Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Fran&#231;aise contre les Myopathies T&#233;l&#233;thon (AFM-T&#233;l&#233;thon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Fran&#231;aises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Universit&#233; Paris Diderot and the ''Who Am I?'' Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ''Investments for the Future'' program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.

<ol>
	<li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells.">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors.">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li><li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+differentiation:+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators.">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li><li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates.">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li><li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+determination+and+differentiation:+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context.">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li><li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development.">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li><li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis:+a+review.">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li><li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding,+interacting+proteins,+and+post-transcriptional+modifications.">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li><li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circuitry+of+a+master+switch:+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription.">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li><li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1/2+fibroblasts+to+myoblasts.">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li><li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis.">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li><li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1.">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li><li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation.">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li><li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1:+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation.">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li><li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes.">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li><li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity.">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li><li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1,+G9a,+GLP,+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex.">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li><li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a.">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics.">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li><li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts.">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li><li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation.">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li><li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SWI/SNF+subunit/tumor+suppressor+BAF47/INI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation.">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858 (2014).</li><li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes.">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation.">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modification+and+muscle+differentiation.">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li><li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation.">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li><li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicases+p68/p72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation.">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li><li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1/Prep1.">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li><li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWI/SNF+complexes,+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis:+it's+time+to+exchange!.">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!.</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li><li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts.">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

