Biz kinesin-5 yapının hediye için Patricia Wadsworth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Charles H. Hood Vakfı, ınc TJM ve Araştırma Bursu sayılı TJM için Dimes Vakfı Mart ayından itibaren 5 FY13-205 yanı sıra desteğiyle bir NIH hibe (5 R01 GM107026) tarafından desteklenmiştir Boston, MA. TJM için

1. transfekte S2 hücreleri <ol><li> Önceden kültürlenmiş 25 cm2 şişeye kaynaktan, onları% 100 konfluansa 2 ml&#39;lik bir nihai hacme GFP-α-tübülin-ifade eden S2 hücreleri 10 ekleyin ve izin 35 mm doku kültürü çanağı içinde alt için yarı bağlı Yaklaşık 1 saat. </li><li> Çanak ortamı çıkarın. Eg5-mCherry Transfect 2 ug,% 10 FBS ile takviye edilmiş Schneider ortamı 11 1 ml yapı üreticinin protokolü takip edilerek, (Schneider ortamı diye değinilmektedir) ve Transfeksiyon ReaktifMaddesi. Parafilm ile çanak Seal ve 16-18 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Schneider medya 1 ml ekleyin. 25 ° C inkübatör hücreleri dönün. </li><li> 3. gün post-transfeksiyon üzerine bir test indüksiyonu için Schneider ortamı 1,5 ml içeren, yeni bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde transfekte edilmiş hücrelerin 500 ul transfer. CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ekspresyonunu indüklemek </sub&gt; 500 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek. Parafilm çanak mühür ve 25 ° CO / N inkübe. </li><li> Konkanavalin A ile kaplı lamelleri, kaplamak için bir çözeltisi (0.5 mg / mL kadar H2O içinde çözülmüş) Concanavalin pipet yeterli hacmi oluşturmak için bir asit yıkandı lamel aşırı kaldırmak ve hava ile kurumaya lamel sağlar. </li><li> Daha sonra lamel üzerine uyarılan hücrelerin% 100 konfluansa 500 ul, tohum temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde 22 mm x 22 mm konkanavalin A ile kaplı lamel yerleştirin ve hücreler oda sıcaklığında 1 saat yapışmaya izin verir. </li><li> , Eg5 mCherry ifade edin bir floresan mikroskop oda sıcaklığında görüntüleme medya ile bir gül haznesine lamel (ya da uygun görüntüleme gemi) bir araya getirmek için. Hücreleri görselleştirmek için uygun ışık kaynakları ve filtre setleri kullanın. Örneğin, bu çalışmada kullanılan mikroskop bir LED beyaz ışık kaynağı ve EGFP (FITC / Cy2) ve DsRed (TRITC / Cy3) filtre küpler vardır. Eg5-MCherry mikrotübüllere lokalize ve nea zenginleştirilmiştirr mili direkleri. </li><li> Olduktan sonra hücreler, Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade edilen, Schneider ortamı 4 ml ihtiva eden bir 25 cm&#39;lik 2 doku kültürü şişesine transfekte indüklenmemiş hücrelerin geri kalanı aktarın. </li><li> Transfekte edilmiş hücrelerin şişeye 25 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda Blastisidin S HCL eklenir ve hücre ölümü periyodik Eg5-mCherry ekspresyonu kontrol etmek için emin olarak sona erene kadar 25 ug / ml Blasticidin S, HCI varlığında, bölme devam etmektedir. 25 ° C inkübatör hücre hatları inkübe edin. NOT: Zamanla Eg5 mCherry artışları ifade hücrelerin yüzdesi. </li><li> Hücreler stabil olarak transfekte edildikten sonra, ilacın yokluğunda bölünmüş ve gelecekte kullanılmak üzere 12 hücreleri dondurma devam etmektedir. </li></ol> 2. RNA Girişim <ol><li> PCR olduğu (Malzeme Listesi verilen sekans) ilave T7 promotör sekansı ile primer kullanılarak cDNA&#39;nın (LD15641) için Klp61F bir ~ 500 bp&#39;lik bir bölge amplifiyedsRNA sentezi için bir şablon olarak kullanıldı. <ol><li> Şablon DNA 100 ng, her bir primer, uygun bir tampon ve polimeraz 25 uM içeren dört PCR reaksiyonları, 50 ul, her biri ayarlayın. Polimerazın üreticinin protokolüne göre PCR PCR protokolünü ayarlayın. </li><li> Havuz ve PCR üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak temiz dört PCR reaksiyonları. -20 ° C de, temiz bir şablon saklayın. </li></ol></li><li> Bir T7 RNA transkripsiyon kiti kullanılarak üreticinin talimatlarına şablon çift sarmallı RNA (dsRNA) hazırlayın. DsRNA&#39;nın ~ 5-15 mg / ml konsantrasyon bekliyoruz. -20 ° C&#39;de dsRNA saklayın. </li><li> DsRNA ile Klp61F demonte etmek için,% 25 birbirine karıştığında Eg5-mCherry ifade eden S2 hücreleri 1 saat boyunca 35 mm doku kültürü çanağı alt yarı uygun sağlar. </li><li> Yemekler ortamı çıkarın ve Klp61F karşı dsRNA&#39;nın 5 ug ekleyin (Drosophila kinesin-5) serum serbest Schneider 1 ml seyreltilmiş &#39;s medya. </li><li> Daha sonra% 10 FBS ile Schneider ortamı 1 ml ilave 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 24 saat dsRNA tedaviden sonra 500 uM nihai konsantrasyona kadar CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ifadesini teşvik eder. Başka bir 24 saat daha 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol> 3. Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> Temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde bir kaplanmış lamel konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin. </li><li> Tohum dsRNA ile muamele edilmiş ve uyarılan O / N konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine ve bunları, yaklaşık 1 saat yapışmaya izin olan hücrelerin 500 ul. </li><li> Görüntüleme için bir gül odasına lamel (veya uygun damarı) birleştirin. </li><li> Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade mitotik hücrelerin bulun. NOT: mili iki kutupluluğun için gerekli olan Klp61F beri monopolar iğ olmalıdır sadece GFP-α-tubulin ifade Mitotik hücreleri, 10,13 düşürülürse. </li><li> Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem ifade eden hücrelerde bipolar miller (dakika başına, örneğin, 1 kare) zaman atlamalı görüntüleri toplayın. </li><li> Görüntüleme sırasında, gül odasından ortamı çıkarın ve Schneider medya mili çöküşü görselleştirmek için odasına 3 ardışık medya alışverişi (~ 5 ml toplam) üzerinde 1 mcM STLC içeren değiştirin. </li><li> Dikkatlice gül odasından STLC içeren ortamı çıkartın ve taze medya ile gül bölmesini son bir kez yeniden doldurmadan önce Schneider medya 4x (6-8 ml toplam) yıkayın, ilaç yıkanmaya ve mil çöküşü tersine çevirmek için. Görüntüleme devam edin. </li></ol> 4. Hata Düzeltme Testi <ol><li> Temiz 35 mm doku kültürü kaplarına bir kaplanmış lamelleri konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin. </li><li> Tohum konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine Klp61F dsRNA ile işlemden geçirildi ve bunları uygun izin olan hücrelerin 500 ul. </li><li> Sonra hücreler adher olaned, 2 ml kadar son hacim getirmek için her yemeğin Schneider medya 1,5 ml ekleyin. </li><li> Mitoz hücreleri yakalama tabağın her birine 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyona değin MG132 ekleyin ve 1 saat kuluçkada bırakın için. </li><li> 1 uM STLC ekleyin ve tek kutup oluşturulması için izin vermek için 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Lamelleri taze Schneider medya 2 ml her seferinde 3x durulama STLC yıkayın. </li><li> Bir kontrol olarak herhangi bir farmakolojik ajanlar (örneğin Aurora kinaz inhibitörleri) veya DMSO ilave olarak Schneider ortamı ile lamelleri inkübe edin. Not: İnhibitör konsantrasyonları, değişebilir ve uygun son konsantrasyonları deneyi ile tespit edilmelidir. Ortama: 1,000 stok çözeltileri, tipik olarak inhibitör 1 seyreltilmiştir şekilde yapılır. Bu durumda, bir 1: DMSO (veya uygun bir çözücü) içinde 1000 seyreltme araç kontrolü olarak görev yapar. Bu 40 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda Aurora B inhibitörü Binucleine 2 kullanır. </li><li> Farklı zaman noktaları t hücreleri saptamako Bipolar iğ oluşumunun ilerlemesini gözlemek ve kinetochore eki durumlarını değerlendirmek için. Düzeltmek: <ol><li> Çabuk 1x BRB-80 2 ml lamelleri yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 1 x BRB-80 içinde seyreltilmiş,% 10 paraformaldehit 2 ml ekleyerek hücreleri saptamak. Bir kimyasal kaputu dikkatle Pipet paraformaldehit. </li><li> 8 dakika boyunca 1 x PBS +% 1 Triton-X 2 ml hücreleri geçirgenliği. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 2 ml ile 3 kez kayar. </li><li> Aktarım hücre tarafı 150 mm Petri kabındaki (Parafilm etiketlemek için bir işaretleyici kullanmak uygun slaytlar izlemek için) Parafilm bir levha üzerine yukarı bakacak şekilde lamelleri. </li><li> 150 ul kaynatıldı eşek serumu (BDS) ile lamelleri kaplayın ve spesifik olmayan bağlanma antikorun bloke etmek 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de bir nem odasında saklanır. Nem odasına yapmak için, 150 mm çanak kenarını hattııslak laboratuvar ile siliniz ve Petri kabı kapağı ile kaplayın. </li><li> Sırasıyla ug / ml, 1 (üreticinin tavsiyelerine göre ya da) bloğunu ve birincil antikor 150 ul 2 ug / ml nihai konsantrasyonları kinetokorlar ile mikro için leke BDS uygun şekilde seyreltilmiş olan, oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri inkübe . Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de bir nem odasında saklanır. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri. </li><li> BDS içinde seyreltilmiş uygun bir florofor konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca lamelleri inkübe edin. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri. </li><li> 5 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI nihai konsantrasyon içeren BDS 150 ul lamelleri inkübe edin. </li><li> Lameller 2x 1x PBS +% 0.1 Triton-X yıkayın ve c monteoverslips aşağı medyayı montaj 8 ul bir 3x1 &quot;slayt hücre tarafı. Slaytlarınıza lamelleri hareketsiz için oje ile köşeleri boyayın. </li></ol></li><li> Eg5-mCherry ifade bipolar iğ Görüntü hücreleri. Bir 100X objektif kullanan tüm kanallarda 0,2 mikron aralıklarla 30 uçaklarının oluşan Z serisi atın. Dikkatle eki (iki-yönlenmeli veya syntelic ekleri) durumlarını belirlemek için kinetokorlar ve mikrotübülleri analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface.">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li><li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Welcome+to+a+new+kind+of+tension:+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal.">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li><li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors.">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li><li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division.">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site.">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li><li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors:+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms.">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li><li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol.">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).</li><li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis:+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line.">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li><li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay.">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells.">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Hata düzeltme görselleştirme bu önemli ve kompleks hücresel süreçte yer alan adımları incelemek için değerli bir tekniktir. Bunu yapmak için, hatalı ek parça döner inhibitörleri kullanılarak oluşturulur ve hata düzeltme ilacın yıkanması sırasında gözlenir. Bu deney, ilk olarak, memeli doku kültürü hücreleri 5 kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak birçok model, memeli hücre tiplerinde kinetokorlar çok sayıda varlığı, bireysel hata düzeltme olayları gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme gözlemlemek için onlara daha fazla tercih hücre hattı yapım kinetokorlar olarak az 4 olarak çift sahiptirler. Bununla birlikte, önemli bir dezavantajı, birçok inhibitörleri, Drosophila S2 hücrelerinde etkili olmasıdır. Bu nedenle, insan kinesin-5 eksprese eden bir insanlaştırılmış Drosophila S2 hücre çizgisi oluşturma yeteneği hata düzeltme incelemek için değerli bir araç sağlar. Drosophila S2 hücreleri olabilir, ancak, birhata düzeltme incelemek için daha iyi hücre hattı, hücre hattını elde etmek ve gerekli genleri aşağı vurma katılan çok sayıda adım bu tekniğin bazı zorluklar yaratıyor. Örneğin, transfeksiyon verimi oldukça düşük olabilir. Hücrelerin% 20&#39;den az Eg5-mCherry ifade ediyorsanız seçim süreci uzun sürer olarak, transfeksiyon tekrarlanmalıdır. Ayrıca, her iki floresan proteinleri eksprese eden hücrelerin yüzdesi zamanla azalabilir. Bu, sırasıyla, Eg5-mCherry eksprese eden hücreler ve GFP-α-tubulin seçilmesi için Blastisidin S HCI ve Higromisin B varlığında hücrelerin bölünmesi ile aşılabilir. Bu Drosophila S2 hücrelerinin birçok insan proteinleri ve ortologlara sahip olduğunu not etmek de önemlidir; bu nedenle, endojen proteinler için demonte koşulları optimize etmek için kritiktir. Optimal demonte koşulları dsRNA&#39;nın miktarı ve tedavinin uzunluğu değişebilir. Ortaya çıkışı ve hızla iyileşme dikkate alındığında CRISPR-Cas9 TECHNOLOGI15-17 es, insan Eg5 yerini Klp61F geni ile bir Drosophila hücre hattı nesil transfeksiyonu ve demonte yaklaşımın sınırlamaları aşmak olacağını güçlü bir alternatif sunuyor. Çalışmalarımız gerekli reaktifler halen geliştirilmekte olan Drosophila S2 hücrelerinde bunu her ne kadar sinek-insana gen değişimi bu durumda geçerli bir seçenek olması gerektiğini göstermektedir. Bu prosedür, Eg5 ile sınırlı değildir, ancak ilgi duyulan diğer proteinlerin fonksiyonu çalışma uygulanabilir. Daha önce Drosophila S2 hücrelerinde etkisiz olduğu kurulmuştur inhibitörleri kullanıyorsanız, bu protokol dışı hedef etkileri hakkında endişeler olmadan canlı hücrelerde inhibitörlerinin direkt etkisini araştırmak için modifiye edilebilir. Bu protokol kullanılarak üretilen hücre çizgisi, aynı zamanda, yüksek verimli tarama kullanılabilecek hata düzeltme katılan proteinleri hedef potansiyel ilaçlar tespit etmek analiz eder.

