Biz Cordelier Araştırma Merkezi (CEF, Paris, Fransa), Genethon (Évry, Fransa) ve Genopole (CERFE, Evry, Fransa) hayvan tesisleri teşekkür ederim. Biz yazının ona dikkatli okumak için Jo Ann Cahn teşekkür ederim. Bu araştırma Enstitüsü National de la Sante Et de la Rechercher MEDICALE, Paris Descartes Üniversitesi, Pierre &amp; Marie Curie Üniversitesi, Dernek la Recherche contre le Kanser, Tunus Yön Générale de la Recherche Scientifique dökmek, Fransız-Tunus CMCU tarafından desteklenen proje ve Incitatives de Genopole (ATIGE) fonları Thématiques Eylemler. JC Yaşam Bilimleri doktora okulda Frontiers tarafından ve INCA (Institut National du Kanser) bir burs ile desteklenmiştir. RBA DGRS-INSERM ve CMCU hibe bir alıcı oldu. SD Institut National du Kanser bir hibe aldı.

fareler içeren tüm işlemler Avrupa Birliği yönergelerine, hayvan deney için Fransız yönetmeliklerine (Tarım Bakanlığı sayılı Kanunun 2001-464, Mayıs 2001), ve Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale (INSERM) Komite yönergelere uyulması hayvan Araştırmaları ve ilgili yerel komite tarafından onaylandı (Charles Darwin Etik Kurulu hayvan Deneyleri, Paris, Fransa için; İzin Numarası: p3 / 2009/004). 1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Fare B büyümek% 10 fetal dana serumu, 100 ug / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 10 mM sodyum piruvat, 50 uM 2-merkaptoetanol ve 0.50 ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde Glutamax lenfoma hücre hattı A20.IIA-luc2 mg / ml higromisin B </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde hücre kültürünün muhafaza etmek ve ortam her iki üç günde bir değiştirin. Hasat orta değiştirdikten sonra bir pipet, bir gün hücre süspansiyonu 5 mi. </li><li> 300 spin hücreleri5; 10 dakika boyunca G ve 3 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri askıya. Hücreleri yıkamak için iki kez bu adımı yineleyin. </li><li> Bir Malassez sayma odasını yüklemeden önce 30 ul Tripan Mavisi etiketleme ile hücre süspansiyonu 15 ul karıştırın. formülü ile hücre konsantrasyonunu hesaplayın: Konsantrasyon (hücre / ml) = sayma ızgara * 3 * 1000 hücrelerinin sayısı. </li><li> 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreler bir kez daha dönerler. Bir pipet ile süpernatantı. C adımında 1.4 hesaplanan konsantrasyon) ile, hücre sayısı N = C * 3&#39;dür. </li><li> Aşağıdaki formüle sahip 5 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, hücre süspansiyonu, elde etmek için gerekli, steril PBS 1X hacmini hesaplayın: PBS hacmi (mi) = N / (5 x 10 7). Bir önceki cümlede hesaplanan steril PBS 1x hacminde) (1.5 adım) hücre pelet askıya. 5 x 10 6 hücre: hücre süspansiyonu, in vivo olarak enjekte hacimde (SCL modeli kullanılmak üzere 100 uls). </li><li> Pipet 10 hücre süspansiyonu A ul, ml başına 5 x 10 6 hücre hücre süspansiyonu B 100 ul elde etmek üzere 1.5 ml bir tüp içinde steril PBS 90 ul ekle. Hücre süspansiyonu oda Piol modelinde kullanılmak üzere (1 x 10 4 Hücreler, canlı içinde enjeksiyon hacmi 2 ul). </li></ol> 2. Luciferase <ol><li> 50 ml bir tüp içinde steril PBS 1X 30 ml D-luciferase potasyum tuzu tozu, 1 g seyreltilir ve agregatlar eritmek için bir kaç saniye için sallayın. NOT: luciferase ışığa duyarlı olduğundan, karanlık 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler 500 ul alikotları hazırlamak. </li><li> -20 ° C&#39;de alikot saklayın. NOT: alikotları birkaç ay boyunca saklanabilir. Çözündükten sonra, tam bölünen miktarları ile + 4 ° C &#39;de en fazla 1 gün için saklanmamalıdır. Donma-çözülme döngüleri 4 ° C&#39;de depolanması tercih edilir. </li><li> intraperitonal Her bir görüntüleme Assa D-luciferase potasyum tuzu çözeltisi 100 ul enjekteY. NOT: Bu çözelti, 150 mg / kg&#39;lık bir dozu için, fare başına 3.3 mg karşılık gelir. </li></ol> 3. Anestezik Karışımı ve Anesthetization <ol><li> Steril PBS 1X ketamin 120 mg / kg ve ksilazin 6 mg / kg karıştırılmasıyla anestetik bir çözelti hazırlayın. </li><li> intraperitonal 25 G iğne ile her bir görüntüleme deneyi için anestezik karışım 60 ul enjekte edilir. (PIOL veya SCL modeli ile) ameliyat için, daha derin bir anestezi elde etmek için karışımın 80 ul enjekte edilir. kendi kafesine geri fare koyun. </li><li> Fare hareketsiz göründüğünde, kafes çıkarın ve yavaşça parmaklar arasında farenin ayağını sıkmak. Fare bir kaçış refleksi ile reaksiyona varsa, birkaç dakika bekleyin. tatmin edici anesthetization teyit Fare tepki vermezse kadar eylem tekrarlayın. </li><li> Isınma bir plaka veya bir