This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

Etik bildirimi: hayvanlarla ilgili Prosedürleri Toksikoloji Araştırmaları FDA / Ulusal Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. NOT: Burada anlatılan çalışma tasarımı, in vivo kemirgen alkalin kuyruklu tahlil 18 kendi doğrulama için Alternatif Yöntemler Doğrulama Japon Merkezi (JaCVAM) tarafından geliştirilen protokole dayanmaktadır ve daha OECD Kılavuzda tavsiyelerine göre modifiye TG489 19 . 1. Hazırlık <ol><li> slayt hazırlama <ol><li> % 1 normal ısıda eriyen agaroz çözülür (a / h) fosfat tampon maddesi içinde (Ca2 +, Mg2 + serbest fenol kırmızı içermeyen) bir mikro dalga fırın içinde ısıtma ile. </li><li> 55 ° C su banyosunda erimiş% 1 standart agaroz çözüm yerleştirin ve küvetli sıcaklık dengelenmesi. Dip cam mikroskop herhangi excès boşaltın, agaroz çözeltisi içine slaytlaragaroz s ve temiz slaytlar arkasını silin. Oda sıcaklığında kurumaya slaytlar düz bir yüzeye dik slaytlar yerleştirin ve izin ver; kuru bir yerde slaytlar saklayın. </li></ol></li><li> Comet tahlil çözeltilerin hazırlanması <ol><li> % 0.5 düşük erimeli agaroz bir çözelti hazırlayın. Fosfat tamponu içinde agaroz (Ca2 +, Mg2 +, ve fenol kırmızı içermeyen), erime noktası düşük çözülür bir mikrodalga fırınında ısıtılarak. kuyrukluyıldız slayt hazırlanması sırasında 37-45 ° C&#39;de çözüm tutmak; Daha sonra kalan agaroz çözüm atın. </li><li> Lizis tampon hazırlayın. disodyum etilendiamintetraasetik asit (disodyum EDTA, Bay 372,24 g / Mol) ve 2.5 M sodyum klorür (NaCI, Bay 58.44 g / mol) ve 10 mM Tris hidroksimetil aminometan (Tris baz, Bay 121.14 g / mol), 100 mM&#39;lik çözelti yapmak saflaştırılmış su içinde, 10 N sodyum hidroksit çözeltisi (NaOH, Bay 40 g / mol) ile pH 10 olacak şekilde ayarlanır. Kullanılacağı gün, son konsantreler elde etmek için çözeltiye Triton X100 ve dimetil sülfoksit (DMSO, Bay 78.13 g / mol) ekleyinsırasıyla% 1 ve% 10, iyonları, ve kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca 4-10 ° C&#39;de karıştırıldı. </li><li> Kullanım gününde taze enzim tamponu sağlayın. 40 mM 2- [4- (2-hidroksietil) piperazin-1-il] etansülfonik asit (HEPES, Bay 238,3 g / mol), 100 mM potasyum klorür (KCl, Bay 74,55 g / mol), 0.5 mM ihtiva eden bir çözelti hazırlayın disodyum EDTA ve saflaştırılmış su içinde% 0.2 sığır serum albümini (BSA, Bay 66.463 g / mol). 10 N potasyum hidroksit çözeltisi (KOH, 56.1 g / mol) ile 8.0 pH ayarlayın. Oda sıcaklığında karıştırın ve kullanımdan önce, tam bir çözünme edin. </li><li> 300 mM NaOH ve arıtılmış su içinde 1 mM disodyum EDTA ihtiva eden bir alkalin tampon çözeltisi hazırlayın. kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca 4-10 ° C&#39;de karıştırılır. kullanmak ve pH&gt; 13 olduğundan emin olmak için önce çözeltinin pH ölçün. </li><li> saflaştırılmış su içinde 0.4 M Tris bazı ihtiva eden bir çözelti hazırlayın ve hidroklorik asit (HCI, Bay 36.46) ile pH 7.5 olacak şekilde ayarlanır. 4-10 ° C&#39;da, çözelti saklayın. Bu tampon nötralize edilir. </li><li> f yapmakresh Kullanım gününde tampon kıyma. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi içinde 20 mM disodyum EDTA ve% 10 DMSO ihtiva eden çözeltisi (HBSS, Ca2 +, Mg2 +, ve fenol kırmızı içermeyen) hazırlayın. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin. </li><li> boyama çözeltisinin hazırlanması için, 1 Tris-borat-EDTA (TBE tamponu) nükleik asit ile floresan lekesi hazır çözeltisi: 10,000 (h / h). alüminyum folyo kullanarak ışık çözüm koruyun. 2-8 ° C&#39;de saklayın ve 24 saat ile kullanın. </li></ol></li></ol> Fare karaciğerinden Tek hücre süspansiyonları 2. Hazırlık <ol><li> Hayvanların ötanazi Amerikan Veteriner Hekimleri Rehberinde önerilen CO 2 gazı aşağıdaki yöntemlerle fareleri euthanize: 2013 Sürümü 20. <ol><li> 2,75 CO 2 akış hızını ayarlayın. Ötenazi odasında sıçan koyun (örneğin, kurutucu kavanoz, havalandırmalı kapak sıçan kafes) ve tank vanasını açarak CO 2 açın. kadar 1,5 ile 2,5 dakika bekleyinSıçan bilinçsiz hale gelir. Maksimum ayara CO 2 akışını artırmak. solunum kesilmesinden sonra, ötenazi sağlamak için yaklaşık olarak 1 dakika boyunca bölme sıçan bırakın. Sıçan hiçbir kalp atışı olduğunu onaylamak için palpe ve sıçan onun uzuv çekilme olmadığını belirlemek için ayak kısma ötenazi doğrulayın. </li></ol></li><li> % 70 etanol ile saçlı-cildi dezenfekte edin. karın boşluğu açın ve cerrahi makas ile sağlam karaciğer çıkarın. karaciğer çıkardıktan sonra, cerrahi makas ile kalan karaciğer sol yanal lob çıkarın. Bir kesme tahtası üzerinde sol yanal lob yerleştirin ve tek kullanımlık bir tek kenarlı jilet kullanarak iki komşu 3-4 mm kalınlığında enine kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> (Bölümün kıvrık önlemek için) filtre kağıdı üzerinde bir çapraz bölüm yerleştirin ve% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içine bölümüne yerleştirin. 