Hücre bölünmesi sırasında genomun Eşit ayrımı çoğaltılmış DNA ve iğ mikrotübüller arasında doğru etkileşimi gerektirir. Mikrotübüller fiziksel kinetokor oluşumunu uyarır 1 olarak bilinen sentromer çeviren proteinlerin bir topluluk sayesinde kromozomlar ile etkileşim. Kromozomların doğru dağıtım kardeş kinetokorlar burada her kardeş zıt kutuplarda iğ kaynaklanan mikrotübül ile ilişkili, iki-yönlenmeli gerektirir. Kinetochore mikrotübül (kt-MT) iki-yönde yönlendirilmiş konformasyonunda olmayan ekler hızlı ve verimli hata düzeltme olarak bilinen bir süreç içinde iki yönde yönlendirilmesi kurmak için fırsat sunmak amacıyla istikrarsızlaştırdı edilir. Daha önce, memeli hücrelerinde kurulmuş bir hata düzeltme deney 5 (kinesin-5) Eg5 karşı döner küçük molekül inhibitörleri kullanılarak tek kutuplu iğ monte gerektirir. Ilaç tedavisi hatalı syntelic ekleri çok sayıda üretir both kardeş kinetokorlar aynı iğ kutbuna bağlayın. Uygulanacak ilacın daha sonraki yıkama hata düzeltme işleminin olarak gösterebilir. Hata düzeltme tahlil hatalı kt-MT ekleri düzelterek aday proteinlerin katkısını incelemek için küçük molekül inhibitörleri veya knockdowns varlığında yapılabilir. Canlı hücreler hata düzeltme görselleştirmek için yeteneği daha bu karmaşık süreçte yer alan moleküler mekanizmayı anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, çoğu hücre hatlarında bulunan kromozomların çok sayıda bireysel kt-MT ekleri gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Onlar kadar az 4 olarak kromozom 6, fakat küçük molekül inhibitörleri içerdiğinden Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme deneyi uygulamak için ideal olacaktır S-tritil-L-sistein (STLC) halinde kinesin 5 ve 7-9 monastrol Drosophila hücrelerinde mili grubunu ya da kinesin-5 motor fonksiyonu etkilemez. Bu nedenle, cinslerted kinesin-5 inhibitörlerine duyarlıdır bir uyarılabilir promoterin altında insan kinesin-5 eksprese eden bir Drosophila S2 hücre çizgisi. Bu protokol, endojen Drosophila kinesin-5 homologunda, Klp61F demonte ve hücre tabanlı hata düzeltme deneyde bu hücre hattını kullanmayı açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F bipolar iğ oluşturmak için gereklidir. İnsan kinesin-5, Eg5, Drosophila S2 hücrelerinde (Şekil 1 A ve D) Klp61F işlevini kurtarmak. Kinesin-5 inhibitörünün (STLC) eklenmesi üzerine, başarılı bir RNAi üzerine endogen Klp61F olmayan hücrelere bir monopol (Şekil 1C ve F) &#39;de elde edilen, motor damla (Şekil 1B ve E) ve iğ kaymalarının mikrotübüle bağlı seviyeleri (Ek film 1). Bu kinesin-5 etkisi insana ait hücrelerde mili çift kutuplu korumak için gerekli değildir, çünkü, bipolar iğ insanlaştırılmış S2 hücrelerinde STLC ilave edilmesi üzerine çökmeye olması dikkat çekicidir. Bu ilginç bir farklılık, iki model sistemlerinde 14 interpolar mikrotübül üst üste ve / veya stabilite farklılıkların bir sonucu olabilir. Kinesin-5 inhibisyonu (Şekil 2A ve E) Reve edilebilir<html> iki kutuplu bir milin ilaç ve geri kazanım yıkanarak rsed zaman içerisinde takip edilebilir. Inhibitörünün (Şekil 2B ve F) çıkarılması üzerine, Eg5-MCherry iki kutuplu bir mili kurullarının (Şekil 2C ve G) olarak mikrotubul-ortakları tekrar ve hücreler, iki kutuplu anafaz (Şekil 2D ve H, Ek film 2 içine ilerleyebilir ). <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> 1. Toplama 1 mcM STLC Şekil Drosophila S2 hücrelerinde monopolar miller yol açar. Temsili görüntüleri Eg5-mCherry (AC) ve GFP-α-tubulin (DF) ifade eden bir Drosophila S2 hücresi time-lapse görüntüleme 1 mcM eklenmesi sırasında STLC. Eg5 önleyicisi 3 dakika ilave edildi. Ölçek çubuğu = 5 um. Zaman Damgası = dk: sn.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Şekil 2. STLC uzaklaştırılması üzerine bir bipolar mili reformları. Bir STLC yıkama deney sırasında Eg5-mCherry (AD) ve GFP-α-tubulin (EH) ifade eden bir Drosophila 2 hücre time-lapse görüntüleme Temsilcisi görüntüler. STLC 5 dakikada yıkandı. STLC kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Ölçek çubuğu = 5 um. Timestamp: dk:. Sn <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Ek Film 1. (sağ indirmek için tıklayın). Widefield floresan görüntüleme Eg5-mCherry ifade eden Drosophila S2 hücresinin bir temsilcisi örnek ( sol) ve GFP-α-tubulin (sağ) 1 uM STLC 2 dakikada ilave edildi ve mili formları inhibitörün ilave edildikten sonra 10 dakika içinde, bir tek kutuplu. Görüntüler her 1 dakika satın almış ve 10 kare bir oranda oynamıştır. saniyede. Ölçek çubuğu = 5 mikron. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Ek Film 2. (Sağ indirmek için tıklayın).</a> Eg5-mCherry (solda) ve GFP-α-tubulin (sağda) ifade eden bir Drosophila S2 hücre temsili örnek Widefield floresan görüntüleme. 1 uM STLC ihtiva Ortam çıkarıldı ve5 dk çalkalandı. Inhibitörü kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Görüntüler her 1 dk edinilen ve saniyede 10 kare hızında çalındı. Ölçek çubuğu = 5 um.

Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Bir &quot;humanize&quot; oluşturuluyor<em&gt; Drosophila</emKinesin-5 Farmakolojik inhibisyonu için&gt; S2 Hücre Hattı Duyarlı

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K Görüntüleme.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

Video: Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Nörobilim

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetik

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

Kas Myosin II Contractility üzerinden katlanmış gastrulasyon sinyal yolu Drosophila S2R + hücrelerde araştırmak için bir hücre tabanlı tahlil

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Gelişim Biyolojisi

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Biyoloji

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Drosophila'da Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Yazar Spotlight: Drosophila Embriyolarında Epitel Gerginliğinin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Bir "humanize" oluşturuluyor

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Tüm ex vivo ekimi ise, Gelişmekte Drosophila Brains

Kas Myosin II Contractility üzerinden katlanmış gastrulasyon sinyal yolu Drosophila S2R + hücrelerde araştırmak için bir hücre tabanlı tahlil

VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu