Bu çalışma Helen Bateup bir Beyin Araştırmaları Vakfı Tohum Grant (BRFSG-2014-02) tarafından desteklenmiştir. Dirk Hockemeyer Ellison Tıp Vakfı Yaşlanma Yeni Bir Scholar ve Glenn Vakfı yanı sıra Shurl ve Kay Curci Vakfı tarafından desteklenmektedir. DH ayrıca NIH hibe 1R01CA196884-01 tarafından desteklenmektedir.

Bu yazıda anlatılan prosedürleri gözden ve UC Berkeley Kök Hücre Araştırma Gözetim Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Düzenleme için Kök Hücreler hazırlayın <ol><li> Büyüme ve mitomisin C ile pasifleştirilmiş fare embriyonik fibroblast 2,4 x 10 6 hücre / levha ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka kültür insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) (MEF) besleyiciler jelatin 32 üzerinde büyümüş. Oyuk (HESC ortamı) başına insan embriyonik kök hücre ortamının 3 ml hPSCs korumak ve 37 büyümesini % 3 O 05/02% CO2 ile ° C inkübatör. Not: Bu protokolün başarısına için, düşük oksijenli bir inkübatör hPSCs korumak için gerekli değildir; Ancak bu kat ve hücre sayıları buna göre ayarlanması gerekir, böylece hPSCs yüksek O 2 ortamında hızlı çoğalan dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, düşük oksijen muhafaza hPSCs kendiliğinden farklılaşma 33 alt fiyat sahip olduğuna dikkat edilmelidir. <ol><li> TO 500 mi HESC ortam 380 ml DMEM / F12, 75 mi Fetal Sığır Serumu (FBS) kombine olmak, 25 mi nakavt Serum Replacement (KSR). Glutamin (1 mM nihai konsantrasyon), 5 ml 100x, esansiyel olmayan amino asitler, 100 birim / ml Penisilin-Streptomisin (P / S), bazik Fibroblast Gelişim Faktörü (bFGF) (4 ng / ml nihai konsantrasyon), ve 2- ekleme merkaptoetanol (5.5 uM nihai konsantrasyon). </li></ol></li><li> Medya (3 ml) tüm hacmini çıkarmadan bir cam pipet ve vakum kullanarak ortamı değiştirin. 3 ml ılık hESC medya serolojik bir pipet kullanarak değiştirin. HPSCs yaklaşık% 50 konfluent (Gün -1) kadar tekrarlayın medya her gün değiştirin. </li><li> Bir gün (Gün -1) hedefleme önce, eski medya kaldırılması ve 10 uM Y-27632 ile desteklenmiş sıcak hESC medya ekleyerek, HESC ortamı değiştirmek. </li><li> Ayrıca Gün -1 üzerine, DR4 farelerinin (2.4 x 10 6 hücre / plaka) 34 ilaç dirençli MEF besleyici hücreler iki 6-kuyu veya 10 cm plakalara birini hazırlamak. Not: Genel olarak, 6 kuyu plakalar reklam vardıravantajdır üzerinde 10 cm&#39;lik tabak, onlar daha çok medyayı ağırlayacak olarak. 6 kuyu plakaları da farklı kuyulardan farklı klonlar bağımsız olmasını sağlamak. Bununla birlikte, 10 cm plaka, bu işlem için uygun bir mikroskop bağlı olarak, daha kolay toplama sağlayacaktır. </li></ol> 2. Düzenleme Pluripotent Kök Hücreler <ol><li> 1.5 ml tüp içine CRISPR / Cas9 px330 kodlayan plazmid (Şekil 1) ZFN 1 ve 2, TALEN, 1 ve 2 ya da 15 ug 5 ug her bir pipetleme transfeksiyon çözelti hazırlayın. Pipet 30 de bu tüpün içine onarım plazmid mikrogram. Son olarak, tüpe pipet 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) 300 ul hacmi getirmek için. Not: 300 ul transfeksiyon altında çözeltisinin hacmi tutmak için 300 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyona sahip en az (herhangi bir kit uygundur) bir Midiprep plazmidler hazırlayın. Bu plazmid düz hale getirmek üzere, ya da endoto kullanmak için, fenol / kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirmek için gerekli değildirXin ücretsiz plazmid hazırlık kiti. </li><li> Cam bir pipet ve vakum kullanılarak hPSCs ortamı çıkarın. Her bir kuyunun içine Pipet 2 ml ılık 1x PBS hücrelerini yıkamak için. </li><li> Hemen bir cam pipet ve vakum kullanılarak PBS çıkarın. Her bir gözdeki hücrelerin doğrudan 0,5 ml% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Yaklaşık 10 dakika boyunca bir inkübatör (37 ° C /% 5 CO 2/3% O 2) yerleştirin. ya da besleyici tabaka plakasını kaldırın başlayana kadar. </li><li> Tripsin reaksiyonu durdurmak için her bir oyuğa, 2 ml sıcak esWash ortamı (470 ml DMEM / F12, 25 mi FBS, 100 ünite / ml P / S) ekleyin. </li><li> Bir yaprak gibi dökülmek bu besleyici hücreler olun. Tüm kuyuları birleştirerek, iyi bir tek 50 ml&#39;lik konik tüp içine her içeriğini pipetle. 