ısınma ışık altında fare yerleştirin. </li><li> görüntüleme deneyi için veya SCL cerrahisi anesthetization sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün. uygulamakPiol modeli için ameliyat sonrası göz merhemi. </li></ol> 4. Cerrahi ve Hücre aşılamadan NOT: Bir hayvan biyogüvenlik düzeyi 2 tesis tip 1 mikrobiyolojik güvenlik kabini içinde, bir ısınma plaka üzerinde ya da ısınma ışık altında tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirin. Bu bölümde kullanılan Tüm cerrahi aletleri kullanımdan önce otoklavlanmışlardır. <ol><li> Subkutan Lenfoma Modeli: <ol><li> 25 G iğne ile 1 ml şırınga içinde aşama 1.6 &#39;de elde edilen hücre süspansiyonu, 100 ul hazırlayın. Yavaşça enjeksiyon yerinde, parmaklar arasında kanadında fare cilt sıkın. tam deri içine kat iğne takın. deri altı enjeksiyon sağlamak için, derin doku içine iğne koymayın. <ol><li> deri kıvrımı içine hücreleri enjekte edilir. Biraz sıvı top enjeksiyonu doğru olarak yapıldığını teyit etmek için cilt altında görünüp görünmediğini gözlemleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Piol modeli: NOT: Bu Procedure operatörü 1 ve operatör 2 olarak anılmaktadır 2 operatörleri gerektirir. <ol><li> konjonktiva Kaldırma: <ol><li> Operatör 1 yerde bir mikroskop altında fare var. yavaşça gözün her tarafında parmakları Basın temizlemek için. Bu konumunu korumak. </li><li> Mikroskop aracılığıyla Operatör 2 lt ook var. Kavrama bir yandan pense küçük bir çift ile konjonktiva; Öte yandan ile, cerrahi makas küçük bir çifti ile sadece pense altında konjonktiva kesti. </li><li> Var Operatör 1 serbest bırakma aşamasında 4.2.1.1 basıldığında fare göz) </li></ol></li><li> Hücre enjeksiyonu: <ol><li> 10 ul künt hassas şırınga hazırlayın. içinden steril deiyonize su pompalama tarafından yıkayın. şırınga hiçbir baloncuklar olmadığından emin olmak için iki ya da üç kez tekrarlayın. Daha sonra, enjeksiyon için hücre süspansiyonu 2 ul hazırlar. </li><li> Üzerinde parmakları ile hafifçe Operatör 2 basın varGözün her tarafında e elini temizlemek için. Bu konumunu korumak. </li><li> Operatör 1 Tutma yeri bir yandan pense küçük bir çift gözün kenar ve doku germek için yavaşça geriye doğru çekin. </li><li> Mikroskop aracılığıyla Operatör 2 lt ook var. Diğer elinizle, 32 G iğne ile fare alt küresi küçük bir delik yapmak. </li><li> Operatör 2 iğne indirdi ve (aynı elle) hassas şırınga pick up ve adım 4.2.2.4 yapılan deliğe iğne takın. </li><li> Öte yandan ile şırınga pistonu Operatör 1 itme var. </li><li> Şırınga hücre süspansiyonu doğru göz küresi içindeki enjekte edilmiş mikroskop ile Operatör 2 v erify var (sıvı akışı kolaylıkla gözlemlenebilir). </li><li> Operatör 2 r aldır hassas şırınga var. </li><li> Operatör 1 R kenarına Elease varproksimal göz) aşama 4.2.2.3 kavranır </li><li> Operatör 2 r Elease sahip adım 4.2.2.2 basıldığında göz kenarları) </li><li> hemen göz merhemi sürün. NOT: Tüm adımlar doğru yapıldı ise, fare bu işlem sırasında hiç kanama olmamalıdır. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. Biyoparlaklık Görüntüleme - Gün 0 NOT: fareye enjekte Tüm ürünler, enjeksiyondan önce oda sıcaklığında olmalıdır. Tümörün sonra hücreler aşılanmış olan ve hayvan hala anestezi ise, görüntüleme için aşağıdaki adımlara devam edin. <ol><li> kamera açın ve satın alma yazılımını açın. &quot;Initialize&quot; butonuna tıklayarak kamera, aşamaları ve lensleri başlatılamıyor. Başlatma tam olduğu 10 ila 15 dakika sürer. </li><li> 25 G iğne ile intraperitonal olarak, D-luciferase potasyum tuzu çözeltisi 100 ul enjekte edilir. intravenöz onu yönetmek etmeyin. intravenou Eğers idaresi herhangi bir nedenle gerekli olan, D-luciferase sodyum tuzu, D-luciferase potasyum tuzu yerine kullanılmalıdır. NOT: Luciferase bu konsantrasyonda aşırı reaktandır; Bu nedenle, biyolüminesans sinyali 3 dakika 7&#39;ye sonra bir plato ulaşır ve 30 dakika boyunca devam eder. </li><li> 10 dakika D-luciferase enjeksiyon 13 sonra, kamera konu fare yerleştirin. Doğal konumu, mümkün olduğunca düz bir konumda kameraya doğru sırtında, fare yerleştirin. Bu pozisyon, doğal ve kolay tekrarlanabilir. </li><li> Otomatik pozlama özelliğini Kene ve otomatik pozlama özelliği ile, hayvanın arka (posterior) görüntü elde etmek Edinme tıklayın. NOT: Otomatik pozlama özelliği 1 sn pozlama görüntü hesaplanarak pozlama süresini optimize eder. Farenin biyolüminesans sinyali negatif veya çok düşükse, uygun pozlama süresi olabilirotomatik fazla 20 dakika olarak ayarlanır. Bu durumda, 8 ila 10 dakika