işin çoğunluğu NWO 175-010-2009-023 ve ZonMW 91111006 tarafından desteklenen UMCG Mikroskopi ve Görüntüleme Merkezi (UMIC), en yapılmıştır; BNGG için STW &quot;Mikroskopi Valley 12718&quot;. Bu eser, Marie Curie Kariyer entegrasyon hibe (nöronlar ölüyor tasarruf) Bir ZonMW VENI hibe ve TJvH bir Alzheimer Nederland burs sponsor oldu

Zebra balığı larvaları ile Tüm deneyler ulusal ve AB direktiflerine göre Groningen Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Numune Hazırlama <ol><li> Fiksasyon ve Gömme <ol><li> tespit <ol><li> Tricaine (% 0.003), balık larvaları uyuşturan hafifçe alay E3 (5 mM NaCI, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7.6) anestezi derinliği zebra balığı su ve test eklendi diseksiyon mikroskobu altında 200 ul pipet ile hareket artık (Şekil 1A) tespit edilene kadar. </li><li> Tarif edildiği gibi agaroz,% 1.8 konfokal veya 2 foton görüntüleme kullanılarak in vivo görüntüleme verileri elde sonra bağlaşık EM için numune işleme tabi tutulduğunda, agaroz 5,15 düzeltme larva Triton-X-100 (% 0.05) ihtiva eden PBS içinde% 4 PFA kullanılmıştır. </li><li> agaroz ve işlem için gelen larva kestibüyük ölçekli EM 5. </li><li> plastik tüplerde, oda sıcaklığında 2 saat süre ile, Triton-X-100 (% 0.05) ihtiva eden PBS içinde, taze% 4 paraformaldehid içinde larvaları düzeltildi. Not: kültür içinde yetiştirilen hücreler bir sonraki aşamada (1.1.1.5) &#39;de tarif edildiği gibi (in vitro), doğrudan, glutaraldehid edilebilir. </li><li> çözüm çıkarın ve 100 ul% 0.5 PFA,% 2 glutaraldehid (GA) ve 0.1 M sodyum kakodilat içinde (pH 7.4) ilave edilir. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca muhafaza ediniz. Durulayın numuneler iki kez 0.1 M sodyum kakodilat içinde. </li><li> osmiyum penetrasyonu kolaylaştırmak için Beyin için rostrally larva başlarını kesti. ince şırınga / forseps kullanın. </li><li> % 1 ozmiyum tetroksit içinde Postfix&#39;i larvaları (OsO 4) 2 saat boyunca potasyum ferrosiyanür (K 4 [Fe (CN) 6]) buz üzerinde 0.1 M sodyum kakodilat içinde /1.5% ve çift damıtılmış H2O 3 x 5 dk durulama </li><li> etanol artan konsantrasyonlarda 20 dakika inkubasyon (% 50,% 70, 3 kez% 100) ile etanol içinde kurutmak. </li></ol></li><li>katıştırma <ol><li> EM laboratuvarlarında kullanılan standart tariflere göre epoksi reçine hazırlayın. Not: şöyle epoksi reçine kullanılmaktadır: karıştırın 19.8 g glycid eter 100, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak 9.6 g 2-dodesenilsukinik asit anhidrit ve 11.4 gr metilnadik anhidrid. 0.5 g DMP-30 (tris- (dimetilaminometil) fenol) eklenir ve tekrar karıştırılır. </li><li> etanol içinde% 50 epoksi reçine larva gece inkübe (h / h) (RT) dönerken. </li><li> Saf reçine ile sulandırılmış epoksi reçine yerine takın. 30 dakika boyunca inkübe tekrar taze reçine ekleme ve 30 dakika için inkübe edilir. Yine reçine yenilemek ve 58 ° C&#39;de 15 dakika ve düşük basınç altında (200 mbar) altında, oda sıcaklığında 1 saat daha ve ardından oda sıcaklığında 3 saat, inkübe edilir. </li><li> Bir iğne kullanarak bir diseksiyon mikroskobu altında piyasada mevcut silikon düz gömme kalıpları başlarını yönlendirmek ya da kalıp ya da gerektiği gibi tarafına bakacak anterior kürdan (Şekil 1B). </li><li> Epoksi res polimerize58 ° C&#39;de gece boyunca. Epoksi reçine ise de çok yumuşak bir gün polimerize edilmesi ve 58 ° C &#39;de sertleşmeye olanak sağlar. forseps kullanarak basınç uygulayarak test sertlik. Bu kolayca girinti başka bir gün polimerize ve 58 ° C&#39;de sertleşmesine izin bırakır. Numune tamamen sertleştiğinde kırparak ve kesit geçin. </li><li> Saplama kullanılarak Jilet (Şekil 1B) aşırı reçine uzak Trim. </li></ol></li></ol></li><li> , Kesit zıt ve Montaj <ol><li> kesit <ol><li> Bir ultramikrotom kullanılarak Bölüm epoksi reçine blok. </li><li> Cam bıçak ya toluidin mavisi / bazik fuksin için de yarı ince kesitler (500 nm) kesmek için bir elmas histoknife kullanarak (Şekil 1D) doğru konumlanmasını tespit boyama. </li><li> kimin ucu bir alev eriterek kapatılmış bir cam Pasteur pipet ile onları toplayıp mikroskobik slaytlar transfer yarı ince kesitler. sıcak bir plaka u kuruntil su bırakılır. sıcak bir plaka üzerinde, su içinde% 1 toluidin mavisi ile 10 saniye boyunca ve% 1 sodyum tetraborat% 0.05 