NIH tarafından desteklenen sej için R01HL105635 verin. Yazarlar teknik danışmanlık için Diego V. Bohórquez teşekkür etmek istiyorum. Biz de teknik yardım için R. Ian Cumming teşekkür ve Duke İnsan Aşı Enstitüsü Araştırma Sitometrisi Paylaşımlı Kaynak Tesisi (Durham, NC) flow sitometri gerçekleştirmek. sitometri Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (adet UC6-AI058607) dan yapımı için kısmi destek aldı Duke Bölgesel biyosınırlılık Laboratuarında gerçekleştirilmiştir Akış.

Hayvan denekleri Prosedürleri Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Hızlı Mavi 1. Burun İdaresi Hızlı Blue, en az 2 gün fare ötenazi önce boya yönetmek. boya sekiz hafta boyunca devam edecektir. <ol><li> yavaş başlar nefes kadar hafif inhalasyon anestezisi (% 2.5 sevofluran) ile fare anestezisi. </li><li> Fareyi sağlamak için zaman zaman duraklayarak, yavaş yavaş burun deliğine boya solüsyonu 40 ul (0.4 mM Hızlı Mavi,% 1 dimetil sülfoksit, DMSO, fosfat tamponlu tuz, PBS) aşılamak için filtrelenmiş ipuçları ile 200 ul pipet kullanın çözümü aspire edilir (Şekil 1A). </li><li> Dikey fare tuşunu basılı tutun başkanlık ve yavaşça boya akciğerlere yayılır sağlamak için göğüs masaj yapın. </li></ol> Diseksiyon ve Analiz gününde 2. Hazırlıklar <ol><li> 10 ml hazırlayın0, tablo 1 &#39;de belirtildiği gibi bileşenleri karıştırarak Ganglion ayrışma çözeltisi (GADS). </li><li> özel bir laboratuvar alanında RNA çekimini gerçekleştirebilecek. deney,% 70 etanol,% 10 çamaşır suyu ve RNaz dekontaminasyon reaktifi ile temiz yüzeyler başlamadan önce. Bu RNA santrifüj, herhangi bir tüp rafları ve pipet içermektedir. RNA kullanım için özel filtre ucu kutuları vardır emin olun. Bu örnekler kontamine olarak, DNA hazırlığı için bu ekipmanı ve bölgeyi kullanmayın. </li><li> RNaz içermeyen su ile, taze% 70 ve% 80 etanol karıştırın. örnek başına 1 mi, RNA ekstraksiyonu kullanılmak üzere hazırlanır. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> miktar </td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 </td><td> 9.5 mi </td></tr><tr><td> glutamin </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> N2 takviyesi </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> B27 (vitamin A) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Ganglion Ayrılma Çözüm (GADS&#39;nin) Tablo 1. Reaktif Karışımı. 3. Diseksiyon Prosedürü <ol><li> 500 ul GADS, her bir deney numunesi için bir pozitif ayıklama kontrol için bir ve negatif ayıklama kontrol için bir tane olan 1.5 ml tüpler doldurun. diseksiyon boyunca buz üzerinde saklayın tüpleri. </li><li> boğumlu ganglion inceleyin ve ayrışma kolaylaştırmak için iki kısmi kesimler yapmak, daha sonra deneysel örnek tüpüne koyun. Boğumlu ganglionlar 16 ve DRG 17 diseksiyon için aşağıdaki vallahi protokolü bakınız. </li><li> sıralama kontrolleri için, incelemek ve kısmen böyle dorsal kök gangliyon (DRG) olarak etiketli olmayan ganliyonunu kesti. Pozitif kontrol ve iki Gangli için iki ganglionlar kullanınNegatif kontrol için, bir. </li><li> Başarılı sıralama için yeterli boğumlu nöronlar elde etmek için, bir deney örnek tüpü içeren GADS&#39;yi içine 5 farelerden alınan ganglionlar birleştirir. </li></ol> 4. Duyu Ganglion Ayrılma <ol><li> tüp içinde ganglionlar bırakarak, 500 ul GADS&#39;yi dışarı pipetle. ganglionlar sonra, tüpün dibine yerleşmek PBS dışarı pipetle için 1 ml PBS ekleyerek bir kez ganglionlar yıkayın, bekleyin. </li><li> 1 mi GADS ve sindirim enzimi 22 ul (kolajenaz I / II ve proteaz karışımı, 2.5 mg / ml H2O) için her bir tüp ekleme. </li><li> Pozitif kontrol tüpüne 20 ul Hızlı Mavi (5.26 mM) eklenir. </li><li> daha önce 37 ° C&#39;ye ayarlanmış bir su banyosu ya da ısıtma bloğunda tüpleri koyun. Not: ganglion sindirim zaman sindirim enzimi yaşına bağlıdır. 