Apoyado por el NIH subvención R01HL105635 de la SEJ. Los autores desean agradecer a Diego V. Bohórquez para el asesoramiento técnico. También agradecemos a R. Ian Cumming para la asistencia técnica y la realización de la citometría de flujo en el Centro de Vacunas Humanas Duke Instituto de Investigación de citometría de flujo de recursos compartidos (Durham, Carolina del Norte). La citometría de flujo se realizó en el Laboratorio Regional de Biocontención en Duke, que recibió un apoyo parcial a la construcción de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (UC6-AI058607).

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Duke. 1. Administración intranasal de Fast Blue Para Fast Blue, administrar el tinte al menos 2 días antes de la eutanasia el ratón. El tinte se mantendrá durante un máximo de ocho semanas. <ol><li> Anestesiar al ratón con anestesia por inhalación de luz (2,5% sevoflurano) hasta que comience a disminuir la respiración. </li><li> Usar una pipeta de 200 l con puntas filtrados para infundir lentamente 40 l de solución de colorante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solución salina DMSO, en tampón fosfato, PBS) en la fosa nasal, haciendo una pausa de vez en cuando para asegurar que el ratón está aspirando la solución (Figura 1A). </li><li> Mantenga pulsado el ratón verticalmente, cabeza en alto, y masajear suavemente el pecho para asegurar que el tinte se propaga a través de los pulmones. </li></ol> 2. Preparativos en la disección y el Día Análisis <ol><li> Preparar 10 ml0; Ganglios solución de disociación (GADS) mediante la combinación de los ingredientes como se especifica en la Tabla 1. </li><li> Realizar la extracción de ARN en un área del laboratorio dedicado. Antes de comenzar el experimento, las superficies limpias con 70% de etanol, 10% de lejía, y el reactivo de descontaminación RNasa. Esto incluye la centrífuga ARN, los bastidores de tubos y pipetas. Garantizar la existencia de cajas de puntas con filtro dedicado para el uso de ARN. No utilice este equipo y el área de preparación de ADN, ya que esto va a contaminar las muestras. </li><li> Mezcla fresca 70%, y 80% de etanol con agua libre de RNasa. Preparar 1 ml por muestra a ser utilizada en la extracción de RNA. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Avanzada DMEM / F12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutamina </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> N2 suplemento </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> B27 (sin vitamina A) </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> NGF (50 g / ml) </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1. mezcla de reactivos para Ganglios solución de disociación (GADS). 3. Procedimiento de disección <ol><li> Llenar tubos de 1,5 ml con 500 l gads, uno para cada muestra experimental, una para un control positivo de clasificación, y uno para un control de clasificación negativa. tubos de las tiendas en el hielo a lo largo de la disección. </li><li> Diseccionar el ganglio nodoso y hacer dos cortes parciales para facilitar la disociación, a continuación, poner en el tubo de muestra experimental. Por favor refiérase a la siguiente protocolo JoVe para la disección de los ganglios nudosos 16 y 17 DRG. </li><li> Diseccionar y cortar parcialmente ganglios no marcado, como el ganglios de la raíz dorsal (DRG), para los controles de clasificación. Use dos ganglios para el control positivo y dos Gangliuna para el control negativo. </li><li> Para obtener suficientes neuronas nodose para la clasificación exitosa, se combinan los ganglios de 5 ratones en gads que contienen un tubo de la muestra experimental. </li></ol> 4. Los ganglios sensoriales disociación <ol><li> Pipetear a cabo 500 gads l, dejando ganglios en el tubo. Lavar los ganglios de una vez mediante la adición de 1 ml de PBS, esperar a que los ganglios que se depositan en el fondo del tubo, luego de la pipeta a cabo PBS. </li><li> Añadir 1 ml gads y 22 l de enzima de digestión (colagenasa I / II y la mezcla de proteasa, 2,5 mg / ml en H 2 O) a cada tubo. </li><li> Añadir 20 l Fast Blue (5.26 