1 ya da daha fazla: bir dokuya% 10 NBF oranı 10 olduğundan emin olun. en az 72 saat, proc bir tespit süresinden sonrahistopatolojik (aşağıda, bkz: bölüm 7) için karaciğer ESS. </li><li> 6 cm Petri kabındaki 5 ml buz gibi soğuk tampon maddesi kıyma (bölüm 1.2.6) içine ikinci enine karaciğer bölümü yerleştirin ve kalıntı kan uzaklaştırmak için 3 kez yıkayın. </li><li> 1 ml buz gibi soğuk tampon kıyma içeren yeni bir 2 ml santrifüj tüpüne karaciğer bölümü aktarın. hücreleri çıkarmak için iyi bir makas ile iyi bir şekilde yıkandı karaciğer bölümü kıyma. herhangi bir doku topaklar kaldırmak için 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu süzün. </li><li> buz üzerinde tek bir hücre süspansiyonu yerleştirin ve 1 saat içinde slaytlar yapmak için kullanabilirsiniz. Konsantrasyonu yaklaşık olarak 2 x 10 6 hücre / mL olması için (hemasitometre veya elektronik hücre sayacı ile, örneğin) sayarak hücreleri konsantrasyonunu kontrol edin. </li></ol> Comet Slaytlar 3. hazırlanması <ol><li> 10 eriyik hacim, 37 ° C,% 0.5 düşük erime noktalı agaroz çözeltisi (bölüm 1.2.1) ile tek bir hücre süspansiyonu, bir hacim karıştırın.Hemen normal erime noktası agaroz (Bölüm 1.1) ile kaplanmış bir slayt üzerine 100 ul pipetle. Hemen hücre agaroz karışımı üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. Her bir numune için en az 8 slaytlar. NOT: Tüm slaytlar bir sayı ya da benzer bir kod tespit edilmeli ve slaytlar olarak kör atılır böylece kimlik (aşağıda, Madde 6.2.2), kaydetti. </li><li> 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;ye slaytlar düz ve serin yatırın. </li><li> Jel katılaşmış sonra, yavaşça kapağını fişleri kaldırmak ve önceden soğutulmuş lizis tamponu (bölüm 1.2.2) slaytlar batırmayın. ışıktan slaytlar korumak ve O, 1 saat (en az) 4 ° C&#39;de lisis tamponu içinde slaytlar tutmak / N (maksimum). </li></ol> Comet Slaytlar 4. Enzim Tedavisi <ol><li> lizis tamponu gelen her doku örneğinden hazırlanan 8 slaytlar 6 çıkarın ve onları oda sıcaklığında enzim tamponu (bölüm 1.2.3) ile 5 dakika her biri için 3 kat durulayın. Alkali Comet yöntemi w için kalan iki slaytlar kullanınildirimde enzim tedavisi (aşağıda, 5.1 bakınız). duruladıktan sonra, boşaltma ve dokularla slaytlar blot fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> 1 enzim tamponu ile hOGG1 ve Endo III enzimi stokları seyreltilir: 1.000 (h / h). Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin. </li><li> Tek başına enzim tamponu (referans slaytlar olarak kullanılan 2 adet kaydırak), 200 ul hOGG1 çözeltisi (2 kaydıraklı) veya 200 ul Endo III çözeltisi (2 kaydıraklı) 200 ul: Her bir tedavi grubunda hazırlanan slaytlar için aşağıdaki çözümlerden 200 ul uygulayın. </li><li> , Nemli bir kağıt havlu ile astarlanmış bir Petri plakalara slaytlar koyun Parafilm slaytlar kapak ve Endo III ile tedavi edilen ve referans slaytlar ve hOGG1 ile muamele slaytlar 30 dakika, 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra damıtılmış su ile yıkayın ve slaytlar altında 5.2 de tarif edildiği gibi işleme devam eder. </li></ol> 5. çözme ve Elektroforez <ol><li> slaytlar enzimlerle muamele için değil, lizis tamponu slaytları kaldırmakSlaytlar drenaj ve artık deterjan ve tuzları yok etmek için 5 dakika boyunca soğuk nötralizasyon tamponu (bölüm 1.2.5) ile bir kez yıkayın. </li><li> boşluk kaçınarak Adımlar 4.5 ve yatay jel elektroforezi tankında rastgele 5.1&#39;den yer slaytlar. Sıvı seviyesi sadece slaytları kapsar kadar taze yapılmış pH&gt; 13 elektroforez tamponu (bölüm 1.2.4) ile doldurun (agaroz üzerinde kabarcıkları önlemek ve emin tank seviye yapmak). DNA ayırma başlangıcında tampon pH ve sıcaklık kaydedilir. </li><li> 20 dk alkali yükümlü hasar DNA ve ifade açma için izin için slaytlar alkali tampon kalır edelim. </li><li> Çözme sırasında, program, güç kaynağı elektroforez deposu (pozitif ve negatif elektrotlar arasındaki cm mesafe ile ayrılır V / cm = Volt) 0.7 V / cm üretmek. </li><li> açma sonra, güç kaynağındaki çalışma düğmesine basın. Gerekirse, yükselterek ya da tampon seviyesini düşürerek 300 mA akım ayarlayın. th tutmaksadece slaytlar yüzeyi üzerinde e tampon seviyesi. 