6 ay 45 dakika süreyle sindirmek - 2 içinde sindirim enzimi çözülmesi 1 ay içinde, 30 dakika boyunca sindirmek. Enzim 6 aydan eski ise, gangliyon f sindirmekya da 60 dakika. </li><li> Her 15 dk sallamak tüpleri kısaca ve ganglionlar sağlamak için onları fiske çözümü ile kaplıdır. </li><li> gangliyon dijeste edilir ve bu esnada bir partikül (polivinilpirolidon ile kaplanmış koloidal silis parçacıkları) kullanılarak yoğunluk gradyanları hazırlar. <ol><li> GADS&#39;de% 12 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın. </li><li> GADS&#39;de% 28 parçacık çözümü, numune başına 500 ul karıştırın. </li><li> Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, her bir numune için yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir tüp içinde 400 | il% 28 yoğunlukta çözeltisi üzerine 400 ul% 12 yoğunlukta çözeltisi ilave edilir. iki kat karıştırmak için izin vermeyin. İki farklı katmanlar tüp içinde görünür olmalıdır; Diğer daha koyu bir. </li></ol></li><li> ganglion sindirilir edilirken, (sıralama numune başına bir Hızlı pozitif Mavi ve bir Hızlı Mavi negatif tüp) sıralama için yeni 1.5 ml toplama tüpleri etiket. interfer etmeyecek şekilde sıralama tesis gereksinimlerine bağlı olarak, bu tüpler sökülebilir kapaklar olmalıdırhücre sıralayıcı ile e. </li><li> Uygun sindirim süresinden sonra, sindirim enzimi ile GADS çıkarın ve 1 ml PBS ile iki kez ganglionlar yıkayın. Her tüpe taze GADS&#39;nin 200 ul ekleyin. </li><li> ayrı hücreler kırmak için yukarı ve aşağı birkaç kez 100 ul hacme ayarlanmış 200 ul pipet, ve pipet ganglion kullanın. doku bozulmamış bir parça görülmektedir kadar tekrarlayın. çözeltide kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden ayrışmış hücrelere geçerler. </li><li> Sol kalan sokak hücreleri pick up ve hücre süzgecinden ek çözüm geçmek için orijinal ayrışma tüpüne başka bir 100 ul GADS&#39;yi ekleyin. Yeni bir pipet ucu kullanarak, süzgecinden geçirildi ve örgü sarıldı herhangi bir kalan hücre ihtiva eden sıvı toplanması. GADS&#39;de asılı hücrelerin son hacim 300 ul olduğunu. </li><li> Dikkatle önce yapılmış yoğunluk gradyanı üstünde hücrelerinin 300 ul katman. kabarcıkları önlemek ve c karıştırmayoğunluklu tabakalar arşın. </li><li> RT&#39;de 2,900 x g&#39;de 10 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Hücreler santrifüj iken aşağıdaki gibi lizis tamponu (deneysel örnek başına 1 mi) karışımı: 10 ul 2-merkaptoetanol (RNA ekstraksiyon kiti), 1 ml tampon RLT bölgesindeki. <ol><li> Hızlı Mavi pozitif toplama tüpüne 300 ul lizis tamponu ve Hızlı Mavi negatif toplama tüpüne (adım 4.7 etiketli tüpler) 600 ul ekleyin. Bu hacim, tahsil edilmesi beklenen hücre sayısına bağlıdır. 7.000 hücreleri 600 ul için &lt;2.000 hücreleri, 300 ul ekleyin&gt;. Bu anlamlı lizis tamponu sulandırmak değil sıralama kılıf sıvısı sağlayacaktır. </li></ol></li><li> Santrifüj tamamlandıktan sonra, dikkatlice çıkarın ve üst 700 ul katmanı atın. Bu katman, aksi takdirde hücre sıralama engel olacak hücre enkaz çoğunluğunu içerir. </li><li> çözümü ve pipet içeren kalan hücreye 700 ul taze GADS&#39;yi eklete yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırın. </li><li> pelet hücreleri 2.900 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Hücreler santrifüj iken, 1 mi GADS 5 ul DNase (10 mg / ml) eklenerek GADS (numune başına 500 ul) sıralama karıştırın. </li><li> santrifüj yapıldıktan sonra, dikkatli bir şekilde hücre pelet bırakarak kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Yeniden askıya 200 hücre pelletini - yukarı pipetleme ve 200 ul birkaç kez ayarlanmış bir 1000 ul pipet yardımıyla aşağı 300 ul sıralama GADS&#39;yi. buz üzerinde örnekleri koyun. Hücreler artık sıralanması için hazırız. </li></ol> 5. Floresan Aktif Hücre (FAC) Sıralama Not: Bu bölümde operasyonel FACS sıralayıcı bilgi ya da kalifiye personel yardım gerektirir. <ol><li> hücre canlılığı test etmek için her bir örnek için 1 ul propidyum iyodür (PI) stok solüsyonu (50 ug / ml) eklenir. 