mm) en el tubo de control positivo. </li><li> Poner los tubos en un baño de agua o bloque de calefacción ya regulado a 37 ° C. Nota: El tiempo de digestión ganglios depende de la edad de la enzima de digestión. El plazo de 1 mes de la disolución de la enzima de digestión, digestión durante 30 minutos, dentro de 2 - 6 meses digieren durante 45 minutos. Si la enzima es más de 6 meses de edad, digerir los ganglios fo 60 min. </li><li> Cada tubos de agitación 15 min brevemente y la película de ellos para asegurar ganglios están cubiertas por la solución. </li><li> Mientras ganglios están siendo digeridos, preparar los gradientes de densidad utilizando una solución de partículas (partículas de sílice coloidal recubiertas con polivinilpirrolidona). <ol><li> Mezclar solución al 12% de las partículas en gads, 500 l por muestra. </li><li> Mezclar solución al 28% de las partículas en gads, 500 l por muestra. </li><li> Poco a poco y con cuidado añadir 400 l solución densidad de 12% en la parte superior de la solución de densidad de 400 l de 28% en un nuevo tubo de 1,5 ml para cada muestra. No permita que las dos capas se mezclen. Dos capas distintas deben ser visibles en el tubo; una más oscura que la otra. </li></ol></li><li> Mientras ganglios están siendo digeridos, etiquetar nuevos tubos de 1,5 ml de recolección para la clasificación (un tubo de Fast Blue positivo y uno negativo Fast Blue por muestra de clasificación). Dependiendo de los requisitos de las instalaciones de clasificación, estos tubos deben tener tapas desmontables de manera que no interferE con el separador de células. </li><li> Después de que el tiempo de digestión apropiada, retire gads con enzima de digestión y lavar dos veces con ganglios 1 ml de PBS. Añadir 200 l de gads frescos a cada tubo. </li><li> Utilice una pipeta de 200 l, ajustado a un volumen de 100 l, y los ganglios de la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las celdas. Repetir hasta que no se observa una pieza de tejido intacto. Evitar la creación de burbujas en la solución. </li><li> Pase células disociadas a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Añadir otros 100 gads l al tubo original de disociación para recoger todas las células restantes que quedan sueltos y pasar la solución adicional a través del filtro de células. Usando una nueva punta de pipeta, recoger el líquido que contiene células restante que ha pasado por el colador y aferrado a la malla. El volumen final de células suspendidas en gads es de 300 microlitros. </li><li> capa con cuidado los 300 l de células en la parte superior de la gradiente de densidad hecha previamente. Evitar las burbujas y mezcla de cells con las capas de densidad. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 2900 xg a TA. </li><li> Mientras que las células están en la centrífuga, la mezcla de tampón de lisis (1 ml por muestra experimental) como sigue: 10 l 2-mercaptoetanol en 1 ml de tampón RLT (del kit de extracción de ARN). <ol><li> Añadir 300 l de tampón de lisis para tubo de recogida positivo Fast Blue y 600 l a tubos de Fast Blue negativo recolección (tubos etiquetados desde el paso 4.7). Este volumen depende del número de células que se espera sean recogidos. Para &lt;2.000 células, añadir 300 l, para&gt; 7.000 células añaden 600 l. Esto asegurará que el fluido de revestimiento de clasificación no diluye significativamente el tampón de lisis. </li></ol></li><li> Una vez que se completa la centrifugación, retirar con cuidado y desechar la capa superior de 700 l. Esta capa contiene la mayoría de los residuos celulares que de otro modo interferir con la clasificación de células. </li><li> Añadir 700 l gads frescas a la célula restante solución y pipeta que contienete hacia arriba y abajo varias veces para mezclar. </li><li> Se centrifuga durante 15 minutos a 2.900 xg para sedimentar las células. </li><li> Mientras que las células están en la centrífuga, la mezcla de clasificación gads (500 l por muestra) mediante la adición de 5 l de ADNasa (10 mg / ml) a 1 ml gads. </li><li> Una vez que se realiza la centrifugación, retirar con cuidado y desechar el sobrenadante, dejando el sedimento celular. </li><li> Vuelva a suspender sedimento celular en 200 - 300 l de clasificación gads la pipeta hacia arriba y abajo con una pipeta 1.000 l ajustado a 200 l varias veces. Poner las muestras en hielo. Las células están listas para ser resuelto. </li></ol> 5. La fluorescencia de células activadas (FAC) Clasificación Nota: En esta sección se requiere conocimiento operativo de un clasificador FACS o la ayuda de personal especializado. <ol><li> Añadir 1 l de yoduro de propidio (PI) solución madre (50 mg / ml) a cada muestra para la prueba de viabilidad celular. Dividir control negativo en 2 tubos, uno con PI y otro sin él. PI se une al ADN sólo en las células muertas. Sidespués de las primeras clases que no hay células muertas de la etiqueta, no es necesario el uso de IP. </li><li> Células de transporte para citometría de flujo instrumento, por ejemplo., BD FACS AriaII que ejecuta el software de la diva 8, en el hielo. </li><li> Dado que el tamaño de la celda es variable en esta población, utilizar una gran boquilla (100 micras) para la clasificación. Para disminuir la cantidad de estrés de la experiencia de las células y aumentar la viabilidad de las células usar baja presión (20 psi). </li><li> Utilice el software clasificador FACS para establecer las parcelas de análisis, dispersión frontal, dispersión lateral (SSC), Fast Blue, y PI, si es necesario. </li><li> Para volver a suspender las células, vórtice suavemente la muestra brevemente antes de cargarlo en el clasificador. </li><li> Comience con el control negativo, sin Fast Blue o PI, para establecer el umbral de la puerta (Figura 2A). Esto determinará la cantidad de autofluorescencia en la población celular. Opcional: Ejecutar el ejemplo negativo con PI para identificar si existe una población de células muertas. </li><li> Ordenar la muestra de control positivo (incubated con Fast Blue), para establecer los parámetros de compensación. </li><li> Una vez que se establecen las puertas y los parámetros, comenzar a clasificar las muestras experimentales. Las muestras se clasifican en los tubos de recogida de preparados que contienen tampón de lisis de ARN. </li><li> Mantener las muestras clasificadas en hielo hasta que la clasificación de células se ha completado. </li><li> Comience etapa de extracción de ARN inmediatamente después se clasifican las células. </li></ol> 6. La extracción de RNA <ol><li> células clasificadas Vortex en tampón de lisis durante 1 minuto para homogeneizar. </li><li> Añadir 1 volumen de 70% de etanol y la mezcla pipeteando arriba y abajo varias veces. </li><li> Transferencia de hasta 700 l de la muestra a una columna de centrifugación. Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 x g. Desechar el flujo continuo. <ol><li> Repetir hasta que el volumen total de la muestra se hace pasar a través de la columna de centrifugación. </li></ol></li><li> Añadir 350 l de tampón RW1 y continuar el proceso de purificación de ARN, incluyendo la etapa de tratamiento de DNasa, de acuerdo con protoco del fabricantel para las células. </li><li> Una vez que se ha extraído el ARN, comprobar la calidad de ARN usando un sistema de electroforesis microfluídico de acuerdo con las especificaciones del fabricante. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método para dirigirse a las neuronas de la vía aérea-inervación en los ganglios nudosos del nervio vago. Una vez marcado, los ganglios se disocian suavemente para preservar de manera óptima el número de células y la viabilidad. Estas neuronas son entonces FAC ordenadas directamente en tampón de lisis y se extrae el ARN. La importancia de este protocolo es la posibilidad de dirigir, aislar y preservar la calidad de una población específica de células sensoriales. La expresión génica se describe en esta pequeña población de neuronas, y se identifican las funciones de órganos específicos y redes neuronales. Los pasos críticos en este protocolo incluyen una rápida progresión a través del proceso de disociación y la posterior clasificación de células. Es importante para programar el tiempo de clasificación de tal manera que comienza inmediatamente después de la disociación. También es fundamental que todos los reactivos de extracción de ARN son frescas, las soluciones de etanol 70% y 80% están recién hechas, y todos los tubos y equipos para la extracción de RNAestán limpias y libre de RNasa. Este protocolo puede ser modificada de tal manera que las células están ordenadas individualmente en placas de pocillos para la extracción de ARN de una sola célula y secuenciación. También se puede utilizar para aislar células procedentes de otros ganglios sensoriales, tales como ganglios de la raíz dorsal (GRD). Inyección de un contraste de diferentes partes del cuerpo para la búsqueda de los primeros GRD ha sido descrito previamente 17. Este protocolo también se puede modificar para recoger las células para el análisis funcional. En lugar de clasificar las células en tampón de lisis, las células se clasifican en medio de cultivo neuronal, gads. Estas células se cultivan a continuación y se utiliza para estudios funcionales tales como imágenes de calcio, o de electrofisiología. Si la población positiva Fast Blue es más pequeño que el resultado esperado, adquirir nueva enzima de digestión. La edad de la enzima de digestión se correlaciona con la eficiencia de la digestión. La enzima de digestión debe ser usado dentro de 1 año de compra. En el caso en que el número de células es alta,ARN se extrae y se puso a prueba la calidad. Si se degrada el ARN esto es una indicación de que los reactivos no son frescos, o han sido contaminados. En este caso, asegúrese de limpiar a fondo todas las áreas de extracción de ARN, pipetas, bastidores, y cualquier cosa que entrarán en contacto con los tubos de muestra. Hacer RNasa fresco y DNasa libre de 70% y 80% de etanol. El agua y el etanol utilizado para hacer estas soluciones también deben ser separados de los otros suministros de laboratorio y se utilizan únicamente para la extracción de RNA. FAC de clasificación es un método rápido y eficiente para el aislamiento de células positivas Fast Blue, sin embargo, una limitación es que la densidad celular debe ser de 1 a 2 millones de células por ml de tampón. Este protocolo empuja el límite de los modelos actuales de clasificación de células. El número de células en el ganglio nodoso es pequeño. Para obtener un rendimiento celular suficiente para el clasificador de células, se agruparon las células de cinco animales. El volumen de clasificación descrito es de 200 - 300 l y tiene menos de 100.000 células en suspensión. Tsus traduce en una concentración de alrededor de 450.000 células por ml, por debajo de la densidad recomendada. Una alternativa al uso de un clasificador de células es handpick con un microscopio y vidrio fluorescente pipeta 24. Esta técnica es más lento y se ha utilizado para recoger 30 - 100 células a la vez. Por lo tanto, este protocolo ofrece un método de alto rendimiento más rápido en comparación con los métodos existentes. Las aplicaciones futuras de este protocolo incluyen la capacidad para determinar el perfil transcripcional de una población específica de los nervios que inervan las vías respiratorias. El ARN de alta calidad recogidos usando este protocolo se puede utilizar como una plantilla para la síntesis de ADNc y secuenciación de próxima generación, y otras técnicas para caracterizar el transcriptoma de las neuronas recogidos. De esta manera, se puede determinar qué genes o vías son específicos para estas neuronas. Esta información ayudará a dilucidar el papel funcional de estas neuronas desempeñan en condiciones fisiológicas normales. Una vez básicalos patrones de expresión se han establecido, el sistema puede ser impugnada por los estímulos físicos y químicos o por patógenos para determinar sus efectos sobre la regulación de genes en las neuronas que inervan-pulmonar. Por último, mediante la identificación de los genes que son regulados podemos identificar nuevas dianas farmacológicas y empezar a investigar los efectos de la terapéutica para interferir con los cambios agudos y crónicos de la función nerviosa en enfermedades de las vías respiratorias.

nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados ​​por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estos nervios aferentes se encuentran en los ganglios sensoriales, tales como la raíz dorsal, trigeminal, o ganglios nudosos. Cada ganglio sensorial inerva regiones específicas del cuerpo y contiene células que inervan los órganos y tejidos separados dentro de esa región. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades, mientras que los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo, que contiene neuronas que inervan la cara, ojos, meninges o superiores vías respiratorias 1, 2. Los ganglios nodosos del nervio vago se encuentra en el cuello por debajo del cráneo y contiene cuerpos celulares que se extienden las fibras nerviosas en todo el tracto gastrointestinal, el corazón y las vías respiratorias inferiores y los pulmones 3. En los seres humanos el ganglio nodoso se encuentra solo, sin embargo, en el ratón se fusionacon el ganglio yugular, que también inerva los pulmones 4. Este ganglio fusionado a menudo se llama la yugular / nodose complejo, ganglio vagal, o simplemente ganglio nudoso 5. En este caso, se conoce como el ganglio nudoso. Las fibras aferentes de la nodose pasan la información de las vísceras al núcleo del tracto solitario (NTS) en el tronco cerebral. De entrada sensorial a este ganglio único controla una diversa gama de funciones, tales como la motilidad intestinal 6, la frecuencia cardíaca 7, la respiración 8,9, y las respuestas respiratorias irritantes activadas 10,11. Con esta diversidad de funciones y órganos inervados, es fundamental para dirigir y aislar subpoblaciones específicas de órgano del ganglio nudoso el fin de estudiar las vías neuronales individuales. Sin embargo, dado el pequeño tamaño de la nodose y el número limitado de neuronas que contiene esta no es una tarea trivial. Cada ratón ganglio nodoso contiene aproximadamente 5.000 neuronas 12Además de una extensa población de células de soporte satélite. De los 5.000 neuronas nodose, sólo un 3 - 5% de inervan las vías respiratorias. Por lo tanto, cualquier cambio funcionales, morfológicos o moleculares dentro de las neuronas que inervan las vías respiratorias, debido a la estimulación respiratoria o patologías, se perderán en el ganglio nodoso densamente poblado. Para resolver este problema, se desarrolló un método para identificar y aislar las neuronas que inervan las vías respiratorias. Las vías respiratorias se expusieron a un colorante indicador fluorescente para identificar a los posteriores neuronas que inervan nodose. Fast Blue fue recogido por las neuronas y se desplaza rápidamente a sus cuerpos celulares en los que se deberá conservarse durante un máximo de ocho semanas 13 - 15. Una vez identificado, un protocolo de disociación suave, pero eficaz se utiliza para conservar tinte de etiquetado y la viabilidad celular de células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación. Las células clasificadas se utilizan para extraer el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) para determinar la expresión de genes o fu otro análisis molecular de aguas abajo. Este protocolo proporciona una técnica útil y robusto para el aislamiento de las neuronas sensoriales que inervan un tejido de interés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="942">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Fast Blue</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:132px;">17740-2</td>
			<td style="width:248px;">stock 2 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N21482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">B27 (no vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6009</td>
			<td>stock 50 &#181;g/ml in PBS/10% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>stock 2.5 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">particle solution (Percoll)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Heating block</td>
			<td>LabNet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">70 um cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Absolute Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2484-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10328-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase kit, RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>stock 10 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

nervios somatosensoriales transducen térmica, mecánica, química, y los estímulos nocivos causados ​​por ambos agentes endógenos y ambientales. Los cuerpos celulares de estas neuronas aferentes se encuentran dentro de los ganglios sensoriales. Los ganglios sensoriales inervan un órgano específico o porción del cuerpo. Por ejemplo, el ganglio de la raíz dorsal (DRG) se encuentran en la columna vertebral y se extienden procesos en todo el cuerpo y las extremidades. Los ganglios del trigémino se encuentran en el cráneo y inervan la cara, y las vías respiratorias superiores. las vías aferentes vagales de los ganglios nodose se extienden por todo el intestino, el corazón y los pulmones. Las neuronas nodose controlan una gran variedad de funciones, tales como: frecuencia respiratoria, irritación de las vías respiratorias, tos y los reflejos. Por lo tanto, para entender y manipular su función, es crítico para identificar y aislar las vías respiratorias específicas subpoblaciones neuronales. En el ratón, las vías respiratorias están expuestos a un colorante indicador fluorescente, Fast Blue, para el rastreo retrógrado de las neuronas de la vía aérea específica nodoses. Los ganglios nodose se disocian y células activadas por fluorescencia (FAC) de clasificación se utiliza para recoger las células positivas de tinte. A continuación, el ácido ribonucleico de alta calidad (ARN) se extrae de las células positivas de tinte para la secuenciación de próxima generación. El uso de este método de la vía aérea se determina la expresión génica neuronal específico.

Usando este método, las neuronas que inervan las vías respiratorias se etiquetan mediante la instilación intranasal Fast Blue (Figura 1A). Después de dos días, las células Fast azul nombres aparecer en los ganglios nudosos (Figura 1C). Estas células constituyen 3-5% de la población neuronal total de los ganglios nudosos. Otros colorantes retrógradas que se han utilizado para este propósito incluyen DiI (1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetrametilindocarbocianina perclorato) y Fluorogold. la exposición pulmonar a las etiquetas con Dil nodose neuronas. Sin embargo, DiI lleva más tiempo alcanzar el ganglio, 7 - 14 días después de la instilación 18,19, por lo tanto, se utilizó un colorante transportado activamente. Fluorogold es un colorante transportado activamente que también ha sido utilizado para marcar las neuronas de las vías respiratorias 14,20. En nuestra experiencia, sin embargo, una vez que este colorante alcanzó los cuerpos celulares en el ganglio nudoso que fue recogido rápidamente por las células de satélite y no neuronas (datos no mostrados). AyunarEl azul es un suplente transporta de forma activa el tinte fluorescente de éxito, y rápidamente, etiquetas DRG en ratas 21 y las neuronas que inervan las vías respiratorias nodose 13,14. El enfoque de Fast Blue, por lo tanto, aparece más robusto y reproducible. La disección del ganglio nodoso se ha descrito previamente 16 y su ubicación se ilustra brevemente en la Figura 1B. La digestión comienza inmediatamente después de los ganglios nodose han sido extirpados. Para evitar que las neuronas se aglutinen y permitir una especie más limpio, utilizar una enzima de la digestión suave, limpiar los desechos y añadir RNasa a la solución de los ganglios de la clasificación. mezclas de enzima de digestión múltiples fueron probadas para la eficacia. Una mezcla de enzimas de digestión suave 22 se intentó, sin embargo, para la digestión ganglio adultos que no era lo suficientemente fuerte como para romper las células de una manera oportuna. Alternativamente, un usado previamente 23 combinación de la papaína, la proteasaY mezcla de enzimas de colagenasa, demostraron ser demasiado agresivo y causaron la muerte celular indeseable (datos no mostrados). El protocolo de la digestión se indica, con la mezcla de enzima se especifica, se encontró que era el ideal para una digestión oportuna con la viabilidad celular alta. Los métodos anteriores han utilizado células manual de picking con una pipeta de vidrio para separar las células marcadas a partir de células no marcadas 24. Esta técnica es más adecuada para el análisis de células individuales de un pequeño número de células. Sin embargo, con una tasa máxima de 48 células / hr esta técnica no es práctica cuando las poblaciones enteras de cientos o miles de células tienen que ser recogidos. Cuando el objetivo es aislar ARN de alta calidad, el tiempo se convierte en una variable clave. Es importante para comenzar la extracción de RNA tan pronto como sea posible para evitar la degradación. FAC clasificación permite la recogida de toda la población marcada en ~ 45 min y se inicia la extracción de RNA inmediatamente después. o: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Cuando se clasifican las neuronas es importante limpiar tanto los residuos de los procesos neuronales rotas. Un gradiente de densidad se utilizó para limpiar la suciedad de las muestras disociadas. Es importante centrifugar a una fuerza lo suficientemente elevado como para garantizar que las neuronas de fibras C, que tienen un radio pequeño, ~ 5 micras 24, son forzados a través del gradiente. Figura 2A y B muestran los controles positivos y negativos se utilizan para configurar las puertas de clasificación. Como puede verse en la Figura 2C, la disociada Fast Blue etiquetado células nodose tipo en dos poblaciones. El número de células recogidas de esta muestra se muestran en la Figura 2D. Clasificación de la eficiencia de este método es 73-85%. Al ordenar los parámetros de dispersión de las neuronas y de dispersión lateral hacia adelante no añadieron especificidad. Desde las neuronas no son esféricas estos parámetros fueron no puede informar de manera fiable tamaño de la celda. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Para rendimiento de ARN de alta calidad, las células necesitan ser ordenados directamente en el tampón de lisis y ARN debe ser extraído inmediatamente después de su clasificación Un sistema de electroforesis de microfluidos se utilizó para probar la. calidad de ARN (Figura 3). los 18S y 28S picos se determina a través de electroforesis en gel se utiliza para calcular un número de integridad del ARN (RIN). para RNA secuenciación de la muestra RIN debe ser mayor que 7. Esta muestra de ARN está ahora listo para ser secuenciados . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53917/53917fig1.jpg" /> Figura 1. Fast Blue Etiquetado de las vías respiratorias que inervan las neuronas en el nodose ganglios del nervio vago. A) Una representación de Fast instilación intranasal azul en los pulmones. Bajo anestesia con sevoflurano luz, pipeta de 40 l de Fast Blue en PBS con 1% de DMSO en la nariz de un ratón, lo que hace que el ratón está aspirando en el fluido. <strong&gt; B) Un diagrama que muestra donde se encuentra el ganglio nudoso. Aparece como un engrosamiento del nervio vago, que corre a lo largo de la arteria carótida. C) Después de al menos 2 días, Fast Blue aparece en los ganglios nudosos, marcando las neuronas de las vías respiratorias. El nodose se contratinción con rojo fluorescente Nissle mancha, que tiñe todas las neuronas. La barra de escala es de 100 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53917/53917fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53917/53917fig2.jpg" /> Figura 2. La fluorescencia de células activadas (FAC) Ordenación de Puertas de Fast células azules positivas. Para configurar la clasificación puertas utilizan el negativo (A) y positiva (B) controla para establecer la población positiva Fast Blue. El control negativo (A) se disocia células DRG THal no inervan los pulmones. El control positivo (B) se disocia células DRG que son incubados con Fast Blue in vitro, después de que han sido disecados. Debido a la forma no esférica de las neuronas disociadas, los parámetros de dispersión y de dispersión lateral por adelantado que no ayudarán a definir la población de células. C) Una especie representativa de disociado nodose células de los ganglios de los ratones cuyas vías respiratorias han estado expuestos a Fast Blue. D) La recuento de células para (C). Se recogieron más de 1.000 células Fast Blue (FB). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53917/53917fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53917/53917fig3.jpg" /> Figura 3. Evaluación de RNA de calidad y Asignación de RNA Integrity Number (RIN) usando un sistema de microfluidos electroforesis. El uso de un electorophoresis sistema de la calidad del ARN se calcula a partir de los picos 18S y 28S gel de la imagen representada en. El pico más bajo representa ARN degradado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53917/53917fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Un método para detectar y aislar las vías aéreas que inervan las neuronas sensoriales en ratones

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K vistas.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

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Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Investigación

Neurociencias

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus mediada por la manipulación genética y la visualización de las neuronas sensoriales olfativas In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash fotólisis de compuestos enjaulados en los cilios de las neuronas sensoriales olfativas

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Un método simple y barato para la Determinación de la sensibilidad al frío y Adaptación en ratones

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).