sunulan yöntem, bir transkripsiyon faktörü, myod ortaklarından ayrıntılı tanımlanmasına izin verir. Bu MyoD kaynaklı farklılaşması, yani HeLa-S3 hücreleri dirençli bir heterolog sistemde MyoD ortakları saptandı. Böylece, tanımı gereği, belirlenen MyoD ortakları yayg ifade edilmiştir. Bu genel sekansa özel kopyalama faktörleri, kromatin değiştirici enzimler, RNA işleme proteinleri kinazlar (Tablo 1 ve 2) içerir. HeLa-S3 hücreleri MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dirençli olduğu için, MyoD etkinliği esas olarak baskı ve tespit ortakları MyoD eş baskılayıcılar olması muhtemeldir. Bu MyoD transaktivasyon yeteneği 8 inhibe ettiği bilinen Id proteini (Tablo 1 ve 2, Şekil 2), varlığı ile vurgulanır. Önemlisi, bu tür baskıcı devlet miyoblastları çoğalan içinde MyoD durumunu gösterir. Gerçekten de, CBFβ bir MyoD o MyoD etkileşimleri teyittarif edilen yöntemle tanımlanmış olan ortak C2C12 miyoblastlar çoğalan tespit edilebilir, ancak hücre (Şekil 3D bakınız) farklılaşma uygulandı kaybolur. Bununla birlikte, sunulan yöntemin önemli sorunlardan biri MyoD ko-aktivatörler tanımlama olmaması dikkat etmek önemlidir. Sürekli böyle histon olarak bilinen MyoD eş-aktivatörleri, bu yöntem hiçbiri kullanılarak 32 tespit edilmiştir asetiltransferazlar. MyoD komplekslerinin saflaştırılması çekirdeğinde veya kromatin zenginleştirilmiş fraksiyonu (zenginleştirilmiş nucleosome, NE) (Şekil 1A) çözünür fraksiyon (ekstrakte nükleer tuz, SE) en az iki büyük fonksiyonu vardır ya. Birincisi, böyle bir fraksiyon MyoD arıtma toplam nükleer özlerinden yapıldığı takdirde maskeli olacağını olmayan stokiyometrik ortakların temsil artırır. İkincisi, bu myod iki fonksiyonel alt popülasyonlarının ayrılması izin verir: Önceden yatırılır / EVICted (SE) ve kromatin bağlı (NE). Proteinlerin yanı sıra bazı kromatin remodelers tespit edilmiştir (Şekil 2) trafiğe DNA bağlanmamış MyoD, birçok kinazlar, transkripsiyon faktörleri için özel interactors arasında yer almaktadır. tamamen valide, böyle bir ağ DNA ilişkisiz myod aktivitesi düzenleme moduna bir fikir verebilir. kütle spektrometresi ile bu iki nükleer bölümlerinde MyoD post-translasyonel modifikasyonlar için ek arama, daha MyoD etkinlik düzenleme çözülmeye başladı. Son olarak, bir gliserol gradyanı üzerinde çözünür ve kromatin bağlı MyoD komplekslerinin fraksiyonlama kromatin bağlı MyoD ağırlıklı bir kompleks olarak bulunur, DNA-bağlı olmayan MyoD üç alt kompleksleri (Şekil 1B) dağıtılır olduğunu ortaya çıkarmıştır. MS ve / veya protein adaylarına karşı western blot ya da bu alt-komplekslerinin karakterizasyonu daha MyoD düzenleme modu aydınlatmak gerekir. Yukarıda da vurgulandığı gibi, HeLa hücreleri doğal olarak Expre yokss kas transkripsiyon faktörü MyoD. Iskelet kası modelinde bulunan etkileşimleri (Şekil 3) Onaylamak için önemli hale geldi. Myod ve sunulan TAP-etiket deneyinde tespit ortaklarından bazıları arasında böyle fonksiyonel etkileşimler ilgili modellerinde teyit birçok raporlar. Bu, örneğin prohibitin 33 DDX17 34, Meis1 35 CBF 27 HP1 26 ve SWI / SNF kromatin remodeling kompleksi 36,28,30 için geçerlidir. Böyle hassas MS kombine miyoblastların gelen hücrelerin, düşük miktarda bu tür TAP-etiket saflaştırma gerçekleştirmek mümkün olduğunu unutmayın. Nitekim, son kağıt miyoblastların 30 Flag-etiketli myod uyanlabilir ifadesinden sonra MyoD ortakları karakterizasyonu nitelendirdi. Miyoblastların istikrarlı ve sürekli MyoD overekspresyonu zararlı olduğundan, alternatif bir yaklaşım miyoblastların endojen MyoD alel (ler) içine Bayrak-HA etiketleri ekleyerek olacaktırBöyle CRISPR-Cas9 31 olarak genom düzenleme yöntemleri kullanarak. Özellikle, etiket (ler) ilave potansiyel dikkatle seçilmelidir etiket (N- ya da C-ucu) bu nedenle bir yerde, bağlayıcı partnerleri protein fonksiyonu ve / veya esas değiştirebilir. İlgili sistemde füzyon proteininin bir fonksiyonel tahlil etiketli protein fonksiyonel olmasını sağlamak için önce TAP-etiket saflaştırma yapılmalıdır. Endojen proteinlerin immünopresipitasyonu, bu problemleri, ancak nadiren kullanılabilir spesifik yüksek afinite antikor, mevcudiyetine dayanır önler. tarif edilen yöntemin diğer bir katma değer saflaştırılmış proteinin kendisinin ve bol ortaklarının (PTMS) post-translasyonel modifikasyonları teşhis etmek üzere bir olasılıktır. Böylece, bu özelliği ile TAP-etiket arıtma sadece yeni etkileşim ortakları değil, aynı zamanda faiz ve / veya ortaklarının proteine ​​bağlı yeni enzimatik işlevler tanımlamak için uygundur. İçindeBir kromatin bağlama proteini (örn., transkripsiyon faktörleri, enzimler) durumunda, bu yöntem bu şekilde bağlantılı &quot;histon kodu&quot; tanımlanması için uyarlanmıştır. Gerçekten de, nükleozom yüzeye maruz kalan amino terminal histon kuyrukları, birden fazla kovalent PTMS tabidir. Histon PTMS katılan nükleozom için benzersiz bir imza görüşmek. histon N-terminal kuyrukları farklı modifikasyonlar kombinasyonu böylece gen ifadesi regülasyonu sağlamak için kromatin yapısını değiştirebilir. Böylece, rolleri ve çalışılan kromatin-bağlayıcı proteinlerin 22 etki mekanizmaları içgörü sağlayabilir belirli bir proteine ​​bağlı bu tür değişiklikler karakterize. Özetle, sunulan metodoloji MyoD ortaklarının kapsamlı tanımlanmasına izin verir. TAP-etiket arıtma gibi GST çekme çıkışlar, maya iki hibrit deneyleri ve faj görüntüleme gibi diğer yaklaşımlara bir alternatif sunuyor. Bile pratik nedenlerden dolayı (production nükleer ekstrelerin büyük miktarda) bir heterolog hücresel sistemi kullanmak zorunda ve biz iskelet kas farklılaşma tespit MyoD ortakların katılımını teyit etmek mümkün olmuştur. Elde edilen veriler, MyoD miyojenik faktör transkripsiyon faktörünün aktivitesi düzenleyen farklı mekanizmaları düşündüren transkripsiyonel düzenleyici RNA bağlama proteinleri arasında değişen bir protein bolluk ile etkileşime görünmektedir göstermektedir. Sonuç olarak, aynı metodolojik yaklaşım kendi özel hücresel bağlamda incelemek için zor olabilir sayısız nükleer faktörlerin yayg ifade ortakları belirlemek için kullanılabilir.