2 tüpler, PI ile diğeri olmadan içine negatif kontrol Böl. PI sadece ölü hücreleri DNA bağlar. Eğerİlk birkaç türlü sonra, PI kullanımı gerekli değildir etiketlemek için hiçbir ölü hücreler vardır. </li><li> Ulaştırma hücreleri buz üzerinde örneğin., BD FACS AriaII Diva 8 yazılımını çalıştıran, enstrüman akış sitometri. </li><li> Hücre boyutu, bu popülasyonda, değişken olduğu için, ayırma için büyük bir ağızlık (100 um) kullanın. stres hücreleri deneyimi miktarını azaltmak ve hücre canlılığı düşük basınç (20 psi) kullanmak artırmak. </li><li> Analiz araziler, gerektiğinde ileri dağılım, yan dağılım (SSC), Hızlı Mavi ve PI, kurmak için FACS sıralayıcı yazılımını kullanın. </li><li> hücrelerin yeniden askıya yavaşça sıralayıcı yerleştirmeden önce örnek kısaca vorteks. </li><li> Kapı eşiği (Şekil 2A) ayarlamak için, negatif kontrol, hiçbir Hızlı Mavi veya PI ile başlayın. Bu hücre popülasyonunun otofloresan miktarını belirler. İsteğe bağlı: Ölü hücrelerden oluşan bir nüfus var olup olmadığını belirlemek için PI negatif örnek çalıştırın. </li><li> (Inc pozitif kontrol örneği sıralamaktazminat parametrelerini ayarlamak için,) Hızlı Blue ile ubated. </li><li> kapılar ve parametreler ayarlandıktan sonra, deneysel örnekleri sıralama başlar. Örnekler RNA lizis tampon içeren hazır toplama tüpleri içine sıralanır. </li><li> Hücre sıralama tamamlanana kadar buz üzerinde sıralanan örnekler tutun. </li><li> Hücreler sıralanır hemen sonra RNA ekstraksiyon adımını başlayın. </li></ol> 6. RNA Ekstraksiyonu <ol><li> 1 dakika süre ile liziz tamponunda Vortex kriteri hücreler homojenleştirin. </li><li> Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme tarafından% 70 etanol ve karışımı 1 hacim ekleyin. </li><li> spin kolona numunenin 700 ul kadar aktarın. 8000 x g&#39;de 15 saniye boyunca santrifüj. flow-through atın. <ol><li> Numunenin toplam hacmi eğirme kolonundan geçirildi kadar tekrar edin. </li></ol></li><li> üreticinin Protoco göre DNaz aşaması da dahil, 350 ul Tampon RW1 ekleyin ve RNA saflaştırma işlemine devamhücreler l. </li><li> RNA ekstre edildikten sonra, üreticinin talimatlarına göre bir mikroakışkan elektroforez sistemi kullanılarak RNA kalitesini test. </li></ol>

<ol>
	<li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia.">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li><li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse.">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).</li><li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects.">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li><li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia.">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li><li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways.">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li><li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat.">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li><li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion.">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li><li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing.">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li><li>Kaczy&#324;ska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration.">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li><li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents.">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li