I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

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L&#39;autore non ha conflitti di interesse da dichiarare.

L&#39;aspetto più importante da considerare quando si imposta un DoE per caratterizzare flocculazione delle particelle è che il design deve in linea di principio essere in grado di individuare e descrivere gli effetti attesi o possibili 36,38, come ad esempio l&#39;influenza del pH, tipo di polimero e la concentrazione di polimero 16. Pertanto, è importante valutare la frazione di spazio di progettazione (FDS) prima di iniziare gli esperimenti reali. L&#39;FDS è la frazione di spazio sperimentale multidimensionale (coperto dai fattori di progetto, ad esempio pH) all&#39;interno del quale è possibile rilevare le differenze pre-definiti tra due risultati sperimentali che un sistema di variabilità noto, ad esempio rilevando una differenza di torbidità 250 NTU dato una variabilità di 125 NTU. La FDS può essere aumentata aumentando il design con prove aggiuntive e dovrebbe essere ≥0.95 per progetti destinati a guidare il controllo di processo 36. Inoltre, se il numero di corse non consente tegli intero esperimento da effettuare in un solo giorno, blocchi dovrebbero essere pre-definiti nel DoE per spiegare lotto a lotto e variabilità giorno per giorno. Quando si lavora con materiale vegetale, l&#39;inclusione di riferimento viene eseguito in ogni blocco (ad esempio, i controlli non trattati) aiuta a compensare la variabilità, che consente la comparazione dei dati provenienti da diverse corse ogni normalizzati per la loro corsa di riferimento corrispondente. In questo contesto, aumentando il numero di corse ripetute nel DoE è anche utile. Quando un gran numero di polimeri sono proiettati, è consigliabile utilizzare le singole proprietà flocculanti, densità di esempio carica e massa molecolare, come fattori numerici discreti piuttosto che i polimeri stessi fattori come categoriali. Questo riduce il numero di esperimenti perché disegni sperimentali spesso bisogno di essere replicati per i fattori categoriali, mentre ulteriori livelli di fattori numerici solo bisogno di un piccolo numero di corse in più. L&#39;aria informazionitenda dell&#39;esperimento aumenta e permette l&#39;identificazione di proprietà dei polimeri che migliorano flocculazione, ad esempio una alta densità di carica come si trova negli esperimenti qui descritti. Disegni CCD e RSM sperimentale sono utili per stabilire modelli ad alto potere predittivo, consentendo l&#39;individuazione di condizioni di lavorazione robuste (ad esempio, per guidare il controllo di processo) e sono in genere utilizzati per seguire i disegni di screening. Se il numero di fattori e fattori livelli sotto risultati investigativi DoE con più di 400 singoli esperimenti, può essere consigliabile ridurre il numero di livelli di fattore o passare ad altri tipi di progettazione poiché il numero di campioni che possono essere facilmente trattato con la tecnica qui presentata è limitato a ~ 100 al giorno. Da un punto di vista sperimentale, polimeri devono rimanere stabili nelle condizioni sperimentali selezionati, ad esempio, essi non devono depolimerizzano a pH basso. Una preparazione accurata del flocculantescorte in termini di concentrazione è anche necessario per ottenere risultati riproducibili e modelli di alta qualità. In questo contesto, il flocculante può essere necessario pretrattati, ad es volte o regolazione del pH gonfiore per chitina, per garantire la completa solubilizzazione, e quindi di ottenere una soluzione omogenea. Altamente scorte viscosi dovrebbero essere evitati, perché questo può causare errori di pipettamento quando si trasferisce il polimero all&#39;estratto. Molti polimeri possono avere un forte effetto tampone e le scorte hanno valori di pH estremi, ad esempio, pH ~ 9,5 per l&#39;8% [w / v] PEI. Questo può influenzare il pH dell&#39;estratto se gli stock non sono pre-regolati e verrà falsare i risultati sperimentali. Ad esempio, se flocculazione è più efficace a pH elevato e un non-pH regolato PEI archivio viene utilizzata poi un DoE potrebbe suggerire che alte concentrazioni di PEI sono più efficaci. Tuttavia, questo effetto sarà causata dal maggiore pH causato dalla maggior volume di magazzino che è stata aggiunta, non dalle maggiori pe concentrazione di polimeroR SE. Le concentrazioni rotabile utilizzato dovrebbe