10 ml&#39;lik serolojik pipet kullanarak triturate hücreleri. Bu besleyici tabaka kırmak için gerekli değildir; hPSCs dikkatlice toz haline getirilerek besleyici tabakanın ayrılırlar. Hücre süspansiyonunun yaklaşık 15 ml olmalıdır. </li><li> VOLU getirmek için tüp esWash ortam 25 ml ilave edilirBeni en fazla 40 ml toplam. Büyük besleyici topakları 1-2 dakika boyunca tüpün dibinde yerleşmek için izin verin. Yeni 50 ml konik tüp içine bir serolojik pipet ve mevduat kullanarak tüpten (~ 38 ml) çıkarın. </li><li> 190 x g&#39;de 5 dakika aşağı doğru döndürün. Cam bir pipet ve vakum kullanılarak tüpten çıkarın. Hücre pelet rahatsız değil emin olun. PBS 1x 500 ul hücrelerin tekrar. Daha önce hazırlanan plazmid transfeksiyon solüsyonu ile birleştirin. Bu aşamada hücreleri saymak. Elektroporasyon başına 5-10 milyon hücre kullanın. </li><li> , 4 mm&#39;lik bir elektroporasyon küveti içine tüm 800 ul süspansiyon Pipet 3-5 dakika buz üzerine yerleştirin. 250 V, 500 iF, ∞ direnci ve 4 mm küvet boyutu: elektroporasyon aşağıdaki parametrelerle sistem üzerinde üstel programı kullanarak electroporate hücreleri. Elektroporasyondan sonra, 3 dakika boyunca geri buz üzerine küvet kullanır. Not: elektroporasyon sistemi üzerinde elektroporasyon sabit süresine uyulmalıdır. Zaman sabitihücre sayısı ve DNA saflığı ile değişir. Listelenen koşulları ve gen üreteci II kullanırken Başarılı nakiller genellikle 10-14 msn arasında sabit bir zaman var. Zaman sabitleri bu değerlerden değişir daha düşük elektroporasyon verimleri oluşabilir. </li><li> Sıcak HESC Medya 10 uM Y-27632 ile desteklenmiş 18 ml electroporated hücreleri tekrar süspansiyon. Plaka 3 DR4 besleyici hücreler ile bir 6 yuvalı plaka her oyuğuna, bu, tek bir hücre süspansiyonunun mi. Inkübatör (37 ° C /% 5 CO 2 /% 3 O 2) geri dönün. </li></ol> Pozitif Kolonilerin 3. Seçim <ol><li> Gün 2, bir cam pipet ve vakum kullanılarak tüm medyayı çıkarın. 10 uM Y-27632 ile takviye edilmiş, sıcak HESC ortamının 3 ml değiştirin. 3. Gün, cam pipet ve vakum kullanılarak tüm medyayı çıkarın. Y-27632 de dahil olmak üzere olmadan sıcak HESC ortamının 3 ml değiştirin. 4. Gün, cam pipet ve vakum kullanılarak tüm medyayı çıkarın. 3 ml selecti antibiyotik ile takviye edilmiş, sıcak HESC ortamı değiştirinüzerinde. Inkübatör (37 ° C /% 5 CO 2 /% 3 O 2) geri dönün. Not: direnç kaseti bağlıdır kullanılan antibiyotik türü tamir şablonunda dahil. WIBR 3. hPSCs (NIH kayıt 0079), 0.5 ug / ml puromisin, 70 ug / ml G418 (genetisin) ve 35 ug / ml higromisin çalışırken başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Seçimi için konsantrasyonlar yaklaşık bir hafta içinde, vahşi tipli hücreleri öldürmek için gereken antibiyotiğin asgari konsantrasyon kurarak ampirik olarak belirlenmelidir. </li><li> Gün 5-12, antibiyotikler ile desteklenmiş sıcak hESC medya ile eski Ortam her zaman yerine günlük ortamı değiştirmek. Not: Hücre ölümü büyük miktarda bekleyin. Bireysel koloniler günde 8-10 civarında anlaşılacaktır. Antibiyotiksiz düzenli HESC ortam sürekli seçimi 12-14 gün sonra kullanılabilir. Hücre yoğunluğu yüksek ya da hücre ölümü yavaş ise, ortam asitleştirilmesi kaçınılmalı ve bu ortam VOLU arttırmak gerekli olabilirSeçimin ilk birkaç gün boyunca beni (4-5 ml). </li></ol> 4. Toplama Seçilen koloniler (Gün 12-14) <ol><li> Günde 12-14 koloniler gözlemleyin. Diseksiyon mikroskobu üzerinde almak ve onlar ayırt başlıyor hücreleri içermediğinden emin olmak için hazırız koloniler gözlemleyin. Yaklaşık boyutu 800-1,200 uM olmalıdır. Koloniler günde 12 önce bu büyüklüğe ulaşmak ise, daha sonra çekilmesi gerektiği önerilmektedir. Not: Her hedefleme deney için, istenilen genotip izole sağlamak için gerektiği kadar koloniler seçin. Bir örnek olarak, AAV-CAGGS EGFP onarım bir şablonla AAVS1 düzenleme sürekli olarak sağlam bir entegrasyon gösterilen ve sadece 12-24 koloniler, yaklaşık 5-10 heterozigotik hedeflenen klonlar elde etmek üzere alınmayı gerektiren gelmiştir. Daha fazla koloni gerektirebilir diğer hedefleme deneyleri (Tablo 1) çekilecek. Doğru hedefleme olaylarının sıklığı gibi SS verimliliği gibi faktörlere bağlıdırN DSB, insert büyüklüğü ve seçim stratejisi tanıtmak. Doğru düzgün hedeflenmiş bir klon elde edilmesi için gereken koloni sayısını azaltarak, bir hedef bölgeye entegre olduğunda burada sunulan AAVS1 lokusu için gen trap yaklaşım durumunda, seçim marker yalnızca ifade edilir. </li><li> (Her koloni aldı doları / plaka 2.4 x 10 6 hücre, bir de kullanılır) Bir gün almadan önce MEF&#39;ler 12-kuyu plakaları hazırlamak. </li><li> Toplama gününde, bir cam pipet ve vakum kullanılarak 12 de MEF plakaları tüm medya kaldırmak ve 1 ml hESC medya ile değiştirin. Ayrıca toplama gününde, seçilmiş olacak 6 kuyu plakalar üzerinde hESC ortamı değiştirmek. </li><li> Besleyici katmandaki tek tek kolonilerin mekanik ayrışma için cam pipetler çekin. Bir in-kaputu Bunsen beki üzerinde pipetler indirin ve cam dövülebilir kadar genişleme noktasında yumuşadı. Hızla alev kaldırmak ve pipet ayrı bir açısal noktası oluşturma çekin. Kırındar bir kanal bırakarak eğilmiş eksene yaklaşık 2 cm etmektedir. 