This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

기본 백혈병 세포 1. 호중구의 분리 및 공동 문화 참고 : 절차는 동의서에 서명 모든 환자와 리옹 병원 윤리위원회의 승인하에 실시 하였다. <ol><li> 기본 백혈병 세포 및 호중구의 분리 <ol><li> 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)으로 진단 된 환자에서 EDTA (혈액의 밀리리터 당 1.8 mg을 EDTA)에 말초 혈액의 튜브를 수집합니다. </li><li> 멸균 50 ㎖ 튜브에 혈액을 각각 15 ㎖에 첨가하고 15 ml의 RPMI로 희석 하였다 (희석 1 : 1)로 조심스럽게 천천히 위상 혼합없이 상기 튜브의 하단에 밀도 구배 용액의 15 mL로 추가한다. 밀도 구배 용액을 제조 RT에있을 수 있도록한다. </li><li> RT에서 브레이크없이 35 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 그림 1A, 위에서 아래와 같이 피가 네 가지 단계로 구분한다 : 혈소판과 혈장, 단핵 세포 (w하이트 링) 밀도 구배 용액 과립구 및 적혈구. </li><li> 새로운 50 ML 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전송에 기본 백혈병 세포를 나타내는 흰색 반지를 수집합니다. <ol><li> PBS로 튜브를 실온에서 10 분 동안 300g에 총과 원심 분리기에 50 ㎖까지 (칼슘과 마그네슘을 포함)를 입력합니다. </li><li> 5 PBS 후 RT에서 10 분 동안 300g로 원심 분리하고 총 50 ㎖의 PBS까지 추가 ml로 펠렛을 재현 탁. </li><li> 완전한 RPMI 배지로 펠렛을 재현 탁 (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 글루타민, 100 U 보충 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신) 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트. </li></ol></li><li> 대기음는 상위 단계 과립구와 적혈구 위상을 떠나 25 ml의 최대 PBS를 추가는 총 50ml로 0.9 % NaClup에 3 % 덱스 트란을 추가합니다. 튜브 10 번을 혼합하고 혼합하지 않고 실온에서 30 분 동안 보관하십시오. </li><li> 상단 RBC 부족한 호중구 층를 수집깨끗한 멸균 50 ㎖ 튜브로 배치하고 RT에서 10 분 동안 300g로 원심 분리 튜브 거라고. PBS 후 총 50 ㎖까지 적혈구 용해 완충액을 추가 5 ㎖ 각 펠렛을 재현 탁. </li><li> RT 후 RT에서 10 분 동안 500g으로 원심 분리기에서 15 분 동안 어두운 데에서 튜브를 유지한다. PBS로 알약을 (총 50 ㎖까지 PBS를 추가) 다음 실온에서 10 분간 500 g에서 원심 분리 세척 할 것. </li><li> 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지 펠렛을 재현 탁. 유세포 사용하여 분리의 순도를 결정하기 위해 5 ㎖ 플라스틱 튜브에 50 ㎕의 PBS-FBS (4 %)에서 각 세포 유형의 3 × 105을 유지한다. </li></ol></li><li> 분리 된 세포 집단의 형태 학적 출연 분석 <ol><li> 이를 위해, 각각 3 × 104 호중구 150 μL 완전 RPMI 배지에서 3 × 104 단핵 세포를 재현 탁. 즉 t을 보장 cytospin 원심 분리기에서 유리 슬라이드 필터 카드 및 샘플 챔버를 조립그는 원심 분리기는 균형이다. </li><li> 원심 분리기에서 슬라이드, 필터 카드 및 샘플 실을 제거 실온에서 10 분 동안 750 XG에서 샘플 챔버 및 사이토 원심 분리기로 각 셀 유형을 놓습니다. 슬라이드의 세포를 손상시키지 않도록 신중하게 분해한다. 필터 카드 및 샘플 챔버를 폐기하십시오. </li><li> 김사 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하고 1 시간 건조 할 슬라이드를 유지합니다. 100X 배율 현미경으로 세포를 검사합니다. </li></ol></li><li> FACS에 의해 고립 된 세포의 순도 테스트 <ol><li> APC에 접합 된 항 - 인간 CD19 항체 (5 μL / 10 6 세포)와 격리 된 차 백혈병 세포를 레이블. 표 1 (5 μL / 10 6 세포)에 나열된 항 인간 항체의 혼합물로 정제 된 호중구 레이블. 4 O ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 세포를 부화 </li><li> 500 ㎕의 PBS-FBS (4 %) RT에서 5 분 동안 300g의 튜브를 원심 분리기로 세포를 씻으십시오. </li><li>200 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 각 펠렛을 재현 탁. </li><li> , SSC-A (488 /이 10bp), FITC (BP 530/30)를 PerCP-Cy5.5 (40분의 695 BP FSC-A (488 nm의) : 488 nm의 레이저 : 다음 광학 구성을 사용하여 사이토 흐름 분석 ), PE (BP를 575/26); 633 nm의 레이저 : APC (BP를 660/20), APC-Cy7 (BP를 780/60). 색 보정을 확인합니다. </li></ol></li><li> 자가 호중구와 차 백혈병 세포의 공 배양 <ol><li> 시드 차 백혈병 세포 단독으로 또는 완전 RPMI 배지에서 비 1:10자가 호중구로 2 × 105 세포 / ml. 