Yazarlar flow sitometri analizi gerçekleştirmek çalışmaya katkıda bulunmak için teşekkürler Dr. Federica Zanzottera istiyoruz.

Etik deyimi: protokolün klinik uygulama hastanın deri otolog doku kullanımını gerektirir çünkü, in vitro karakterizasyonu hasadı, işlenmesi Milli Kuralları yönergeleri izleyerek Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası homolog deri dokusu üzerinde klinik kullanımdan önce gerçekleştirildi ve nakli için dokular (2013 CNT) dağıtılması. Klinik Uygulama için 1. Bio-kompleks Yapı NOT: Bu protokol, klinik Rigeneracons (doku Topu) ve RiGenera Machine (doku Topu sistemi) (Şekil 1A) kullanımına dayanmaktadır. Doku Topu yaklaşık 50 mikronluk bir kesme altıgen bıçaklar ve filtreleme hücreleri ve hücre dışı matris bileşenleri tarafından sunulan bir ızgara ile dokuların küçük parçalar bozmak için mümkün insan dokularının biyolojik, tıbbi bozan bir. <ol><li> Bir bi aracılığıyla hastanın skinsamples toplayınOPSY delme (Şekil 1B) ve otolog mikro greft 6,7,9 elde etmek için her bir parça için tuzlu su çözeltisi 1 ml ilave parçalamak (veya adım 2.1). </li><li> Kollajen sünger mikro greft 1 ml koyun (Şekil 1C) toform biyo-kompleksleri klinik uygulama için kullanılacak. </li><li> Kültür, bir% 5 CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer içinde 37 ° C &#39;de% 10 fetal inek serumu ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi içinde 6 ml mevcudiyetinde kolajen süngeri üzerine mikro greft bir 1 mi. </li><li> Kültür, 3 gün sonra, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile% 0.3 paraformaldehid ile biyo-kompleksleri düzeltin. numune üzerine doğrudan belirli bir dağıtıcı ile parafin dökün. 5 um kalınlığında bir mikrotom ile dilimleri elde edilir ve cam slayt doğrudan koydu. </li><li> 20 mi ksilen (ticari olarak temin - - m-ksilen (40 karışımı -% 65), p-ksilen (% 20), o-ksilen (20% 15 ihtiva eden, histolojik analizler için bir cam içinde 5 um&#39;lik parafin dilim daldırın ) ve ETHil benzen (6-20%) ve 3 dakika her biri için, tolüen, trimetil benzen, fenol, tiyofen, piridin ve hidrojen sülfid) izleri. </li><li> de-paraffinizing ve daha sonra deiyonize su (1 saat, 1 saat için% 80 etanol,% 70 etanol, 1 saat boyunca için 1 saat için% 100 etanol,% 95 etanol), etanol azalan sınıflarda dilimleri (% 100 ila% 70) daldırın ve bölümleri rehidrasyon. </li><li> 1 1 g / L Ematoxylin 2 ml - 1 - ile bölümleri Leke 2 dakika ve daha sonra herhangi bir Ematoxylin fazlası çıkarmak için su ile durulayın. </li><li> etanol% 70 ile karıştırılmış konsantrasyonunun% 1 Eosin Y alkolik çözelti, 5 dakika karıştırıldı ve su içinde seyreltildi - 4 bölümler Leke. </li><li> Her slayt bölümü için Eosin Y 2 ml ve akan musluk suyu altında durulayın - 1 kullanın. </li><li> Etanol sınıflarda artan bölümleri daldırın dayalı bir montaj mediumand 100X büyütme (Şekil 1D) bir ışık mikroskobu altında gözlemlemek bir 1 saat süreyle Ksilen içinde geçit, lamel sonra, nihayet ve (adım 1.6 bakınız). </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Toplama, Ayrıştırma ve Doku Vitro Analizinde <ol><li> Bir dermatom kullanarak, sırasıyla 0,6 mm, 1 mm ya da 4 farklı çoklu organ ve / veya çok bagaj alanından kalınlığı 2 mm bağımsız cilt dokusu, papiller de-epidermized dermis (Ded) ya da retiküler dermis (dermis) almak hasat, işleme ve nakli için doku dağıtımını Milli Kuralları (CNT 2013) takip eden 40 ile 55 yıl arasında değişen bir aralıkta doku bağış. <ol><li> Yavaşça 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde bir çanak koyarak% 0.9 NaCI çözeltisi tüm örnekleri yıkayın. </li><li> 5 mm biyopsi yumruk kullanarak, deri dokusunun, Ded ve Dermisinde çapı muntazam ve ayrıştırma önce tüm doku örneklerinin tartmak örnekleri oluşturmak. </li><li> ayrıştırma için tuzlu su çözeltisi, 1.5 ml ilave doku bozucu deri dokusu, DED sırasında veya dermiş sekiz, üç ya da dört tip numuneler, yerleştirin. </li><li> farklı gerçekleştirinTüm doku örnekleri için ayrıştırma kat, Tablo 1 &#39;de gösterilen. </li><li> kontrol olarak bozulmamış doku örneklerinden elde edilen punch biyopsi bir muhabir numarasını kullanın. </li><li> Mekanik ayrıştırma sonra ayrı ayrı 12 plaka tek bir kuyuda her numune mikro greft ve yeri ihtiva eden tuz çözeltisi aspire. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin. </li><li> Her bir örnek için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotikler ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ekleyin. </li><li> hemen hücre canlılığı değerlendirmek. her bir (sırasıyla deri dokusu, DED veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), bir mikro-greft ihtiva eden 0.5 mg / MTT ml (3- [ihtiva eden ortam 1 ml ilave 4,5- dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolyum bromür) çözeltisi ve CO2 / hava% 5 bir atmosferde 37 ° C de 3 saat inkübe edilir. sağlam kontrolü için aynı protokol gerçekleştirmebiyopsi yumruk. </li><li> İnkübasyondan sonra, her MTT ihtiva eden ortam çıkarın ve 10 dakika süre ile, her bir numune, 1 ml dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. </li><li> bir küvet içinde her bir örnek ve DMSO aktarın ve bir spektrofotometre kullanılarak 570 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) okunmuştur. 570 nm&#39;de absorbans oranı ve ayrıştırma daha önce kullanılan doku gram (gr) ağırlık hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması. bozulmamış kontrol punch biyopsi için aynı protokolü gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Mekanik ayrıştırma sonra, deri dokusu, tek bir vericinin aşınmıştır ve dermis örneklerinden türetilmiş mikro greft ihtiva eden tuzlu su çözeltisi aspire. <ol><li> 12 oyuklu bir plaka, tek bir oyuk ya da sırasıyla, hücre canlılığı testi ve morfolojik analiz için bir kültür şişesi içinde ayrı ayrı örnek yerleştirin. </li><li> % 5 CO2 / AI bir atmosferde 37 ° C &#39;de, 1 ml (12 çukurlu plaka) ya da 5 ml 1640 ortamında% 10 FCS ile takviye edilmiş RPMI (kültür şişesi) ile antibiyotik ilave kültür mikro greft24 saat ya da 7 gün süre ile R. </li><li> 24 saat ya da 7 gün (tekrar 2.1.8-2.1.10 adımlar) sonra hücre canlılığı değerlendirmek. </li><li> 24 saat ve şişe içindeki kültür 7 gün sonra ışık mikroskobu ile hücre süspansiyonu varlığını değerlendiren morfolojik analizi yapın. </li><li> FACS analizi 6 ile CD146, CD34 ve CD45 antijenleri de dahil olmak üzere mezenşimal ve hematopoetik hücre belirteçleri, için pozitiflik için Dermisinde örneklerini analiz edin. </li><li> Laminer akış kapağı tohum altında ve tamamen ayrıştırılmış olup, her doku numunesinde bir muhabir küçük bir parçası (deri dokusu sırasıyla Ded veya dermişi sekiz, üç ya da dört tek tip numuneler aynı anda ayrıştırma ile elde edilir), her mikro-grefti (&gt; büyüklüğü 50 mikron % 5 koyun kanlı Broth 100 ul içeren Columbia agar plaka üzerine parçalanma sürecine sonra). </li><li> Üç gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası ve kısırlık değerlendirmek için Columbia agar plakası üzerinde mikrobiyolojik analizler gerçekleştirmek 11. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).</li><li>Ellis, E., Sinn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+homologous+bone+grafts+in+maxillofacial+surgery.">Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery.</a> J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).</li><li>Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+survival+of+autologous+adipose+tissue+taken+and+transplanted+by+different+techniques.">Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques.</a> Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).</li><li>Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+Autologous+Fat+Transplantation+With+Platelet+Rich+Plasma.">Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma.</a> AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).</li><li>Trovato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Medical+Device+Rigeneracons+Allows+to+Obtain+Viable+Micro-Grafts+from+Mechanical+Disaggregation+of+Human+Tissues.">A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues.</a> J Cell Physiol. , (2015).</li><li>Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Derived+Stem+Cells+and+Growth+Factors+Applied+on+Hair+Transplantation+Follow-Up+of+Clinical+Outcome.">Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome.</a> JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).</li><li>Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Medical+Device,+Based+on+Rigenera+Protocol+in+the+Management+of+Complex+Wounds.">A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds.</a> J Stem Cells Res, Rev &amp; Rep. 1 (3), 3 (2014).</li><li>Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+dental+pulp+stem+cells+in+periodontal+regeneration:+a+case+report.">Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).</li><li>Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+tissue+generation+using+autologous+dental+ligament+micro-grafts:+case+report+with+6+months+follow-up.">Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up.</a> AOMS. 1 (2), 20 (2013).</li><li>Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+lift+tissue+engineering+using+autologous+pulp+micro-grafts:+A+case+report+of+bone+density+evaluation.">Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation.</a> J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).</li><li>Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culture+medium+for+medical+bacteriology.">A new culture medium for medical bacteriology.</a> Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).</li></ol>

Yazar Antonio Graziano üretir ve RiGenera sistemini pazarlayan İnsan Beyin Dalga srl ​​Bilimsel Direktörü. Yazar Letizia Trovato İnsan Beyin Dalga srl ​​Bilimsel Bölümü işbirlikçisi olduğu