arasında bir tutma süresi iyi bir uzlaşma olabilir. Pozlama süresi manuel olarak ayarlanmış olabilir, ancak görüntülerin doymuş piksel içermemelidir. </li><li> Kameraya fare ön ortaya çıkarmak için fareyi ters çevirin. onlar göğüs bloke kalmamak için fareyi düzleştirmek ve ön uzuvların yaymak için çalışın. </li><li> Hayvan ön görüntü kazanır. Otomatik pozlama onay kutusu hala işaretli olduğundan emin olun ve &quot;Edinme&quot; butonuna tekrar tıklayın. NOT: Ön görüntü arka görüntü önce iktisap ve tersi olabilir. ön ve arka görüntü maruz kalma süresi, fare her bir tarafında göreli yoğunluğuna bağlı olarak farklı olabilir. otomatik pozlama özelliği kullanılırken otomatik olarak hesaplanır. Niceleme sadece foton akı (saniyede fotonlar) kullanır ve maruziyet süresine bağlı değildir. </li><li> Bir ısınma plat üzerinde fare yerleştirine veya anestezi kurtarır ve daha sonra kendi kafesine geri koyun kadar ısınma ışık altında. </li></ol> 6. Biyoparlaklık Görüntüleme - Gün 0 sonra <ol><li> ) Adım 5.1 olarak kamera, aşamaları ve lensler başlatmak, kamera açın. </li><li> ketamin (120 mg / kg) / ksilazin (6 mg / kg) karışımı, 60 ul (adımlar 3.5&#39;e 3.1 bakınız) intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi. NOT: anesthetization Bu yöntem her 5 günde görüntüleme sağlar. Günlük görüntüleme, anestezi ve anestezi ile kullanılmak için müsait bir biyoışıldama görüntüleme gerekli olduğu gibi izofluran kullanan bir yöntemi gerçekleştirmek için. </li><li> Adımlar 5.5) ve 5.6) &#39;de olduğu gibi otomatik pozlama özelliğini kullanarak hayvanın ön ve arka görüntüleri, edinin. Adım 5.7) olarak fareyi tutun. </li></ol> 7. Biyoparlaklık sayısallaştırılması ve Görüntü Analizi Not: luminoscore yöntemi görüntü analysi dayanırs. Çıkan yukarıdaki adımları göre elde edilmiş sonra, ölçme her zaman gerçekleştirilebilir, her zaman noktasında her bir fare için bir luminoscore ilişkilendirmek (edinme hemen sonra olmak üzere). <ol><li> &quot;Görünüm&quot; menüsünden tıklayarak &quot;Aracı Paleti&quot; Ekran ve önceden görüntülenen o zaman &quot;Aracı Paleti&quot; üzerine tıklayın. Aracı Palette &quot;ROI Aracı&quot; sekmesine tıklayın. &quot;Kontur&quot; düğmesini seçin ve ardından &quot;Ücretsiz beraberlik&quot; seçeneğini seçin. </li><li> El ile ön görünümünde fare kenarlarını takip ederek fare etrafında Önemli (ROI) Bölge işaretleyin. bilgisayar fare üzerinde bir sağ tıklama ile kontur kapatın. </li><li> &quot;Görünüm&quot; menüsünden ve sonra &quot;ROI Ölçümleri&quot; linkine tıklayın. &quot;(Fotonlar)&quot; emin olun &quot;ROI Ölçümleri&quot; penceresinin sol alt menüyü kaydırma &quot;Ölçme Türleri&quot; seçilir. Değilse, onu seçin. Sonra foton fl ölçmekux &quot;Toplam Flux [p / s]&quot; kutusundaki değeri kaydederek (ph / s). NOT: Parıltısını veya YG yüzey alanına göre herhangi bir başka birim kullanmayınız. </li><li> Tekrarlayın arka görünümü için 7.2) ve 7.3) yineleyin. </li><li> Ön ve arka görünümü elde edilen iki foton akı değerleri toplamak. Sonuç luminoscore olduğunu. </li><li> 14 (örneğin, non-parametrik iki kuyruklu Mann-Whitney testi), uygun istatistik testi kullanılarak her bir grup için değerleri karşılaştırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Rehemtulla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Quantitative+Assessment+of+Cancer+Treatment+Response+Using+In+Vivo+Bioluminescence+Imaging.">Rapid and Quantitative Assessment of Cancer Treatment Response Using In Vivo Bioluminescence Imaging.</a> Neoplasia. 2 (6), 491-495 (2000).</li><li>Edinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+animal+models+of+neoplasia+through+in+vivo+bioluminescence+imaging.">Advancing animal models of neoplasia through in vivo bioluminescence imaging.</a> European Journal of Cancer. 38 (16), 2128-2136 (2002).</li><li>Hastings, J. W., Gibson, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Oxygen+in+the+Photoexcited+Luminescence+of+Bacterial+Luciferase.">The Role of Oxygen in the Photoexcited Luminescence of Bacterial Luciferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 242 (4), 720-726 (1967).</li><li>Inouye, S., Shimomura, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Renilla+Luciferase,+Oplophorus+Luciferase,+and+Apoaequorin+as+Bioluminescent+Reporter+Protein+in+the+Presence+of+Coelenterazine+Analogues+as+Substrate.">The Use of Renilla Luciferase, Oplophorus Luciferase, and Apoaequorin as Bioluminescent Reporter Protein in the Presence of Coelenterazine Analogues as Substrate.