이렇게 희석하여 세포 현탁액을 세포 수를 조절하고 2 × 106 세포 / ml로 호중구 주 백혈병 세포를 2 × 105 세포 / ㎖를 추가한다. 조심스럽게 섞는다. </li><li> 세포에의 Bruton의 티로신 키나제 (BTK) 억제제 (ibrutinib)의 25 μM을 추가합니다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 24 시간 동안 품어. </li></ol></li><li> 세포 수확 및 FACS 분석 <ol><li> 콜요법 FACS 분석 및 원심 분리기 RT에서 5 분 동안 300g의 튜브 5 ML의 플라스틱 튜브에 세포. 다음 실온에서 5 분간 300 g에서 원심 분리기 1 ml의 PBS-FBS (4 %)와 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 상업 키트를 사용하여 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 세포를 배양 재현 탁의 넥신 V의 펠렛 및 PI. (FSC-A (488 ㎚), SSC-A (488 /이 10bp), FITC는 (BP 530/30), PI 610 : 488 nm의 레이저 :도 2A의 게이트 전략을 사용하여 유세포과 같은 광학 구성에 분석 / 20 BP). 색 보정을 확인합니다. </li></ol></li></ol> 과립 통로 및 3D 모델에서 RL 림프종 B 세포와의 공동 배양을 따라 HL60 세포의 분화 (2) <ol><li> 호중구와 같은 세포로 인간 전 골수성 (HL60) 세포의 분화 <ol><li> / ㎖가 그들의 분화를 유도하기 위해 1 μm의 레티노 산 (RA) 및 1.25 %의 DMSO를 추가 3 × 10 5 세포에 HL60 세포 수를 조정합니다. 각 3 × 10 5 종자 </s최대&gt;도 48 웰 플레이트 당 HL60 세포는 5 % CO 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다. </li><li> 그 후, 실온에서 5 분 300g에 세포와 원심 분리기를 수집합니다. 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지로 세포를 재현 탁. </li><li> 이어서 용액 3 × 105 세포 /으로 HL60 세포의 수를 조정하고 1 μM 레티노 산 (RA) 및 1.25 % DMSO를 첨가하여 다시 분화를 유도하는 완전 RPMI 배지에서 세포 현탁액을 희석. 당 잘 48 웰 플레이트에 각 3 × 10 5 HL60 세포를 종자와 5 % CO 2와 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 배양한다. </li></ol></li><li> HL60 분화 분석 (HL60의 차이) <ol><li> 세포를 수집하고 RT에서 5 분 동안 300g로 원심 분리 튜브. 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지 펠렛을 재현 탁. </li><li> 유동 세포 계측법에 의한 세포 표면 마커의 발현에서의 변화를 분석. 각 3 × 10 (5)를 배치 </suP&gt; 미분화 (세포 배양에서) HL60 세포와 FACS 분석 및 원심 분리기 RT에서 5 분 동안 300g의 튜브 5 ML의 플라스틱 튜브에 3 × 10 5 HL60은 diff 세포. </li><li> 50 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 펠렛을 재현 탁. AF700 또는 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38 (5 μL / 10 6 세포)에 접합 된 항 - 인간 CD11b를 가진 세포를 레이블. 4 O ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 세포를 부화 </li><li> 다음 실온에서 5 분 300g에 원심 분리기 500 μl의 PBS-FBS (4 %)로 세척. 200 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 488 nm의 레이저 :도 3A의 게이팅 전략과 같은 광학 구성을 이용하여 유동 세포 계측기에 분석 FSC-A (488 나노 미터), SSC-A (488 /이 10bp); 633 nm의 레이저 : APC (660/20 BP), 알렉사 플 루어 700 (BP를 730/45). </li><li> HL60은 diff의 형태 학적 변화를 테스트하려면, 현미경 검사 용 유리 슬라이드에 세포를 고정. <ol><li> 이렇게하려면 각 3 × 10을 재현 탁 <su(세포 배양)에서 P&gt; 4 미분화 HL60 세포 150 μl를 완전 RPMI 배지에서 3 × 10 4 HL60은 diff. 원심 균형 것을 보장 cytospin 원심 분리기에서 유리 슬라이드 필터 카드 및 샘플 챔버를 조립한다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 1,500 rpm으로 샘플 챔버 및 사이토 원심 분리기로 각 셀 유형을 놓습니다. 원심 분리기에서 슬라이드, 필터 카드 및 샘플 실을 제거합니다. 슬라이드의 세포를 손상시키지 않도록 신중하게 분해한다. 필터 카드 및 샘플 챔버를 폐기하십시오. </li><li> 김사 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하고 1 시간 건조 할 슬라이드를 유지합니다. 