Ökaryotik çok hücreli organizmalar farklı organ ve dokularda oluşmaktadır. Her işlevsel doku, her farklılaşma adımında belirlenen spesifik bir gen deseni ifade vardır. Hücresel farklılaşma gen bir dizi hücre proliferasyonu ile ilgili olanlar gibi bir susturma, genel olarak özel genlerin aktivasyonu, kendi ifade bakım gerektirir ve. İskelet kası farklılaşma veya Miyogenesis, o miyoblastların içine mezodermal kök hücrelerin belirlenmesi ile başlar, böylece çok adımlı bir süreçtir ve daha sonra ilk mono-çekirdekli ve daha sonra çoklu çekirdekli, myotubes bu miyoblastların terminal farklılaşmasına yol açar . Böylece, miyoblastlar hala çoğalmaya edebiliyoruz hücreleri, &quot;kararlı&quot;, ama onlar embriyonik gelişim sırasında veya yetişkin kas rejenerasyonu ya iskelet kas hücrelerine sadece ayırt edebilir, böylece iskelet kası soy taahhüt ve edilir. iskelet kası terminal işlemi farklıdırayırt edilmesi gibi E2F hedef genlerin 1 proliferasyon ilişkili genlerin, kesin bir susturma neden miyoblast öncü hücrelerin hücre döngüsüne kalıcı çıkış ile başlayan belirli bir genetik program tarafından yönetilen bir almaktadır. Gerçekten de, farklılaşması sürecinde, miyoblast proliferasyonu tutmak iskelet kası, belirli genlerin ekspresyonunu ve miyotüplerinin 2&#39;ye miyoblastların füzyon öncesinde çok önemli bir adımdır. Böyle bir program iskelet kası hasarı aşağıdaki rejenerasyon sürecinde ayırt etmek için erişkin kas kök hücrelerini de denilen uydu hücreleri, izin verir. Memeli Miyogenesis myojenik temel helix-loop-sarmalın bir ailenin kritik bağlıdır (bHLH) transkripsiyon sıklıkla iskelet kası belirleme faktörleri veya MRF (kas Düzenleyici Faktörler) 3 ailesinin olarak anılacaktır myod, Myf5, MRF4 ve Myogenin, faktörler. Bunların her biri tarifnamede ve dif önemli bir rol oynariskelet kası hücreleri ferentiation ve belirli bir sentezleme modelini Nisan 05-07 yer alır. Myf5 ve myod aktivasyonu miyojenik soy hücreleri taahhüt belirleyici bir adım teşkil ve Myogenin sonraki ifadesi gibi MCK (kas Kreatin Kinaz) olarak iskelet kası belirli genlerin aktivasyonu ile Miyogenesis tetikler. Miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri önceden sessiz loci 8 kas genlerin aktivasyonuna MEF2 aile üyeleri ile işbirliği. Ayrıca çeşitli gen düzenleyici bölgeler 8 sözde e-kutuları bağlanan D proteinleri olarak bilinen her yerde bHLH proteinler, E12 ve E47, ile heterodimerler olarak iskelet kası, gen transkripsiyonu teşvik eder. Büküm, Kimliği (farklılaşma inhibitörü) ve diğer faktörler olumsuz 8 bağlayıcı E proteinleri için myod ile rekabet ederek, bu süreci düzenler. MyoD kas terminal farklılaşma 9 tetikleyen önemli bir oyuncu olarak kabul edilir </syukarı&gt; birçok tamamen farklılaşmış olmayan kas sistemlerinde 10-13 bir myojenik belirleme / farklılaşma (trans-farklılaşma) programı neden kapasitesine sahip çünkü. Nitekim, myod zorla ifadesi farklı hücresel türde başka embriyolojik kökenli 12 türetilmiş hatta trans-farklılaşmasını uyarır. Örneğin, MyoD kas-benzeri hücrelere hepatositler, fibroblastlar, melanosit, neuroblasts ve adipositler dönüştürebilirsiniz. Myod trans-farklılaşma eylem orijinal genetik programı (özellikle, çoğalma genleri) susturulmasına eşlik olmayan bir kas ortamda myojenik genetik programın anormal aktivasyonunu (özellikle hedef genler), içerir. Miyoblastları çoğalan yılında MyoD ifade ama onların rehberleri 14-16 bağlanır bile hedef genleri aktive edemiyor edilir. Bu nedenle, MyoD sürekli farklılaşmamış miyoblastların ifade edilmesi şartı oldukça ELU kalırsive. MyoD önce kromatin remodeling aktive 14,17 enzimleri yüklenmesiyle miyoblastları çoğalan baskıcı kromatin değiştirici enzimlerin işe nedeniyle hedef genleri bastırmak olabilir. Örneğin, miyoblastlar çoğalan, MyoD histon H3 lizin 9 veya H3K9 ve H3K27 KMTs içeren transkripsiyonel ko-represör KAP-1, histon deasetilaz (HDAC) ve baskı lisin metiltransferaz (KMTs) ile ilişkili ve aktif hedef genlerin ekspresyonunu baskılayan bir bir yerel baskıcı kromatin yapısı 14,17 kurarak. Önemli olarak, yeni bir rapor MyoD kendisi doğrudan H3K9 KMT G9A olan transaktivasyon aktivitesini, 16 inhibisyonu ile sonuçlanan metillenmektedir olduğunu göstermiştir. MyoD non-kas hücrelerinin, bu şekilde trans-farklılaşmada rol oynayan epigenetik mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, bazı hücre çizgilerinden MyoD kaynaklı trans-farklılaşma dayanıklıdır. Böylece HeLa hücrelerinde, MyoD ya olmayan veyaHatta bağlı kompleks SWI / SNF 18 remodeling kromatin BAF60C alt biriminin ekspresyonu olmaması bastıncısı yerine transkripsiyon aktivatörü olarak işlev olabilir. Bu model, bu şekilde daha iyi bir MyoD kaynaklı geni sentezlenmesi mekanizmalarını tanımlamak