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (2), 349-353 (1997).</li><li>Pesnel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+Bioluminescence+Imaging+by+Correction+of+Tissue+Absorption+for+Experimental+Oncology.">Quantitation in Bioluminescence Imaging by Correction of Tissue Absorption for Experimental Oncology.</a> Molecular Imaging and Biology. 13 (4), 646-652 (2010).</li><li>Corre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Fluctuations+and+Distributed+Control+of+Gene+Expression+Impact+Cellular+Memory.">Stochastic Fluctuations and Distributed Control of Gene Expression Impact Cellular Memory.</a> PLoS ONE. 9 (12), (2014).</li><li>Ben Abdelwahed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+B-cell+responsiveness+to+CpG-DNA+depends+on+the+tumor+microenvironment.">Lymphoma B-cell responsiveness to CpG-DNA depends on the tumor microenvironment.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research CR. 32 (1), 18 (2013).</li><li>Abdelwahed, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Study+of+Ublituximab,+a+Glycoengineered+Anti-Human+CD20+Antibody,+in+Murine+Models+of+Primary+Cerebral+and+Intraocular+B-Cell+Lymphomas.">Preclinical Study of Ublituximab, a Glycoengineered Anti-Human CD20 Antibody, in Murine Models of Primary Cerebral and Intraocular B-Cell Lymphomas.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (5), 3657-3665 (2013).</li><li>Donnou, S., Galand, C., Touitou, V., Saut&#232;s-Fridman, C., Fabry, Z., Fisson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Models+of+B-Cell+Lymphomas:+Promising+Tools+for+Designing+Cancer+Therapies.">Murine Models of B-Cell Lymphomas: Promising Tools for Designing Cancer Therapies.</a> Advances in Hematology. 2012, (2012).</li><li>Qi, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+oligodeoxynucleotide+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+A20+lymphoma+cells+via+TLR9-mediated+pathways.">CpG oligodeoxynucleotide induces apoptosis and cell cycle arrest in A20 lymphoma cells via TLR9-mediated pathways.</a> Molecular Immunology. 54 (3-4), 327-337 (2013).</li><li>Houot, R., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+modulation+combined+with+intratumoral+CpG+cures+lymphoma+in+a+mouse+model+without+the+need+for+chemotherapy.">T-cell modulation combined with intratumoral CpG cures lymphoma in a mouse model without the need for chemotherapy.</a> Blood. 113 (15), 3546-3552 (2009).</li><li>Krieg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+9+(TLR9)+agonists+in+the+treatment+of+cancer.">Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer.</a> Oncogene. 27 (2), 161-167 (2008).</li><li>Inoue, Y., Kiryu, S., Watanabe, M., Tojo, A., Ohtomo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+Imaging+after+D-Luciferin+Injection+Affects+the+Longitudinal+Assessment+of+Tumor+Growth+Using+In+Vivo+Bioluminescence+Imaging.">Timing of Imaging after D-Luciferin Injection Affects the Longitudinal Assessment of Tumor Growth Using In Vivo Bioluminescence Imaging.</a> International Journal of Biomedical Imaging. 2010, (2010).</li><li>Mann, H. B., Whitney, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+a+Test+of+Whether+one+of+Two+Random+Variables+is+Stochastically+Larger+than+the+Other.">On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other.</a> Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).</li><li>Darne, C., Lu, Y., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+fluorescence+and+bioluminescence+tomography:+a+review+of+approaches,+algorithms+and+technology+update.">Small animal fluorescence and bioluminescence tomography: a review of approaches, algorithms and technology update.</a> Physics in Medicine and Biology. 59 (1), 1 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu sınırlama herhangi bir optik görüntüleme yöntemi ile içsel olmasına rağmen organ ve dokuların ışık emme, biyoparlaklık görüntüleme bir sınırlama kalır. Bizim yaklaşımımız çerçevesinde, luminoscore üzerinde anatomik yapıların etkileri çalışmalar daha sonra karşılaştırmalar izin verilen bir modelin (konumu ve fare iplikçik) yapılmaktadır şartıyla düşük değişkenlik olması bekleniyor. Biyoparlaklık uyarma ışık gerekmez ve böylece daha fazla floresan fazla in vivo görüntüleme tüm vücuda adapte edilir. Uzamsal çözünürlük de biyoparlaklık görüntüleme bir sınırlama ve biyoparlaklık fotonlar yayılan edildiği organın hassas konum zordur. Ancak, modelin iyi bilgi tümör siteleri nitel bir konumda yardımcı olabilir. Bu