100X 배율 현미경으로 세포를 검사합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 3 차원 (3D) 문화 주 :이 실험에 사용 된 물질은 저온이며 실험 얼음 일어나고 있는지 확인. <ol><li> 단독으로 또는 HL60은 diff와 혼합하거나, 각 5 × 10 4 RL 세포를 재현 탁 </em&gt; 비 RL에서 : HL60의 DIFF 1:10 약 2 내지 3 mm의 개구부를 넓게하기 위해 멸균 가위로 절단 한 ml의 피펫 팁을 사용하여 300 ㎕의 기저막 매트릭스. 이 단계에서 거품을 피하십시오. </li><li> 24 웰 플레이트에 잘 / 세포 현탁액 각각 300 μl를 시드. 이 단계에서 거품을 피하십시오. 그 다음 각 웰에 대해 RPMI 배지를 완료하고, 5 % CO 2, 37 ℃에서 7 일간 배양한다 ㎖로 1을 추가 5 % CO 2, 37 ℃에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다. 매 2 일 매체를 변경합니다. 하루 5에서 10 나노 빈 크리스틴을 추가합니다. </li></ol></li><li> FACS 분석 <ol><li> 문화 7 일 후, 매체를 대기음 두 번 1 ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 각 웰을 씻는다. 3 ㎖ / 얼음처럼 차가운 PBS-EDTA (5 mM)을 잘을 추가합니다. 200 μL 피펫 팁의 바닥을 이용하여 긁어 웰의 바닥에서 겔을 분리. 30 분 동안 얼음에 부드럽게 판을 흔들어. </li><li> 멸균 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 IC에 부드럽게 튜브를 흔들또 다른 30 ​​분 동안 전자. 균일 한 세포 현탁액의 모양을 확인합니다. (이 경우가 아니라면, 다음 긴 시간 동안 세포를 흔들 이상의 PBS-EDTA 추가). </li><li> RT에서 10 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리기. PBS로 펠릿 후 RT에서 10 분 동안 300 × g으로 원심 분리로 세척 하였다. </li><li> PBS-FBS (4 %)으로 재현 탁 및 PE Cy7하고 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38 항체 (5 μL / 10 106 세포)를 접합 항 - 인간 CD19 항체 레이블. 4 오 ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 품어 </li><li> 실온에서 5 분 동안 300g에 500 ㎕의 PBS-FBS (4 %) 원심 분리기 튜브로 씻으십시오. 상업용 키트를 사용하여 아 넥신 V 및 PI로 세포를 재현 탁. </li><li> 도 4a의 게이팅 전략을 사용 사이토 흐름을 분석하고 다음 광학 구성 : 488 nm의 레이저 : FSC-A (488 ㎚), SSC-A (488 /이 10bp), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm의 레이저 : APC (BP를 660/20). 색 보정을 확인합니다. </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion.">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+Inflammation,+and+Cancer.">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li><li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells,+relieves+immunosuppression,+and+improves+chemotherapeutic+responses.">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy.">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions.">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li><li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Cinderella+of+innate+immune+system.">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li><li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li><li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes.">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. F&#252;rKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li><li>Aynaud, M. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A.">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li><li>Zi&#242;&#322;kowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip.">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li><li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers.">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li><li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc&#947;RIIIB+and+Mac-1.">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via Fc&#947;RIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li><li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids.">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606 (2012).