bazik fuksin ile 10 saniye boyunca su, leke ile durulandıktan sonra leke. 40X için 10X de normal ışık mikroskobu ile incelenmesi. </li><li> Beynin içinde uygun yer / oryantasyon ulaşıldığında, ultra ince bölümleri kesmek için bir elmas bıçak ile epoksi reçine blok kesit devam (~ 70 nm; Şekil 1E) </li><li> kesit ultra ince esnasında ilgi bölgeyi tanımlamak için ve örnek hareket ettirildiğinde kesit açısını ayarlamak için, koku çukurlar, gözler, gri-beyaz cevher sınırları da dahil olmak üzere, beyinde ve çevresinde kolayca tanımlanabilir anatomik yapıları kullanır. </li><li> Tek yuvalı L2 x 1 bakır ızgaralar (Şekil 1F), Mount bölüm ızgara çubukları tarafından kesintisiz edinimi izin vermek. bölümleri desteklemek için Formvar kaplı ızgaralar kullanın. </li></ol></li><li> karşıt <ol><li> ızgara üzerinde leke ince kesitlerReynolds, ardından metanol içinde% 2&#39;lik üranil asetat içinde 2 dakika süreyle s başka bir 2 dakika 16 kurşun sitrat. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Görüntü Alma <ol><li> Büyük Ölçekli KÖK Not: KÖK algılama kullanarak yüksek çözünürlükte 3,5,7,17 ​​de görüş birden çok büyük alanları edinme yeteneğine sahip bir dış tarama jeneratör ile tarama EM kullanın. Tipik olarak, tek bir görüntü, bu şekilde önemli ölçüde dikiş miktarını azaltarak, ~ 100 Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntü bakış alanları eşdeğerdir oluşturulur. <ol><li> Mikroskop Örnek montaj <ol><li> Birden fazla ızgara numune tutucu bölümünde ile ızgara yerleştirin ve SEM odasına transfer. </li></ol></li><li> KÖK Dedektör hizalama <ol><li> kiriş altında numune ile ızgara koyun ve yaklaşık olacak şekilde yukarı hareket ettirin. Lens kutuptan 5 mm. kullanılarak 20 kV bir görüntü eldelens-dedektörü. </li><li> ızgara kenarında odaklanın ve 4,0 mm çalışma mesafesi ayarlayın. </li><li> güvenli bir konuma numune tutucu taşıyın ve KÖK dedektörü getirmek. </li><li> in-lens dedektörü ile maksimum hızda ayarlamalar vidaları ise görüntüleme çevirerek görüntü alanında STEM dedektör delik ortalayın. </li><li> Dikkatle sadece objektif kutup ve detektör arasındaki uyacak numune tutucu geri getir. </li><li> kesit alanı olmak emin olmak için de lens dedektörü ile bir görüntü kazanır. </li><li> Anahtar algılama (kazanç orta ve &#39;eksi&#39; ayarlanmış tüm kadranlar) STEM ve bir görüntü elde ve taranacak alanı seçmek için. </li><li> 21 kV hızlandırma gerilimi yükseltmek ve (yine kararlı görüntünün) ışın stabilizasyonu için bekleyin ve daha sonra 2 kV adımlarla 29 kV gidin. </li></ol></li><li> Görüntüleri Kazanılması <ol><li> örnek Ön-irradiate yakınlaştırma (e-beam neden olduğu parlaklık değişikliklerini önlemek için)taranacak tam alana kadar dışarı görüntü penceresi uyuyor. </li><li> 120 mikron diyafram değiştirin (dedektör kazançları bir adım azaltılması gerekmektedir uygun dinamik aralığı tutmak için). </li><li> De-odak görüntü bulanık yani. </li><li> azaltılmış alan tarama seçeneğini kullanarak mümkün olduğunca sıkı taranan bölgeyi olun. </li><li> Bir çerçeve yaklaşık olarak taranır şekilde ayarlayın tarama hızı. 1-2 sn. Not: boyutu ve doku bağlı olarak bu tipik alır ½ saat (100 x 100 mm FOV) 3 saat (1.000 x 500 mm) kadar kadar. </li><li> En az 100X de yakınlaştırmak ve 10 sn için küçük bir alan taraması. Not: Bu bölge çevresindeki, ışınlama öncesi yeterli karşılaştırıldığında parlaklığı değişmez zaman. </li><li> 30 mikron diyafram geri getir (ve orta kazancı STEM) </li><li> örnek odaklanın. </li><li> wobbler (~ 40,000X büyütmede) kullanarak diyafram hizalayın. </li><li> odak hafif alan / özelliği seçerken, tarama hızını ayarlamak gibi ayrıntılar olduğunugörebilir. </li><li> mikroskop yazılımı dikkatlice dinamik aralığındaki tüm pikselleri tutmak için histogramı izleyerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. karanlık alan / özellikler için aynı şeyi. </li><li> geri parlak alana gidin ve tekrar kontrol edin. histogram her iki tarafında biraz boşluk var bu yüzden güvenli tarafta olmak. </li><li> taranacak tam alan görüntüleme penceresini uygun şekilde uzaklaştırın ve geniş alan satın alma programını başlatın. </li><li> ekranından bir alanı seçerek bir mozaik kurmak için sihirbazı seçeneğini kullanın. Kullanım piksel boyutu 2 - ayrıntılar gerekli