biyolüminesans tabanlı yöntemde sadece çıkış luminoscore olduğunu. Yer luminoscore etkilemez interes manuel mark-up Region çünküt (YG) tüm fare kapsar. Son olarak, ateşböceği lusiferaz oksijen gerektirir. Buna göre, biyoparlaklık görüntüleme genellikle nekrotik tümörler hafife. Bir kez daha, bu modelin bu yönünün iyi bir bilgi gereklidir. Bu yazıda (zaten 7,9,11 gösterilmiştir) ama biyolüminesans veri setlerinin karşılaştırma sağlayan bir yöntem tanımlamak için bir anti-tümör ilaç olarak CpG etkinliğini değerlendirmek yönelik değildir. Biz gerçekten farklı zamanlarda farklı yerlerde farklı deneyleri karşılaştırmak için satın alma protokolü standardize yardımcı olmak için tasarlanmıştır tümör yükünü ölçmek için bir yöntem tarif ve bilgisayar hesaplamaları gerektirmez. tekrarlanabilirlik ve doğru foton akı ölçümü sağlamak için, görüntüleme cihazı ev yapımı cihazlar için hafif bir başvuru ile kalibre veya gereken ticari cihazlar için sağlayıcı tarafından tavsiye edilen. Bizim protokol pek çok kritik p dikkat gerektiriroints: (i) Birincisi, fare anestezi kalitesi özellikle uzun pozlama süreleri olgularda, net görüntüler elde etmek için çok önemlidir. (Ii) ölçümü birimi her zaman Radiance her farenin yüzey alanına bağlıdır ve farklı fareler karşılaştırmak için alakasız olabilir çünkü foton akısı olmalıdır. Bu önyargı luminoscore olur çünkü (iii) biyolüminesans görüntüleri, doymuş piksel içermemelidir. (iv) Arka ve ön alım tümör sitesinden (yani, ön alım mutlaka tümörün arkasından fotonlar tespit olmayabilir) yayılan tüm fotonları toplamak için gereklidir. Çeşitli farklı YG çizimleri luminoscore yönteminin gelişimi sırasında test edilmiştir. Sadece manuel işaretleme (veriler gösterilmemiştir) istatistiksel olarak anlamlı daha muhtemeldir tatmin edici sonuçlar vermiştir. Inoue ve diğ. 75 mg luciferin dozunu tavsiye / 13 kg. 150 mg doz kullanılarak / sonra yerine görüntüleme zamanlamasını kgluciferin yönetim değişmeden kalır ve biz yayla uzun pozlama edinimi boyunca sürer emin olun. Luciferase edinme süreci boyunca aşırı reaktan olmalıdır. Biz hayvan başına iki ROI çekti SCL modelinde gösterdi modeline bağlı olarak, faiz bölge, adapte edilebilir. SCL modelinde, tedavi enjekte edilir tümör değişkenliği sınırlamak için onun en büyük çapı 0.5 cm ulaştığında engraftman. fareler bağlı tümör farklı büyümüş olabilir. standardize ve fareler karşılaştırmak için, biz her iki kanat tümörlerin nispi büyüme ortaya muamele ve olmayan işlemden geçirilmiş tarafı arasında bir oran kullanmaya karar verdi. Sinyal, pozitif olması beklenen enjekte fareden gözlenirse, (i) hücre sayısı çok düşük olduğu ve sinyal algılama eşiğinin altında olduğu; veya (ii) fare oksijen yoksun ve acil bakım gerektirir. Kantitatif bioluminesc çeşitlience çeşitli yazarlar tarafından açıklanan analizleri yayılan Biyoparlaklık fotonların 5,15 mutlak ölçümü yaklaşım karmaşık hesaplamaları ve araçları (örneğin, 3D biyoparlaklık tomografi) gerektirir. 2B biyolüminesans görüntüleyici ile, özellikle tümör modellerinde, tekrarlanabilir ışıldaması ölçülerek için bir yöntem üzerinde görüş birliği yoktur. Amacımız kullanıcı bağımlılığını sınırlamak için görüntü elde etme protokolünü standardize oldu. Tümör aşılamasından sonra in situ CpG enjeksiyonu her iki modelde de tümör yükünü azaltmaktadır. luminoscore yöntem, tümör immünoterapilerin diğer modellerde tümör yükünü izlemek için bir araç olarak kullanılabilir. tümör yükünü İzleme tümör mikroçevresinin müdahale etmeden tümör büyümesi ve metastaz mekanizmaları anlayışımız artırabilir noninvaziv bir yöntem sağlar. yapmak ve bu yöntemle tedaviye yanıt vermeyen hayvanların tanımlanması s doğrulama ile takviye edilmiştirDeneyin başında uccessful tümör hücresi enjeksiyonu yapılmıştır. Burada A20.IIA-luc2 hücreleri kullanılarak SCL modelinde luminoscore yönteminin uyum göstermiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, diğer hücre hatları da lusiferaz eksprese eden veya bu Resim kullanılarak başka tümör modelinde adapte edilebilir T-hücresi çalışmaları (tümöre özgü sitotoksik T hücrelerinin, düzenleyici T-hücrelerin, vs.) bağlamında. Nadir görülen gen terapisi bağlamında in vivo gen transferi izlenmesi de luminoscore yöntemi kullanılarak yapılabilir. Sonunda veri biyolüminesans tabanlı luminoscore yöntemi, deneyler arasında karşılaştırma sağlayan spesifik deneysel ihtiyaçlarına esneklik ve uyum sunar ve invaziv olmayan uzunlamasına preklinik çalışmalar için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.

