Yazarlar Pluripotent Kök Hücre Tesisi ve Cincinnati Çocuk Hastanesi Konfokal Görüntüleme Çekirdek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ve 2U19AI70235 (GKKH) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki protokol kurumları insan araştırma etik komitesinin kuralları takip eder. 1. Burun mukozasının Örnekleme NOT: viral solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ücretsiz konulardan örnekler alın. <ol><li> katılımcı ziyareti öncesinde bir 15 ml konik taze hazırlayın ve 2 ml Begm (Bronş Epitel Hücre Büyümesi Orta) artı 20 ul steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (% 0,01) ekleyin. </li><li> Açık sitoloji sadece örnek almadan önce fırça ve steril fırça tutmak için emin olun ve burun yüzeyleri dışında herhangi bir yüzeye dokunmayın. </li><li> Hala oturup tavana doğru kafasını eğmek için katılımcı isteyin. küçük ya da daha fazla huzursuz çocuklar ellerinde oturmak ve / veya uzak fırça swatting önlemek için yatarken. </li><li> geçit daraltır (küçük kara delik gibi görünüyor) burun arkasındaki fırça yöneltin. aşağı fırça kaydırın ve fırça Nostri kaldırılır olarak bileklerini büküml. </li><li> konik fırça yerleştirin ve Begm daldırın. Fazla fırça kesti ve tüp kapağını kapatın. VORTEKS DO NOT. NOT: katılımcı istekli ise, aynı şekilde ancak ikinci burun deliğine ikinci fırça edinin. Her iki burun deliklerinin bir fırçalama Edinme örnekleme başarılı olacaktır daha yüksek bir olasılıkla sonuçlanacaktır. Aynı burun deliği Örnekleme kanama neden olabilir ve büyük olasılıkla örnek iyileştirmek değil. </li><li> ılık su ile bir beher kullanarak taşıma sırasında mümkün olduğunca 37 ° C kadar yakın örnekleri tutun. </li></ol> 2. Hücre Sayımı ve sitospin <ol><li> Yavaşça Begm fırçayı ajite ve hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı için örnek 10 ul alır. canlı / ölü leke 10 ul ekleyin ve sadece mikroskop altında hücrelerin canlı saymak. </li><li> örnek 50 ul almak ve 1 x PBS ile 200 ul&#39;ye seyreltilmiş. 2 dakika boyunca 300 rpm&#39;de cam slayt ve spin bağlı Sitospin huni ekle. followin kuru O / N ve leke slayt slayt edelimg üreticinin talimatlarına. tercihen karanlıkta, O / N kurumaya bırakın. </li><li> Hema 3 Stain ile Leke Slide <ol><li> Her solüsyonu (; Hema 3 Çözüm I, pembe, Hema fiksatif, açık mavi ve Hema 3 Çözüm II, mavi derinlik) aktarın boyama kabına; Kullanılmadığı zaman kapalı tutun. slayt boyama tekne içine slaytlar ekleme </li><li> Daldırma slaytlar sürekli 30 sn için sabitleyici olarak, daha sonra fazla drenaj sağlar. Daldırma 30 sn için, daha sonra fazla drenaj sağlar Çözüm sürekli olarak kayar. Dip daha sonra fazla süzülmesini bekleyin, 30 saniye boyunca sürekli Çözüm II slaytlar </li><li> Su berrak bitene kadar deiyonize su ile durulayın. Karanlıkta, tercihen O / N kurumaya bırakın </li></ol></li><li> epitel hücrelerinin yüzdesini belirlemek, mikroskop ve sayım hücreleri altında slayt bak. örnekleme iyi ise% 90 veya daha fazla olmalıdır. </li></ol> 3. Tohum Hücreler NOT: Uygun ve sertifikalı doku kültürü tüm hücre kültürü prosedürlerini yürütmekdavlumbaz steril tekniği kullanarak. <ol><li> Sığır dermal kolajen (BDC) ile kaplayın plakaları, tip 1 49.5 mi 1 x PBS içinde seyreltilmiş, 3 mg / ml BDC 0.5 ml ilave edilir. sadece bir kaç plakaları kullanılacak olursa az hazırlayın. Kat 2 saat boyunca 37 ° C &#39;de, bir T25 2 mi BDC şişe ve steril bir başlık O inkübe / N veya gerekirse. </li><li> İnkübasyondan sonra, herhangi bir geri kalan sıvı aspire. steril bir muhafaza içinde 30 dakika, UV ışığına şişeler Açığa. ama bir ay kadar 4 ° C Mağaza şişeler, hücrelerin ekim önce C RT getirmek ya da 37 °. </li><li> Tohum için hazır olana kadar 37 ° C&#39;de Begm fırçayı ve hücreleri tutun. Yavaşça homoseksüel konik içinde fırça, ancak girdap yok. <ol><li> Plaka, bir T25 şişesi içinde 7 x 10 5 hücre. az olması durumunda, daha küçük bir kap, bir 6-yuvalı plaka gibi bir de kullanmak. Bu boyut plakası yaklaşık 3 x 10 5 hücre gerektirir. NOT: Bu birçok hücre yoksa, o devam