Bu ön çalışma. Zaten mikro greftler implantların 9 etkinliğini, 10 optimize etmek için, diğer klinik uygulamalarda bildirilen Bu protokol ile elde edilen mikro greftler, kollajen sünger ile kombine edilebilir olduğunu gösterdi Özellikle, bu çalışma bio kapasitesini bildirdi komplekslerdeki klinik uygulamadan 30 gün sonra, bir bacak lezyon yara iyileşmesi adjuvan, mikro-greft ve kolajen süngeri oluşmuştur. Ayrıca, in vitro sonuçlar hemen mekanik ayrıştırma sonra da 24 saat ve kültür 7 gün sonra her ikisi de kayda değer bir hücre canlılığı sürdürmek, üç farklı deri dokuları ayrıştırmak için bu protokolün etkinliği hakkında kanıtlar sunmaktadır. homojenizasyon bu tür sonra hücre canlılığı bakım geniş manipülasyon kaçınarak, sadece bir adım steril otolog mikro greft halinde elde etmesini sağlar. Bu kanıt uyum içindedirDiğer yeni kağıtları ile hangi in vitro bu protokolün etkinliği periost, kalp atriyum ve göz küresinin 5 lateral rektus kasının biyopsi de dahil olmak üzere dokuların diğer tip, içinde de test edilmiştir. Özellikle, muhtemelen% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş bir ortam kullanılması ile, 7 günlük bir kültürden sonra, aşınmıştır ve dermiş örneklerde artmış hücre canlılığı gözlendi. hücre canlılığı bakım ek olarak, bu sistem, güvenli ve kullanımı kolay ve birkaç dakika içinde örneğin enzimatik hücre izolasyonu için geleneksel yöntemler ile ilgili olarak, mekanik hücre yapılarının bozulmasını önlemek dokuların farklı parçalamak edebilmektedir yürütme daha uzun zamana ihtiyacı sindirim. Ayrıca, bu sistem 50 mikronluk bir cut-off ile hücreleri seçmek mümkün ve bu aralığı içerir çünkü bu yönü, enjektabl mikro greft başarısı dikkate alınarak çok önemlidirBirçok hücre tiplerinde farklılaştırmak ve daha sonra lezyon onarım iyileştirmek mümkün progenitör hücreler. Bu protokol donör konusu da bu mikro-greft alıcı olduğu göz önüne alındığında, bize canlı değil, aynı zamanda otolog mikro greft elde etmek için değil sadece izin verir. otolog mikro greft elde etmek için bu sistemin kapasitesi özellikle olmayan bir otolog Diş Pulp Kök Hücrelerin bu nakli (DPSCs) gösterilmiştir diş hekimliği alanında bildirildi kemik içi defekt periodontal tamir ve atrofik yenilenmesine katkıda bulunan 5,6 maksilla. Yara iyileşmesi sürecini iyileştirmek için bu mikro-greft yeteneği de daha önce cerrahi müdahaleler veya komplikasyonlar 4 sonra karmaşık yaraların tedavisinde bildirildi. otolog ve mikro greft kullanıma hazır kullanımı ile ilgili diğer bir avantaj, deri lezyonları üzerindeki sonraki implant görünümünde, steril koşullar tutmaktadır. Sonuç olarak, bu yazıda anlatılan protokol böyle bu çalışmada belirtilen gibi akut / kronik deri yaraların iyileşmesini geliştirmek için klinik müdahale kullanmak insan mikro greft doku hazır oluşturmak için kapasitesini gösterdi. In vitro sonuçları için olasılığı üzerinde oluşturmak canlı mikro greftler de rapor edilmiştir ve bu parametre doku onarımında başarı yüzdesini arttırmak için kesinlikle önemli olduğunu var. Birlikte ele alındığında, veriler, bu yeni sistem deri yaralarının tedavisi hızlı ve güvenli bir alet ihtiyacı olan klinisyenler için gelecek vaat eden bir araç olarak kabul edilebilir olduğunu göstermiştir. Şu anda, bu özel uygulamada protokolü için özel modifikasyonlar veya sınırlamalara cilt kullanımı kolay bir doku temsil verilen ve diğer çalışmalarda farklı deri lezyonları 6,7 aynı protokolün etkinliğini rapor, yok </&gt; Sup. Biz (kemik rejenerasyonu için veya ülserler tedavi için damar tıp örneğin ortopedi), diğer klinik alanlarda klinik kullanımını doğrulamak için bir konu çok sayıda bu sistemi kullanmak için gelecekte umut.