1-2 saniye alev teşhir ederek kanalın sonuna lehçe. Not: İsteğe bağlı, ancak bu kültürün klonalite azaltabilir, koloniler bir p20 pipet ucu almak, donuk ucu potansiyel sonraki avanta kirletici, ortama her koloninin hücreleri büyük miktarlarda çıkarmak olabilir. </li><li> P1000 filtre pipet alarak ve dar ucuna bir emme ampul takarak cihazı toplama birleştirin. Geniş sonunda çekti cam pipet yerleştirin. </li><li> HPSCs bir 6-deney levhası, bir doku kültürü kaputu monte edilen bir diseksiyon mikroskobu aşamasında alınmayı yerleştirin. Toplama cihazının ampul sıkıştırın ve yavaşça ortama parçaları serbest bırakmak için özen tüketim ve 10-20 eşit büyüklükte parçalar halinde bireysel koloni kesti. Ampulü bırakarak pipet içine koloni kesilmiş hPSC parçalarını alın. Aktarım sırasında mümkün olduğunca az medyayı almaya çalışın. </li><li> Transfer 12 kuyu MEF plaka tek bir kuyudan, şimdi kırık koloni bırakmadan doğrudan kuyuya tekrar ampulü sıkıştırarak bireysel koloni. Tek hücreden türeyen klonlann belirlenmesine olanak sağlamak için eşsiz bir Her çukurun etiketleyin. Cam pipet her zaman değişen gerektiği gibi birçok koloniler için tekrarlayın. Not: Toplama koloniler öğrenmek için biraz zaman alabilir. Bu hedeflenen koloniler izole etmeye çalışırken önce bazı kontrol hücreleri üzerinde deneyci uygulaması tavsiye edilir. </li><li> Hafifçe her bir orta hücre birikimini önlemek için birinci plaka, sallanan kuluçka makinesi (37 ° C /% 3 O 05/02% CO2) 12 gözlü levha üzerinde döndürür. </li><li> Bir sonraki gün, her takip eden gün bir cam pipet ve vakum kullanılarak ortamın hacmini çıkarın ve hücreleri, yaklaşık% 50 konfluent kadar ılık HESC ortamı 1,5 ml ile değiştirin (bu genellikle 10-12 gün sürer). </li><li> 10-12 gün sonra, her bir iki koloni birini seçmek ve yeniden yeni 12-kuyu MEF plakaları transferpeating bir yineleme plaka üretmek için 4.1-4.8 adımları tekrarlayın. </li><li> Orijinal MEF plakaların her kalan koloniler DNA (aşağı bakınız) ekstrakte edin. <ol><li> Cam bir pipet ve vakum kullanılarak tüm kuyulardan bulunan ortamı çıkarın. Iyi hücreleri yıkamak için her üzerine PBS 1x Pipet 1 ml. Cam pipet ve vakum kullanılarak PBS çıkarın. Pipet hücre parçalama tamponu 250 ul (H2O içinde nihai konsantrasyonlar: 10 mM Tris HCI, 5 mM EDTA,% 0.2 SDS, 200 mM NaCI, 0.08 mg / ml proteinaz-K) her üzerine yerleştirin. Inkübatör Yeri (37 ° C /% 3 O 2 /% 5 CO 2) O / N. </li><li> Sonraki gün, pipet Her oyuğun içeriği bireysel 1.5 mi borular. Pipet Her tüpe izopropil alkol 250 ul DNA çökeltildi. Kuvvetlice tüpü çalkalayın. Beyaz bir çökelti görünür olmalıdır. </li><li> Bir masa üstü santrifüjü içinde 13,000 rpm&#39;de 3 dakika için her bir tüp dönerler. Spin aşağı sonra sıvı atık haline boşaltılarak süpernatant atın. Bir küçük DNA pelet altına sıkışmış kalmalıdırtüp. DNA pelet yıkamak için her bir tüp içine% 70 etanol içinde 250 ul Pipet. Kuvvetlice sallayın. Bir masa üstü santrifüjü içinde 13,000 rpm&#39;de 3 dakika için her bir tüp dönerler. </li><li> Aşağı iplik sonra, sıvı atıklar içine boşaltılarak süpernatant atın. Küçük bir DNA pelleti, tüpün altına takılıp kalması gerekir. Tüp sol herhangi bir sıvı yoktur yani süpernatant geri kalanını pipetle. 5-10 dakika masa üstü kuruması için açık tüp bırakın. Kurutma işleminden sonra, 250 ul TE tamponu içinde yeniden süspanse DNA. DNA, çözünmesi için 6 saat süre ile 37 ° C &#39;de yerleştirin. </li></ol></li><li> PCR optimize önceden veya güney leke strateji kullanarak her bir örnek Genotip. Not:.. AAVS1 AAV-CAGGS EGFP onarım şablonu kullanan hedefleme için, Güney benek stratejisi ve arkadaşları, 2009 4 kapsamlı bir güney lekeleme protokolü Southern bulunabilir Hockemeyer bulunabilir 2006 35 arasında çoklu PCR genotipleme için. Aynı deney, astar ve koşullar olabilirTablo 2 36 bulunabilir. </li><li> Doğru hedeflenmiş olmayan kuyular atın ve her gün doğru hedeflenmiş hücreler üzerinde HESC medya değiştirerek devam edin. Bunların yaklaşık% 50 konfluent olduğunda, hücreleri aşağı Freeze protokolü dondurma için aşağıya bakınız. <ol><li> Bir gün dondurmadan önce, eski medya kaldırılması ve 10 uM Y-27632 ile desteklenmiş sıcak hESC medya ekleyerek, HESC ortamı değiştirmek. </li><li> Donma günde iki 15 ml konik tüp