etmek tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> steril Kaputun altında, tüp ve ge dışına fırça almakntly kaplama kazımak için dikkatli olmak, kaplanmış balonun yüzeyi üzerinde fırça döndürün. uygun bir biyolojik tehlikeli atık kabına fırça atın. </li><li> Yavaşça konik dışına ve T25 balona Begm kalan hücrelerin pipetle. mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. Dalgalı bir hücre sayısı görülmektedir ve bu aşamada (Şekil 3A) olarak uygun olan burun, çıkan toz olabilir. </li></ol> 4. Hücre Kültürü <ol><li> Hücrelerin ekim sonra, onları kesinti olmadan 48 saat (Şekil 3) razı olsun. 48 saat sonra, yavaş yavaş ve hafifçe 2 ml sıcak Begm ve steril Penisilin / streptomisin / Fungizone (P / S / F) 20 ul ekle. NOT: Medya orijinal 2 ml aspire ETMEYİN. </li><li> Tohumlama sonra 4. gününde, dikkatlice sıvı aspire ve taze 4 ml ile değiştirin, Begm artı 1x Pen / Strep (fungizon artık gerekli değildir) ısındı. Her iki gün medya değiştirin ve takmak için hücreleri değerlendirmekment, büyüme ve izdiham. Hücreler ulaştığında ~% 80 izdiham, genellikle 2-3 hafta içinde, onlar pasajlanır hazırdır. </li><li> Bir T25 şişesi (yaklaşık 2.5 x 10 6 hücre olduğunda konfluent), üç T25 şişelerinde ya da bir T75 şişesi içine geçişli olabilir. İlk geçişten sonra, hücreler her üç günde bir kaynaşmaya eriştikten, sağlam ve sağlıklı olmalıdır. </li></ol> 5. Pasajlanması Hücreler <ol><li> Yavaşça plakadan medya aspire. yaklaşık 4 dakika için inkübatör plaka ve yere T25 şişesi başına 1 ml% 0.05 tripsin solüsyonu ekleyin veya hücreler plaka ayrılana kadar. hücrelerin her 2 dakikada bir dekolmanı seviyesini kontrol edin ve daha uzun 10 dk tripsin bırakmayın. </li><li> enzimi etkisiz hale getirmek 5 ml Tripsin Giderici Çözüm (TNS), ya da serum içeren medya ekleyin. 15 ml konik tüp içinde şişesi ve yerden tüm sıvı ve hücreleri çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de (hızlanma 0 yavaşlama 0) Santrifüj, bir hücre peleti elde edilmiştir. aspire SupernaYeni şişelere için gerekli olan hacimde S Begm bölgesindeki + U / tant ve tekrar süspansiyon hücreleri (T75 şişeye bir T25 şişesi 4 mi, 10 mi) </li><li> (2.1) yukarıda açıklandığı gibi bir ölü / canlı boya ile hücre sayımı gerçekleştirin. kaplanmış şişelere Begm ve hücrelerin uygun miktarda ekleyin ve inkübatör dönmek. Yukarıda detaylı Bakım veya ml başına 0.5-2 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ortam (% 70 Begm,% 20 FBS ve% 10 DMSO) dondurma cryopreserve. </li></ol> iPSCs 6. yeniden programlanması NOT: iPSCs oluşturmadan önce, nesil ve insan iPSCs kullanımını düzenleyen tüm kurumsal düzenlemelere uyumu sağlamak. Kültür ortamı rutin antibiyotik içermeyen steril bir teknik, iPSC kültürleri için özellikle önemlidir. UEM sağlıklı görünen ve sağlam başarılı yeniden programlama için proliferatif olduğu önemlidir. <ol><li> Plaka 6 gözenekli bir doku kültürü plakasının oyuk başına 5 x 10 5 UEM. 24 saat sonra, polybrene eklemeBegm için ortama Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc ifade lentiviral partikülleri ilave edilmiş 8 ug / ml transdüksiyonu UEM bir nihai konsantrasyona seyreltildi. ~ 5 27 enfeksiyonu (İçişleri) çokluğu sağlamayı hedefliyoruz. <ol><li> İçişleri Bakanlığı belirlenmesi için, konsantre-lentiviral stokunun seri dilüsyonları hazırlamak ve bu seyreltmeleri ile HT1080 hücreleri nakletmek. HT1080 hücrelerinde dTomato ifadenin ilk tümden algıladıktan sonra, dTomato-pozitif hücre / her seyreltme hücrelerin küçük kümeleri sayısını puanlama &quot;ml transducing birim /&quot; sayısını hesaplamak. NOT: Genellikle, çok yüksek dilüsyonları (her şey dTomato pozitif) ve çok düşük (yok ya da pozitif hücrelerin sadece bir çift) olacaktır. </li><li> hücrelerin ayrı ayrı pozitif hücreler / küçük kümeleri tespit edildiği dilüsyonları puanlama gerçekleştirin. Uygun seyreltme faktörü ile birim / ml transducing sayısını düzelterek titresi belirlemek. İB, sonra sayısına oranıdırvirüs partiküllerinin 27 sayısına hücreleri transdüse. NOT: Her dTomato pozitif