Son yıllarda, birçok yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonlarında tek adım tedaviler sağlamak amacıyla ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyonlar ve diğer nedenlere bağlı akut ama esas kronik yaraların yönetimi, zorlu kalır. Kronik yaralar sağlık sistemleri, dünya çapında 1 üzerinde çok büyük bir mali yük neden ciddi bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir montaj kanıtlar vardır. deri lezyonlarının tedavisi başarı oranını artırmak için, (hücre geliştirme dahil) geniş bir manipülasyon olmaması ve steril koşullar bakımı hemen hasarlı alan üzerinde uygulanabilen bir hücresel süspansiyon oluşturmak için, gerekli olan Hastalar, böylece bu tür hücre fabrikalarında olarak temiz oda daha uzun bir işlem önler. Stküçük bir deri biyopsisi, öğütme, santrifüjleme ve diğer ayırma yöntemlerinin (örneğin, enzimatik veya mekanik) arasında Arting, sık sık bir büyüme ortamında kültürlenebilir bir hücresel süspansiyon elde etmek için kullanılır. Tüm bu yöntemler, genellikle hücre yapıları vurgulayarak ve hücre canlılığının bir azalmaya yol açan, uygulama, uzun bir süre gerektirir. Bir diğer önemli bir yönü zarar görmüş alanların onarmak, örneğin, klinisyenler tarafından kullanılmak üzere hazır bir otolog hücre süspansiyonu elde etmektir. Ayrıca, iyi otolog doku greftleri sonunda indüksiyon ve iletim 2, 3 ilkeleri ile alıcı sitesine hayatta transfer prosedürleri hayatta olduğu saptanmıştır. İdeal greft dokusu hazır olması ve düşük antigenesiti ve donör saha morbiditesi 4 olmalıdır. Bu delillerden, bu çalışmanın ilk amacı için uygun otolog biyo-kompleksleri oluşturmak oldudoku onarımında klinik uygulama. Bu amaçla, bu protokol ile ayrıştırılmış edildi deri dokulardan başlayarak otolog mikro greft elde etmek için bir yeni bir yöntem tarif. Bir olgu sunumu da burada kollajen sünger ile birlikte bu protokolü tarafından elde edilen otolog mikro greftler bir klinik uygulama olarak tarif edilir. Bu yaklaşım, daha önce insan dokularıyla 5 mekanik ayrıştırma etkili olduğu rapor edilmiştir ve greft ve dermal dokularda 6,7 rejenerasyonu için hem de oral çene cerrahisi 8-10 bağlantı dokularının rejeneratif terapisi için klinik olarak kullanılmaktadır . Buna ek olarak, bu çalışmanın ikinci amacı da bu protokol tarafından kendi ayrıştırma sonrası deri dokuların biyolojik karakterizasyonu oldu. Bu amaçla, cilt dokusuna farklı homolog numuneler farklı çoklu organ gövde alanından türetilmişve / veya çoklu doku bağış Emilia Romagna Bölge Cilt Bankası nakli için dokular (CNT 2013) hasat, işleme Ulusal Kuralları takip eden ve dağıtan işlenmiştir. Olgu Sunumu: Trafik kazası nedeniyle karmaşık bir travma gösteren 35 yaşındaki kadın hasta Ancona Hastanesi Yoğun Bakım Ünitesi&#39;ne yatırıldı. Hastada bir açık yara ve eksternal fiksatör ile stabilize bir bileşik kırık bacak bir enfeksiyon gösterdi. Iki radikal debridman ve yara negatif basınç terapisi (VAC tedavisi) sonra temiz oldu ve periost sağlıklı göründü, biz kurtarma iki ay sonra protokol uygulandı. Bu sistem ile ayrıştırma sonra, elde edilen mikro-greftler, daha sonra lezyon tamir üzerindeki etkinliğini araştırmak için implante edildi kollajen sünger ile biyo-kompleksleri oluşturmak için kullanıldı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="978">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Rigenera Machine</td>
			<td style="width:257px;">Human Brain Wave</td>
			<td style="width:217px;">79210R</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Rigeneracons</td>
			<td style="width:257px;">Human Brain Wave</td>
			<td style="width:217px;">79450S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">MTT</td>
			<td style="width:257px;">Roche Diagnostic GmbH</td>
			<td style="width:217px;">11465007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:245px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:257px;">PBI International</td>
			<td style="width:217px;">733-2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:245px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:257px;">PBI International</td>