içinde dondurulur olan bir 12 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu çözelti A ve çözelti B, 0.5 ml, her hazırlayın. Buz üzerinde yerleştirin çözümleri. Çözelti A:% 50 hESC medya ve% 50 FBS; Çözelti B:% 80 FBS ve% 20 dimetil sülfoksit (DMSO). </li><li> Dondurmadan önce tek hücre içine hPSC kolonileri ayırmak. Buna göre hacimleri ölçekleme, bunu yapmak için adımlar 2,2-2,8 izleyin. Çözelti A&#39;nın 0.5 ml tam tekrar süspansiyon hücre topağı </li><li> Hücre süspansiyonu, pipet up 0.5 ml solüsyon B ekleyin ve aşağı hücre süspansiyonu homojen hale getirmek için. Take 2 ml cryotube hücre süspansiyonu (~ 1 mi) ve yatağın toplam hacim. Kapağı sıkıca kapatılır. </li><li> -80 ° C dondurucu O / N yerleştirin cryotube. Dondurma gün sonra, -80 ° C derin dondurucuda dondurulmuş hücreleri çıkarmak ve hemen uzun süreli depolama için sıvı azot tankına yerleştirin. </li></ol></li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan ederim.

Gen-düzenlenmiş insan pluripotent kök hücrelerin homojen popülasyonları izole etmek için burada sunulan yöntem hedeflenen loküsündeki sadece farklı izojenik hPSC hatları oluşturmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu hücreler insan hücre farklılaşması ve gelişimi mekanizmaları prob hem de kontrollü bir genetik ortamda monogenik hastalıkların patofizyolojisi anlamak için ideal bir sistem bulunmaktadır. Burada gösterildiği gibi, bu AAVS1 lokusuna yönelik entegrasyonu sağlamak için üç bağımsız SSK tasarım stratejileri (ZFNs, TALENS ve CRISPR / Cas9) kullanmak mümkündür. Bu yöntemlerin her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Potansiyel ZFNs bir avantajı, bir dereceye kadar, TALENS bağımsız nükleaz 42 bağlanma domenlerinin DNA geliştirmek amacıyla yinelemeli mühendisliği sağlar tasarım esnekliği vardır. Bu nukleaz optimizasyonu CRI ile başarılabilir ötesinde ZFNs ve Talens özgünlüğünü artırabilirSPR / Cas9 sistemi. Bu tür seçiciliği, hedef yüksek bir spesifite derecesi gerektiren klinik uygulamalar için önemli olabilir. CRISPR / Cas9 sisteminin en önemli avantajı kullanım kolaylığı olduğunu. TALEN ve ZFN yapım setleri (Addgene 21 aracılığıyla, yani,) kamuya olmasına rağmen sadece gerekli özelleştirme bir 20 baz çifti oligonükleotid olarak px330 plazmidi kullanıldığında, CRISPR / Cas9 tabanlı SSNs (oluşturmak için önemli ölçüde daha kolay Tasarım 14). Bu basitlik kendi çalışmalarında genom düzenleme dahil etmek isteyen araştırma laboratuarları için avantajlı olduğunu kanıtlamaktadır. Gen-düzenlenmiş hPSC satırları oluşturmak için nucleofection 43, dahil olmak üzere alternatif transfeksiyon teknikleri vardır; Ancak elektroporasyon, tutarlı ve düşük maliyetli 4,5,25 olduğu gösterilmiştir. Nucleofection SSK etkinliği yükselen doğrudan çekirdeğin içine Cas9-kılavuz RNA ribonükleoprotein kompleksleri transfekte etmek için kullanılabilird sadakat 44. MEF&#39;lerden üzerinde hPSCs Büyüyen aşırı farklılaşma olmadan bir pluripotent devlet hPSCs korumak için sağlam ve ucuz bir yöntemdir. Buna ek olarak, bu genetik olarak özdeş kolonilerin kolay izole edilmesini sağlar. Alternatif olarak, bununla birlikte, bu kültür koşulları besleyici göre kültürler daha pahalı olabilir MEF&#39;ler içermeyen kültür hPSCs mümkündür. Bundan başka, tüm süreç çok nadir düzenleme etkinlikleri izolasyonu veya paralel düzenleme deneylerinde, birçok farklı hücre serilerinin jenere edilmesi için izin ölçeklenebilir. Burada açıklanan protokol sağlamdır; Ancak doğru düzenlenmiş klonlar elde edilebileceği ile verimliliği etkileyen birçok önemli adımlar vardır. Bu yöntem için en kritik bileşeni yüksek kaliteli MEFS ve ilaca dirençli DR4 MEFS yaşıyor. Tek hPSCs sağkalım ince ve düşük kaliteli MEF&#39;ler farklılaşmamış hPSC hatlarının izolasyonu engel olacak. İkinci olarak, Y-27632 kullanımı daanormal karyotip 45 olan hücreler için selektif bir basınç oluşturmadan tek hücre hayatta kalmasını garantileyen, anahtar. Üçüncü olarak, iyi aralıklı koloniler çekme türetilen hücre çizgilerinin genetik homojenlik sağlar. Son olarak, bu açılış birçok küçük parçalar halinde koloni kırmak için yeterince küçük olacak şekilde birden fazla koloniler yeni kuyuda büyüyecek sağlanması, cam pipetler hazırlamak için önemlidir. Bir kopya plaka genotiplemeye izole kolonilerin orijinal plaka bırakarak, kültürde var Bu iyi aralıklı alt-klon toplama izin verir. Bu protokolde zorlu kısmı cam pipetler çekerek manuel; Bu daha önce uygulanmalıdır. Bir cam pipet gerektirmeyen klonu