hücre / küçük yığın, tek bir virüs partikülü kaynaklandığı varsayılmaktadır. </li></ol></li><li> Yaklaşık 3 saat sonrası transdüksiyon, medyayı çıkarın ve taze Begm ile değiştirin. kurumsal onaylı prosedürler kullanılarak lentivirüs içeren ortam atın. 3 gün için kuluçka makinesine geri kalıt UEM dönün. </li><li> 3 gün, taze Begm ile medyayı değiştirmek ve daha sonra başka 3 gün kuluçkaya yatmaktadır. Aspire medya, 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve iyice 1 ml% 0.05 tripsin çözüm ekleyin geçirdi. Tripsin ile Passage hücreleri (Bölüm 5) Yukarıdaki yazılı olarak. Dikkatle 4 ml Begm + P / S supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. Hücreler, işlem bittikten (bir sonraki adıma bakınız) BDC ile kaplanmış bir 6 yuvalı plaka yeni bir oyuğuna geçişli veya MEF kültürlere ilave edilebilir. </li><li> MEF kaplı tabak hazırlayın. 4. günde () +/- Thiazovivin (SPT yerine adım 6.6 kadar) de bir 6 2 oyuklarına (1 ml / oyuk) ve% 0.1 jelatin çözeltisi ilave edilir. Bir sonraki ongün, inaktive MEFS 28 bir şişe çözülme. </li><li> MEF ortamı (DMEM + 1 x NEAA +% 10 dFCS) 10 ml MEFS yerleştirin. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüj pelet. MEF medyada süspanse. Aspire 6 plaka jelatin ve jelatin kaplı 6 plaka oyuk başına 1.87 X 10 5 MEFS ekleyin. 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe ya da 24 saat içinde en az. </li><li> Begm Devri 2 mi önceden kaplanmış 6 plaka 2 kuyulara oyuk başına hücreleri transdüse ve / nO inkübe içeren. Bir sonraki gün, 4 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü ihtiva eden, standart HESC ortam oyuk başına 2.5 ml Begm değiştirin. taze hESC medya ile hücrelerin besleyin +/- SPT 10 gün boyunca günde NOT: Bu UEM 23 etkinliği ve yeniden programlama kinetiğini arttırmak için küçük moleküller (SB431542, PD0325901 ve Thiazovivin (SPT) kokteyli) oluşan bir karışımla ilave edilmesi mümkündür. </li><li> On gün sonra, SPT olmadan HESC ortamını kullanarak günlük beslemeye devam ediyor. hESC benzeri koloniler kadar günlük kültürleri beslemek(Şekil 5A, P0 koloni) görünür. sitoplazmik oranı ve belirgin nükleol: yüksek çekirdeği tarafından varsayılan iPSCs barındıran koloniler belirleyin. </li><li> hESC benzeri morfolojisi ile manuel olarak tüketim ve transfer koloniler bir besleyici içermeyen sistemde ayrı satır olarak kültür ve genişleme için kuyu ayırmak için. Eksize koloniler bu koşullara hızla adapte edilmelidir. <ol><li> kaplama eksize koloniler sonra bu ayrık varsayımsal iPSC hatları artık geçit 1 (p1) olarak kabul edilir. Günlük mTeSR1 ile yem kültürleri. Passage ve standart prosedürler kullanılarak iPSC hatları genişletmek. p1 koloniler onlar pasajlanır edilmesi gereken büyüklüğe ulaşması için bir hafta birkaç gün sürebilir. </li></ol></li></ol> 7. Kültür iPSCs bakımı <ol><li> Yem ve günlük kültürleri değerlendirir. El ile özel tüketim alanları steril bir cam pipet veya mikro pipet ile kazıyarak açık farklılaşma sergileyen. Günlük toplama sonra ortamı değiştirin. </li><li> Passage hücreleri approxima sonrately her dört günde: yavaşça aspire ortam, 6-çukurlu bir tablaya (yarısı besleme hacmi) oyuk başına 1 mi, sıcak Dispase (1 mg / ml) ekleyin, sonra yaklaşık 4 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kolonilerin kenarları kolonisi etrafında beyaz bir anahat gibi görünüyor, hangi kaldırmaya başlayacaktır. Yavaşça Dispase aspire ve ısıtılmış DMEM / F12 ile 3x yıkayın. </li><li> 2 ml mTeSR1 ekleyin ve plaka koloniler kaldırmak için bir hücre kaldırıcı kullanmak. koloniler küçük kümeler halinde kırılmış kadar yavaşça hücreleri çiğnemek için 5 ml serolojik pipet veya P1000 mikropipet kullanın. <ol><li> sağkalım ve daha sonra proliferasyon optimal olacak şekilde, çok küçük bir küme veya tek üreten hücrelerin kaçının. koloniler yeniden kaplama yaparken, 1: 4 ile 1: 6 bölünmüş optimum koloni yoğunluğu koruyacaktır. Yavaşça plaka koloniler ve ortamı çıkartın ve yeni, Matrigel kaplı kuyucuklara ekleyin. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Burun epitel hücreleri (UEM) havayolu hastalığı eğitimi için erişilebilir bir platform olup, NEC-iPSCs hastalık geliştirme, tedavi ve terapi 1,31,32 keşfetmek için heyecan verici bir cadde sunuyoruz. UEM kolayca stresli ya da potansiyel olarak zararlı prosedürler 6,23 olmadan elde edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, bu protokol açıklandığı gibi nazal mukozanın örnekleme daha az stresli ve daha iyi çocuklar için kan toplama daha algılanan gibi görünüyor. Bu nedenle, bu yöntem havayolu hastalıklarının araştırılmasında özellikle pediatrik hasta popülasyonlarında faydalı ve alakalı olabilir. UEM diğer bir avantajı, kültür içinde bir kez, epitel hücreleri ortam kültür koşulu ile seçilir ve homojen hale olmasıdır. Bu, kan hücreleri gibi karmaşık bir doku kullanarak daha avantajlı ve daha kolay transkriptomik ve epigenetik yaklaşımlar kullanılarak iPSC hatları ortaya çıkan hücre kökenli etkisini değerlendirmek için yapar. Ne zamanburun mukozası, örnekleme çoğunlukla epitel hücreleri alınır, böylece bir mikroskop (Şekil 2) altında sitospin görüntüleme ile kanıtlandığı gibi, burun doğru alanı örneklenir önemlidir. Doğru örnekleme ≥90% epitel hücreleri verecektir. Sağlıklı hastalarda numune elde etmek üzere ve örnek elde edilir ve kaplama hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için, uygun bir şekilde toplanır sağlamak için çok önemlidir. Protokol (Bölüm 1.5) &#39;de tarif edilen büküm hareketi fırça mümkün olduğu nazal yüzeyinin kadar temas sağlar. Yabancı bir cisim kişinin yüzüne doğru gidiyor zaman kişinin başını açmak için doğal bir reflekstir. Bu nedenle, bir çocuğun başını ya açar veya çekiliyor durumunda, numune hızlı ve doğru bir şekilde meydana esastır. Bu tekniklerin kullanılması protokolün her adımında verimliliğini artırmak ve başarılı yeniden programlama olasılığını belirleyecektir. çocuğu sormayatmak ve hatta altlarında ellerini yere ya da bir ebeveyn veya kardeş ellerini tutmak zorunda hala yalan ve pürüzsüz ve ağrısız örnek toplama garanti yardımcı olmak için onları teşvik etmek için iyi bir yoldur. Son zamanlarda, birkaç örnekleme teknikleri, konforlu, kolay ve örnek sonuçlar değerlendirilmiştir hücre içeriği ve kompozisyon gibi RNA göre ve DNA 33 verim edilmiştir. grup polyester bez karşı bir sitoloji fırçası ile örnekleme gözden ve onlar aşağı konka yanı sıra şiddetle burun etrafında fırça veya bez dönen tarafından ön burun deliğine hem örneklenmiş. en iyi RNA kazançları elde mi en siliyalı epitel hücrelerinin oluşmasına rağmen bir poliester çubuk ile karşılaştırıldığında bir fırça ile alt konkanın Örnekleme, biraz rahatsız olduğu bulunmuştur. Bu protokolde önerilen yöntemin bu nedenle solunum hava yolu incelemek için bir yol olarak burun epitel örnekleme en güvenilir yöntem olarak doğrulandıepitel. Örnek elde edildikten sonra, bu, 37 ° C&#39;de tutulmalıdır. en etkili yollarından biri, katılımcıyı karşılamak için hazırlanırken güvenli taşıma için bir strafor kap içine daha fazla 37 ° C ve nestle o su bir beher sıcak olduğunu. Numune alındıktan hemen önce, sıcaklık yaklaşık 37 ° C&#39;ye getirilir ve böylece soğuk su ekleyin ve medya ile konik tüp ekleyin. Fırça konik tüp eklendiğinde, su banyosunda hemen tüp dönmek ve hangi hücrelerin kadar tüp düzenlenmiş 37 ° C su banyosunda konulmalıdır işaret laboratuvara iade edilebilir kadar orada tutmak bir kültür karnisi üzerine tohumlandı. tüm noktalarda, steril bir teknik kültür yabancı maddeler oluşumunu ortadan kaldırmak için kullanılır. Hücreler kültür bindirildi zaman örneklerin arasında değişkenlik önemli miktarda görüldü. Bu değişkenlik donör kaynağı hem de kök yanı sıra gibiydiNumune kalitesi kendisi. örnek kalitesini artırmak için bir yolu, her burun deliğine birer fırça veya katılımcı başına iki fırça elde etmektir. Hücreler geçişli taze örnek tohumlama sonra, ve, hücrelerin koşulu da yeniden programlanması için uygun olduğundan emin olmak için düzenli olarak izlenmelidir. için en iyi aday yapmak Hücreler kültüre almak ve hızlı bir şekilde çoğalırlar olanlardır. Bazı donörlerden alınan hücreler, diğer hücrelerden daha daha sağlam neden bilinmemektedir, ama bu tür örnekleme zamanında yaşı, burun boyutu ve vericinin sağlığı gibi faktörlere bağlı olabilir. Örnek verimleri çok az sayıda hücre ya da hücrelerin sadece az sayıda kez kaplama takarken, örnek ortak akışa kadar büyümeye mümkün değildir. Bir mücadele kültür izdiham ulaşmak yaparsa, hücreler zayıf olma eğilimindedir ve birçok hücre pasajlarının sırasında ölür. numunenin bu tür olduklarını hücrelerin hızlı ve güçlü bir çoğalan olarak önemli olduğundan, yeniden programlama için çok zayıf bir aday olup,mümkün olan en erken geçit numarasına transduced. Çok ince, donör değişkenliğine, kötü numune veya pasajlama kültürlerine bağlı olup olmadığını, yavaş büyüyen hücreler transfeksiyonu için tavsiye edilmez. yeniden programlama kötü hücre kültürü ile teşebbüs ise, semere devam etmek mümkün değildir. transdüksiyon hücrelerini hazırlamak için en zor olan protokolün bir parçasıdır. 5 x 10 5 hücre hücre büyümesi, 2 x 10 5 göre transdüksiyon için önerilen ve özel hasta örneklerinde, bu bağımlı olan. Bu nedenle ideal bir sayısını elde etmek için hücre sayıları değişen kaplı bir kaç kuyu gerekebilir. Bu protokol örnekleme kolaylığı değil, aynı zamanda göreli kolaylığı ve primer hücre kültürleri kurulması zaman çizelgeleri ve daha sürdürülebilir ve çok yönlü araştırma fırsatları iPSC hatları için bu birincil hücre kültürleri sonraki yeniden programlanması sadece özetliyor. Tümklinikten kültürde ayrı iPSCs kurulmasına süreci yaklaşık 3 ay sürer ve yeniden programlama sürelerini kısaltmak için yeni yöntemler 6,34,35 geliştirilmektedir. Bu alan hızla iPSCs birincil hücreleri dönüştürmek için, ve daha sonra ilgi belirli hücre ve doku tiplerine iPSCs ayırt etmek daha verimli ve tam yollar bulmak için gelişmektedir. Ancak, hava yolu hastalığı için önemli dokular için farklılaşma protokolleri, akciğer epiteli olarak, hala 36-38 dışarı çalıştı ediliyor. UEM gelen iPSCs oluşturma hücrelerinin basit ve nispeten acısız izolasyon avantajı vardır. Ayrıca, NEC iPSCs yararlanılabilir diğer doku türleri türetilen iPSCs göre avantajlar sunar mümkündür. kanıtlar, fare ve insan iPSCs arasında somatik hücrenin transkripsiyonel ve epigenetik belleği barındıran göstermektedir, ancak daha sonra iPSC farklılaşma iPSC epigenetik etkisi tamamen anlaşılamamıştırkökeni ve bu seçici diğer kaderi 5,26 kısıtlayan iken donör hücre tipi ile ilişkili soy içine farklılaşma yana olduğunu. Nedeniyle menşe dokusunun önemi ve daha iyi anlaşılır doku spesifik epigenetik işaretleri 39-45 tutulması özellikle saygı ile bu etkiler iPSCs fonksiyonel özellikleri, iPSC hatları daha net sırayla çalışılması gereken nasıl kaynaklı doku etkisi. NEC türetilmiş iPSCs kökenli 23 kendi doku epigenetik bellek tutma gösteren bir genomik metilasyon imza liman olduğunu daha önce gösterilmiştir. Daha önceki çalışmalar, daha kolay bir fibroblast ya da daha kan hücreleri ayrılırlar kökenli kan hücrelerinin epigenetik bellek arzeden kan hücresi kaynaklı iPSCs göstermiştir NEC&#39;in-iPSCs korunur Bu epigenetik belleği hava yolu hücrelerine pluripotent kök hücrelerin farklılaşması faydalı olabilir Bloo yoksun yumuşak kas kaynaklı iPSCsd hücreye spesifik epigenetik bellek 5,26. modelleme akciğer hastalıkları için iPSC kökenli havayolu hücrelerinin büyük potansiyeli göz önüne alındığında, UEM havayolu hücre / doku içine iPSCs farklılaşması için optimal hücre tipini temsil olup olmadığının araştırılması için önemli olacaktır. Ayrıca, bu sabit şekilde tutulan bellek donör hücrelerin hastalık durumları için kromozomal yeniden programlama dirençli yerleri ve adayları temsil edebilir. IPSCs dönüştürmek protokoller proksimal ve distal akciğer hücre tipleri 36-38 geliştirilen gibi, bu NEC-iPSCs astım, KOAH, kistik fibrozis, ve diğerleri gibi ve akciğer gelişimi üzerine çevresel etkileri inceleyerek modelleme hava yolu hastalıklarında bir avantaj olabilir ve homeostasis.