</li><li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+advance:+autofluorescence-based+sorting:+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production.">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments.">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586 (2013).</li><li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo.">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li><li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+neutrophils.">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li><li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3.">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li><li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells:+Their+contributions+to+tumourigenesis.">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li><li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+cultures:+current+trends+and+beyond.">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li><li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Neutrophils,+and+Cancer:+A+Double+Edged+Sword.">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940 (2014).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li><li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment:+role+of+myeloid+cells.">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4.">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li><li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03.">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression.">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

밀도 구배 원심 분리 방법을 이용하여 고순도의 인간 혈액 호중구의 분리를 위해 동일한 단계 단핵 세포 내에서, 여기에 효과적인 간단한 빠르고 저렴 프로토콜 설명도 분리 회수된다. 분리 된 세포 집단은 ≥90 % 순수 있습니다. 여러 가지 방법 인간의 혈액에서 호중구의 분리에 사용할 수 있습니다. 이러한 불연속 그라디언트 (11, 12)를 사용하거나 호중구는 면역 자기와 같은 후 CD16-의 결합에 의해 농축 호중구 항 - 인간 CD16으로 특정 항체로 표지되는 동안 긍정적 인 면역 자기 선택에 의해 호중구 격리를위한 상업 키트를 사용하여 유사한 방법을 포함 자기 열 (13)에 양성 세포. 음의 면역 자기 선택과 상업 키트는 전혈 또는 과립구 정지 세포의 다른 그쪽에 결합하는 항체의 칵테일로 표지하는 동안도 사용할 수 있습니다n은 호중구 9 (즉, 적혈구, 혈소판 등 CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, 글리코 포린 A와 덱스 트란 코팅 된 자성 입자와 같은 원치 않는 세포를 라벨 항체 복합체), 다음 호중구는 항체로 용출에 의해 강화된다 자기 컬럼에 결합하지 않는 세포의 부정적인 부분. 또한, 호중구 형광 활성 세포 분류 (14)에 의해 분리 될 수있다. 일부 기술은 같은 양의 면역 자기 선택과 같은 순수한 호중구의 높은 수익률을 제공하는 것으로 나타났다. 그러나,이 방법은 호중구의 표면에 결합하고 이러한 잠재적으로 활성화 또는 분화를 유도함으로써 기능을 변경할 수있는 라벨 제제로 인한 밀도 구배 원심 분리 방법에 비해 단점이있다. 또한 포지티브 면역 자기의 선택에있어서, 분리를위한 자기 열에 항체 표지 호중구 바인딩을 사용하고 또한이 그 기능에 영향을 미칠 수있다.이 방법은 부정적으로 호중구의 생존에 영향을 미칠 수있는 세포를 수집하기 위해 긴 시간을 필요로 형광 활성화 된 셀 정렬은 그들의 짧은 반감기로 한, 다른 제한이 있습니다. 