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de elektroforez gerçekleştirin. başlangıç ​​ve elektroforez sonunda kayıcı yerleştirme tampon sıcaklığı ve akımı (amper) kaydedin. NOT: Çok fazla tampon DNA göç engelleyebilir düşük voltaj neden olacaktır. </li><li> elektroforez sonra, yavaşça 5 dakika boyunca (Bölüm 1.2.5) tanktan slaytlar kaldırma ve nötralizasyon tamponu daldırarak aşırı alkali nötralize. slaytlar boşaltın ve iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca soğuk% 100 etanol içinde daldırarak slaytlar sabitleyin. depolama için kuru bir alanda kuru hava ve yer slaytlar izin verin. </li></ol> 6. DNA Boyama, Comet Görselleştirme ve Analizi <ol><li> DNA boyama <ol><li> Bir karton veya metal tepsi üzerinde slaytlar yerleştirin ve her slayt nükleik asit floresan leke çalışma solüsyonu (bölüm 1.2.7) 200 ul ekleyin ve cam kapak slip ile kaplayın. slaytlar koruyunIşık slaytlar skorlama öncesi en az 30 dakika boyunca boyama solüsyonu ile temas halinde kalmasını sağlamaktadır. Bir seferde 20 gruplar halinde slaytlar Leke. </li><li> Her slayt okumaya başlamadan önce, hafifçe kapak camı rahatsız etmemek için dikkatli olmak, aşırı boyama çözüm uzak leke. </li></ol></li><li> Comet Görselleştirme ve Puanlama <ol><li> bilgisayar monitöründe kuyruklu yıldız sürgünün canlı görüntüleri bir floresan mikroskop bağlı bir video kamera kullanın. </li><li> Rasgele hücreleri içeren bir mikroskop alanı seçin. Fare kullanma, bir hücreyi seçin. farenin sol tıklama ile &quot;kuyruklu kafa&quot; merkezi tıklayın. NOT: Bilgisayar yazılımı hücre için tüm ölçüm parametrelerini hesaplar ve bir veri dosyasına veri ekler. </li><li> Geçerli alan (adım 6.2.4 bakınız) tüm hücreleri Puan ve sonra hücrelerin başka bir dizi bulmak için mikroskop sahne kontrolleri ve ekrandaki videoyu kullanın. 6.2.2&#39;de tarif edildiği gibi bu hücreleri puan. </li><li> slayt f Skorurom sağa sola ve yukarı aşağı. yaklaşık 10 alanları rastgele seçin. Bu süreçte, görünüm alanında görüntülenen herhangi bir uygun kuyrukluyıldız hücre önyargısız attı edilmelidir. NOT: Aşağıdakilerden herhangi biri doğruysa bir kuyruklu yıldız puanı etmeyin: 1) slayt kenarlarında herhangi bulunur; 2) İki veya daha fazla kuyrukluyıldızların üst üste; 3) kuyruk enkaz var; 4) Yazılım baş ve kuyruk ayırt edemez; veya 5) çekirdek ve / veya kuyruk boyama slayt diğer kuyruklu yıldız büyük ölçüde farklıdır. Not: kuyruk hemen hemen tüm DNA floresan ile Kuyrukluyıldızlar genellikle &#39;dikenli&#39; kuyruklu olarak adlandırılır. Kirpi kuyrukluyıldızların attı edilmemelidir, ancak slayt puanlama sırasında tespit kirpi sayısı kaydedilir ve toplam kuyruklu bir yüzdesi olarak rapor edilmelidir. </li><li> En az 150 kuyrukluyıldız hücre / toplam örneği almak için organ / doku başına iki slaytlar okuma slayt başına en az 75 kuyrukluyıldızlar, analiz edin. Bir slayta hücrelerinin istenen sayısından sonra olmak vartr sonuç daha sonra veri analizi için bir tablo dosyası olarak kaydedilir, attı. </li></ol></li></ol> 7. Histopatolojisi Analizi <ol><li> Doku 21 kırparak ardından% 10 NBF 72 saat tespitin en az sonra, rutin işleme ve 22 orta bazlı parafin-balmumu örneklerinin sol lateral karaciğer lobu gömün. Bölüm numuneler, yaklaşık 5 mikron cam slaytlar üzerinde toplar. </li><li> hematoksilen &amp; eozin (H &amp; E) ile bölümleri Leke: <ol><li> boyama prosedürü öncesinde 2 saat için 60 ° C fırın içinde parafın doku kesitleriyle slaytlar ısıtın. </li><li> tarafını deparaffinize ksilen kullanın. Bir akan musluk suyu durulama için kademeli etanol (EtOH) ile slaytlar rehidrate. </li><li> 2 dakika ve 40 saniye hematoksilen 450 ml slaytlar yerleştirin. 4 saniye asit ile durulayın slaytlar (450 mi deiyonize edilmiş su, 2 ml buzlu asetik asit) 5 dakika akan musluk suyu ile durulanır, aşağıdaki. </li><li> kaydırdı yerleştirin2 dakika ve 30 saniye, ve 1 dakika boyunca% 70 EtOH durulama için musluk suyu durulama çalıştırarak ve ardından 2 dakika boyunca 1 ml amonyum hidroksit içeren 450 ml% 70 EtOH içinde es. </li><li> 3 dakika boyunca 4 mL buzlu asetik asit ihtiva eden 450 mi Eosin Y çözeltisi ile slaytlar inkübe edin. </li><li> kademeli EtOH ile slaytlar dehydrate. ksilen ile slaytlar (üç kez 1 dk) temizleyin ve kapak fişleri slaytlar yerleştirilir kadar ksilen slaytlar tutun. </li></ol></li><li> 1 (minimal), 2 (hafif), 3 (orta), ya da 4 olarak şiddeti ışık mikroskobu, kayıt bulguları ve sınıf non-neoplastik lezyonlar slaytlar inceleyin (işaretli). NOT:; hafif = 16-35%, orta = 36-60%; belirli bir lezyon için uygulanan şiddeti dereceli lezyonu olan karaciğerin nispi oranda (en az = &lt;% 1-15 dayanır ve işaretlenmiş = 61- % 100). </li></ol> 8. Veri analizi <ol><li> Hayvan istatistiki değerlendirmeler için deneysel birim olarak kabul edilir. DNA hasarı% DN olarak ifade edilirkuyruk A. </li><li> aşağıdaki gibi oksidatif DNA hasarı hesaplanır: Referans slaytlar (enzim yok tedavisi) arka plan DNA zincir kırıkları (SB) bir tahmin sağlar. NOT: Enzim-tedavi slaytlar bir zincir kırıkları ölçüsünü ve okside üsleri (SB + OX) sağlar. DNA hasarının bir fonksiyonu olarak kuyruk,% DNA için doğrusal bir doz cevap varsayarsak, SB + OX gelen SB çıkarma okside