için bir seçim olabilir. Ilişkili ortakları ile hedef odakta baskıcı kromatin ortamı teşvik ve bu nedenle terminal farklılaşma ince ayar yapmak için miyoblastları çoğalan olarak MyoD bağımlı baskıcı mekanizmaları ortaya çıkarmak için myod yeteneğini tahlil edilmesi de uygundur. Burada kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak MyoD ortaklarının tespiti için protokol açıklar. stabil Bayrak-HA-myod ifade HeLa-S3 hücrelerinin kullanılması fraksiyone nükleer ekstrelerinden MyoD kompleksleri arındırmak için yeterli malzeme almak için izin verdi. heterolog sistemde MyoD ortaklarının tespiti validati izlediilgili bir sistemde üzerinde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="543">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Cell lines</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HeLa-S3</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CCL-2.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">C2C12</td>
			<td style="width:115px;">ATCC</td>
			<td style="width:101px;">CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Equipment</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Spinner</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">778531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Homogenizer :&#160; Dounce homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Wheaton</td>
			<td style="width:101px;">432-1273 and 432-1271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Agitating device for spinners</td>
			<td style="width:115px;">Bellco</td>
			<td style="width:101px;">778531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;">Diagenode</td>
			<td style="width:101px;">UCD 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:115px;">Marienfeld Superior&#160;</td>
			<td style="width:101px;">640610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Low-binding tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sorenson</td>
			<td style="width:101px;">27210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Empty spin column</td>
			<td style="width:115px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:101px;">7326204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Reagents</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">SDS-polyacrylamide 4-12 %&#160; gel</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0336BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X loading buffer&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10X reducing agent</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Silver staining kit</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">A8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Centrifugal filter units, 10K</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">UFC501024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Protein G agarose beads</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Protein A/G&#160; Resin</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">53132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">HA resin (monoclonal Anti-HA agarose)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">MNase</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Flag free peptide (DYKDDDDK)</td>
			<td style="width:115px;">Ansynth Service BV</td>
			<td style="width:101px;">Custom synthesis</td>
			<td>Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">HA free peptide (YPYDVPDYA)</td>
			<td style="width:115px;">Ansynth Service BV</td>
			<td style="width:101px;">Custom synthesis</td>
			<td>Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Protease inhibitors</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S8830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:177px;">Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">34075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BSA</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spermine tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spermidine</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glycerol</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">PBS</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MOPS running buffer</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D0822</td>
			<td>Pre-warm&#160; at 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Trypsin-EDTA (0.05% phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;">Serum</td>
			<td>GE healthcare life sciences&#160;</td>
			<td style="width:101px;">PAA A15-102</td>