밀도 구배 원심 분리 방법은 매우 비슷하며 호중구 순도 양쪽 방법을 사용하여 90 %를 초과 할 수 있지만, 전자는 40 %, 60 %, 80 부피 %로 구성 레이어 구배 용액에 비해 기술적으로 덜 도전 이중층 구배 / PBS에서 권. 그것은 세 의한 층간 작은 밀도 차이 Swamydas 외. 구배 용액 인터페이스 상호 혼합은 종종 일어나는 것을 15으로 언급 하였다. 음의 자기 면역 선택 방법과 관련하여, 이들은 또한 고순도 생존 9 호중구의 분리를위한 효과적인 것으로보고되었다. 긍정적 인 면역 자기 선택과 형광 활성 세포 정렬을 통해 그들의 장점은 호중구입니다임의의 표지 제와 표지되지 않으며, 따라서 세포의 활성화를 방지 자기 컬럼에 결합하지 않지만,이 방법은 많은 비용과 많은 시간 밀도 구배 법에 비해 소비이다. 호중구는 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 모두에서 급속한 16,17 자연 세포 사멸을 겪는다. HL60promyelocyticcells 18은 호중구로의 분화를 겪게 할 가능성 인간 백혈구 전구 세포의 여러 특성을 유지한다. 호중구는 달리, HL60은 diff 세포는 빠르게하지 않는 세포 사멸을 받아야하고 이러한 세포를 사용하기 때문에 다른 기증자로부터 자신의 고립에 호중구의 다른 응답을 갖는 문제를 해결합니다. 최근, 3D 문화는 인간과 동물 생리학, 특히 암 분야에서 다른 생물학적 연구를위한 매력적인 모델에 더 성숙하고 해당된다. 3D 문화의 차원에서 패턴 변화는 빠르게 SI 진행후자의 NCE 암 (19)과 같은 다양한 병리 적 상태로 공부하는 동안 더 눈에 띄는 것입니다. 셀의 환경에 세 번째 차원을 추가하면 세포의 상호 작용 (20)의 중요성에 대해 자세히 살펴하고 세포의 행동과 특성의 차이를 연구하기 위해 중요 2D 문화의 단점의 인식이 증가하고있다. 3D 문화의 관련성 연구에 선도적 인 살아있는 유기체의 조건과 유사한 환경 (예., 인간)을 만듭니다. 그러나, 3 차원 배양은 세포 외 기질 및 2D 문화에 존재하지 않는 간질 성 유체와 같은 다른 파트너들 사이의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 따라서, 노력이 주문 방법 교정을 수립하고 특히 좋은 실험실 관행뿐만 아니라 효과적인 공급 광범위하게 테스트 및 모니터링 상업 브랜드에 계산에 필요합니다. 종양 미세 환경에 참여하고 항암제 (21, 22)에 종양, 전이 및 응답을 조절하는 많은 면역 세포 인구를 포함한 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다. 몇몇 연구는 종양에서 호중구 침윤의 증가가 현저 안티 VEGF 치료 23,24 여러 항암제를 획득 내성과 상관되는 것을 보여 주었다. 또한, 전처리 호중구에서 상승 전이성 신장 세포 암 (25)뿐만 아니라, 다양한 고형 종양 환자 내 종양 호중구의 높은 수준의 존재하에 환자 카운트 (26)가 불량한 생존 예후 인자로서 제시되어왔다. 본 연구에서 호중구 항암제 - 유도 아폽토시스로부터 B 림프종 세포를 보호하는 역할을 할 수 있음을 시사한다. 요약하면, 여기에 설명 된 신뢰성 및 재현성이 방법은 잡음으로부터 호중구 및 단핵 세포를 수집 할 수있는 기관에 의해 사용될 수있다혈액. 또한, 과립 통로 따라 HL60 세포의 분화는 이러한 급속한 자발 아폽토시스 일부 neurophil 문제를 회피하기 위해 제공된다. 호중구는 2D 및 3D 배양 시스템을 사용하여 이들 제제에 대해 림프종 세포에 대한 보호 효과를 보여 여기서 이러한 방식은 안티 림프종 에이전트 림프종 세포의 민감도 호중구의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 이러한 접근 방법은 암 생물학에서 호중구의 역할에 대한 우리의 이해를 깊게한다 호중구의 기능 연구의 다양한 사용할 수 있습니다. 특히이 방법은 더 호중구 및 종양 세포 간 또는 호중구 및 미세 환경의 다른 컴포넌트들 사이의 크로스 토크를 이해하기 위해 사용될 수있다.

선천성 면역 세포는 종양 미세 환경 내에서 세포의 중요한 비율을 구성하는 환자, 암 (1)의 동물 모델에서 종양의 암과 연관되어왔다. 최근에,보다 널리 만성 면역 반응은 화학 요법에 대한 종양이 진행, 전이 저항 증진에 중요한 역할을하는 것으로 인식되고있다. 식세포 직접 화학 요법에 3,4- 종양 세포 반응을 조절하는 것으로 나타났다 중요한 선천성 면역 세포이다. 그러나 항암 치료에 대한 종양 반응을 조절하는 호중구의 선천 면역 키 선수의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 프로토콜의 목적은 CLL 환자의 혈액 샘플로부터의 호중구를 분리하는 빠르고 신뢰할만한 방법을 사용하여 안티 림프종 에이전트 림프종 세포의 민감도를 조절하는 역할을 연구하기 위하여 과립 통로 따라 HL60 세포를 구별한다. 6 침입에 대한 방어의 첫 번째 줄 혈액 (5) 행동의 선천성 면역 시스템의 가장 풍부한 세포의 구성 요소입니다. 호중구 여러 병리 적 상태 (7)에 가변 이펙터 기능 이외에 유효 선천성 면역 반응을 상승에 필수적인 역할을한다. 따라서, 이러한 농도 구배 분리법과 같은 다른 혈액 세포에서 호중구를 분리하는 빠르고 신뢰할만한 방법은 시험 관내 연구에 필요하다. 호중구 격리를 위해이 방법을 사용하면 생체 내 및 생체에서 호중구 매개 면역 기능에 대한 추가 연구를 촉진 할 것이다. 호중구 순수한 집단을 수득하는 능력은 면역 학적 질환 환자의 팔 조사 중요한 첫 단계이다. 밀도 구배 분리 방법은 세포의 높은 수율을 수득하는 이상적인 방법이다. 운전 방식D는 쉬지 않고 35 분 동안 300g으로 원심 분리 한 다음 희석 된 인간 혈액을 함유하는 튜브의 바닥에서 밀도 구배 용액의 첨가를 포함한다. 단핵 세포의 링 인터페이스에 표시하고, 호중구 전 이하 상주. 이 방법은 훨씬 더 9 비싼 호중구 분리 키트로 사용 가능한 다른 방법에 대한 상당한 이점이있다. 또한, 인간의 호중구에 대한 특정 표면 마커에 관한 항체를 사용하여 상업용 키트에 의해 인간 혈액으로부터 분리 호중구 세포 활성화 또는 분화의 위험을 증가시킨다. 밀도 구배 분리 방법은 단시간 호중구의 분리를 허용한다. 동일 단계 내에서 단핵 세포는 분리 회수된다. 순수한 세포의 높은 수율 무결성 기능을 달성하기 위해 수득되는 기본 기술이다. 종양 microenv을 모방하기 위해ironment, 3 차원 실험을 수행 하였다. 체외에서 호중구의 짧은 반감기를 고려할 때, 신선한 인간의 호중구와 3D 실험은 결정적인 없습니다. 이런 이유로, 전 골수성 (HL60) 세포 분화 유도제 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 및 레티노 산 (RA)를 사용하여 호중구와 같은 세포로 분화 유도된다. 차별화 된 HL60 세포 (HL60은 diff)를 사용하여 인해 다른 기증자로부터 격리에 호중구의 다른 응답을 갖는 것을 방지 할 수 있습니다. 체외 차원에서 문화 모델은 체외 2D 모델 사이의 생체 내 모델에서 중간 단계를 나타냅니다. 2D 문화에서, 세포는이 합성 표면에 변성되어 퇴적 단백질에 자연스러운 세포의 첨부 파일을 형성하는 플라스틱 표면에 확산. 반대로, 세포가 세포 외 기질의 합성 보낸 3D 배양 형태 천연 세포 - 세포 부착에 세포는 이들이 결합되어있는 천연 물질이다.이러한 이유로, 특히 암 세포 및 다른 세포 유형 간의 3D 공동 배양 모델은 종양 성장, 혈관 신생 및 전이에 대한 기여를 나타내는 매우 유용한왔다. 결과적으로, 3 차원 배양은 세포 배양 물이 생체 내 (10)에 존재하는 생리적 조건을 모방 할.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1161">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">21875-034</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:156px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bruton&#39;s tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">CliniSciences</td>
			<td style="width:156px;">A3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine&#160;</td>
			<td style="width:157px;">EG labo</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">BD Matrigel basement membrane matrix&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>Put at 4 oC overnight before the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Red cell lysis buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll (Pancoll)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td style="width:156px;">P04-60500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Annexing V-FLOUS staining kit&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Roche</td>
			<td>11&#160;988&#160;549&#160;001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit</td>
			<td style="width:157px;">Cosmos Biomedical</td>
			<td style="width:156px;">CB361550-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica DMR-XA microscope</td>
			<td style="width:157px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter</td>
			<td style="width:157px;">Nexcelom&#160; Bioscience</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil isolation and analysis to determine their role in lymphoma cell sensitivity to therapeutic agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

흰색 환 단핵 세포이고, 혈소판 혈장 :. 여기에 설명 된 농도 구배 분리법은 CLL 환자의 혈액에서 분리 된 일차 백혈병 세포 및 자극되지 호중구도 1a는 위에서 아래로 (밀도 구배 원심 분리 후의 다른 혈액 층을 나타낸다 제공 밀도 구배 용액, 과립구 및 적혈구).도 1b 및 1c는 각각 호중구 (멀티 로브 핵 세포)와 단핵 세포의 형태 학적 외관의 차이를 나타낸다. 그림 1D의 결과는 기본 백혈병 세포 (단핵 세포)의 측면 산란 (SSC) 플롯 대 전방 산란 (FSC)을 나타냅니다. 하나와 히스토그램 (그림 1E)의 전체 오른쪽 시프트는 APC에 접합 된 항 - 인간 CD19이 인구를 보여줍니다 라벨 붙이기이 인구는 CD19과 순수에 대한 긍정적 인 것을 나타냅니다 피크. 세포 계측법 표 1에, 형광 접합 된 단일 클론 항체의 혼합물로 분리 된 호중구 라벨 후 흐름에 의해 확인으로 호중구는 ≥90 % 순수하다. 그림 1 층은 CD45에 대한 긍정적 고립 된 호중구의 SSC의 산점도 대 FSC (그림을 나타냅니다 1G), CD14 (그림 1H에 대한 CD15 양성 및 음성), CD56 (그림 1J를 들어, CD15 및 CD16 (그림 1I) 모두 긍정적 인 긍정적 인 CD16 및 음수). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig1.jpg" /> 환자들의 혈액에서 고립 된 형태 학적 외관 및 기본 백혈병 세포의 순도 및 호중구의 그림 1. 분석. (A) 개략도 밀도 GRADI 후 다른 혈액 층을 나타낸다엔트 원심이. (BC) 김사 염색 (B) 및 호중구 (C) 주요 백혈병 세포 (단핵구)의 형태의 차이를 나타낸다. 사진은. 100X 배율 현미경으로 촬영 (D) 앞으로 산란 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 플롯은 고립 된 차 백혈병 세포 인구를 나타냅니다 하였다. (E) 절연 차 백혈병 세포는 항 CD19-APC와 함께 표시 하였다 CD19의 발현을 분석 하였다. 빨간색 선은 레이블이없는 세포를 나타내고 파란색 선은 항 CD19-APC로 표지 세포를 나타냅니다. (F) FSC는 SSC의 산점도 대 고립 된 호중구 인구를 나타냅니다. (GJ)에 격리 된 호중구 표에 나와있는 항체의 혼합물로 표지 된 (1) 및 (G) CD45 (H) CD14 및 CD15, (I) CD15과 CD16, (J) CD16의의 발현 분석D CD56입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 항원 </td><td> 형광 색소 </td><td> 복제 </td></tr><tr><td> CD14 </td><td> APC-Vio770 (CY-7) </td><td> TÜK4 </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> APC </td><td> VIMC6 </td></tr><tr><td> CD16 </td><td> FITC </td><td> VEP13 </td></tr><tr><td> CD45 </td><td> 를 PerCP-Vio700 (Cy5.5) </td><td> 5B1 </td></tr><tr><td> CD56 </td><td> 체육 </td><td> AF12-7H3 </td></tr></tbody></table> 표 1. 형광 색소 - 복합 정제 된 단일 클론 항체는 고립 된 호중구의 순도를 테스트하는 데 사용됩니다. 모든 항체가있는 Miltenyi 생명 공학에서 얻어졌다. <p class="jove_content"fo를 : 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 주 백혈병 세포 (CLL) ibrutinib하는 감도에 호중구의 효과를 조사하기 위해, 후자는 단독으로 또는 비 N에서 24 시간 동안자가 호중구 (N)와 함께 배양 하였다 25 μM의 존재 또는 ibrutinib의 부재에서 1 : CLL 10. 살아 기본 백혈병 세포 (네거티브 넥신 V 제외 / PI)의 비율은 유세포 분석 하였다 넥신 V-FITC와 PI 이중 염색에 의해 측정 하였다. 도 2a에서 SSC의 산점도 대 FSC는 호중구 및 기본 백혈병 세포의 문을 나타냅니다. 호중구는 훨씬 더 세분화 된 기본 백혈병 세포가 그래서 그들은 더 높은 SSC와 함께 표시보다 있습니다. ibrutinib의 존재 호중구와 공 배양 차 백혈병 세포상의 게이팅 결과는 살아있는 세포의 높은 비율 단독 배양 된 세포와 비교하여 (도 2C, 84.8 %) (도 2B, 53.1 %)을 나타낸다. 그림 2D의 상자 그래프는 그 decreas를 보여줍니다ibrutinib에 의해 유도 된 세포 생존의 전자는 크게 호중구의 존재 (40.1 ± 3.1 대 60.1 ± 3.5, P &lt;0.001, 19 명)에 의해 억제되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig2.jpg" /> 2.자가 호중구가 Ibrutinib. 혈액에 대한 기본 백혈병 세포를 보호 그림은 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)으로 진단 된 환자에서 수집되었다. 기본 백혈병 세포는 격리 및 기본 백혈병 세포에서자가 호중구 (N)와 단독 또는 함께 배양 하였다 : 24 시간 동안 Nratio 1:10 존재 또는 25 μM의 ibrutinib의 부재이다. 라이브 차 백혈병 세포의 비율 (Annexiv V 음 / PI 부정적인)는 유세포 분석에 의해 다음 넥신 V-FITC와 PI 이중 염색에 의해 측정 하였다. (A) 앞으로 산란 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 줄거리는 호중구 및 기본 백혈병 세포의 문을 나타냅니다. (B) 양성 차원 도트 오 살아과 세포 사멸 차 백혈병 세포 만 배양 및 25 μM의 ibrutinib 처리의 비율을 보여줍니다. (C) 양성 차원 도트 오 살아과 세포 사멸 차 백혈병 세포의 비율이 공동 -를 보여줍니다 호중구 배양 및 25 μM의 ibrutinib 처리 하였다. (D) 박스 플롯은 19 명의 살아 기본 백혈병 세포의 비율을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. *** p &lt;0.001 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 체외에서 호중구의 짧은 반감기는 3D 문화에서의 사용은 비효율적합니다. 