Erken tümör hücre tespiti bir sorun olmaya devam etmektedir ve kanser tedavisi etkinliğini arttırmak için çok önemlidir. In vivo biyoparlaklık görüntüleme (BLI) yaygın küçük hayvanlarda tümörleri izlemek için kullanılan çok hassas, non-invaziv optik bir tekniktir. Ateşböceği lusiferaz sentezleyen hücreler, genel olarak, bu gibi deneylerin 1,2 kullanılmaktadır. Bu oksijenaz D-luciferase moleküler oksijen ile okside olur ancak iki kofaktör gerektirir - Mg 2+ ve adenozin trifosfat 3. Ateş böceği lusiferaz Renilla lusiferaz 4 onun kuantum verimi yüksek olduğu için daha in vivo görüntüleme için daha uygundur. okside tabaka - oksilusiferin - kendiliğinden onun temel duruma geri dönmek için bir foton yayar ve sonra inaktif hale gelir. fotonların 530 nm civarında maksimum bir dalga boyuna sahiptir. Yüksek hassasiyetli kamera, küçük bir hayvanın içinden Işıklı fotonlar algılar ve poss hale görüntüleri sağlayabilirtümör hücrelerini bulmak için ible. foton sayıları ile doğru tümör yükünü ölçmek yeteneği tedavi etkinliğini ölçülmesi için güçlü ve hassas bir araç olarak hizmet verebilir. tedavi etkileri erken tespit edilebilir, çünkü bu duyarlılık sayesinde tedavi etkili hale geldiği anı tam olarak belirleyecek yapmak olabilir. Toplam fotonların mutlak ölçümü çok karmaşıktır. toplanan fotonların sayısı, tümörün derinliği ve fotonlar yoluyla yayılan organlar bağlıdır. Doku emme katsayılarına dayalı düzeltme katsayıları 5 hesaplanabilir, ancak tümör hücre sayıları mutlak miktar, her tümör hücresi tarafından yayılan foton sayısı bilerek gerektirir. Ayrıca, birçok muhabir gen (örn., Flüoresan protein) gibi lusiferaz ekspresyonu, hatta tek bir klon 6 türetilen bir hücre popülasyonunda, homojen değildir. lucifer sayısıhücrelerde ase proteinleri tam hesaplanamaz. standart deney koşullarında kurulması ve böylece güvenilir bir yarı-nicel analiz için çok önemli görünmektedir. Biz iki farklı fare lenfoma modellerinde 7,8,9 için luminoscore yöntemi uygulanır. Bu modellerde, singeneik tümör hücreleri gözün içine veya sırasıyla, birincil intraoküler (Piol) modeli ve deri altı lenfoma (SCL) modeli elde etmek için deri altına enjekte edilir. Bu ortotopik modeller her birinde, tedavi yedi gün PIOL tümör aşılanmasından sonra, in situ olarak uygulanır ve tümör SCL için büyük çapı 0.5 ila 0.7 cm eriştiğinde. Biz yerinde CpG tedavide etkilerini izlemek için luminoscore yöntemi kullanılır, daha önce 7,10,11 etkili olduğu gösterilmiştir. CpG da birçok CE tarafından ifade edilen bir hücre içi reseptör olan bir oligonükleotid sekansı ve TLR9, bir liganddırdendritik hücreler, B lenfositler, monositler ve doğal öldürücü hücreleri dahil olmak üzere bağışıklık sistemi LLS. CpG DNA, CpG (CG) immünostimülatör motifi ihtiva eden bir 20-mer DNA dizisidir; Kontrol (ODN-kontrol) immünostimülatör CG dizisi (GC) ters çevrilmesi haricinde, aynı 20-mer DNA dizisidir. Biz okuyan kemirgen lenfomada TLR9 nişan, apoptoz 10 indükler bağışıklık sistemini 12 harekete geçirir ve böylece önemli ölçüde tümör yükünü 7,11 azaltır. Burada tümör yükünü ve bioluminescent görüntüleri aracılığıyla tedavi yanıtını ölçülmesi için bir standart yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem güvenilirliği, tekrarlanabilirliği olmayan kullanıcı bağımlılığı ve istatistiksel anlamlılık optimize etmek, alımından analiz, görüntüleme işlemi farklı yönleri dayanmaktadır. Bir biyolüminesans ölçümü indeksi her fare atfedilir; Biz luminoscore dediğimiz bu değer, sadece hayvanlar değil al arasında mukayese edilebilirdeneyler arasında böylece. Bu çalışmada, biyolüminesans görüntüleme prosedürü yanı sıra luminoscore yöntemi ile görüntü ölçümü odaklanmak. Biz, enjeksiyon doğrulama tümör yükü, izleme ve in situ kanser tedavisinde etkinliğini değerlendirmek için bu yöntemin etkisini göstermektedir. Bu gelişmelerin her biri luminoscore yönteminin uyum vurgulamak için farklı fare modelleri kullanılarak yapılan deneylerden elde Örnek sonuçlarında gösterilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CpG 1826</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT 
			Catalog number: tlrl-1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1826 control</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT 
			Catalog number: tlrl-1826c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin potassium salt</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>Catalog number: FP-M1224D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Virbac, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer Healthcare</td>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20.IIA-luc2 cell line</td>
			<td></td>
			<td>A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 
			(Promega E1310)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Balb/cByj</td>
			<td>Six-weeks old females from Charles River</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS lumina Biolumienscence imager</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software (opensource)</td>
			<td>R-project</td>
			<td>Used for statistic tests</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Precision Serynge 10&#181;L&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Product number 7642-01100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Lacrinorm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Luminoscore Yöntemi Tümör Hücre Enjeksiyon doğrulama için kulluk edebilir Enjeksiyon bölgesi enjeksiyon görsel doğrulama izin vermediğinde tümör hücrelerinin az sayıda enjeksiyonunu içeren modellerinde veya, enjeksiyon kalitesini sağlamak için çok zor olabilir. luminoscore yöntemi prosedürünün kalitesini doğrulamak ve kolayca ve anında her şeyi doğru gittiğini tespit etmek hızlı ve kolay bir araç olarak hizmet vermektedir. Her iki modelde, tümör enjeksiyonu (Şekil 1A) sonra, 10 dakika kadar erken tespit edilebilir. görüntüleri tek başına tümör hücreleri doğru konumda mevcut doğrulamak için yeterli. Bununla birlikte, görüntüleri miktarının enjeksiyon heterojen bir fikir vermektedir. Nokta arsa (Şekil 1B) açıkça alınan hayvanlar arasında bir fark (siyah nokta) gösterir ve tekrar etmediEğer