toplama birden çok teknik vardır olduğuna dikkat edilmelidir. Deneyci kendileri için en uygun olanı bulmak için teşvik edilir. Basit modifikasyonlarla aşılabilir, bu protokole sınırlamalar vardır. O amaçlayan bir deneynly kimin tamir şablonu seçme kaseti içermiyor, düzenlendiği hücrelerin zenginleştiren başka bir yöntem kullanmanız gerekir tamir veya biri olmadan ilgi odağı bozabilir. Pozitif bir klon bulmak için çekilmesi gereken koloni sayısı, seçim yapılmadan büyük ölçüde artırır unutmayın. Verimliliğini artırmak için bir strateji, bir flüoresan proteini eksprese eden bir bütünleşmeyen plazmid birlikte transfekte etmektir. Hücreler iki gün boyunca geri bırakıldıktan sonra, hedef hücreler, flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif kullanılarak pozitif floresans kriteri ve 29 replated olabilir. Bu işlem, elektroporasyon ile plazmit ile transfekte edilmiş hücreler için zenginleştirir ve böylece hücre içinde aynı anda düzenleme olayın olasılığını arttırır. Burada açıklanan teknikler aynı anda birkaç loci 14,46,47 hedef için birden fazla rehber RNA&#39;ların kullanmak için uzatılabilir. Birçok protokol hPSCs ayırt etmek için kurulmuşturfarklı hücre tiplerine, ilgi 30 hücre tiplerinde çeşitli genetik manipülasyonlar izin. Genel olarak, biz ne olursa olsun SSN seçim hPSCs etkili genom düzenleme potansiyelini ortaya koymuştur. Bu teknik, herhangi bir genomik loküsündeki gen düzenlenmiş olan izojenik hPSC satırları oluşturmak için adapte edilebilir öneriyoruz.

Genom düzenleme teknolojileri hızla moleküler ve hücre biyolojisi 1 için standart araçları haline gelişmektedir. HPSCs genetik olarak sağlam primer insan hücreleri, bir kendi kendini yenileyen kaynağı temsil insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) genetik mühendisliği, özellikle ilgi çekicidir. hPSCs hastalığı modelleme veya transplantasyon terapisi 2,3 için bir kaynak gibi çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir. AAVS1 mahalinde bir raportör yapısının hedeflenen entegrasyonu için endojen DNA tamir mekanizmaları ile birlikte siteye özgü nükleazlardır (SSNs) üç farklı tipte kullanan bir protokoldür burada gösterdi. HPSCs içine SSNs transfeksiyonu sonra, muhabir barındıran izojenik hücre popülasyonlarının izole etmek için nasıl gösterilmektedir. Özellikle pluripotent hücre genomları kök, genom manipüle etme yeteneği kullanarak SSNs çinko parmak nükleazlardır (ZFNs) ve transkripsiyon activat yararı olarak yeni bir fenomen değil,gen düzenleme için veya benzeri bir efektör nükleazlar (Talens) birkaç yıl önce 4-10 gösterilmiştir. Ancak, S. pyogenes CRISPR gelişiyle / Cas9 teknolojisiyle 11-13 ile gen düzenleme 14 yaygın olarak erişilebilir hale gelmiştir. Tüm SSNs homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ya da homoloji yönettiği onarım (HDR) 15 kullanılarak endojen hücresel mekanizmalar tarafından tamir edilir belirtilen hedef sitenin 1,4,5,11 bir çift sarmallı DNA kırılmasını (DSB) tanıtmak. NHEJ hata eğilimli ve yeni elemanlar SSN sahip bir tamir şablonunun ko-transfeksiyon yoluyla uygulanabilir için HDR izin verirken, gen fonksiyonunun kaybıyla sonuçlanan çerçeve kayma mutasyonları neden olabilir. Gen düzenleme kolaylaştırmak DNA tamiri altında yatan ilkeler, her SSN büyük ölçüde aynı olduğu düşünülen edilirken, platformlar arasında bazı farklılıklar dikkat edilebilir. De ZFNs ve novo tasarım esnekliği ve nukleaz optimizasyonu 16 alenen bununla birlikte kullanılmasını sağlarBireysel ZFNs tasarım mevcut montaj kütüphaneleri ve tarama araçları zaman alıcı olabilir. ZFN aracılı hedefleme için istenen lokus belirlendikten sonra, ZFN çiftleri online bir araç ZiFit 17 ile tasarlanabilir. Tasarımı sonra ZFNs modüler plasmid klonlama 18 birkaç tur ile monte edilebilir. Alternatif olarak, birçok ticari olarak temin edilebilen, önceden onaylanmış ZFNs 19 vardır. TALE nükleazlar aynı zamanda online araçları ve kamuya açık bileşenler 17,20 kullanılarak dizayn edilebilir. Örneğin, hızlı bir şekilde TALENS FLASH düzeneğinin 21 veya PCR bazlı bir hiyerarşik Altın Kapı düzeneği 22 kullanılarak yoluyla beş TACE tekrarlarının bloklarından monte edilebilir. SSN tasarımı ve CRISPR / Cas9 kullanarak inşaat hızının kolaylığı yaygın erişilebilir düzenleme aracı genom yaptık. Kılavuz RNA&#39;lar çoklama tek yapı 14 ile birkaç loci hedef için CRISPR kısa kılavuz RNA aracılı hedefleme / Cas9 da izin verir. DizaynHedef mahaline proksimal gen düzenleme için Cas9 bir protospacer bitişik