			<td style="width:151px;">Each lot of serum has to be first tested for your cells.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:101px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Water (sterile-filtered)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:101px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Antibodies</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HA from rat (12CA5)</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11583816001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Flag</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A8592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">MyoD</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td>sc-32758</td>
			<td>To use for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">MyoD</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td>SC-760</td>
			<td>To use for immunoprecipitation and western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">CBFbeta</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:101px;">FL-182&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HP1alpha</td>
			<td style="width:115px;">Euromedex</td>
			<td style="width:101px;">2HP2G9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HP1beta</td>
			<td style="width:115px;">Euromedex</td>
			<td style="width:101px;">1MOD1A9AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">HP1gamma</td>
			<td style="width:115px;">Euromedex</td>
			<td style="width:101px;">2MOD1GC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:177px;">Suv39h1</td>
			<td style="width:115px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:101px;">8729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">BAF47</td>
			<td style="width:115px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:101px;">612111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Myf5</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td>SC-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Tubulin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Actin</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">IgG Mouse</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:101px;">SC-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">IgG Rabbit</td>
			<td style="width:115px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:101px;">SC-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Goat anti-rat -HRP</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Goat anti-rabbit -HRP</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A6154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:177px;">Goat anti-mouse -HRP</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A4416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of myod interactome using tandem affinity purification coupled to mass spectrometry

İskelet kası terminal farklılaşma iskelet hücreleri pluripotent mezodermal öncü hücrelerin taahhüdü ile başlar. Bu hücreler hala çoğalmaya yeteneğine sahip ya da myofibers oluşturmak için daha olgunlaşmak çok çekirdekli miyotüplerinden, içine ayırt ve sigorta olabilir. İskelet kası terminal farklılaşma özellikle kas Düzenleyici Faktörler veya MRF üyeleri (MyoD, Myogenin, Myf5 ve MRF4), aynı zamanda miyojenik bHLH transkripsiyon faktörleri ailesi olarak adlandırılan, çeşitli transkripsiyon faktörleri koordineli hareket tarafından orkestra edildiği. Bu faktörler iskelet Miyogenesis ulaşmak için ayrıntılı kopyalama düzenleyici ağı içinde kromatin-remodeling kompleksleri ile işbirliği. Bu bağlamda, MyoD kas terminal farklılaşma tetikleme master myojenik transkripsiyon faktörü olarak kabul edilir. Bu kavram iskelet kası hücrelerine olmayan kas hücrelerini dönüştürmek için myod yeteneği ile güçlendirilmiştir. Burada myod tanımlamak için kullanılan bir yaklaşım tanımlamakiskelet kası farklılaşması dahil çeşitli faktörleri aydınlatmak için ayrıntılı bir şekilde protein ortakları. Uzun vadeli amaç iskelet kası genlerin düzenlenmesi, yani., MyoD hedefleri yer alan epigenetik mekanizmalar anlamaktır. MyoD ortakları iskelet kası farklılaşması esnasında ilgili mümkün rolü doğrulama ve ardından kütle spektrometrisi (MS) karakterizasyonu bağlanmış bir heterolog sistemde, Tandem afinite saflaştırma (TAP-Etiketi) kullanılarak tespit edilir. kas rejenerasyon konjenital myastenia, miyotonik distrofi rabdomiyosarkomda ve kusurları: miyojenik faktörler, ya da anormal düzenleme anormal şekilleri, kas bozuklukları sayısı ile ilişkilidir. Bu nedenle, myojenik faktörler hastalığın tedavisini artırabilir hastalığın kendisi ve rejeneratif mekanizmaların neden mekanizmaları ile ilgili hem kas bozukluklarında potansiyel terapötik hedefler havuzu sunmaktadır. Bu nedenle, ayrıntılı understankas kaynaklı faktörler tarafından kontrol edilen moleküller arası etkileşimlerin ve genetik programları Ding etkin terapiler rasyonel tasarımı için gereklidir.

MyoD etkinliğinin düzenlenmesini anlamak için, kütle spektrometrisi (MS) ile ve ardından MyoD bir çift etiketli formda imüno göre, biyokimyasal saflaştırma ile MyoD komplekslerinin ayrıntılı karakterizasyon üstlenmiştir. Bayrak-HA-etiketli myod ve Bayrak-HA izinleri ifade eden bir kontrol hücre hattı ifade HeLa-S3 hücre hattının kullanılması Bayrağı-HA-myod çift-afinite saflaştırma gerçekleştirerek MyoD kompleksi arındırmak için yeterli malzeme elde etmek için. Bu nükleer kısmını fraksiyonlarına daha da ayrıntılı olarak, Sitoplazmik ve nükleer bölümler halinde hücre ekstreleri fraksiyonlarına tuz ekstre (Nükleer tuz ekstrakte, SE) ve nükleozom için (nükleozom zenginleştirilmiş NE) kısımlar zenginleştirilmiş. Bu ayrı nükleer fraksiyonların (Şekil 1, Tablo 1 ve 2) TAP-Tag arıtma nispeten düşük ab sahip ortakları çözülüyor izinbelirli bir çekirdek içi bölmesinin lokalize zaman undance. Dahası, böyle bir strateji MyoD etkinlik düzenleme ayrıntılı bilgi edinmek için DNA&#39;ya bağlı (NE) myod karşı ilişkisiz (SE) ortakları ortaya çıkarmak için istismar edilmiştir. TAP-Etiket arıtılması için, Bayrak-HA tandem epitop sistemi kullanıldı. Küçük hidrofilik Flag ve HA epitopu protein fonksiyonunun en az müdahale ve antikor-antijen etkileşiminin için son derece erişilebilir. Anti-Flag ve anti-HA reçine bazlı sıralı imüno Flag ve HA peptitler kullanılarak immüno komplekslerinin elüsyon yapılarak gerçekleştirildi. daha sonra bir SDS-sayfasında yürütülmüş sonra elüt, protein proteinler, jel girmesine izin vermek için. Bütün saflaştırılmış proteinlerin içeren jel parçaları kesilmiştir; proteinler, ekstre tripsin ile sindirilmiş ve kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, </stronNE fraksiyonu arınmış g&gt; MyoD kompleksleri transkripsiyon faktörlerinin ve ortak-baskıcılar yüksek zenginleştirme var. MS analizi, örneğin HP1 olarak bu analizi ile oluşturulan çalışmalarda teyit edildi ve yeni ortaklar (örneğin Pbx, Id, E12 / E47 (HTF4), BRG1 (SMCA4), MEIS1 ... gibi) myod bilinen ortakları (bir dizi sökülmüş CBF, MBD3, BAF47 (SNF5 / Ini1) ve tüm diğer SWI / SNF kompleks alt birimleri ...) (Şekil 2 ve 3) 26-28. Bu baskıcı-kromatin ortamı kurabilir DNA&#39;ya bağlı MyoD ortakları ve muhtemel ortak düzenleyiciler ışık tutuyor. Örneğin, tarif edilen yöntem vasıtasıyla, MyoD ortak olarak tespit edilmiştir HP1 proteinleri, gen baskısı ve heterokromatin yapısını korumak için metil H3K9 bağlandığı bilinmektedir. Gerçekten de, HP1 bozulmuş MyoD, hedef gen ekspresyonu ve kas farklılaşması 26 elde MyoD transkripsiyonal aktivitesini inhibe eder. daha da fraksiyonasyongliserol degrade üzerine GD ve KD MyoD kompleksler (29 anlatıldığı gibi) iki subnuclear bölmeleri (Şekil 1B) MyoD alt kompleksleri ortaya çıkardı. kromatin bağlı MyoD bir kompleks esas ait Özel olarak, SE MyoD, üç alt kompleksleri dağıtılır. TAP-etiket / MS Bazı interaktörler MyoD kompleksleri üzerinde western blot ile doğrulandı saptandı. Bu transkripsiyon faktörü CBF, EBB, MTG8R ve SWI / SNF altbirim BAF47 (SNF5) (Şekil 3A, sol) ve HP1 proteinleri (CBX1 ve CBX3) (sağ Şekil 3A) sayılabilir. HeLa hücreleri, kas hücreleri değildir ve myod ifade yoktur çünkü önemlisi, miyoblastların içinde yeni tespit interactors ve myod arasındaki etkileşimleri (Şekil 3 BD) onaylamak için gereklidir. Özellikle, bu tür doğrulama için, (SE ve NE üzerinde ayrılık olmadan) toplam nükleer özler yüklenebileceğini, genellikle yeterlidirH Numune hazırlanması için kullanılan miyoblastların miktarının azaltılmasına izin verir. 