okumak (kırmızı çizgi) enjeksiyonları. İlginç bir şekilde, SCL modelinde elde edilen sinyal Piol modelinde 100 kat daha fazla olduğu; Bu bulgu, enjekte edilen hücrelerin sayısı (5 x 10 6 ve 1 x 10 4 hücreleri, sırasıyla) ile tutarlıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig1.jpg" /> Farklı fare lenfoma modellerinde Enjeksiyon Şekil 1. doğrulanması. Luminoscores farklı lenfoma modellerinde tümör hücresi aşılamasından sonraki 10 dakikada bir ölçülür. (A), her iki model Örnek görüntüler. (B) Luminoscore farklı model her bir hayvanın. Kırmızı çizgi tümör hücre aşılamadan önce 10 hayvanlar üzerinde ölçülen ortalama arka plan gürültü karşılık; noktalı çizgiler ortalama +/- standart sapma değerleridir. Her bir model için, bütün hayvanlar arka plandaki gürültüden ayırt edilebilir. Piol modelinde, 1 x 10 4 hücre INOC edildiSağ gözün vitreus olup, bun- ve SCL modelinde, deri altı fare her böğrüne 5 x 10 6 hücre. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53609/53609fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tümör Yükü ve Tedavi Tepkisi İzleme Luminoscore ayrıca tümör büyümesini ve tedavi etkinliğini incelemek için güçlü bir araçtır. 2A kontrolünde tümör büyümesinin izlenmesi temsilcisi görüntüler gösterir ve CpG Piol grupları tedavi Şekil. Farenin 1 x 10 4, tümör hücreleri, her aşılandı ve tedavi resim yeterli bir süre (28 gün) sonra, metastaz, kontrol grubunda ortaya çıkmaya başladı göstermektedir 7. günde yerinde uygulanmıştır. Primer tümör tedavisine duyarlı görünmedi, ancak, daha azmetastaz CpG ile tedavi edilen grupta (Tablo 1) &#39;de tespit edilmiştir. Her bir grupta (Şekil 2B) tümör yükünün kantitatif analiz CpG tedavi ve 28 gün (non-parametrik iki kuyruklu Mann-Whitney testi, p = 0,0079 sonra kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark üreten, tümör gelişimini yavaşlattığını göstermektedir ). Bununla birlikte, tümör de tedavi edilen farelerde büyümüş ve bunların hiçbiri (veriler gösterilmemiştir) kurtuldu. Bu bulgu önceki çalışmalarla tutarlıdır: CpG Primer oküler tümörler 10 üzerinde önemli etkileri vardır. Biz ODN ve CpG grubu arasında burada sahip önemli bir etkisi metastazı büyüme inhibisyonu geliyor. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig2.jpg" /> Şekil 2. İzleme Tümör Yükü ve Tedavi Tepki. (A) İki grubun Örnek görüntüleri (ODN kontrol ve CpG ile muamele edilmiş) nf farelerde Piol taşıyan. luminoscore (B) İzleme tümör yükünü. nokta arsa üzerinde görüldüğü gibi, luminoscore üzerinde CpG etkisi bu iki grupta da 28. günde önemli olan, bu yöntem sayesinde tümör yükünü izlemek ve CpG- hafif fakat anlamlı (p = 0.0079) etkilerini ölçmek için yapılan yalnız görüntüleri ile tespit edilmemiştir olabilirdi DNA. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53609/53609fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Gruplar </td><td> Fare </td><td> Metastazların varlığı </td><td> yer </td><td> Foton akı (ph / s) </td></tr><tr><td rowspan="5"> CpG </td><td> 1 </td><td> Yok hayır </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Evet </td><td&gt; Göz drenaj lenf nodu </td><td> 9.32E + 05 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Yok hayır </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Yok hayır </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Evet </td><td> Göz drenaj lenf düğümü </td><td> 2.21E + 07 </td></tr><tr><td rowspan="5"> ODN </td><td> 1 </td><td> Evet </td><td> Göz drenaj lenf düğümü </td><td> 1.06E + 07 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Evet </td><td> Göz drenaj lenf düğümü </td><td> 7.25E + 07 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Evet </td><td> Göz drenaj lenf düğümü + kontralateral </td><td> 7.64E + 08 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Evet </td><td> Göz drenaj lenf düğümü + kontralateral </td><td> 1.74E + 09 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Evet </td><td> Göz drenaj lenf düğümü + kontralateral </td><td> 9.76E + 07 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. TO Luminoscore Yöntemi Farklı Yaklaşımlar adapte edilebilir Luminoscore yöntemi fare modeli, tek bir türü ile sınırlı değildir. Bu, farklı fare modelleri için adapte edilebilir 3 göstermektedir. SCL modelinde, iki tümör fare her bir yanı üzerinde aşılı vardır. Tedavi 0. günde tek bir tarafına yerinde tatbik edilmektedir, ve karşı tümör, kontrol (Şekil 3A) olarak görev yapmaktadır. Bu nedenle, iki YG fare başına çizildi: her bir tarafında (Şekil 3C) için bir tane. Tedavi ve kontrol tarafta luminoscore arasındaki oran her tümörün göreli ders açıklanmaktadır. Tedavi verildiğinde bu oran, Gün 0 1 olarak ayarlandı. Biz 13 gün tedavi uygulandıktan sonra bu oranın önemli bir azalma gözlenmiştir (Şekil 3D, non-parametrik iki kuyruklu Mann-Whitney testi, p = 0.004). Bu azalma olduğu tedavi tarafı tümörü açığatemsili biyoparlaklık görüntüleri (Şekil 3B) gösterildiği gibi, rezorbe olmuştur. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53609/53609fig3.jpg" /> Şekil İki İlköğretim Tümör Siteleri ile bir Model Luminoscore Yöntem 3. Adaptasyon. (A) bir SCL testinin deneysel tasarım. farenin her bir kanat iki primer tümör enjekte edilmiştir. Bir iki tarafında CpG DNA veya ODN kontrolü ve PBS ile diğer tarafta da bir kontrol olarak hizmet etmek için enjekte edilir. (B), 0. günde ve 13. günde tedavi CpG ile tedavi edilen ve kontrol farelerinin Örnek resim uygulanmıştır günde 0. tümör büyüme fare CpG tedavi edilen tarafta engellenmiştir. (C) elle iki primer tümör siteleri için hayvan başına ilgi alanları işaretlenmiş. (D) CpG-muamele ya da luminoscores arasındaki oran ODN-kontrol tarafı ve PBS kontrol tarafı bir dizin olduğunuAynı hayvanda her tümörün nispi büyüme yansıtır. Bu oran, 13. günde 0. günde 1 olarak ayarlandı, CpG ile tedavi edilen grubun oranı önemli ölçüde azalmış (p = 0.004), CpG-DNA&#39;ya in situ yönetiminde ile tümör büyümesinin engellenmesini ortaya çıkarılmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53609/53609fig3large.jpg" target="_blank">Burada tıklayın görüntülemek Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models at JoVE.com