pirimidinler / değiştirilmiş pürin 23 DNA zincir kırıkları bir tahminini verir. </li><li> Araç kontrol ile tedavi edilen hayvanlarda tepkilerin ikili karşılaştırma için Dunnett testi tarafından takip tek yönlü ANOVA ile dozun bir fonksiyonu olarak kuyruk% DNA analiz edin. NOT: Tüm testler tek kuyruklu ve daha az 0.05 p değeri istatistiksel anlamlılık için kriter olarak ayarlanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+'comet'+assay.">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li><li>Committee, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+opinion+on+genotoxicity+testing+strategies+applicable+to+food+and+feed+safety+assessment.">Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment.</a> EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+dose-response+analysis+of+genotoxicity+in+cyproterone+acetate-treated+F344+rats.">Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats.</a> Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genotoxicity+of+estragole+in+male+F344+rats.">In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats.</a> Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genotoxicity+of+furan+in+F344+rats+at+cancer+bioassay+doses.">In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+genotoxicity+assessment+of+silver+nanoparticles+in+mouse.">Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse.</a> Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).</li><li>Ding, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyleugenol+genotoxicity+in+the+Fischer+344+rat+using+the+comet+assay+and+pathway-focused+gene+expression+profiling.">Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling.</a> Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).</li><li>Manjanatha, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+of+doxorubicin+in+F344+rats+by+combining+the+comet+assay,+flow-cytometric+peripheral+blood+micronucleus+test,+and+pathway-focused+gene+expression+profiling.">Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling.</a> Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).</li><li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII.">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+damage+to+DNA+and+its+repair+with+the+comet+assay.">Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).</li><li>Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+comet+assay:+use+and+status+in+genotoxicity+testing.">The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing.</a> Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).</li><li>Hartmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+conducting+the+in+vivo+alkaline+Comet+assay.+4th+International+Comet+Assay+Workshop.">Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop.</a> Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+oxidative+DNA+damage+and+its+repair+using+the+comet+assay.">Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay.</a> Mutat Res. 681, 24-32 (2009).</li><li>Collins, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+in+human+biomonitoring+studies:+reliability,+validation,+and+applications.">Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications.</a> Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).</li><li>Gutzkow, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+comet+assay+using+96+minigels.">High-throughput comet assay using 96 minigels.</a> Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).</li><li>AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf">https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf</a> (2013)</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).</li><li>Carson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Self-Instrumental+Text.">A Self-Instrumental Text.</a> Histotechnology. , 25-37 (1996).</li><li>Dusinska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+COMET+ASSAY,+modified+for+detection+of+oxidised+bases+with+the+use+of+bacterial+repair+endonucleases.">THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases.</a> Dusinska Protocol [Internet]. , (2000).</li><li>Schuppler, J., Gunzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumors+and+steroid+hormones+in+rats+and+mice.">Liver tumors and steroid hormones in rats and mice.</a> Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).</li><li>Hobkirk, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+sulfotransferases+and+steroid+sulfate+sulfatases:+characteristics+and+biological+roles.">Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles.</a> Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests. The information in these materials is not a formal dissemination of information by FDA and does not represent agency position or policy.