insan örneklerinde (hiPSCs) den uyarılmış pluripotent kök hücreler kök hücre araştırmalarının bir hızla gelişen teknolojidir. Onlar çok daha az etik ve ahlaki sakıncaları 1,2 ile embriyonik kök hücre (hESC) araştırma bir alternatif sunuyoruz. Bunlar HESC 3-5 epigenetik özdeş olmayan, ancak hiPSCs gelişimi ve hastalığın fenotipleri modellemek için benzersiz bir yol sunar, ve hastalık durumunun 5-8 ilgili dokulardan elde edilebilir. Üreten hiPSCs yeni yöntemler sürekli transplantasyon için uygun GMP kalite iPSCs hazırlamak ve aynı zamanda yeniden programlama sürecinin 6,9-11 zamanında ve verimliliği artırmak için bir yol olarak, başlamak için en uygun hücre tiplerini belirlemek için araştırılmaktadır. Havayolu epitel hücreleri allerjik inflamasyon 12 gelişiminde kritik ve epitel Immun ile etkileşim yoluyla alerjik tepkiler ve havayolu yeniden önemli bir sürücüE ve stromal hücreler. solunum yolu epitel Kalkış ve astım gibi akciğer hastalıklarının kalıcılığı önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, alt solunum yolu epitel hücreleri, özellikle sağlıklı kontrol ve çocukların, bir klinik ortamında elde edilmesi zordur. Hava kirliliği ve alerjenlere karşı tepkileri okuyan özellikle birkaç çalışmalardan elde edilen veriler, burun mukozasından epitel hücreleri alt solunum yolu epitel hücreleri 13-20 için geçerli ve pratik vekil olduğu öncül desteklemektedir. Burun mukozası% 90&#39;dan fazla kirpikli hava yolu epitel hücreleri oluşur ve diğer hücre / doku örnekleme tekniklerine göre daha az invazif ve olduğu gibi bu burun epitel hücreleri (UEM) örnekleme kolayca yaş dört ya da beş gibi küçük çocuklarda yapılabilir enfeksiyon 20-23 gibi olumsuz olayların en az risk ile ilişkili. Bu, uzun gereksiz ve sıklıkla ağrılı bronkoskopi procedu olmadan sağlıklı ve hastalıklı çocuklara hem de örnek bir hızlı ve basit bir yol sunuyorsedasyon gerektiren res. Daha önceki çalışmalar, astım şiddeti ile ilişkili bir hastalık alt tipleri burun mukozası gibi astım çocuklardan alınan bronş hücre numuneleri hem de ayırt edilebilir olduğunu bulduk, ve iki doku tipleri arasında gen ekspresyonu olmayan yerde gen 22 yaklaşık% 90 benzer olan 24. iPSCs için bir kaynak olarak, UEM diğer sık ​​kullanılan hücre türleri üzerinde avantajlar sağlar. Fibroblastlar genellikle iPSC üretimi için kullanılan, ancak bu hücreler kolayca cilt biyopsisi kültüre olabilir, ancak, bu süreç genellikle lokal anestezi, bir kesi ve dikişler gerektirir ve enfeksiyon bazı riski ile ilişkilidir. Bu nedenle, biyopsi bu tip hastaların bilgilendirilmiş onayını aldıktan 25 zor olabilir. fibroblastlar için bir alternatif periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) &#39;dir. Bununla birlikte, çocuk hastalar arasında iPSC oluşturulması için yeterli derecede kan elde etmek zor olabilir. Buna ek olarak, alt-AP sınırlamalar vardırfibroblast ve kan hücresi kaynaklı iPSCs, belirli hücre tipleri 5,26 özellikle kendi farklılaşma kapasitesi komplikasyonların. Bu nedenle, nispi erişilebilirlik ve kendi koleksiyonu aşağıdaki yan etkileri düşük riski göz önüne alındığında, UEM pediatrik popülasyonların gelen iPSC nesil için ideal bir hücre kaynağını temsil etmektedir. iPSCs yeni hastalık modelleri, insani kalkınmayı okuyan üretmek için bir platform olarak son zamanlarda ilgi çok aldı ve kişiselleştirilmiş tedaviler için hücrelerin potansiyel bir kaynağı olarak var. Bu teknolojinin tam potansiyelini fark edilebilir önce yeniden programlama sürecinin moleküler temellerinin açıklanması gerekir, ama şimdi bu protokol ve içinde belirtilen usuller havayolu maruz odaklanmış araştırmalar ışık tutacaktır için, yanı sıra bir platform sağlamak iPSCs içeren kişiselleştirilmiş tıp etkilerini araştırmak. Birkaç laboratuarları işbirlikçi çalışma Generatio yol açmıştırburun mukozasının örnekleme değil, aynı zamanda UEM kültürlenmesi ve iPSCs 23 bu hücrelerin yeniden programlanması sadece için başarılı bir teknik n. Bu makale optimum örnekleme, kültürleme ve yeniden programlama koşulları için bir protokol bir özeti verilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">15mL conical</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:108px;">14-959-49D</td>
			<td style="width:139px;">Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">BEGM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3170</td>
			<td>Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Penn/Strep/Fungicide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Protocol Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Penn/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Protocol Step 4.a.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cytosoft cytology brush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-263-357</td>
			<td>Protocol Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25-900-CI</td>