somigliare a quelli utilizzati in applicazioni su larga scala per evitare differenti effetti di diluizione tra le scale che possono influenzare la concentrazione di particelle e quindi flocculazione. Alcuni flocculanti a base di argilla come il caolino contengono un gran numero di particelle fini stessi che può mascherare l&#39;effetto flocculazione, ad esempio riduzione torbidità dopo filtrazione iniziale, e altre risposte dovrebbero essere selezionati per valutare l&#39;efficacia di queste sostanze, ad esempio capacità del filtro a valle. Per l&#39;analisi dei dati, è importante valutare i risultati raccolti in termini di valori estremi, disallineamenti e la coerenza generale, ad esempio, valori estremi possono indicare un errore di copia-incolla, un cambiamento nella posizione decimale o un malfunzionamento di dispositivi analitici attrezzature /. Un&#39;analisi approfondita farà in modo che solo i dati di alta qualità vengono utilizzati per la creazione del modello. Durante la costruzione di un modello che è importante valutare costantemente °e ampio set di indicatori di qualità forniti dal software DoE. I criteri di base sono la R 2, regolato R 2 e previsti R 2 valori, ma residui normali, residui-vs-run ed effettiva-vs-previsti trame (Figura 4) sono ancora più importanti perché forniscono informazioni su ogni corsa nel un esperimento piuttosto che un parametro somma. Inoltre, la coerenza del modello finale e le sue previsioni con i meccanismi noti di flocculazione devono sempre essere esaminati. Le principali differenze tra le previsioni e le aspettative scientifiche può verificarsi a causa modelli DoE sono solo descrittive piuttosto che meccanicistico, modelli ad esempio, possono prevedere i valori estremi ai bordi di uno spazio di design che riflette l&#39;uso di algoritmi di adattamento polinomiale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53940/53940fig4.jpg" /> Figura 4:. Indicatori di qualità dei modelli DoE Il noplot rmal di residui studentizzati dovrebbe assomigliare ad una linea retta il più possibile (A) con solo piccole deviazioni (frecce verdi) accettabili per i modelli di alta qualità. Un aspetto curvo (C) con deviazioni forti (frecce rosse) dalla linea ideale (rosso) indica un modello povero, ad esempio, a causa della mancanza fattori significativi. In definitiva, il predetto e valori sperimentali (effettivo) deve corrispondere (B) e ancora una volta seguire una linea retta. Deviazioni dalla linea ideale (cerchio rosso e la linea tratteggiata) indicano poveri previsioni basate su modelli (D). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53940/53940fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> L&#39;approccio DoE può aiutare a caratterizzare flocculazione in scorte di mangimi complessi come estratti di piante, anche se non ci sono dati esistenti. La flocculazione degli estratti di tabacco è stato ottimizzato con un carico di lavoro di 2 siamoeks ei costi di consumo di ~ 500 €. Questo ha ridotto il numero di filtri di profondità necessari per un singolo lotto scala pilota che coinvolge ~ 800 L di estratto vegetale del 60%, che ha raggiunto una corrispondente riduzione dei costi di consumo. I flocculanti sono stati applicati anche ai diversi estratti di piante e di omogenati di coltura cellulare. Anche se lo stesso flocculante è efficace per tutte queste scorte di mangimi, la concentrazione del polimero doveva essere adeguati per accogliere le diverse concentrazioni di particelle disperse. Inoltre, una volta un polimero efficace è stato identificato, potrebbe essere necessario regolare in modo che corrisponda la distribuzione delle dimensioni delle particelle differenti 11 le fasi di filtrazione e / o centrifugazione. Il metodo descritto qui può essere facilmente adattato ad altre scorte di mangimi ed è quindi rilevante anche per gli scienziati e gli ingegneri di sviluppo strategie di chiarimento per colture cellulari di mammifero e dei processi di produzione degli alimenti / dei mangimi. Especially processi a base di piante potranno beneficiare dei volumi di campione intermedi suggerito qui perché estratti vegetali possono contenere particelle fino a 1 mm di diametro, che sono incompatibili con i formati di micropiastre 21, ad esempio, perché le dinamiche di miscelazione differiscono a causa di un diametro delle particelle in rapporto al diametro del vaso che non è rappresentativo della scala processo.