과립 경로를 따라 HL60 세포의 분화는 분화 유도 물질에 의해 유도했다. 두 개의 다른 매개 변수 (세포 표면 마커의 발현 및 형태학 창ES) HL60의 분화를 측정하는 데 사용 하였다. 도 3a에서 SSC 분산 플롯 대 FSC는 HL60 세포가 더 높은 FSC와 HL60은 diff 세포에 비해 크기가 더 큰 것으로 나타났다. 과립 분화의 나타내는 분화시 CD11b를 증가 및 CD38 발현 (그림 3b는) AF700 및 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38antibody에 접합 된 항 - 인간 CD11b를 항체와 세포 (HL60 또는 HL60은 diff)를 보여줍니다에 레이블. HL60은 diff 세포는 또한 멀티 잎 모양 핵 (그림 3C)의 모양에 의해 검출 된 형태 학적 변화를 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig3.jpg" /> 그림 3. 차별화 된 HL60 세포의 구조 매개 변수. (A) 앞으로 산란 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 플롯 HL60 차별화 된 HL60 세포 (HL60은 diff)를 나타냅니다. (B) HL60 및 H를L60은 diff 세포 유동 세포 계측법 분석 하였다 항 -CD11b-AF700 또는 항 CD38-APC으로 표시 하였다. SSC-A 산점도 (A) 대 FSC-A의 각 세포 집단 게이팅 후, 세포는 CD11b 또는 CD38의 발현에 대해 분석 하였다. (C) HL60 세포는 과립구쪽으로 분화와 일치하는 형태 변화를 나타낸다. 사진은 100X의 배율 현미경으로 촬영되었다. 굵은 검은 색 화살표는 다중 잎 모양 핵을 가리 킵니다. 그래프 다섯 독립적 인 실험의 대표입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 3D 모델에서 빈 크리스틴에 RL 세포 반응을 조절하기에 HL60의 DIFF 세포의 효과를 시험하기 위해, RL 세포는 단독으로 또는 10 N에서 빈 크리스틴의 유무에 기저막 매트릭스 HL60의 DIFF 배양 하였다도 4a에 도시 된 게이팅 전략을 사용 M.은 두 집단은 CD19 및 CD38 발현에 기초하여 판별된다; CD38 양성 CD19 및 HL60은 diff 셀에 대한 긍정적 인 RL 세포. 빈 크리스틴의 존재하에 HL60 diff의 세포와 공동 배양 된 RL 세포상의 게이팅 결과는 살아있는 세포의 높은 비율 단독 배양 RL 세포에 비하여 (도 4C, 35.9 %) (도 4b, 19.7 %)을 나타낸다. 도 4d에 막대 그래프는 HL60의 DIFF 세포 (19.5 ± 0.2 대 33.1 ± 1.0, p &lt;0.001)의 존재 하에서 살아있는 RL 세포의 비율이 크게 증가 (음 CD19 양성 아 넥신 V / PI 음극)을 나타낸다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig4.jpg" /> 그림 4. 호중구와 같은 HL60은 diff 세포는 3D 문화에 빈 크리스틴에 대한 RL 림프종 세포를 보호합니다. RL 세포를<html> 기저막 매트릭스에서 7 일간 HL60 DIFF 비 1시 10분 : RL에서의 DIFF HL60 세포를 단독으로 또는 함께 배양 하였다. 5 일째에, 빈 크리스틴 (VCR)는 10 nM의 농도로 첨가 하였다. 구 상체는 7 일째에 분해하고, 세포를 유세포 분석 하였다 넥신 V-FITC와 PI로 재현 탁 항 CD19-PECy7 및 항 CD38-APC로 표지 하였다. (A) 앞으로 산란 (FSC) 및 측면 산란 (SSC)의 플롯 RL 세포와 HL60은 diff 세포의 문을 나타냅니다. (B) 양성 차원 도트 오 혼자 배양 및 10 나노 빈 크리스틴으로 치료 살아있는 세포 사멸 RL 세포의 비율을 보여줍니다. (C) 양성 차원 도트 형, 얼룩은 HL60은 diff와 공동 배양 및 10 나노 빈 크리스틴으로 치료 살아있는 세포 사멸 RL 세포의 비율을 보여줍니다. (D) 막대 그래프가 살아 RL 세포의 비율을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. *** 페이지 ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents at JoVE.com

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K 조회수.  Cancer Research Center in Lyon. Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. 

비디오: Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup과 p53의 - / -</sup 마우스

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

방법은 작은 RNA를과의 리보솜 점유 규제 역할을 조사하기 위해<em&gt; 말라리아 원충</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

체외 방법에서 대상 바인딩 및 치료 항체 사이 CDC 유도 비교 : 응용 프로그램 생물학적 동등성 분석에

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...