (Şekil 2C) etkilenmediğini etkili olduğu gösterilmiştir. Bu gösterir: (i) işlem gelişimi sırasında zaman tasarrufu, diğer besleme stoklarının transfer ölçüde olabilir besleme stokunun bir tür için belirlenen bu flokülasyon koşulları, ve (ii) DoE stratejisi değil, sadece bu aktarılabilirliği teyit etmek için kullanılabileceğini tüm tasarım alanı üzerinde ancak tek tek işlem koşulları. Flokülant karışımları ile flokülasyon deneyleri Pıhtılaştırma kombinasyonları nedeniyle parçacıklar 12 arasında daha gelişmiş köprüleme tek polimerler, örneğin daha etkili olabilir. Bu nedenle, yöntem, yukarıdaki iki polimerlerin ilave edilmesi (karşılamak üzere uyarlanmış tarifedilene3.2) 26. Üç olmayan sentetik polimerler birbirleri ile kombinasyon halinde, tek başına veya test PEI ile bir araya getirilmiştir. Tütün özleri en verimli flokülasyon yalnız PEI ile elde edilmiş, ancak PEI ve kitosan ya da polifosfatlar bir arada gerekli PEI konsantrasyonunu azaltabilir. Ayrıca, DoE yaklaşımı olarak, böylece yağış nedeniyle örneğin PEI hedef proteini ile uyumsuz süreçler, optimal flokülasyon koşulları tanımlamak için yardımcı (veya kitosan ve polifosfatlar olmadan) PEI atlayarak zaman bize en etkili polimer kombinasyonlarına belirlemek için izin βglucuronidase 24,25 için rapor edilmiştir. Ayrıca, DoE hiçbir mekanik modeli mevcut olduğu için karmaşık bir tasarım alanı (Şekil 2B) karakterize başardı. Mümkün olduğunu DoE yazılımının ANOVA araçları kullanılarak güvenilir öngörü modelleri ve kötü değerlendirildi meslektaşları (Şekil 4) ayırt etmek.

Watch this Scientific Journal Video about Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts at JoVE.com

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Prosedür bitki özleri gelen Dağınık Parçacıkların çıkarması için Flokülantlar Verimliliği değerlendirin

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

procedure-to-evaluate-efficiency-flocculants-for-removal-dispersed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Görüntüleme.  Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.. The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Video: Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which include many crops such as cabbage, broccoli, Brussel sprouts etc. Rearing of the insects takes place on cabbage plants in the greenhouse. At least two cages are needed for the rearing of Pieris rapae. One for the larvae and the other to contain the adults, the butterflies. In order to investigate the role of plant hormones and toxic plant chemicals in resistance to this insect pest, we demonstrate two experiments. First, determination of the role of jasmonic acid (JA - a plant hormone often indicated in resistance to insects) in resistance to the chewing insect Pieris rapae. Caterpillar growth can be compared on wild-type and mutant plants impaired in production of JA. This experiment is considered "No Choice", because larvae are forced to subsist on a single plant which synthesizes or is deficient in JA. Second, we demonstrate an experiment that investigates the role of glucosinolates, which are used as oviposition (egg-laying) signals. Here, we use WT and mutant Arabidopsis impaired in glucosinolate production in a "Choice" experiment in which female butterflies are allowed to choose to lay their eggs on plants of either genotype. This video demonstrates the experimental setup for both assays as well as representative results.

Plant resistance to chewing insect herbivores can be tested in several ways. Here, we demonstrate how to set-up a choice and a no-choice experiment with the model plant Arabidopsis thaliana to identify resistance against the pest species Pieris rapae.

Çiğneme Böcekler A. thaliana Direnç Test seçimi ve No-Choice Tahliller

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Biyoloji

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Mikroenjeksiyon kullanarak Yaprak bitleri Viral İletim Fizyolojik Engelleri Test

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murin Böbrek Nakli Prosedürü

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Wild-tip ve Süs Çeşitler arasında ayırt A PCR tabanlı Genotiplendirme Yöntemi Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Antik Biyolojik Topluluklar barındırmıştır İç Araştırma Dondurulmuş Çekirdek dış bölümünden Eksojen Malzeme Kaldırma

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...