Le piante sono ampiamente utilizzati per la produzione di prodotti alimentari quali succhi di frutta, ma possono anche essere sviluppati come piattaforme per la fabbricazione di maggior valore biofarmaceutici 1-3. In entrambi i casi, la lavorazione a valle (DSP) spesso inizia con l&#39;estrazione di liquidi dai tessuti come foglie o frutti, seguita dalla chiarificazione di estratti di particelle cariche 4,5. Per la fabbricazione dei prodotti biofarmaceutici, i costi di DSP possono rappresentare fino al 80% dei costi di produzione complessivi 6,7 e ciò in parte riflette l&#39;alta pressione di particelle presenti negli estratti preparati con metodi di disturbo come omogeneizzazione blade basato 8,9 . Sebbene la scelta razionale di strati filtranti per abbinare la distribuzione granulometrica nell&#39;estratto può aumentare la capacità filtrante e ridurre i costi 10,11, il miglioramento può non superare il limite di capacità di assoluta definito dal numero di particelle che devono essere conservati perunità di superficie filtrante per ottenere chiarimenti. Il soffitto può essere sollevato se meno particelle raggiungono la superficie dei migliori filtri nel treno filtrazione, e questo può essere raggiunto se particelle disperse sono miscelati con polimeri noti come flocculanti che promuovono l&#39;aggregazione a formare grandi flocculi 12. Tali fiocchi possono essere conservati più a monte da filtri a maniche grossolane e meno costosi, riducendo il carico di particelle di raggiungere il più fine e filtri di profondità più costosi. I polimeri devono avere profili di sicurezza adeguati per le loro applicazioni, ad esempio per prodotti biofarmaceutici devono essere conformi alle buone pratiche di fabbricazione (GMP), e in genere devono avere un molare di massa&gt; 100 kDa e possono essere sia neutro o addebitato 13. Considerando flocculanti neutri genere agiscono mediante reticolazione particelle disperse causando la loro aggregazione e la formazione dei fiocchi di diametro&gt; 1 mm 11, polimeri applicati neutralizzare la carica di dparticelle ispersed, riducendo la loro solubilità e provocando così la precipitazione 14. Flocculazione può essere migliorata regolando parametri quali tampone di pH o conducibilità, e il tipo di polimero o di concentrazione, in base alle proprietà dell&#39;estratto 15,16. Per gli estratti di tabacco pretrattati con 0,5-5,0 g L -1 polietilenimmina (PEI), un incremento maggiore di 2 volte della capacità di filtro di profondità è stato segnalato in un processo su scala pilota 100-L. Il costo di questo polimero è inferiore a 10 kg -1 così la sua introduzione nel processo portato a risparmi di costo di circa € 6.000 per filtri e materiali di consumo per lotto 16 o anche di più se combinato con filtro a base di cellulosa aiuti 17. Anche così, modelli predittivi sono necessari per valutare i benefici economici a priori flocculanti perché la loro inclusione può richiedere fasi di attesa di 15-30 min 16,18, con conseguente ulteriore costi di investimento per lo stoccaggiocarri armati. Tuttavia, attualmente non esistono modelli meccanicistici disponibili che possono predire l&#39;esito di tali esperimenti a causa della natura complessa di flocculazione. Pertanto, un approccio 19 esperimenti progettazione di-più appropriati (DoE) è stato sviluppato come descritto in questo articolo. Un protocollo per la procedura generale DoE è stato recentemente pubblicato 20. Dispositivi di piccole dimensioni sono ora disponibili per l&#39;high-throughput screening di condizioni di flocculazione 21. Tuttavia, questi dispositivi non possono realisticamente simulare le condizioni durante la flocculazione di estratti vegetali perché le dimensioni del recipiente di reazione (~ 7 mm per pozzetti su una piastra a 96 pozzetti) e le particelle o fiocchi possono essere inferiore ad un ordine di grandezza a parte. Questo può influenzare i modelli e quindi il potere predittivo del modello di miscelazione. Inoltre, può essere difficile per scalare i processi che coinvolgono precipitazioni dovute a variazioni non lineari nel comportamento di miscelazione e precipitato stabilità 22. Pertanto, questo articolo illustra un sistema di screening banco scala con una portata di 50-75 campioni al giorno, producendo risultati che sono scalabile dal volume iniziale reazione 20 ml ad un processo su scala pilota 100 L 16. Quando combinato con un approccio DoE, questo permette ai modelli predittivi da utilizzare per l&#39;ottimizzazione del processo e la documentazione come parte di un concetto di qualità by design. Il metodo descritto di seguito può anche essere adattato alle biofarmaceutici prodotte nei processi basati su colture cellulari, in cui flocculanti sono anche essere considerato come uno strumento di risparmio di costi 23. Può anche essere usata per modellare la precipitazione delle proteine ​​target da un estratto grezzo come parte di una strategia di purificazione, come dimostrato per β-glucuronidasi prodotto in canola, soia e granoturco 24,25. Una descrizione dettagliata delle proprietà flocculanti può essere trovato altrove 16,26 ed è importante per garantire che il polimero Concni sono o non tossici o nocivi di sotto dei livelli nel prodotto finale 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td style="width:195px;">Hach</td>
			<td style="width:119px;">4650000</td>
			<td style="width:272px;">Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2G12 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Polymun</td>
			<td style="width:119px;">AB002</td>
			<td>Reference antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">BP-410</td>
			<td style="width:195px;">Furh</td>
			<td style="width:119px;">2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Catiofast VSH</td>
			<td style="width:195px;">BASF</td>
			<td style="width:119px;">79002360</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424 000.410</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">2017106</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Chitosan</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">5375.1</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Design-Expert(R) 8</td>
			<td style="width:195px;">Stat-Ease, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">&#160;4984.3&#160;</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:195px;">Kammlott</td>
			<td style="width:119px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:195px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:195px;">Grodan</td>
			<td style="width:119px;">102446</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9105.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">K700P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">KS50P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Miracloth</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">475855-1R</td>
			<td>Filter cloth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">MultiLine Multi 3410 IDS</td>
			<td style="width:195px;">WTW</td>
			<td style="width:119px;">WTW_2020</td>
			<td>pH meter / conductivity meter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:195px;">Osram</td>
			<td style="width:119px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Phytotron</td>
			<td style="width:195px;">Ilka Zell</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Polymin P</td>
			<td style="width:195px;">BASF</td>
			<td style="width:119px;">79002360</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">POLYTRON PT 6100 D</td>
			<td style="width:195px;">Kinematica</td>
			<td style="width:119px;">11010110</td>
			<td>Homogenization device with custom blade tool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Protein A</td>
			<td style="width:195px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10-1006</td>
			<td>Antibody binding protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">P029.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Synergy HT</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SIAFRT</td>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TRIS</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">4855.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9127.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">VelaPad 60</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">ZEN3600</td>
			<td>DLS particle size distribution measurement</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