olan ne bağlı 5 nm. KÖK için bekleme süresi 3 uS kullanın. </li><li> Seçeneğini seçin &quot;önceki karo üzerinde otofokus&quot; onay kutusunu, varsayılan şirket ayarları ile büyük ölçekli toplama yazılım otofokus kullanmak &quot;önce yürütme ayarını doğrulamak&quot; ve nerede verileri kaydetmek tanımlayın. </li><li> Basın mikroskop ayarlarını kontrol etmek &quot;optimize&quot;. Not: Şimdi ihtiyaç duyulan zaman sh olacakkendi. Bu kadar 1 x 0,5 mm alanları için 72 saat için olabilir. </li><li> Pencere &quot;maksimum karo çözünürlük&quot; türü 20.000 nedenle bireysel fayans künt kenar etkileri önlemek, daha büyük daha 20k x 20k olmayacaktır. Basın &quot;yürütme&quot;. </li><li> odaklama ve Parlaklık / Kontrast (B / C) kontrol etmek için sorulduğunda, dış tarama jeneratörü kapatmak ve dikkatli bir şekilde mikroskop yazılımı odağı ve astigmat ayarlayın. B / C değiştirmeyin. Not: Sahne taşındı ve büyütme değişti ama büyütme geri istediğiniz piksel boyutuna ayarlanmış olması gerekir edilebilir. </li><li> Yine dış tarama Jeneratör geçmek ve basın &quot;Devam&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi <ol style="margin-left: 40px;"><li> büyük ölçekli EM dosyası görüntüleyici programı açın ve dosyayı &quot;mozaik bilgi&quot; açın. Bu, tüm kiremitli tif dosyaları açılacaktır. Bu, tercihen yeni satın almalar engel değil başka bir iş istasyonunda gerçekleştirilir. </li><li> seçeneği &#39;au seçinTüm mozaik dikiş (parametreler eşik 0.90, otomatik gürültü azaltma dikiş, yarısı modu üst üste. vaka dikiş kriterlerinde de, zoom yerine elle konumunda karo yerleştirin ve &#39;olduğu gibi devam&#39; düğmesine tıklayın olamaz). </li><li> bir html dosyası olarak ihracat, ya da alternatif olarak tek bir TIF olarak. TIF bir küçültme gerekli olabilir dışa unutmayın. Daha sonra ölçümler sağlayan dosya adı son piksel boyutunu içerir. </li><li> bir resim düzenleme programında açarak TIF dosyasındaki açıklamaları gerçekleştirin. Buna paralel olarak, optimum çözünürlük gözlem için bir web tarayıcısında yakınlaştırılabilen html dosyasını açın. </li></ol>

<ol>
	<li>Faas, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+nanoscopy:+generation+of+ultra-large+high+resolution+electron+microscopy+maps.">Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps.</a> J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).</li><li>Kuipers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPPER,+a+combinatorial+probe+for+correlated+live+imaging+and+electron+microscopy,+allows+identification+and+quantitative+analysis+of+various+cells+and+organelles.">FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles.</a> Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).</li><li>Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+transmission-mode+scanning+electron+microscopy+(tSEM)+for+large+volume+analysis+at+nanoscale+resolution.">Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution.</a> PLoS One. 8, e59573 (2013).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destruction+of+tissue,+cells+and+organelles+in+type+1+diabetic+rats+presented+at+macromolecular+resolution.">Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution.</a> Sci Rep. 3, 1804 (2013).</li><li>van Ham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+correlated+microscopy+reveals+differential+macrophage+and+microglial+dynamics+during+resolution+of+neuroinflammation.">Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation.</a> Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).</li><li>Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+EM+of+non-heavy+metal+stained+biosamples:+Large-field+of+view,+high+contrast+and+highly+efficient+immunolabeling.">Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling.</a> Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).</li><li>Sokol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Electron+Microscopy+Maps+of+Patient+Skin+and+Mucosa+Provide+Insight+into+Pathogenesis+of+Blistering+Diseases.">Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases.</a> J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).</li><li>de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+Ultrastructure+lights+up!+Nat+Methods.">Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods.</a> Nat Methods. 12, 503-513 (2015).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12, 51-54 (2015).</li><li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina.">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li><li>Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+dynamics+in+the+CNS:+Learning+from+the+zebrafish.">Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish.</a> Glia. 63, 719-735 (2015).</li><li>van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cells+are+cleared+by+directional+migration+and+elmo1-+dependent+macrophage+engulfment.">Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment.</a> Curr Biol. 22, 830-836 (2012).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304, 811-824 (2007).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li><li>van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+apoptotic+cells+in+zebrafish.">Live imaging of apoptotic cells in zebrafish.</a> FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).</li><li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron-opaque+stain+in+electron+microscopy.">The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).</li><li>Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+reconstruction+of+brain+tissue+from+high-resolution+serial+section+images+acquired+by+SEM-based+scanning+transmission+electron+microscopy.">Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy.</a> Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).</li><li>Stensaas, L. J., Reichert, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+and+amoeboid+microglial+cells+in+the+neonatal+rabbit+brain.">Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain.</a> Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).</li><li>Mori, S., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microglia+in+light+and+electron+microscopy.">Identification of microglia in light and electron microscopy.</a> J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

EM biyolojik bağlamda makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile hücresel bağlam analizi sağlar. Bununla birlikte, bu tipik olarak görüş alanını sınırlar. Büyük ölçekli 3D EM karmaşık veri işleme 10 gerektiren, nano ölçekli çözünürlüğü 3 boyutlu rekonstrüksiyon oluşturarak haritalama nöronal bağlantısı için uygundur. Buna karşılık, 2D büyük ölçekli EM görüntüleme verileri tek bir bölümü ve dikiş gerektirir ve verilerin değerlendirilmesi, bir internet tarayıcısına erişimi olan herkes tarafından mümkündür. Biz ve diğerleri, daha önce dokuları ve bütün hayvanların analiz etmek büyük ölçekli EM kullanılır. En yaklaşımlar, TEM ve SEM-tabanlı dikiş gelince kendi avantajları var. Burada, tarama iletim EM (STEM) yüksek çözünürlükte geniş bir görüş alanının oluşturulmasına imkan olduğu kullanılmıştır. Büyük Yıkıldığı görüntüleme, genellikle, tek bir KÖK görüntü yaklaşık olarak 100 TEM görüntüleri, önemli ölçüde dikiş miktarının azaltılması bakış alanları eşdeğerdiryüksek çözünürlükte bakış DS. Daha yüksek çözünürlük gerekli ise, TEM avantajlı olabilir. KÖK olmayan kontrast örnekler iyi bir ince yapı kontrast 6 kullanılabileceğini TEM üzerinde bir avantaja sahiptir. Buna ek olarak, burada açıklanan yöntem basitçe bölümler birden mikroskop sistemleri kullanımının yaygınlaştırılmasının, silis gofret üzerine monte geri saçılan elektron algılama (BSD) ile kullanılmak üzere ayarlanabilir. HTML yakınlaştırılabilen doku EM dosyaları hasta verilerini analiz etmek için, bilimsel araştırma LM ve EM verileri (CLEM) 8, sunum amaçlı birleştirerek, tam içeriği analiz edilmemiş olabilir veri paylaşımı ve eğitim, ölçümü için çok yararlıdır. BSD kullanılabilir, daha genel olarak algılama gövdesinden tarama elektron mikroskobu geçerli olan: Seçenek olarak ise, bir SEM büyük ölçekli EM, ancak bir TEM silis gofret iki ana avantajı olan, kullanılabilir. İkincisi, büyük bölümünün (&gt; 1 mm 2 alanlarda montajıfaiz) basittir. Tek yarıklı ızgaraları montaj emek yoğun ve teknik açıdan zor. TEM, SEM ve KÖK arasında ayrıntılı bir karşılaştırma başka bir yerde 6 ayrıntılı. BSD görüntüleme bir dezavantajı, resim gürültü artmıştır, KÖK göre olmasıdır. Bu, kısmen daha uzun alıcı zamanlarda elde edilen piksel kalma