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Biyoparlaklık görüntüleme tümörleri ve metastazları lokalize için iyi bilinen bir araçtır, ama bu görüntülerin miktar genellikle karmaşık hesaplamaları ve özellikle araçların gerektirir. Biz hiçbir hesaplamalar gerektiren ve tümör yükü ve tedavi yanıtı fare modellerinde izlenecek sağlayan hassas satın alma koşullarına göre, kolay kullanımlı luminoscore yöntem açıklanmaktadır.

Fare Lenfoma Modellerinde İzleme Tümör ilerleme ve Tedavi Etkileri Biyoparlaklık Tabanlı Tümör Niceleme Yöntemi

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

bioluminescence-based-tumor-quantification-method-for-monitoring

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

20.0K Görüntüleme.  Genethon.  Biyoparlaklık görüntüleme tümörleri ve metastazları lokalize için iyi bilinen bir araçtır, ama bu görüntülerin miktar genellikle karmaşık hesaplamaları ve özellikle araçların gerektirir. Biz hiçbir hesaplamalar gerektiren ve tümör yükü ve tedavi yanıtı fare modellerinde izlenecek sağlayan hassas satın alma koşullarına göre, kolay kullanımlı luminoscore yöntem açıklanmaktadır. 

Video: Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence imaging using IVIS Spectrum was employed to monitor the distribution and development of the tumor cells following the delivery procedure including DLIT reconstruction to measure the tumor signal and its location.
Development of metastatic lesions to the bone tissues triggers osteolytic activity and lesions to tibia and femur were evaluated longitudinally using micro CT. Imaging was performed using a Quantum FX micro CT system with fast imaging and low X-ray dose. The low radiation dose allows multiple imaging sessions to be performed with a cumulative X-ray dosage far below LD50. A mouse imaging shuttle device was used to sequentially image the mice with both IVIS Spectrum and Quantum FX achieving accurate animal positioning in both the bioluminescence and CT images. The optical and CT data sets were co-registered in 3-dimentions using the Living Image 4.1 software. This multi-mode approach allows close monitoring of tumor growth and development simultaneously with osteolytic activity.

An experimental mouse model of bone metastasis was established following intracardiac delivery of luciferase expressing mammary tumor cells. Tumor development and resulted osteolytic lesion were monitored longitudinally with bioluminescence and micro CT imaging.

Biyoparlaklık ve Micro CT Görüntüleme Tümör Metastazlari ve osteolitik Lezyonlar İzleme

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

Tıp

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

Tekrarlayan Glioblastoma&#39;nın Tedavisinde Bevacizumab ile Kombine Alan Terapi Tedavisi Tümör

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...