Bu protokol, tek hücre düzeyinde sıçan karaciğer hem doğrudan ve oksidatif DNA hasarının eşzamanlı ölçümünü açıklamaktadır. Genel protokol (örneğin, DNA hasarı olmayan deney maddesinin tarafından değil, hayvan dokularının kullanım ve işleme neden) tek hücre ya da çekirdekler minimal işleme neden olduğu DNA hasarının izole edilebilir olan herhangi bir dokuya uygulanabilir. Araştırmamızda, biz kemik iliği 7,9, mide 6, böbrek 9, mesane 9, akciğer 9, kalp 10, meme bezi 5, rahim 5, testis 5 ve kan 5 hücreleri üzerinde alkali kuyruklu yıldız deneyleri yaptık. Bu deneyler, çoklu organ ve deney hayvanları dokuları ksenobiyotik neden olduğu DNA hasarına çalışmak için, hızlı, basit ve ucuz bir yöntem olabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, periferal kandan, örneğin, iletken deneyleri insan biyolojik izleme çalışmaları için kullanılabilir dağılmış olabiliridrar yolu hücreleri veya klinik veya mesleki maruz kalan bireyler elde edilen bukkal veya burun epitelyum. Temel yaklaşım ayrıca, in vitro kültürlenmiş hücrelerde DNA hasarını değerlendirmek için kullanılabilir. Kuyrukluyıldız deneyi, yani akut veya subkronik toksikoloji çalışmalarında, örnekleme süresi, entegre edildiğinde, son tedavi ve doku toplama arasındaki süre, bazen diğer toksikolojik veri toplama ile bağdaştırılabilir gereken kritik bir değişkendir. Eğer mümkünse, örnekleme süreleri zamana kuyruklu veriler, doruk plazma veya doku konsantrasyonu (Cmax) elde veya kararlı durum testi 19.maddesi birden idareler aşağıdaki sağlandıktan sonra edildiği zamana dayalı olmalıdır. durumlarda Kinetik veriler, ya da doku konsantrasyonları tek bir tedavi ise, OECD TG489, iki ya da daha fazla tedavi yapmak ve son tedaviden sonra dokular 2-6 saat toplama tavsiye veya mevcut değildir edildiTedavi 19 sonrasında 2-6 ve 16-26 saatte dokuları örnekleme, gerçekleştirdi. Kuyruklu yıldız slayt hazırlama ötanazi zaman uzunluğu mümkün olduğunca kısa olması büyük önem taşımaktadır. Deneysel yetkinlik deneye tabi tutulur dokulardan hızlı bir şekilde yüksek kalitede tek hücre süspansiyonları elde yeterlilik göstererek kurulmasını tavsiye edilir. Genellikle, kuyruklu yıldız slaytlar tek hücre hazırlama bir saat maksimum alarak, en kısa sürede hayvan kurban sonra hazırlanmalıdır. aralıkları ve negatif (araç) kontrol dağılımları kurmak için tarihsel bir veri tabanının oluşturulması son derece tahlil doğru kontrol altında olmasını sağlamak için tavsiye edilir. Aşağıdaki meydana geldiğinde DNA hasarının aşırı düzeyde araç / negatif kontrol hayvanlarında gözlenen edilebilir: doku 1) yanlış kullanım; ötanazi ve kuyrukluyıldız slayt hazırlama arasındaki 2) çok uzun bir süre; UV containin için tek bir hücre süspansiyonu ya da 3) maruzg hafif. aralıkları ve pozitif kontrollerin dağıtımları için tarihsel bir veri tabanının oluşturulması da son derece tahlil bilinen genotoxins uygun hassasiyet gösterir sağlamak için tavsiye edilir. Metil metansülfonat (MMS) bu çalışmada pozitif kontrol olarak kullanılmıştır; etil metan sülfonat (EMS) in vivo kuyruklu tahlilinde 18 için pozitif bir kontrol olarak JaCVAM tarafından tavsiye edilmektedir. Comet tahlil protokolüne lezyon özgü endonükleaz ile sindirim birleştirilerek DNA belirli tiplerinin tanınması yoluyla testin duyarlılık ve özgüllüğünü arttırır lezyonlarda-örneğin, burada yükseltgenmiş DNA bazları sundu. Ancak, bazı endonükleaz tanıma ve DNA lezyonları çeşitli sınıflarının en yaran yeteneğine sahip olabileceği kabul edilmelidir; Endo III durumunda, bu oksidatif DNA hasarı ile ilişkili olmayan lezyonları içerir. Pozitif Endo III modifiye kuyrukluyıldız tahlil sonucu karışık MOA gösterebilir. By karşılaştırma, hOGG1 oksidatif DNA hasarı 11 içeren bir MOA kurulması için daha yararlı olabilecek bir hOOG1 modifiye testte oksidatif lezyonlar ve veri daha özeldir. Sitotoksisite (hücre apoptoz ve nekroz), DNA zincir kırıkları ve yanlış pozitif kuyrukluyıldız tahlil sonucu yol açabilir: kendileri pozitif kuyrukluyıldız tahlil sonuçları genotoksisite olarak yorumlanamaz. sitotoksisite ile ilgili bilgiler olumlu kuyrukluyıldız tahlil sonucu biyolojik alaka kurmak için gereklidir. Kuyruklu yıldız pozitif dokuların histopatolojik analiz doku toksisitesi 19 ilgili bir önlem olarak, OECD TG489 tarafından tavsiye edilmektedir. doku toksisitesi (hücre apoptoz veya nekroz) açık kanıtlarla pozitif kuyrukluyıldız tahlil verileri dikkatli yorumlanması gerekmektedir. In vivo alkali kuyruklu yıldız tahlil ve Endo III ve hOGG1 modifiye alkalin kuyruklu yıldız deneyleri ve genotoksisite ile ilgili kararlar almak için nicel bir şekilde kullanılabilirKsenobiyotik maruz kalma. Ayrıca, birden fazla hayvan dokularında, DNA hasarı ve onarım temel araştırma yapmak için kullanılabilir.