süresini arttırmak sureti ile telafi edilebilir. Numune hazırlama, nispeten standart EM işleme (fiksasyon, gömme ve kesit) için 5-7 ihtiyaç olmasına rağmen, eserleri tamamen yoksun büyük ultra ince bölümleri kesmek için teknik olarak zordur. Bölümler, kolay kırılabilir, çok kırılgan olan kat veya tipik veri kümesi başına birden fazla saat sürer görüntüleme sırasında yok edilir. Ancak, ham tarafsız verilerin çevrimiçi paylaşımı, bu yayınladığı verilere daha kolay karşılaştırmak ve kontrol grubu olarak açık alanda yayınlanan veri kümesi kullanmak mümkün hale gelmelidir. Şu anda, yetenekli la birkaç EM cihazlarırge ölçekli analiz kullanılmakta olan ve çoğu görüntüleme merkezleri işbirlikçi çabaları takdirle karşılıyoruz ama bu nedenle bu tekniği erişilebilirlik, biraz sınırlı. Büyük ölçekli bölümler için doku doğru, numune boyunca sabit olması gerekmektedir. Bu hızlı ama ılımlı fiksatif PFA bir karışımı yavaş ama güçlü fiksatif GA ile birlikte kullanılır nedeni budur. Kesme ve eserler olmadan büyük bölümleri toplayıp zordur. BSD ile birlikte gofret ile çalışma tek delikli ızgaralar ilgili bölümler toplama kıyasla daha kolaydır. Ağır metal sonrası boyama klasik EM göre daha önemlidir. Bütün bölüm görüntülü beri her obje görünür olacaktır. TEM kullanıcılar genellikle zor, çünkü mikroskop operasyonda farkı, bir SEM geçmek için bulabilirsiniz. Sayısallaştırılması ve veri paylaşımı - hücre içi özellikleri miktarının tek EM görüntüler zordur. olasılık ve büyük ölçekli uzaklaştırmak içinÇıkan kolaylıkla hücreler içinde nano ölçümü ile takip edilebilir ilgi hücreleri, belirlenmesini sağlar. Bu veri kümeleri belirli hücre tipleri hızla farklı ölçeklerde saptanabilir özelliklere dayalı tespit ve bu büyük doku kesitlerinde tarafsız bir şekilde ölçülebilir olduğunu göstermektedir. Örneğin mikroglia kendi morfolojisi ve yoğun sitoplazmaya dayalı tespit edilebilir. Daha önce büyük ölçekli EM doku kültürü veri kümesi 2 içinde ER genişliği gösterdi Daha sonra, tek tek hücrelerin üzerinde yakınlaştırma üzerine, bu hücrelerin nano ölçekli hücre içi ve moleküler özellikleri, aynı veri kümesi içinde ölçülebilir. nanotomy bir başka avantajı çevrimiçi büyük ölçekli veri setleri barındırma diğerleri belki diğer özellikler için veri incelemek için izin ve yeni hipotez kendi sonuçlara ulaşmak olacaktır. CLEM - kantitatif EM kolaylaştırılması yanı sıra, büyük ölçekli EM kolay ışık mikroskobik ilişkilendirmek için yaparEM seviyeye 8 pic etiketleme. Bu örnekte, bir zebrabalıkları ablasyon modelinde fagositik mikroglia varlığı gösterilmiştir. nörobilim önemli bir soru, bireysel fonksiyonları ve katkıları mikroglia ve fagositik ve bağışıklık hücrelerinin potansiyel diğer kaynaklardan budur. Erken EM çalışmalar hastalığın 18 mikroglia ayırt edici hücre içi özelliklerini göstermiştir. bu gen ifadesi, morfoloji ve işlev olarak, diğer bağışıklık hücreleri büyük örtüşmeyi sergileyen Ne yazık ki, seçici bir şekilde patolojik bir ortamda, özellikle mikroglia etiket zordur. Bu nedenle, belli olup olmadığı ve ultrastrüktürel düzeyde mikroglia makrofajlar infiltre türetilmiş monosit dahil olmak üzere diğer kaynaklardan bağışıklık hücrelerinin farklı zaman. İşlevsel farklar analizi için bir başlangıç ​​noktası sağlayacaktır bu hücreler arasındaki ultrastrüktürel farklılıklar anlama olup olmadığını. seçici transgenik ya da ifade işaretlerini birleştiren ve CLEM det veriyorultrastrüktürel özellikleri ection belirli nüfusa seçici. Tanı ve sunum ve eğitim - tek bir veri kümesi EM verileri içinde microscale için nano ölçekli görselleştirme ile büyük ölçüde geniş bir kitleye kolaylaştırılır. bağıntılı ve büyük ölçekli EM artan imkanları ve araçları ile temel ve tıbbi araştırmalarda EM&#39;nin bir canlanma öngörüyoruz. Burada temsil edilen Yöntem A zebrabalıkları beyin yaralanması modeli 5&#39;e uygulanır, ancak diyabet 4 ve hücre kültüründe 2 bir fare modelinde, insan dokusu 7, fare beyni 3 kullanılmaktadır ve aynı zamanda, bir TEM ile kombinasyon halinde de kullanılabilir Bu yöntemin çok yönlülük gösteren tabanlı bir yaklaşım 1. mikroskop operatörü artık çok seçilmiş ve dolayısıyla yanlı görüntüler, ancak tüm sayısız ultrastrüktürel özellikleri kaydedildi ve dünya çapında analiz için açık olan kaydediyor.