			<td>Protocol Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td>Protocol Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2438-4</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cytology Funnel Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cytospin funnel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-640-320</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Cytospin 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">blank slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S95933</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hema 3 stain kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-122-911</td>
			<td>Protocol Step 2.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Bovine Dermal Colagen, type 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1064401</td>
			<td>Protocol Step 3.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">T25 flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-45</td>
			<td>Protocol Step 3.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypsin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Protocol Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td>Protocol Step 5.2.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:207px;">Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65&#176;C for 30min</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Protocol Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:207px;">Dimethyl sulfoxide Hybri-Max&#8482;, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, &#8805;99.7% -&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Protocol Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">polycistonic lentivirus*</td>
			<td>e.g. Millipore</td>
			<td>SCR511</td>
			<td>Protocol Step 6.4.&#160; 
			A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">polybrene</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-134220</td>
			<td>Protocol Step 6.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Irradiated CF1 MEFs</td>
			<td>GlobalStem&#160;</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td>Protocol Step 6.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hESC media</td>
			<td>See recipe included in protocol</td>
			<td></td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">PD0325901</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0006</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Thiazovivin&#160;</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
			<td>Protocol Step 6.11.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">hESC-qualified Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">Corning plate, 6 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">mTeSR1</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5850</td>
			<td>Protocol Step 6.13.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">250mL disposable filter flask (0.22&#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SCGP-U02-RE&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">dispase</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>7923</td>
			<td>Protocol Step 7.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Protocol Step 7.3.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td>Protocol Step 7.4.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hESC Media**</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Protocol Step 6.11. 
			components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4&#176;C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37&#176;C longer than 15 min</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:207px;">DMEM-F12 50/50 media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11330-032</td>
			<td>Final Concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">KO replacement serum (KO-SR)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td align="right">0.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">200mM L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>1mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">55mM &#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>0.1mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:207px;">100x non-essential amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:207px;">2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>4ng/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

Burun girişinde adı burun ilk kısmı, kıkırdak 29 ile alandır. Fırça burun valfi (ostium iç dünyasıyla, ya da Nare arkasında görülen &quot;kara delik&quot;) ötesinde, burun bu alandaki geçmiş sorunsuz gitmek gerekiyor, ve örnek alt konka (Şekil 1) elde edilir. Burun konkalar, burun 29 yüzey alanını arttırmak örnekleme için onları ideal bir konuma yapma kemiksi yapıları vardır. Alan da yakından alt solunum yollarının balataları benzer ve çevresel maruziyet immün yanıtta da aktif vaskülarize mukoza dokusunun tarafından kaplıdır. Doğru doku örneği yeniden programlanması hücreler epitel hücreleridir sağlar. Bu, aynı zamanda kültürdeki hücrelerin gözlemleyerek başlangıç ​​hücre sayısı ve Sitospin ile değerlendirilebilir.Cytospin, bir kez döndürülür, kurutuldu ve lekeli numunenin makyaj gösterir. Çoğu örnekleri bir yuvarlak çekirdeği ile, sütunlu ve kirpikli epitel hücreleri, oluşur. Birlikte clumped görülen burun doğrudan alındığında Hema 3 leke kiti ile, genellikle (Şekil 2) koyu mor çekirdeği ile açık mavi bir renk leke ve. Burun hücre örnekleri, başlangıçta kültür ve ortam değişiklikleri ile zaman bir burun hücre tiplerinin bir karışımı olarak enkaz olsa da, epitel hücreleri baskın (Şekil 3A, B) olmaktadır. Epitel hücreleri izdiham büyüyor, onlar çekirdek büyük bir taze kırık yumurta, şeklinde ve merkezinde bulunan ve hücre (Şekil 3B) bölmek için hazırlanırken sitoplazma &quot;uzanarak&quot; ve germe tür olduğunu vardır. Hücreler bir araya büyüdükçe, onlar bir futbol şekli daha almak ve (tabak rahatça birbirine Şekil sığacak başlar3C). Hücreler transdüksiyona tâbi tutulursa, onlar. Çekirdekte tdTomato fluoresan işaretleyici ifade edecek da transduse edilmiş sonra parlak saha, floresan ve her iki resim birleştirilmiş olan, 4 hücrelerini göstermektedir. Her hücre işaretleyici ifade ve bu nedenle her hücrenin transduse, ancak her bir kuyunun yaklaşık yüzde 90 transdüksiyon verimliliği olmalı ve bu bazı hücreler MEFS üzerinde kaplama edildikten sonra pluripotensini elde olasılığını artıracaktır. ko-kültür MEFS ve hücreleri gibi koloniler oluşmaya başlar, onlar yavaş yavaş tdTomato ifade duracaktır. Ancak, bu koloni oluşumunun en iyi göstergesi değildir. koloni oluşumunun en iyi göstergesi görsel teyididir. pluripotency &quot;altın standart&quot; olan hESC koloniler, çoğunlukla yuvarlak ve larg ile çok sayıda küçük, yuvarlak hücrelerden oluşure çekirdekleri ve sitoplazma oranı yüksek bir çekirdek. Her hücre, çoğunlukla çekirdeklerin oluşan görünür ve diğer organelleri açıkça görülebilir değildir. Standart besleyici içermeyen koşullarda iPSC koloni hasat ve kültür ardından, yeni kurulan iPSC kolonileri çok kendi HESC meslektaşları gibi görünmelidir ve Şekil 5B görüldüğü gibi bireysel hücreler, HESC fenotip hemen hemen aynıdır. kullanan iPSCs deneylerde nazal epitel hücreleri (NEC-iPSCs) elde etmeden önce, yeni hatların kalitesini değerlendirmek için tavsiye edilir. Bu genellikle karyotip, Pluripotency belirteçlerinin ifadesi ve 3 embriyonik germ (endoderm, mezoderm ve ektoderm) her birine ayırt etmek iPSCs yeteneğinin değerlendirilmesini içermektedir. Farklılaşma kapasitesi birçok yönden test edilebilir, ancak şu anda, en sıkı tahlil teratom tahlil 2,23,30 olduğunu. Bu transkripsiyonel olarak daha kapsamlı deneyler<html> ve Epigenomik profil herhangi bir kromozom anomalileri 23 yeniden programlama tarafından tanıtıldı belirlemek için yararlıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53814/53814fig1.jpg" /> Şekil 1. İnferior Konka. Örnekleme hareketi ve örnekleme hedefi, alt konka, siyah ok ile gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53814/53814fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53814/53814fig2.jpg" /> Şekil 2. sitospin. Numunenin çoğu bir ucunda silya ve diğer bir yuvarlak çekirdeği ile, uzun ve sütunlu olan epitel hücreleri oluşur. Nare doğrudan örneklenmiş zaman sık sık birlikte clumped. Oklar bağımsız epitel hücreleri göstermektedir.&quot;Https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53814/53814fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53814/53814fig3.jpg" /> Numune alındıktan ve kaplama hemen sonra kültüründe Şekil 3. Primer nazal epitel hücreleri. (A) Yüzer hücreleri ve enkaz. (B) Hücreler bir gün sonra pasajlanır ediliyor. Hücre morfolojisi tutarlı ve kültür başta burun epitel hücreleri, 10X büyütme ve (C) 5X büyütme oluşur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53814/53814fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53814/53814fig4.jpg" /> UEM Şekil 4. İletimi. Hücreler<html> vektör alınmış ve kırmızı floresan işaretleyici tdTomato göstermek var transduced ediliyor. Onlar bir pluripotent devlete doğru ilerlerken Bu işaretleyici solmaya gerekir. (A), kalıt aktarımlı hücrelerin Aydınlık alan görüntüsü. (B), kalıt aktarımlı hücrelerin florasanla görüntüsü. (C) Yerleşimi parlak bir alan ve floresan görüntüleri (paneller A ve B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53814/53814fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53814/53814fig5.jpg" /> Şekil 5. iPSC hücre benzeri koloniler kaynaklanıyor. (A) MEFS üzerinde büyüyen koloni çoğunlukla kenarları yuvarlak ve hiçbir farklılaşma az gösterir. (B) Bireysel hücreleri büyük çekirdekler ile küçük yuvarlak hücreler ile tipik hESC benzeri morfoloji göstermektedir.5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Çocuklar Primary Burun Epitel Hücreleri yetiştirmek ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine programlayın

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K Görüntüleme.  Cincinnati Children's Hospital. This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Video: Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Gelişim Biyolojisi

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...