alkali comet tahlil tek hücre düzeyinde DNA zincirinde kırılmalara ölçer. tek hücre süspansiyonları, bir mikroskop lamı üzerine agaroz gömülür ve hücrelerin DNA süper-döngüler içeren nükleotidler oluşturmak için lize edildi. anot doğru göç DNA serbest ipliklerini, iplikli sonları içeren DNA döngüler süperburulma kaybı pH&gt; 13 sonuçlara Elektroforez, floresan mikroskop ile görülebilir kuyruklu yıldız benzeri yapılar oluşturarak. Parçalanmış DNA, DNA kırılmasını 1 ölçmek için kullanılabilir fragmanının boyutu ve toplam yoğunluğu (ön ve arka) ile karşılaştırıldığında kuyruklu kuyruk nispi floresan göre &quot;kuyruk&quot; olarak kuyruklu &quot;kafa&quot; den göç 2. Tahlil, basit, duyarlı, çok yönlü, hızlı ve 1 nispeten ucuzdur. DNA&#39;ya hasar veren ajanlar tarafından neden parçalanmış DNA&#39;nın saptanması hücrelerde DNA hasarına miktarının belirlenmesi için bir tahlil veya kullanılmış gelen çekirdekler izole edilir Indivipotansiyel olarak genotoksik malzeme (ler) ile muamele edilmiş hayvanların, çift dokular. Avantajları nedeniyle, in vivo kuyrukluyıldız tahlil geçerli Uyumu Uluslararası Konferansı (ICH) 3 ve Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi ürün güvenliği değerlendirmeler yapılması için (in vivo mikronükleus testi ile eşleştirilmiş) ikinci in vivo genotoksisite deneyi (EFSA olarak tavsiye edilir ) 4 düzenleyici kurallar. Laboratuvarda, gıda maddeleri, ilaç, ve Nanomalzemelerin 5-10 tarafından uyarılan in vivo DNA hasarına değerlendirilmesinde tahlil istihdam var. Fare Karaciğer Bu protokolde bir örnek olarak kullanılmıştır, ancak kuyruklu deney, deney hayvanlarının diğer dokular / organ sürece dokusundan izole edilebilir bozulmamış tek hücreler ile gerçekleştirilebilir. DNA hasarının bazı türleri temel alkali kuyrukluyıldız tahlil değiştirmeden, DNA zincir kırıkları olarak tespit etmek zordur. oksidatif DNA hasarı durumunda, iplik breaks örneğin 8-OxoGuanine (8-oxoGua) ve metil-fapy-guanin 11&#39;de sonları oluşturur insan 8-OxoGuanine-DNA-N-glikosilaz 1 (hOGG1 gibi tamir enzimleri ile sindirme ile DNA oksidatif lezyonlar oluşturulabilir. Ayrıca, Endonükleaz III (Endo III) okside pirimidinlerin 1 ağırlıklı olarak sonları oluşturur. bu nedenle, bir enzim-sindirim adımı eklenmesi çalışma, canlılar üzerinde 12 oksidatif DNA hasarı ölçmek için özel ve hassas bir yöntem sağlar. bu deneyler kullanarak, gösterdiğimiz sıçan ve fareler 6-8 karaciğer ve sıçanların 10 kalbinde toxicant yol açtığı oksidatif DNA hasarı. In vitro hassas tarafından tanımlanan genotoxins in vivo deneyinde takip 3,13 testleri gibi 1), 2) çok sayıda dokuda ksenobiyotik kaynaklı DNA hasarının mekanizmasını için: alkali Comet deney genetik toksikoloji ve insan Biyomonitorlama bir çok uygulama alanı vardır 14, 3) araştırmak içinkanserojen, 4), 5) İnsan hastalıkları ve mesleki maruz kalmayı 16 araştırmak ve DNA hasarı tamir 15 değerlendirmek için bir genotoksik ya da eylem olmayan bir genotoksik modu (MOA) 7 kullanarak çalışır 6) için potansiyel yüksek verimli bir tarama deneyinde olarak organ-spesifik genotoksisite 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">12-544-14</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">12-550-123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">EDTA, Disodium</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">HyClone</td>
			<td style="width:156px;">SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">HEPES</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Low Melting Point Agarose (LMP)</td>
			<td style="width:140px;">Lonza</td>
			<td align="right" style="width:156px;">50081</td>