Son teknik gelişmeler ultrastrüktürel analiz canlanma lider, EM çok yönlülük, uygulanabilirliğini ve nicel doğa düzeldi. Gelişmeler doğrudan EM seviyesine 8-10 mikroskobik analiz diğer modları karşılaştırmak için 3D EM, büyük ölçekli 2D EM ve ilişkili ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu (CLEM) için geliştirilmiş yöntemler ve belirteçler bulunmaktadır. Büyük ölçekli 2D EM ölçmek ve insan patoloji (yeni) hastalığı özelliklerini belirlemek, hastalık ve doku kültürü modelleri için hayvan modelleri çalışma özellikle uygundur. Nedeniyle görünüm genellikle küçük alanı ile bir doku, geniş ölçekli yüksek büyütme değişiklikleri ilişkilendirmek için, hem de tarafsız bir ve kantitatif ultrastrüktürel özellikleri analiz etmek zordur. İnsan doku ya da hayvan modellerinde, patoloji değerlendirmesi, hematoksilin ve eozin (H &amp; E) renkli gömülü formaldehid sabit parafin kesitleri (FFPE) tis patolojik analizi içinsue standarttır. Basit yanı sıra H &amp; E boyama immün da patolojik anormallikleri tespit etmek için yapılır. Bu dokular EM DÜZEYİ, özel hücre tipleri de analiz edildi ve edilebilseydi hücre içi değişiklik tespit edilememiştir. Büyük ölçekli EM tarafsız doğa hastalığın beklenmedik ve yeni özellikler bulmak sağlar. Büyük ölçekli tarafından milimetre karelik EM alanlar kadar görülebilir. Biz ve diğerleri, daha önce pankreas adacık 4 sıçan nanotomy, hücre kültürü 2, sıçan beyin 3, deri ve mukoza 7 ve tüm Zebra balığı larvaları 1,5 (www.nanotomy.org) uygulanır. Balığı, beyin bağışıklık hücreleri 11 de dahil olmak üzere, memeli dokularında erişilmesi zor olan hücre tipleri görselleştirmek için, özellikle de, in vivo görüntüleme için son derece uygundur. Burada nanotomy prosedürü nöronal ile metronidazol dönüştürülmesiyle koşullu nöronal ablasyon uygulanan zebra balığı kafaları koronal bölümlerine uygulanan ayrıntılı olarak tarif edilmiştirifade nitroredüktaz (www.nanotomy.org) 5,12-14. Tüm ham veri doku ölçekli değişikliklere moleküler görselleştirme, yakınlaştırılabilen HTML dosyaları olarak sunulmaktadır. Ham verilerin sunumu, dünya çapında uzmanlar tarafından diğer açılardan veri setleri tarafsız analizler sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Chemicals</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Low melting point agarose</td>
			<td style="width:204px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">444152G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tricaine</td>
			<td style="width:204px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton- X-100&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutaraldehyde</td>
			<td style="width:204px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:204px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">osmiumtetroxide</td>
			<td style="width:204px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6)</td>
			<td style="width:204px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">4984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">ethanol</td>
			<td style="width:204px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20821.365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">uranyl acetate&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">8473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodiumtetraborate</td>
			<td style="width:204px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1063808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Tolduidene blue</td>
			<td style="width:204px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Basic Fuchsin</td>
			<td style="width:204px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">340324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:204px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">EPON</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-dodecenylsuccinicacid anhydride&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">20755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylnadic anhydride</td>
			<td style="width:204px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">29452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycid ether 100</td>