26,27 gibi in vitro etkileşim tahlilleri, ayrıca, bu bulgular onaylanmıştır yardımcı olur. Son olarak, kas hücrelerinde bu etkileşimlerin fonksiyonel anlamları daha 26-28 gibi ele alınmalıdır. Birlikte ele alındığında, veri yayg ifade MyoD ortakları küresel bir görünüm göstermek ve daha alakalı bir kas modelinde yol daha da fonksiyonel çalışmalar açacağı sundu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53924/53924fig1.jpg" /> Şekil 1: Tandem Affinity Arıtma tarafından İzole MyoD kompleksleri (A) Nükleer tuz-ekstrakte (SE) veya nucleosome zenginleştirilmiş (NE) izole çift afinite ile saflaştırılmış eMyoD kompleksleri HeLa-S3 hücre hatları stabil nükleer fraksiyonlar bir gümüş boyama. ifade Bayrak-HA-MyoD (MyoD kompleks) bird kontrol hücre hattı (Mock). MW kilo Dalton moleküler ağırlık markörü (kDa) sahiptir. Ok Bayrak-HA-myod (eMyoD) gösterir. Bu araştırma aslında 37 yılında yayımlandı. Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için Telif The American Derneği. Sahte saflaştırma ile şerit ve SE nükleer kesirler izole karmaşık şimdi gösterilmiştir eMyoD: Bu rakam 26 ile modifiye edilmiştir. (B) (a) &#39;da çift afiniteyle saflaştırılmış eMyoD kompleksleri% 20 ila% 41 arasında değişen gliserol gradyanı üzerinde parçalara ayrıldı. Fraksiyonlar elle toplanmıştır konsantre edildi ve anti-Flag antikorları kullanılarak Western Blot (WB) ile analiz edilmiştir. Varlığını Not birkaç eMyoD içeren nükleer tuz ekstrakte (SE) fraksiyon alt kompleksleri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/53924fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src = &quot;/ files / ftp_upload / 53924 / 53924fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2:. Nükleer Çözünür (nükleer tuz ekstrakte, SE) MyoD Partners karşı (nucleosome, NE zenginleştirilmiş) Kromatin bağlı Karşılaştırılması Üst: Nükleer tuz-ekstrakte (SE) ve nükleozom zenginleştirilmiş izole eMyoD interactors arasında Venn şeması gösteren örtüşme ( NE) kesir. . Ribozomal proteinler, çeviri-başlatma faktörleri, DNA onarım faktörleri ve tübülin izoformları non-spesifik Bottom olarak TAP ile elde edilen ve kabul çeşitli veri setleri mevcut olarak analize dahil edilmiştir: Her iki SE bulundu MyoD inter ve (ortak) veya (özel) kısımların biri için belirli bir KD fraksiyonlar fonksiyonel ek açıklamalar göre gruplara ayrıldı. Hücre iskeleti ile ilgili ve diğer çeşitli proteinlerin tasvir edilmemiştir. altı çizili proteinler ya HeLa ve / veya myoblas valide MyoD Uygulayıcılar olanko-immunoprecipitation tarafından ts. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/53924fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53924/53924fig3.jpg" /> Şekil 3:. MyoD interactors seçilmiş takımı, Doğrulama stabil olarak Flag-HA-MyoD (eMyoD) ifade HeLa-S3 hücre hattı, kütle spektrometrisi, sol panel tarafından tanımlanan MyoD interactors (A) doğrulama,., Çift afinitesi Western blot analizi nükleer ekstrakte tuzu-(SE) ya da kararlı bir şekilde belirtilen antikorlar ile (Mock) eMyoD ya da kontrol hücre hattı ifade HeLa-S3 hücre çizgisinin nükleozom bakımından zenginleştirilmiş (NE) fraksiyonlarından izole -purified MyoD kompleksleri. MW moleküler ağırlık markörü Sağ panel:. HeLa-S3 hücre hattı s nükleer nükleozom zenginleştirilmiş fraksiyonlarından izole çift afiniteyle saflaştırılmış MyoD komplekslerinin Western blot analizianmalıyım belirtilen antikorlar ile eMyoD ya da kontrol hücre çizgisi (Mock) ifade. Bu panel aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Yahi lH, Fritsch L Philipot, O, Guasconi V Souidi E, Robin P, Polesskaya A, Losson R Harel-Bellan A Ait-Si-Ali S. J. Biol Chem. 2008 29 Ağustos, 283 (35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için Temmuz 2. Telif The American Derneği. Bu rakam 26&#39;dan modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve metin şekil içindeki etiketleme birleştirmeye döndürüldü. MyoD diğer panellerde sunulan endojen IP ile karışıklığı önlemek için eMyoD olarak etiketlendi. C2C12 fare miyoblastların içinde MyoD interactors (BD) Doğrulama. (B) çoğalan C2C12 miyoblastların Nükleer toplam ekstreler BAF47 (SNF5) ya da MyoD karşı ya da kontrol IgG&#39;si ile antikorlarla immüno-çökeltme (İP) için kullanılmıştır. Elde edilen çökeltiler, DB wit ile analiz edilmiştirH belirtilen antikorlar. Anti-MyoD uzun antikorlar (uzun expo.) ve daha kısa (kısa expo.) maruziyet süreleri gösterilmiştir. Girdi ekstreleri endojen protein düzeyleri göstermek için yüklendi. Bu panel, Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) kapsamında 28 yayımlanarak yürürlüğe girmiştir. Bu rakam 28&#39;den modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve test şekil içinde etiketleme birleştirmeye döndürüldü. (C), çoğalan C2C12 miyoblastların Nükleer toplam ekstreler MyoD, Suv39h1 (pozitif kontrol) karşı antikorlarla immüno-çökeltme için kullanıldı ya da IgG (negatif kontrol) kontrol edildi. Elde edilen çökeltiler, daha sonra, belirtilen antikorlar ile WB tabi tutuldu. Bu panel aslında Biological Chemistry dergisinde yayımlandı. Yahi lH, Fritsch L Philipot, O, Guasconi V Souidi E, Robin P, Polesskaya A, Losson R Harel-Bellan A Ait-Si-Ali S. J. Biol Chem. 2008 29 Ağustos; 283(35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji için Temmuz 2. Telif The American Derneği. Bu rakam 26&#39;dan modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve metin şekil içindeki etiketleme birleştirmeye döndürüldü. Çoğalan (D) Nükleer toplam ekstreleri (Prolif.) Ile ayırt C2C12 miyoblastlar (48 sa, fark olarak gösterilmiştir.) Immüno (IP) için kullanılan MyoD ve Myf5 karşı antikorlarla ya da normal tavşan IgG ve boş boncuklar negatif kontrol. Nihai çökeltiler belirtilen antikorlar ile WB ile analiz edilmiştir. Girdi ekstreleri endojen protein düzeyleri göstermek için yüklendi. Bu panel, Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) kapsamında 27 yayımlanarak yürürlüğe girmiştir. Bu rakam 27 ila modifiye edilmiştir: Polis türü ve boyutu değiştirildi ve metin f içindeki etiketleme birleştirmek için döndürüldüŞEKIL. Çoğalan ve özgün figür aksine ikiye ayrılır C2C12 farklılaşan elde edilen sonuçlarla panelleri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/53924fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tablo 1:. Kontrol hücre hattından elüsyonların MS tarafından belirlenen Arka Plan Proteinlerin Çıkarma sonra Nükleer Tuz ekstrakte Kesir İzole Çift Affinity saflaştırılmış eMyoD Kompleksleri MS Analizi ile Belirlenen Proteinlerin listesi (Proteinler non-spesifik arka plan olarak kabul edildi . veri dört bağımsız saflaştırma toplamını ifade etmektedir). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/Table_1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Tablo 2: Proteinler I listesiArka plan Proteinlerin Çıkarma sonra Nükleozom zenginleştirilmiş Kesir İzole Çift Affinity saflaştırılmış eMyoD Kompleksleri MS Analizi ile dentified. veri üç bağımsız saflaştırma toplamını ifade etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/Table_2.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Tablo 3. Tampon kompozisyonlar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53924/Table_3.xls" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Görüntüleme.  Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité. MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Video: Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...