><li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents.">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li><li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin.">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li><li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+expression+of+cold+receptors+(TRPM8+and+TRPA1)+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex.">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li><li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry.">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li><li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus:+A+comparison+of+Fast+Blue,+Fluoro-ruby,+Fluoro-emerald,+Fluoro-Gold+and+DiI.">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li><li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat.">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li><li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels.">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782 (2013).</li><li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus.">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li><li>Kwong, K., Lee, L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE(2)+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli.">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li><li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways.">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li><li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2/3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats.">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li><li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon.">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li><li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains.">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, vagus sinirinin nodoz ganglionlarda hava yolu innerve nöronların hedeflemek için bir yöntemi anlatmaktadır. Bir kez etiketlenmiş, ganglionlar yavaşça optimum hücre sayıları ve canlılığı korumak için ayrışmış. Bu nöronlar FAC lizis tamponu doğrudan sıralanır ve RNA ayıklanır daha sonra. Bu protokolün önemi, hedef izole ve belirli duyusal hücre popülasyonunun kalitesini korumak için yeteneğidir. Gen ekspresyonu nöronların bu küçük nüfus anlatılan ve organa özel fonksiyonları ve sinir ağları tanımlanır. Bu protokol kritik adımlar ayrışma sürecinde hızlı ilerlemesi ve sonraki hücre sıralama içerir. O ayrışma hemen sonra başlar, öyle ki sıralama zamanı planlamak için önemlidir. RNA ekstraksiyonu için tüm tüpler ve ekipmanları tüm RNA ekstraksiyon reaktifleri, taze% 70 ve% 80 etanol çözeltileri taze yapılır ve bu da önemlidirücretsiz, temiz ve RNaz bulunmaktadır. Bu protokol, hücrelerin tek hücre RNA ekstraksiyonu ve sekanslama için delikli plakalara tek kriteri şekildedir değiştirilebilir. Aynı zamanda, arka kök gangliyon (DRG) ve diğer duyusal gangliyon hücreleri izole etmek için kullanılabilir. DRG&#39;lerde geri izleme için farklı vücut parçaları boya enjeksiyonu önce yapılmış 17 nitelendirdi. Bu protokol, aynı zamanda işlevsel analiz için hücreleri toplamak için modifiye edilebilir. Bunun yerine lizis tamponu içine hücreleri sıralama, hücreler nöronal kültür ortamı, GADS&#39;yi halinde sıralanır. Bu hücreler daha sonra kültürlenmiş ve kalsiyum görüntüleme veya elektrofizyoloji gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılmaktadır. Hızlı Mavi pozitif nüfus beklenen sonucu küçükse, yeni sindirim enzimi satın. Sindirim enzimi yaşı sindirim verimliliği ile bağlantılıdır. sindirim enzimi satın alma 1 yıl içinde kullanılması gerekmektedir. hücre sayısı yüksek olması durumunda,RNA ekstre edildi ve kalite test edilmiştir. RNA