			<td>NuSieve GTG Agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Normal Melting Agarose (NMA)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">pH testing paper strips (pH 7.5-14)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">M95873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Potassium Cloride</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">slide labels, (0.94 x 0.5 in.)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">NC9822036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Sodium Chloride (NaCl)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Sodium Hydroxide (NaOH)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">SYBR&#8482; Gold&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Trizma Base&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">2.0 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">05-402-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Cell strainer (40 &#181;m)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td align="right" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Endonuclease III (Nth)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:156px;">M0268S</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">hOGG1&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:156px;">M0241S</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring dna strand breaks and oxidative dna damage in rat liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In vivo olarak, alkalin Comet deney siproteron asetat (CPA) 5 ile muamele edilmiş sıçanların karaciğer doğrudan ve oksidatif DNA hasarı, hem ölçmek için bir enzim ile modifiye edilmiş Comet yöntemi ile bağlantılı olarak yapılmıştır. EBM ile, cinsiyete spesifik bir şekilde sıçan karaciğer tümörleri neden olmaktadır sentetik hormon ilaçtır kadınlarda 24 ile karşılaştırıldığında erkek sıçanlarda karaciğer tümörlerinin indüklemek için gerekli olan yüksek dozlar beş kat. Bu, erkek ve dişi farelerin karaciğerinde CPA ile üretilen doğrudan DNA hasarı da hepatotumorigenicity aynı cinsiyet belirli bir desen sahip olduğunu bulduk: CPA beş kat daha yüksek bir dozda DNA hasarı önemli bir artış indüklemek için gerekli olan kadınlara oranla erkeklerin karaciğerleri (Şekil 1). Biz cinsiyete özgü kuyruklu yıldız tahlil sonucu 15 kat daha fazladır hidroksisteroid sulfotransferase (ler) (HST) aktivitesi, bağlı olduğu varsayımındayetişkin erkeklerde daha erişkin dişi sıçanlarda. HST metabolizması DNA bağlanma metabolit (ler) 25 CPA aktivasyonunda bir hız sınırlayıcı bir adımdır. Bunun aksine, CPA-neden olduğu oksidatif DNA hasarı dişi sıçan karaciğerinden daha erkek genel olarak daha büyük ve oran-sınırlayıcı tümör oluşumu, adım (Şekil 2) olmak böylece daha az olasıdır. EBM-tedavi sıçan karaciğerinin Histopatoloji değerlendirme olumlu kuyrukluyıldız tahlil sonuçları sitotoksisite 5 ikincil etkisi olmadığını belirten ajan kaynaklı apoptoz veya nekroz (Tablo 1 ve 2) hiçbir kanıt gösterdi. 1 Şekiller ve 2 ve Tablo 1 ve 2 Elsevier BV (Referans 5) izni ile yeniden basıldı edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53833/53833fig1.jpg" /> EBM-muamele erkek ve dişi sıçanların bana karaciğerlerinde Şekil 1. DNA hasarıin vivo alkali kuyruklu tahlille asured. beş ila yedi haftalık erkek ve dişi F344 sıçan grupları, zeytin yağı ya da tedavi edilen 10, zeytin yağı içinde 25, 50 ya da 100 mg / kg / gün EBM. Tedaviler, 0, 24 ° yapılmıştır, ve 45 saat, sıçanlar 48 saat sonra kurban edilmiştir ve DNA hasarı alkalin Comet analizi kullanılarak% kuyruk DNA olarak karaciğerde ölçülmüştür. CPA tedavi anlamlı bir artış sadece 50 ve 100 mg / kg / gün dozu ile tespit edilmesiyle, bir eşik benzeri bir şekilde erkek sıçanların karaciğerlerinde% kuyruk DNA&#39;sının bir artış uyarmıştır. CPA tedavi bütün CPA gruplarında tespit edilen% kuyruk DNA&#39;sının önemli artışlar ile yakın bir lineer doza bağımlı bir şekilde dişi sıçanların karaciğerlerinde birlikte DNA ipliklerinde kırılmalara neden olmuştur. dişi ve erkek sıçanların karaciğerlerinde EBM-bağlı DNA hasarını için Gözlemlenen en düşük Genotoksitisi Etkisi Düzeyleri (LOGELs) sırasıyla 10 ve 50 mg / kg / gün olarak tahmin edildi. * Aracın con p≤0.05 nispetle önemlitrol; Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53833/53833fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53833/53833fig2.jpg" /> CPA ile muamele edilmiş erkek karaciğer ve dişi sıçanlarda Şekil 2. oksidatif DNA hasarı, enzim ile modifiye edilmiş, in vivo olarak alkali Comet yöntemi ile ölçüldü. Beş ila yedi haftalık erkek ve dişi F344 sıçan grupları, zeytin yağı ya da 10 ile tedavi edildi, zeytin yağı içinde 25, 50 ya da 100 mg / kg / gün EBM. Tedaviler 0, 24 olarak yapılmıştır ve 45 saat, hayvanlar 48 saat sonra kurban edildi ve enzim modifiye kuyruklu yıldız tahlil DNA hasarının bir ölçüt olarak% kuyruk DNA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm EBM dozları EBM-tedavi erkek sıçanların karaciğerlerinde Endo III duyarlı DNA hasarının önemli artışlar üretilen; Endo III duyarlı bir DNA D iseAmage sadece 25, 50 ve 100 mg / kg / gün EBM (A) ile tedavi edilen dişi farelerde tespit edilmiştir. Bütün CPA