			<td style="width:204px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">21045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMP-30&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard flat embedding mold</td>
			<td style="width:204px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">diamond knife</td>
			<td style="width:204px;">Diatome Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">copper grids&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double sided carbon tape&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanning EM Zeiss Supra55</td>
			<td style="width:204px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultramicrotome Leica EM UC7</td>
			<td style="width:204px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atlas external scan generator&#160;</td>
			<td style="width:204px;">Fibics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale scanning transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain

Büyük ölçekli 2D elektron mikroskobu (EM), ya da nanotomy, nano ölçekli çözünürlük elektron mikroskobu doku çapında bir uygulamadır. Diğer ve daha önce insan derisi pankreatik adacıklar, doku kültürü ve bütün zebra balığı larvası 1-7 büyük ölçekli EM uygulanır. Burada alt-hücresel ve moleküler özelliklerinin tarafsız tespiti için doku ölçekli tarama EM için evrensel olarak uygulanabilir bir yöntem açıklanmaktadır. Nanotomy sağlıklı ve nörodejeneratif zebra balığı beyin araştırmak için uygulanmıştır. Bizim yöntemi standart EM numune hazırlama protokolleri dayanmaktadır: Fiksasyon gluteraldehit ve osmiyum ile, epoksi reçine gömme ardından kesit ve uranil ve kurşun post boyanması ve ardından tek delikli ızgaralar üzerinde ultra ince kesitlerin, montaj ultra ince. Büyük ölçekli 2D EM mozaik görüntüleri EM tarama iletim EM (STEM) kullanarak harici bir geniş alan tarama jeneratöre bağlı bir tarama kullanılarak elde edilir. 50 G piksel i - Büyük ölçekli EM görüntülerin genellikle ~ 5 vardırn boyutu ve en iyi online coğrafi HTML haritalarına benzer herhangi bir web tarayıcısında açılabilir yakınlaştırılabilen HTML dosyaları, kullanarak inceledi. Bu yöntem, (insan), doku, çapraz Bütün hayvanlar bölümleri hem de doku kültürü 1-5&#39;e uygulanabilir. Burada, zebrafish beyinler non-invaziv nöronal ablasyon modelinde analiz edildi. Biz nöronlar ve mikroglia, beynin makrofajlar dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde ölçülebilir bir hücresel tek veri kümesi doku ve hücre içi değişiklikler içinde görselleştirmek. Büyük yüzey alanı, daha önce görüntülü Buna ek olarak, nanotomy floresan mikroskopi kullanılarak, aynı doku ışık mikroskobu (Clem) EM korelasyonunu 8 kolaylaştıran, daha sonra nano anatomisi (nanotomy) arasında ortaya çıkan, geniş bir alan EM tabi tutulabilir dokular. Toplamda, nanotomy bir doku çapında ölçülebilir bir şekilde EM düzeyinde özelliklerin tarafsız algılanmasını sağlar.

1 haftalık Zebra balığı larvalarının baş koronal kesitlerin Büyük ölçekli EM veri kümesi tek bir büyük ölçekli görüntüde birçok doku ve hücre özelliklerini gösterir (www.nanotomy.org). Kontrol beyin bölümlerinin Nanotomy koku elyaf demetlerinin, nöronal çekirdekleri ve sinaps da dahil olmak üzere nöronal alt bölümlerinde (Şekil 2A, www.nanotomy.org) de dahil olmak üzere, rostral önbeyin nöral dokuya tipik ultrastrüktürel özelliklerini ortaya koymaktadır. ayırt edilebilir kafasına hücre tipleri alt çene büyük vakuoller, koku sinir hücrelerinin osmiophilic miyelin, küçük bir kabın endotel hücreleri, yapılar Meninx (meninkslerin Zebra balığı meslektaşı membranöz tabaka kaplayan dahil olan kondrositler dahil memeli beyin). Hücre alt yapıları farklı cel içinde epidermisin Glikokaliks, farklı nükleer morfolojiye ve odaklar bulunmaktadır<html> Golgi aygıtı, endoplazmik retikulum (ER), mitokondri ve sinaptik veziküllerin ve post-sinaptik yoğunlukları da dahil olmak üzere l türleri ve organeller. Beklenmedik ventrikül döşeyen hücrelerin çekirdekleri beyinde daha yanal dağılmış diğer hücrelere göre çok elektron yoğun. Buna ek olarak, bu ventriküler çekirdekler beyinde diğer hücrelere mevcut değildir ve fagositik mikroglia (Şekil 2) çekirdeklerinde bulunan heterokromatin, boyut ve yapıda farklı görünür koyu odaklar göstermektedir. zebrafish gelişmekte olan ventrikül astar hücreleri daha farklılaşmış hücrelerden daha bir değişmiş kromatin durumunu yansıtıyor olabilir çoğunlukla radyal glial hücreler ve nöronal atalarıdır bulunmaktadır. dokuda kök hücreler genellikle oldukça nadir olduğu için, nanotomy EM nedenle kök hücrelerin mikroskopik özelliklerini belirlemek için kullanılabilir, doku ölçekli kök hücre markörleri için doku etiketleme ilişkilendirmek için. ve_content: nöronal ablasyonu uygulanan bir Zebra balığı larva bir koronal bölümünde &quot;fo tutmak-together.within sayfa =&quot; 1 &quot;&gt; Büyük ölçekli EM (www.nanotomy.org) bulunmayan birçok özel dokular ve hücresel ve moleküler özellikleri ortaya Hücresel özellikleri fagositik mikroglia içerir ve büyük olasılıkla ölmekte olan hücre (Şekil 2B, www.nanotomy.org) temsil eden, hücrelerinin boyutunu vaküol kontrol hayvanlarında.. Önceki EM çalışmaları omurgalılarda 18,19 mikroglia tanımlanmıştır. mikroglia karakteristik özellikleri uzatılmış çekirdek içerir bir sonraki uzun dar sisternala- nispeten karanlık / yoğun sitoplazmalı ve bu fagozomların, lipid damlacıkları ve lizozomlar gibi çok sayıda kapanım, nükleer zarf, belirgin Golgi aygıtı, ücretsiz poliribozomların, granüllü endoplazmik retikulum (ER) yamalı kromatin kümeleri. Tüm bu memeli dokularında mikroglia atfedilen diğerlerinden ayıran, aynı zamanda zebra balığı beyinlerinde bu hücreler (Şekil 2B, www.nanotomy.org) bulundu. &lt;keep-together.within sayfa = &quot;1&quot;&gt;: fo p class = &quot;jove_content&quot; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> Şekil 1: Zebra balığı Brain üzerine Büyük ölçekli Doku Elektron Mikroskobu iş akışı. (A) 7 günlük bir Zebra balığı larva. (B) epoksi reçine yan yana gömülü Zebra balığı larva kafaları. Yarı kesit ve numune yönlendirilmesi -thin için (C) Cam bıçak. (D) iki gösteren Temsilcisi yarı ince toluidin mavisi lekeli bölüm yan yana (F).. ultra ince (70 nm) bölümleri kesmek için (E) Elmas bıçak Zebra balığı larvaları gömülü konumlandırma belirtmek için tek delikli ızgara üzerinde tüm Zebra balığı larva beyin bölümünün (D) görüntü Düzenlendi. (G) Bu çalışmada büyük ölçekli 2D EM için kullanılan mikroskopi sistemi. görüntü işleme (H) Akış. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . Şekil 2: Nanotomy Sonuçlar:. Makromolekül itibaren Doku tedavi 7 gün sonra döllenme kontrolü ve (B) beyin (A) Nanotomy (nöronal ablasyonu; Şekil 1), nöron spesifik özellikler gösteren dejeneratif beyin ablasyon (B) Bu hücre ölümünü ve nöral doku ((A) ve (B)) süngerimsi görünümünü geçiren fagositik mikroglia koyu hücreleri bulunur. (5 uyarlanmıştır) Üst paneller: Bölgenin 10X büyütülmüş görünümü orta paneller belirtti. Orta paneller: Bölgenin 10X büyütülmüş görünümü alt paneller belirtti. (A, orta panel) (A, alt panel) içinde neuropil gösteren sinaps yüksek büyütme görünümü, sinaptik veziküller (SVS) vepostsinaptik yoğunluğu (PD). (B, Orta panel) belirgin Golgi aygıtı (G) gibi tipik amoeboid mikroglial özelliklerini (alt panel) gösteren muhtemelen amoeboid mikroglia veya makrofaj (orta panel, M) Yüksek büyütme görünümü, lizozomal vakuol (L) dahil kapanımlar. Ölçek çubukları: 50 um (üst), 5 um (orta) ve 0.5 um (alt). Bu rakam 5 ile modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız</a> , veya tam veri çevrimiçi ziyaret (nanotomy.org).

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain at JoVE.com

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

Sağlıklı ve Yaralı Zebra balığı Beyin büyük ölçekli Tarama Transmisyon Elektron Mikroskobu (Nanotomy)

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

large-scale-scanning-transmission-electron-microscopy-nanotomy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

11.0K Görüntüleme.  UMC Groningen. Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury. 

Video: Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...