motif (S. için bir NGG trinucleotide Cas9 pyrogenes PAM) sadece kimlik gerektirir. Px330 plasmid 14 içine PAM 20 baz çifti 5 &#39;e karşılık gelen bir oligonükleotid sokulmasıyla, yapı, bir klonlama adımında birleştirilebilir. S. ek olarak pyogenes Cas9, N arasından Cas9 5&#39;-NNNNGATT-3 &#39;(PAM) tanır meningitidis (NmCas9) hPSCs 23 verimli gen düzenleme için izin vermek için gösterilmiştir. SSK tasarım kolaylığı farklılıklara ek olarak, her bir platform belirli özelliklere sahiptir. Örneğin, ZFNs ve TALENS Cas9 çok oluşturmak uçlu DSBs künt düşünülmektedir ise dört nükleotid 5 &#39;çıkıntı 24 oluşturur Foki nükleaz etki kullanmaktadır. ZFNs, TALENS ve Cas9, açma-kapama hızı hedef DNA, protein stabilitesi açısından farklılık ve DNA tarama modu her biri cteorik düzenleme sonucu 1 küçük farklılıklara neden ould. Ileri çalışmalara tam bu farklılıkların sonuçlarını anlamak için gerekli olacak, biz burada üç platformlarda son derece sağlam ve kolaylıkla genetiği değiştirilmiş hPSCs oluşturmak için kullanılabilecek bir protokol açıklar. Ne olursa olsun SSN seçim, elektroporasyon hPSCs 25 içine Sosyal Güvenlik Numaralarını ve benzerlik onarım şablonları transfect sağlam bir işlemdir. Antibiyotik direnci için seçimden sonra koloniler hayatta sayısı lokus spesifik parametreler ve düzenleme stratejisi (transgenik ekin ve seçim modu, örneğin boyutu) bağlıdır. Burada açıklanan protokol genellikle yaklaşık 150-400 tek hücreli türetilmiş koloniler halinde sonuçlanır. Gen-düzenleme, bu protokolü kullanarak AAVS1 loküsündeki önce SSNs 4,5 etkinliğini göstermek için kullanılır olmuştur. AAV-CAGGS EGFP onarım şablonu bir gen tuzak str kullanırategy locus spesifik bir şekilde puromisin direnç kazandırmak için. Kısaca, tamir şablonu yükselticisiz puromisin direnç kasetinin üst kısmında bulunan bir bağlayıcı alıcı alanı ihtiva eder. AAVS1 lokusundaki PPP1R12C geninin ilk intronu içine doğru entegrasyon üzerine, direnç kaseti düzenlenmiş genin promoterinden ifade edilir. Bu özel AAVS1 tahlil sağlamlığı bize her SSN platformunun etkinliğini karşılaştırmak için izin verir. Sosyal Güvenlik Numaralarını kullanarak Gen düzenleme bozabilir ve / veya teorik herhangi geni değiştirmek için yeteneği verilen güçlüdür. HPSCs bu stratejiyi uygulanması hPSCs daha sonra, nöronlar 26 gibi insan hücre tiplerinin bir çok ayrışmıştır edilebilir, çok yönlü ve çok 27 hepatositlerin ve 28 kardiyomiyositlerin. Buna ek olarak, bir hastada elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımı, bir hastaya özgü genetik temelinde 29 onarım ya da bilinen hastalığa neden olan mutasyonlar devreye girmesine olanak </sup&gt;, Hastalık mekanizmaları ve hastanın kendi hücrelerini kullanarak test 30 terapötikleri araştırmak için bir platform sağlar. Özetle, hPSCs gen düzenleme insan gelişimi ve hastalığın 31 temel biyoloji araştırmak için etkili ve çok yönlü bir yaklaşımdır.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor - basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, plugged</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml Cryotubes</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) Genomu düzenleme insani gelişmeyi anlamak ve hastalığın patofizyolojisi araştırmak için hangi genetik olarak kontrol ve klinik olarak anlamlı bir platform sağlar. Genom düzenleme için siteye özgü nükleazlardır (Sosyal Güvenlik Numaralarını) kullanılarak, bir başka izogenik ortamda belirli genetik değişikliklerin barındıran yeni hPSC hatlarının hızlı türetme mümkün olur. Çinko parmak nükleazlar (ZFNs), transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (Talens) ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromic tekrarlar (CRISPR) / Cas9 en sık kullanılan SSNs vardır. Bu nükleazlara her böylece bir genomik lokusta kesin gen düzenleme teşvik, belirli bir sahada iki iplikçikli bir DNA kırılmasının katılmasıyla işlev görürler. SSN-meditasyon genom düzenleme ekleme / silme mutasyonlar veya alt tanıtmak ya hücrenin endojen DNA onarım mekanizmaları, homolog olmayan uç (NHEJ) katılmadan ve homoloji yönettiği onarım iki (HDR), sömürençift ​​sarmallı mola yerinde bir homolog onarım şablonu kullanarak genom er. HPSCs Elektroporasyon gibi floresan gazetecilere ve antibiyotik direnç kasetleri olarak transgenlerin dahil Sosyal Güvenlik Numaralarını ve onarım şablonları transfecting etkin bir yoludur. Elektroporasyondan sonra, antibiyotik direnç seçilerek, tamir yapısı dahil yalnızca hPSCs izole etmek mümkündür. Mekanik hPSC koloniler alınır ve genotipleme boyunca hedef yerde uygun bir entegrasyon teyit doğru hedef ve genetik olarak homojen bir hücre hatlarının izolasyonu sağlar. Bu protokolün geçerliliği EGFP ve puromycin direnç insan pluripotent kök hücreleri AAVS1 güvenli liman mahaline içine inşa dahil her üç SSN platformları kullanarak burada gösterilmektedir.

Burada Genetiği hPSC satırları oluşturmak için üç farklı SSN platformları ile uyumlu bir protokol göstermektedir. Biz EGFP muhabiri ve bir puromycin direnç kaset 4 tanıtan bir onarım şablonu kullanarak daha önce yayınlanmış ZFNs 4, Talens 5 ve CRISPR / Cas9s 37 kullanılarak AAVS1 loküsündeki WIBR 3. insan embriyonik kök hücrelerini hedef aldı. Biz farklılaşmamış hPSCs bakım ve genişletme izin veren bir hücre kültürü iş akışı (Şekil 2) için MEF&#39;ler bizim hPSCs kültürlü, o da etkili ve ölçeklenebilir maliyetidir. Hücreler gerekenden daha uzun büyüdüklerinde transfekte pluripotent hücrelerin sayısını ve dolayısıyla elde edilen doğru hedef hPSC koloni sayısını azaltarak, artan farklılaşma riski vardır. Bu electropSSN platformu başına 5.0 x 10 6 hücre orated ve DR4 MEF&#39;lerin tek 6 plaka üzerine her hedef hücreleri kaplı. Seçimden sonra, her platform EGFP-pozitif koloniler (Şekil 3) ve hedefsiz homozigotik ve heterozigotik olarak hedef hedef klonlar (; Tablo 3 Şekil 4A, B) bir kombinasyonu ile sonuçlanmıştır. Burada yer alan şartlar altında, AAVS1 TALENS en EGFP-pozitif klonlar neden olduğunu bulmak. Bu deney için kullanılan onarım şablonu EGFP raportör ve puromisin direnç kasetinin üst kısmında bulunan bir bağlayıcı alıcı alan oluşur. Bu &quot;gen trap&quot; stratejisi (Şekil 1) kullanılarak, yapı puromisin dirençli bir kasetin ekspresyonunu tahrik etmek için endojen promotör ile, AAVS1 lokusunun ilk intronu eklemek gerekir. Ekspresyonu engellemelidir onarım şablonu içinde puromisin direnç geni ekspresyonunu tahrik eden promoterden olmaması<html> rastgele entegrasyon olay. Bu nedenle, tüm puromycin dirençli klonlar AAVS1 sitesinde hedef olacağını bekliyoruz. Bu ancak en PCR stratejileri (Şekil 1, Şekil 4C) ile klonların bir alt kümesi, bir iç probu kullanılarak Southern blot ile tespit edilebilir AAVS1 lokusunda olarak anormal entegrasyonlar taşıdığına işaret edilmelidir 4. Bu entegrasyon olaylar büyük olasılıkla donör plazmid 4 çoklu entegrasyonlar yol açan heterolog hedef olayların sonucudur. Her SSN deneyinden 24 koloniler aldı ve tüm platformlar çok yüksek hedefleme verimliliği vardı ve sadece çok az farklılıklar gösterdiğini gördük. PCR tarafından sorguya gibi TALEN platformu en homozigotik hedeflenen klonlar (Tablo 3) varken, CRISPR / Cas9 en doğru hedeflenmiş klonları elde edilmiştir. /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Gen Şekil 1. şematik AAV-CAGGS EGFP onarım şablonu. Dan Hockemeyer ve ark. Modifiye kullanarak AAVS1 lokusunu düzenlenmiş, 2009. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> WIBR 3. hücrelerinin Şekil 2. kolonileri. 3 insan embriyonik kök hücreleri önce hedeflemesine WIBR # kolonileri Temsilcisi parlak bir alan görüntüler. Farklılaşma eksikliği ve ideal olmayan bir (sağ) farklı olarak ideal bir kolonisi (solda) besleyici tabakadan net bir ayrım unutmayın. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> Şekil 3. EGFP-pozitif WIBR 3. hücreleri. WIBR # AAVS1 mahalinde bir EGFP-ifade onarım şablonu ile hedeflenen 3 hücrelerinin Temsilcisi görüntüler. ZFNs düzenlenmiş temsilci kolonilerin Görüntüler, Talens ve CRISPR / Cas9 gösterilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4. Genotipleme stratejileri doğru hedefleme onaylayın. (A) Üç SSN platformlarda, hedefsiz heterozigot ve homozigot hedeflenen klonlar gösteren Temsilcisi PCR genotipleme sonuçları. WT CTL yabani tip kontrolü =. (B) Repreheterozigot hedeflenen klon ve 3 &#39;dış prob ile tespit edilen bir homozigot hedeflenen klon gösteren silci Southern blot sonuçları. Fragment boyutları: WT-6.5 kb, Düzenlendi-6.9 kb. (C), uygun şekilde düzenlenmiş bir klon ve rastlantısal olmayan çift entegrasyonu ile heterozigot klon gösteren Örnek Southern blot sonuçları. Fragment boyutları:. Düzgün düzenlenmiş-6.9 kb, anormal ek entegrasyon-5 kb <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Çalışma </td><td> Gen hedefli </td><td> Platform </td><td> Onarım şablon türü </td><td> Klonların # aldı </td><td> Hedefleme verimliliği </td></tr><tr><td> Sexton ve diğ., 2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td&gt; <td> bildirilmemiş </td><td> bildirilmemiş </td></tr><tr><td> Sexton ve diğ., 2014 </td><td> TERT </td><td> ZFN </td><td> Higromisin </td><td> bildirilmemiş </td><td> bildirilmemiş </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 31 </td><td> 39.0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 74 </td><td> % 14,9 </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2011 </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 68 </td><td> % 91.0 </td></tr><tr><td> Hockemeyer ve diğ., 2011 </td><td> PITX3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 96 </td><td> % 13,0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ., 2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 139 </td><td> % 94.0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ. &lt;/ em&gt;, 2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 30 </td><td> % 93.0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ., 2015 </td><td> Hcrt </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 154 </td><td> % 92.0 </td></tr><tr><td> Merkle ve diğ., 2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td> Muhabir-Geneticin </td><td> 11 </td><td> % 45.0 </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> bildirilmemiş </td><td> % 30.0 </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Cterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> bildirilmemiş </td><td> % 14.0 </td></tr><tr><td> Soldner ve diğ., 2011 </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td> Puro </td><td> 96 </td><td> % 1.0 </td></tr></tbody></table> Tablo diğer genlerin 1. Tanım Corre olan bu yöntem kullanılarak hedeflenensponding daha önce yayınlanmış çalışmalar alınan verim hedefleme. 4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Locus </td><td> Sekans </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> AAVS1-F astar </td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> PCR koşulları: Tm = 57 ° C, 35 döngü </td></tr><tr><td> AAVS1-WT-R primer </td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> WT bandı: 1273 bp </td></tr><tr><td> AAVS1 Hedefli-R astar </td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td> Hedeflenen bant: 992 bp </td></tr><tr><td> T2-Cas9-rehber </td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td> Mali ve diğ., 2013 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN Sağ </td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-Sol </td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN Sağ </td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2011 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-Sol </td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> Hockemeyer kaynaktan ve diğ., 2011 </td></tr></tbody></table> Astar ve SSN hedef dizilerin Tablo 2. listesi. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Konstrukt Hedefleme </td><td> EGFP + Kolonileri sayısı </td><td> Hedeflenen aldı klonlar (PCR doğrulanmadı) </td><td> (Güney blot) Önceki Bildiren Doğru Hedefleme Verimliliği </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> % 86.9 (% 73.9 het /% 13,0 homo) </td><td> % 56 (% 50 het /% 6 homo) </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> % 91.3 (% 47.8 het /% 39,1 homo) </td><td> % 47 (% 37.5 het /% 9,3 homo) </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> % 95.7 (% 69.5 het / 2% 6,3 homo) </td><td> bildirilmemiş </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Karşılaştırmalı EGFP-pozitif sayılar ve Talen, ZFN hedeflenmiş ve CRISPR / Cas9 insan kök hücre kolonileri. PCR önceki deneylerde 4,5 uygun tek entegrasyonlar doğrulanmış Güney lekesi ile karşılaştırıldığında bu deney için AAVS1 loküsündeki entegrasyonlar doğrulandı.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation at JoVE.com

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K Görüntüleme.  University of California, Berkeley. Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance. 

Video: Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Gelişim Biyolojisi

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Genetik

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Biyoloji

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

içinde Recombinase aracılı Kaset Borsası tarafından Rekombinant insan pluripotent kök hücreleri hızlı ve verimli Nesil<em&gt; AAVS1</em&gt; Odağı

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Tıp

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...