bozuluyorsa bu reaktifler taze değildir, ya da kontamine olmuş olduğunun bir göstergesidir. Bu durumda, tüm RNA ekstraksiyon alanları, pipetler, raflar, ve bir şey örnek tüpleri ile temas edeceğini iyice temizleyin emin olun. Taze RNase ve DNaz ücretsiz% 70 ve% 80 etanol olun. Bu çözümleri yapmak için kullanılan su ve etanol de diğer laboratuvar malzemeleri ayrı tutulması ve RNA ekstraksiyonu için sadece kullanılmalıdır. FAC sıralama Fast Blue pozitif hücrelerin izole edilmesi için hızlı ve etkili bir yöntemdir, ancak bir sınırlama hücre yoğunluğu ml tampon için 1 ila 2 milyon hücre olmasıdır. Bu protokol mevcut hücre sıralayıcı modellerinin sınırını iter. boğumlu ganglion hücrelerinin sayısı azdır. hücre sıralayıcı için bir hücre verimi yeterli elde etmek için, beş hayvandan alınan hücreler toplanır. 300 ul ve az 100.000 askıya hücreleri vardır - açıklanan sıralama hacmi 200. TTavsiye yoğunluğunun altında, ml başına yaklaşık 450,000 hücre, bir konsantrasyona yaptığı anlamına gelir. Bir hücre ayırıcıyla için bir seçenek, bir flüoresan mikroskop ve bir cam pipet 24 seçmenize etmektir. Bu teknik, daha yavaş ve 30 toplamak için kullanılmaktadır - her seferinde 100 hücre. Bu nedenle, bu protokol, mevcut yöntemlere kıyasla daha hızlı, yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu protokolün gelecekteki uygulamalar havayolu-innerve sinirlerin, belirli bir nüfusun transkripsiyonel profilini belirlemek için yeteneği vardır. Bu protokol kullanılarak toplanan, yüksek kaliteli RNA toplandı nöronların Transcriptome karakterize etmek için cDNA sentezi ve yeni nesil dizilemesi ve diğer teknikleri için bir şablon olarak kullanılabilir. Bu şekilde, genler veya yollar bu nöronların spesifik olan saptanabilir. Bu bilgi, bu nöronlar, normal fizyolojik koşullarda oynamak fonksiyonel rolünü aydınlatmak için yardımcı olacaktır. temel kezifade kalıpları sistem akciğer innerve nöronlarda gen regülasyonu üzerindeki etkilerini belirlemek için fiziksel ve kimyasal uyaranlara veya patojenler tarafından itiraz edilebilir, kurulmuştur. Son olarak, genler düzenlenir hangi belirleyerek yeni farmakolojik hedefler belirlemek ve hava yolu hastalıklarında sinir fonksiyonu akut ve kronik değişikliklere müdahale etmek terapötik etkilerini araştırmak için başlayabilirsiniz.

Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent sinirlerin hücre gövdeleri arka kök, trigeminal veya nodoz gangliyon olarak, duyusal ganglia yer almaktadır. Her duyu ganglion vücudun belirli bölgeleri innervates ve o bölgedeki ayrı organ ve dokuları innerve hücreler içerir. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve trigeminal ganglion kafatası yer alırken hava yolları 1 üst yüz, gözler, meninksler veya innerve nöron içeren, gövde ve uzuvların boyunca süreçleri uzatmak, 2. Vagus sinirinin boğumlu ganglion alt solunum yolları ve akciğerleri 3 kafatası altındaki boyunda bulunan ve gastrointestinal sistem, kalp boyunca sinir liflerini uzatmak hücre gövdeleri içerir ve. İnsanlarda boğumlu ganglion, ancak fare birleştirildiği, tek başına duruyorAyrıca akciğerleri 4 innervates juguler gangliyon ile. Bu erimiş ganglion genellikle / juguler boğumlu karmaşık, vagus ganglion denilen, ya da sadece boğumlu ganglion 5 edilir. Burada, boğumlu gangliyon olarak adlandırılır. boğumlu afferent lifler beyin sapındaki yalnız yolu (NTS) çekirdeğine iç organlardan gelen bilgi aktarmak. Bu eşsiz ganglion duyusal girdi böyle gut hareketindeki 6, kalp hızı 7, solunum 8,9 ve tahriş aktive solunum tepkiler 10,11 gibi işlevleri, çeşitli bir dizi kontrol eder. fonksiyonları ve innerve organların bu çeşitliliği sayesinde, hedef ve bireysel nöronal yolları araştırmak için boğumlu ganglion organ spesifik alt popülasyonlar ayırmak için kritik öneme sahiptir. Ancak, boğumlu küçük boyutu ve bu önemsiz bir görev değildir içeren nöronların sınırlı sayıda verilen. Ganglion nodoz Her fare yaklaşık 5.000 nöronlar 12 içerirUydu hücreleri destekleyici geniş bir nüfusa ek olarak. % 5 innervate solunum yollarında - 5000 boğumlu nöronlar, sadece 3. Dolayısıyla, solunum uyarılması veya patolojilere havayolu-innerve nöronların içinde herhangi bir fonksiyonel morfolojik veya moleküler değişiklikler, yoğun dolu boğumlu ganglion kaybolur. Bu sorunu çözmek için, bir yöntem belirlemek ve hava yollarını innerve nöronlar izole etmek için geliştirilmiştir. üst solunum yolları takip eden innerve nodoz nöronların tespit etmek, bir floresanlı işaretleyici boya maruz bırakılmıştır. Hızlı Mavi nöronlar tarafından yakalandı ve en fazla sekiz hafta 13 korunur hücre gövdeleri hızla yolculuk oldu - 15. Bir kez nazik, henüz etkili, ayrışma protokol floresan aktif hücre (FAC) sıralamak için boya etiketleme ve hücre canlılığını korumak için kullanılan belirlendi. Kriteri hücrelerinin gen ekspresyonunu veya f belirlemek için, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) elde etmek için kullanılırveya diğer alt moleküler analizi. Bu protokol, ilgi konusu bir dokuda innerve duyusal nöronlar izole etmek için kullanışlı ve güçlü bir teknik sağlamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="942">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Fast Blue</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:132px;">17740-2</td>
			<td style="width:248px;">stock 2 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N21482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">B27 (no vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6009</td>
			<td>stock 50 &#181;g/ml in PBS/10% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>stock 2.5 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">particle solution (Percoll)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Heating block</td>
			<td>LabNet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">70 um cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Absolute Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2484-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10328-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase kit, RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>stock 10 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

Somatosensoriyel sinirler termal, mekanik, kimyasal, hem endojen ve çevresel faktörlerden oluşan zararlı uyaranlara transduce. Bu afferent nöronların hücre gövdeleri duyusal ganglionlar içinde yer almaktadır. Duyu ganglion vücudun belirli bir organ veya bir kısmını innerve. Örneğin, dorsal kök gangliyon (DRG) Vertebral kolon bulunan ve vücutta ve bacaklarda boyunca süreçleri uzatmak. trigeminal ganglion kafatası bulunan ve yüz innerve ve üst solunum yolları vardır. boğumlu ganglionlar vagal afferentler bağırsak, kalp, akciğerler ve boyunca uzanır. solunum hızı, solunum yolu tahrişi ve öksürük reflekslerinin: boğumlu nöronlar gibi fonksiyonların çeşitli bir dizi kontrol eder. Bu durumda, anlaşılması ve işlevini değiştirmek için, hava yolu spesifik nöronal alt popülasyonlarının belirlenmesi ve izole edilmesi için çok önemlidir. Fare, hava yolları havayolu özgü boğumlu nöronun retrograd takibi için bir floresan tracer boya, Hızlı Mavi, maruzs. nodoz gangliyon parçalanır ve flöresanla aktive edilen hücre (FAC) ayırma boyası pozitif hücrelerin toplanması için kullanılır. Daha sonra, yüksek kaliteli ribonükleik asit (RNA) yeni nesil dizileme için boya pozitif hücreler elde edilir. spesifik nöronal gen ifadesi belirlenir bu yöntem havayolunu kullanarak.

Bu yöntem kullanılarak, hava yolu innerve nöronlar intranazal Fast Blue (Şekil 1A) aşılamak ile etiketlenir. İki gün sonra, Fast Blue etiketli hücreler nodoz gangliyon (Şekil 1C) görünür. boğumlu ganglionlar toplam nöronal nüfusun% 5&#39;i - Bu hücreler 3 oluşturuyor. Bu amaç için kullanılan diğer retrograd boyalar DII (1,1&#39;-dioktadesil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perklorat) ve Fluorogold bulunmaktadır. nöronlar boğumlu DII etiketlere Akciğer maruz kalma. Ancak, DII ganglion ulaşması uzun sürer, 7-14 gün damlatılması 18,19 sonra, bu nedenle aktif taşınan boya kullanılmıştır. Fluorogold aynı zamanda havayolu nöronlar 14,20 etiketlemek için kullanılan bir aktif taşınan boyadır. Bizim tecrübelerimize göre, ancak, bir kez bu boya (veriler gösterilmemiştir) hızla uydu hücreleri ve nöronlar tarafından tutuklanmıştı boğumlu ganglion hücre gövdeleri ulaştı. HızlıMavi alternatif aktif başarılı ve hızlı bir şekilde, sıçanlarda 21 ve havayolu-innerve boğumlu nöronlar 13,14 DRG etiketler floresan boya taşınan olduğunu. Hızlı Mavi bir yaklaşım, bu nedenle, daha sağlam ve tekrarlanabilir görünür. Boğumlu ganglion diseksiyonu önce 16 tarif edilmiştir ve konumu kısaca Şekil 1B gösterilmiştir. Sindirim boğumlu ganglion eksize edilmiştir hemen sonra başlar. topaklanma nöronlar birlikte önlemek ve daha temiz bir tür için izin hafif bir sindirim enzimi kullanmak için, herhangi bir enkaz temizlemek ve çözüm sıralama ganglionlar RNaz ekleyin. Birden fazla sindirim enzim karışımları için test edilmiştir. Hafif sindirim enzim karışımı 22 ancak yetişkin ganglion sindirim için zamanında hücreleri bozmaya yeterince güçlü değildi, denendi. Alternatif olarak, önceden papain 23 kombinasyonu kullanılan proteazVe kolajenaz enzim karışımı, (veriler gösterilmemiştir) çok agresif olduğu kanıtlanmıştır ve istenmeyen hücre ölümüne neden olmuştur. Belirtilen enzim karışımı ile belirtilen sindirim protokolü, yüksek hücre canlılığı ile zamanında sindirim için doğru olduğu bulunmuştur. Önceki yöntemler etiketsiz hücrelerden 24 etiketli hücreleri ayırmak için bir cam pipet ile toplama manuel hücre kullandık. Bu teknik, bir hücre az sayıda tek hücre analizi için daha uygundur. yüzlerce ya da binlerce hücrenin tamamı popülasyonu elde edilmesi gereken, ancak 48 hücre / sa.&#39;lik bir maksimum oranı ile bu teknik pratik değildir. amaç, yüksek kaliteli RNA izole etmek, zaman önemli bir değişkendir olur. Bozulmasını önlemek için mümkün olduğunca çabuk RNA çıkarma başlamak önemlidir. FAC sıralama ~ 45 dakika tüm etiketli nüfusun toplanmasını sağlar ve RNA ekstraksiyon hemen sonra başlatılır. o: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; nöronları sıralama yaparken kırık nöronal süreçlerden kadar enkaz temizlemek için önemlidir. Bir yoğunluk gradyan ayrışmış örneklerinden enkaz temizlemek için kullanılmıştır. Küçük bir yarıçapına sahip C-lif nöronlar, ~ um 24 5, degrade geçmeye zorlanır sağlamak için yeterince yüksek bir kuvvette santrifüj önemlidir. Şekil 2A ve B sıralama kapıları ayarlamak için kullanılır negatif ve pozitif kontroller göstermektedir. Şekil 2C&#39;de görüldüğü gibi, ayrışmış Fast Blue sıralama iki popülasyon boğumlu hücreleri etiketli. Bu örnekten toplanan hücre sayıları Şekil 2D&#39;de verilmiştir. % 85 - Bu yöntem için verimlilik sıralama 73 olduğunu. nöronlar sıralarken ileri dağılım ve yan dağılım parametreleri özgüllük eklemek vermedi. nöronlar küresel olmadıklarından bu parametreler güvenilir hücre boyutunun bildirmek için koyamadık. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; KBB kaliteli RNA verimi için 1 &quot;&gt; hücreler lizis tamponu doğrudan sıralanması gerekiyor ve RNA bir mikroakışkan elektroforez sistemi test etmek için kullanılan sıralama hemen sonra çıkarılan olmalıdır. RNA (Şekil 3) kalitesi. 18S ve 28S tepe bir RNA bütünlüğü numarası (RIN) hesaplamak için kullanılan jel elektroforez ile tespit edilir. örnek dizilenmesi RNA, RIN Bu RNA numunesi sekanslanacak hazır artık 7. daha büyük olmalıdır . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53917/53917fig1.jpg" /> Şekil 1. Vagus Sinir boğumlu Ganglia Havayolu innerve Nöronlar Hızlı Mavi Etiketleme. A) ciğerlerine Hızlı Mavi burun damlatılması bir temsili. Işık sevofluran, pipet fare sıvısında aspire edilir emin bir fare burun delikleri içine% 1 DMSO ile PBS içinde Fast Blue 40 ul altında. <strong&gt; B) boğumlu ganglion nerede gösteren bir şemadır. It) karotid arter. C boyunca uzanan vagus siniri, bir kalınlaşma olarak görünür, en az 2 gün sonra, Fast Blue hava yolu nöronlar işaretleme nodoz ganglia görünür. boğumlu tüm nöronlar lekeleri kırmızı floresan Nissle leke, ile karşıt edilir. Ölçek çubuğu 100 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53917/53917fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53917/53917fig2.jpg" /> Hızlı Mavi Pozitif Hücreleri için Gates&#39;i Sıralama Şekil 2. Floresan Aktif Hücre (FAC). Kapılar negatif (A) ve pozitif (B) kullanan sıralama kurmak için Hızlı Mavi pozitif nüfusu kurmak kontrol eder. Negatif kontrol (A) inci DRG hücreleri ayrışmışEn akciğerleri innerve yok. Pozitif kontrol (b) parçalara edildikten sonra in vitro olarak hızlı mavi ile inkübe edilir DRG hücreleri ayrıştırılır. Nedeniyle ayrışmış nöronlar olmayan küresel şekli, ileri dağılım ve yan dağılım parametreleri hücre popülasyonu. C) solunum yolları Mavi. D Hızlı maruz kalmış farelerin ganglion hücrelerinin boğumlu ayrışmış bir temsilci sıralama) tanımlanmasına yardımcı olmaz (C) hücre sayısı. 1.000 &#39;den fazla Hızlı Mavi (FB) hücreleri toplanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53917/53917fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53917/53917fig3.jpg" /> Şekil 3. Bir seçecek kullanarak RNA Kalite ve RNA Bütünlük sayısı (RIN) Görevlendirilmesine mikroakışkan Elektroforez Sistemi Kullanımının Değerlendirilmesi.rophoresis sistemi RNA kalitesi betimlenen jel resmin üzerine 18S ve 28S zirveleri hesaplanır. Düşük zirve bozulmuş RNA temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53917/53917fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice at JoVE.com

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Bir Yöntem Hedef ve Fare İzole Havayolu-innerve Duyu Nöronlar için

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Görüntüleme.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Video: A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Nörobilim

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Koku Duyu Nöronlar Cilia Kafesli Bileşiklerin Flash Fotoliz

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Hücre içi Kaydı, Duyu Alan Haritalama ve Sülük de Kültüre Belirlenen Nöronlar Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Biyokimyasal Analiz için Duyu Nöronlar gelen üretim ve Aksonlar izolasyonu gözenekli Filtre Kullanma

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).