Flocculazione di estratto di tabacco con diversi polimeri Il metodo sopra descritto è stato usato con successo per sviluppare un processo per la flocculazione di estratti di tabacco durante la produzione di un anticorpo monoclonale (anticorpi HIV-neutralizzanti 2G12) e una proteina fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, e da allora è stato trasferito ad altre proteine, tra cui lectine, malaria candidati vaccini e proteine ​​di fusione (dati non pubblicati). Tipicamente, l&#39;applicazione di flocculanti ridotto la torbidità di estratto vegetale sacchetto-filtro da ~ 6000 NTU (10.000 NTU dopo estrazione) a ~ 1.000 NTU. In un esperimento screening iniziale, un disegno 91-run IV-ottimale è stato usato per testare 18 diversi polimeri in tre diverse concentrazioni (perché questo fattore influisce efficienza flocculazione 13,27) e osservato flocculazione su uno ~ 12 ore di incubazione period (Figura 2A e B). Il periodo di incubazione può essere importante identificare tempi significativi per il processo di flocculazione. Anche valori di pH di 4-8 sono stati testati in quanto questi possono essere rilevanti nei processi futuri a causa delle proprietà di specifiche proteine ​​bersaglio 13,25,27,37. Tra i 18 polimeri testati, sei sono stati trovati per ridurre la torbidità estratto dopo la filtrazione bag in estratti tipici con conducibilità 25 ms cm -1. Il modello è stato affinato escludendo tutti i polimeri inefficaci in due iterazioni e quindi inclusi i parametri di processo aggiuntivi, come conduttività nelle 15-45 mS cm -1 gamma, un tempo di incubazione di 5-75 min e temperature di 4-30 ° C, generare modelli adatti per una vasta gamma di condizioni di processo. Il potere predittivo del modello incrementato dopo ogni iterazione, con un conseguente altamente affidabile modello (Figura 3A). </p<html> &gt; Dopo quattro iterazioni, cationico fortemente carica e polimero ramificato PEI è risultato essere il più efficiente per l&#39;aggregazione delle particelle disperse in estratti di tabacco. Tuttavia, l&#39;efficienza di questo polimero è diminuita con l&#39;aumentare estratto di conducibilità. Le proprietà di dimensione molecola, di carica, la struttura (ramificato o lineare), densità di carica e grado di sostituzione ammina (primaria, secondaria, terziaria o quaternaria) sono stati testati come fattori in un DoE e gli ultimi due parametri ha avuto il più grande effetto. I dettagli sono stati riportati altrove 16. Sulla base di questa conoscenza delle proprietà dei polimeri dai risultati DoE, altri cinque polimeri sono stati selezionati con caratteristiche molecolari simili a PEI (densità di carica&gt; meq g -1 e ammine quaternario). Uno di questi cinque polimeri hanno dimostrato una maggiore efficienza flocculazione a conducibilità superiori (figura 3b) 11. nt. &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Come parte dell&#39;approccio DoE, è stato confermato che nessuno dei Peis colpito di recupero del prodotto in alcuna delle condizioni testate, infatti la capacità di filtri di profondità utilizzato successivamente per rimuovere restante solidi dispersi aumentato di un fattore di 3,2-5,7, raggiungendo ~ 110 L m -2 a seconda del tipo di filtro. Questi risultati sono stati confermati anche in un processo su scala pilota 100 L, a cui l&#39;applicazione di flocculanti ridotto il chiarimento i costi di produzione -related di&gt; 50% e il totale dei costi di produzione di ~ 20%. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53940/53940fig2.jpg" /> Figura 2: rendimento di diverse flocculanti in condizioni di processo diverse (A). Estrarre i campioni subito dopo flocculazione e filtrazione a sacco possono ancora apparire torbida. (B) Dopo decantazione per diverse ore, la torbidità dellastessi campioni possono essere ridotti in modo significativo. Tuttavia, i valori di torbidità ottenuti subito dopo la filtrazione sono spesso preferibili perché i tempi di attesa prolungati potrebbe non essere possibile in processi di produzione su larga scala. (C) flocculazione è efficace anche quando applicato ad estratti di piante generate con una pressa a vite, invece di un miscelatore come indicato dal liquido rosso chiaro al fondo delle provette 50 ml (il colore rosso è dovuto alla presenza della proteina fluorescente DsRed ). (D) miscele di diversi flocculanti possono anche indurre flocculazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53940/53940fig3.jpg" /> Figura 3:. Modellazione flocculazione utilizzando un approccio DoE (A) La precisione del modello predizioni aumentato il numero di polimeri nel modello è stato ridotto da screening iniziale all&#39;affinamento anche se il numero di parametri di processo aumentata da two a cinque. (B) di commutazione del tipo di polimero (qui da un PEI all&#39;altro) in conseguenza di una variazione dei parametri di processo (qui conducibilità) mantiene flocculazione delle particelle efficiente e corrispondente bassa torbidità filtrato rispetto all&#39;estratto di controllo non trattato (solido linea rossa). Le barre di errore in A e B indicano deviazioni standard delle previsioni dei modelli. Linee rosse tratteggiate indicano deviazioni standard di estratto non trattato (n = 10). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53940/53940fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Flocculazione di tabacco estratti preparati con una pressa a vite I risultati flocculazione sono stati trasferiti da estratti di tabacco preparati con un omogeneizzatore a quelli preparati con una pressa a vite, che ha generato meno particelle disperse nella gamma di dimensioni mm ma piùparticelle nella gamma di dimensioni micron. In un 29-run disegno IV-ottimale, è stato dimostrato che PEI è anche efficace per questo tipo di estratto in un intervallo di concentrazione simile e che il recupero di proteine ​​bersaglio non è influenzata (Figura 2C). Questa mostra (i) che le condizioni di flocculazione identificati per un tipo di scorta di alimentazione può essere in qualche modo trasferito ad altre scorte di mangimi, risparmiando tempo durante il processo di sviluppo, e (ii) che la strategia DoE può essere utilizzato per confermare la trasferibilità non solo per condizioni di processo individuali, ma su tutto lo spazio di progettazione. esperimenti di flocculazione con miscele flocculante Combinazioni di flocculanti può essere più efficace di singoli polimeri, ad esempio a causa di più avanzata ponte tra le particelle 12. Pertanto, il metodo sopra descritto è stato adattato per ospitare l&#39;aggiunta di due polimeri (3.2) 26. Tre polimeri non-sintetici sono stati testati soli, in combinazione tra loro o combinati con PEI. La flocculazione più efficiente di estratti di tabacco è stato ottenuto con PEI sola, ma una combinazione di PEI e chitosano o polifosfati può ridurre la concentrazione di PEI richiesto. Inoltre, l&#39;approccio DoE ha permesso di individuare le combinazioni di polimeri più efficaci quando omettendo PEI (con o senza chitosano e polifosfati), contribuendo così a definire le condizioni di flocculazione ottimali nei processi in cui Pei è incompatibile con la proteina bersaglio, ad esempio a causa di precipitazioni, come riportato per βglucuronidase 24,25. Inoltre, il DoE è stato in grado di caratterizzare uno spazio disegno complesso per il quale non modello meccanicistico era disponibile (Figura 2D). Utilizzando gli strumenti ANOVA del software DoE era possibile distinguere tra modelli predittivi affidabili e controparti mal valutati (Figura 4).

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Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedura per valutare l&#39;efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

procedure-to-evaluate-efficiency-flocculants-for-removal-dispersed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.. The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Video: Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which include many crops such as cabbage, broccoli, Brussel sprouts etc. Rearing of the insects takes place on cabbage plants in the greenhouse. At least two cages are needed for the rearing of Pieris rapae. One for the larvae and the other to contain the adults, the butterflies. In order to investigate the role of plant hormones and toxic plant chemicals in resistance to this insect pest, we demonstrate two experiments. First, determination of the role of jasmonic acid (JA - a plant hormone often indicated in resistance to insects) in resistance to the chewing insect Pieris rapae. Caterpillar growth can be compared on wild-type and mutant plants impaired in production of JA. This experiment is considered "No Choice", because larvae are forced to subsist on a single plant which synthesizes or is deficient in JA. Second, we demonstrate an experiment that investigates the role of glucosinolates, which are used as oviposition (egg-laying) signals. Here, we use WT and mutant Arabidopsis impaired in glucosinolate production in a "Choice" experiment in which female butterflies are allowed to choose to lay their eggs on plants of either genotype. This video demonstrates the experimental setup for both assays as well as representative results.

Plant resistance to chewing insect herbivores can be tested in several ways. Here, we demonstrate how to set-up a choice and a no-choice experiment with the model plant Arabidopsis thaliana to identify resistance against the pest species Pieris rapae.

I dosaggi scelta e No-scelta per il test della resistenza di Arabidopsis thaliana per Insetti da masticare

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Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

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Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

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A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

A PCR-based metodo di genotipizzazione di distinguere tra le varietà selvatiche di tipo ornamentale e di Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...