dozlar erkek sıçanların karaciğerlerinde hOGG1 duyarlı oksidatif DNA hasar belirgin artışlar ile sonuçlanmıştır; hOGG1 duyarlı DNA hasarının de ise sadece 50 ve 100 mg / kg / gün EBM (B) ile muamele edilmiş, dişi farelerde tespit edilmiştir. * Araç kontrolü için p≤0.05 nispetle önemli; Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53833/53833fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tablo 1 ve 2. Sitotoksisite apoptotik ve / veya nekrotik hücreler için yalancı pozitif kuyruklu yıldız tahlil sonuçlarını, histopatolojik değerlendirmeler üretebilir beri histopatoloji analiz sonuçları. Kuyrukluyıldız pozitif dokular için yapılmalıdır. Bu çalışmada, CRA kaynaklı hepatosit apoptoz veya nekroz gözlemlenmiştirBir yanlış pozitif kuyrukluyıldız tahlil tepki olasılığını hariç hem erkek hem de dişi sıçanların, karaciğerlerinde. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td rowspan="2" style="width:105px"> yara </td><td rowspan="2" style="width:105px"> Veri </td><td colspan="5"> doz EBM </td></tr><tr><td> 0 mg / kg </td><td> 10 mg / kg </td><td> 25 mg / kg </td><td> 50 mg / kg </td><td> 100 mg / kg </td></tr><tr><td rowspan="4"> HEPATOSİT sitoplazmik vakuolizasyon </td><td> lezyon Sayısı </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> # İncelendiğinde </td><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> lezyon% </td><td> % 17 &lt;/ Td&gt; <td> % 20 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> Ort Önem </td><td> 1.0 </td><td> 1.0 </td><td> 1.2 </td><td> 1.8 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td rowspan="4"> hepatosit mitoz </td><td> lezyon Sayısı </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> # İncelendiğinde </td><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> lezyon% </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> Ort Önem </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 1.0 </td><td> 1.4 </td><td> 1.8 </td></tr></tbody></table> Taşıt ve EBM-tedavi erkek F344 sıçanların karaciğerlerinde non-neoplastik lezyonların Tablo 1. Sıklığı. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot; fo: keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2" style="width:105px"> yara </td><td rowspan="2" style="width:105px"> Veri </td><td colspan="5"> doz EBM </td></tr><tr><td> 0 mg / kg </td><td> 10 mg / kg </td><td> 25 mg / kg </td><td> 50 mg / kg </td><td> 100 mg / kg </td></tr><tr><td rowspan="4"> HEPATOSİT sitoplazmik vakuolizasyon </td><td> lezyon Sayısı </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> # İncelendiğinde </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> lezyon% </td><td> % 20 </td><td> % 60 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> Ort Önem </td><td> 1.0 </td><td> 1.3 </td><td> 1.8 </td><td> 1.8 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td rowspan="4"> hepatosit mitoz </td><td> lezyon Sayısı </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> # İncelendiğinde </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> lezyon% </td><td> 0 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> Ort Önem </td><td> 0 </td><td> 1.0 </td><td> 1.2 </td><td> 1.8 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td rowspan="4"> hepatosit Karyomegaly </td><td> lezyon Sayısı </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> # İncelendiğinde </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> lezyon% </td> &lt;td&gt; 0 </td><td> 0 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td><td> % 100 </td></tr><tr><td> Ort Önem </td><td> 0 </td><td> 1.0 </td><td> 1.2 </td><td> 1.8 </td><td> 2.0 </td></tr></tbody></table> Araç-ve EBM-tedavi dişi F344 sıçanların karaciğerlerinde non-neoplastik lezyonlar Tablo 2. Sıklığı.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver at JoVE.com

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Sıçan Karaciğer DNA Strand Breaks ve Oksidatif DNA Hasar Ölçüm Vivo Alkali Comet Assay ve Enzim-modifiye Alkali Comet Tahlili

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

in-vivo-alkaline-comet-assay-enzyme-modified-alkaline-comet-assay-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

15.3K Görüntüleme.  US FDA/National Center for Toxicological Research. The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

Video: In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Biyoloji

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme<em&gt; In Vivo</em&gt; Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...