			<td style="width:217px;">F 0415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:257px;">Biological Industries PBI</td>
			<td style="width:217px;">03-038-1 &#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:245px;">Antibodies for FACS Analysis</td>
			<td style="width:257px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:217px;">code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349&#160; for CD34-APC&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Columbia agar</td>
			<td style="width:257px;">BioMerieux Company</td>
			<td style="width:217px;">43041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Condress&#174;</td>
			<td style="width:257px;">Abiogen Pharma</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td>collagen sponge used for bio-complexes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">DMSO&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl solution</td>
			<td>Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:257px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue characterization after a new disaggregation method for skin micro-grafts generation

Birkaç yeni yöntemler akut ve kronik deri lezyonları için bir adım tedaviler sağlamak amacıyla, ameliyat sırasında otolog hücre süspansiyonları elde etmek için biyoteknoloji alanında geliştirilmiştir. Ayrıca, travma, diyabet, enfeksiyon ve diğer nedenlere bağlı kronik fakat akut yaraların yönetimi, zorlu kalır. Bu çalışmada, tek bir hastanın cilt dokusuna ve klinik uygulama otolog mikro greft oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, deri, de-epidermized dermis (DED) ve çok-organ ve / veya çok doku donörlerin dermis türetilen cilt dokusuna in vitro biyolojik karakterizasyonu de yapıldı. Bütün dokular bize canlı mikro greft elde etmek için izin, bu yeni protokolün göre ayrıştırılmış bulundu. Özellikle, bu yenilikçi protokol deri lezyonları uygulanacak hazır otolog mikro greftler ve kollajen sünger tarafından bestelenen biyo-kompleksleri oluşturmak mümkün olduğunu bildirdi. CliniBir bacak lezyon otolog biyo-komplekslerinin cal uygulaması da yeniden epitalization süreci ve lezyonun yumuşaklık hem de bir gelişme göstererek, bildirildi. Buna ek olarak, in vitro bir model bu sistem ile, mekanik ayrıştırma sonra hücre canlılığı, kültür kadar yedi (7) gün süre ile uzun süre devam eder gösterdi. Ayrıca ayrıştırma elde edilen hücre havuzu yüksek rejeneratif potansiyeli, doku yenilenmesi ve onarım süreçlerinde önemli bir rol meydana mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinin, oluştuğunu, akış sitometri analizi ile saptanmıştır. Son olarak, Ağar levhalarına kültüre Bu prosedür mikro greft kısırlığı tutar in vitro olarak gösterilmiştir. Özet olarak, klinisyen, uygun bir steril ve en sık görülen biyolojik scaffo tek başına ya da kombinasyon halinde uygulanabilir mikro greft kullanıma hazır tek bir adımda elde etmek için yeni bir reaktif yaklaşım, umut verici bir araç olabilir sonucunalds.

Bu ön çalışmada, ilk hedefimiz kullanıma hazır biyo-kompleksleri üretmek için kolajen gibi bir biyolojik destekle birlikte insan otolog mikro greftler, yeteneğini, araştırmaktır. Bu biyo-kompleksleri, bir hastada yerleştirildi Bir araba kazası (Şekil 2A) yol açtığı bir bacak lezyon ve 30 gün (Şekil 2B) sonra doku onarımı ile ilgili tam bir reepitelizasyon gözlenmiştir. Ayrıca, klinik takip, klinik uygulamaya paralel olarak. 5 aydır (Şekil 2C) sonra hasarlı alanın iyi bir doku ve yumuşaklık gösterdi, in vitro çalışmalar aynı zamanda cilt dokusu gibi farklı deri dokularının hücre canlılığı değerlendirmek için yapılmıştır , Ded ve dermis önce ve bu sistem ile ayrıştırma sonra. Özel olarak, doku, her tür dikkate farklı kalınlık alarak, sekiz eşiğideri dokusu, DED ve derma için tek bir aşamada işlenebilir dört ve üç biyopsiler sırasıyla oluşturulmuştur. Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi biyopsi kurulan sayı daha sonra iyi bir hücre canlılığını korumak için ayrıştırma en iyi durumda belirlemek için biyolojik özelliklerine göre, dört farklı zamanlarda ayrıştırılmış edildi. Doku işlenmesini kaçınılmaz sağlam doku ile karşılaştırıldığında hücre canlılığının bir bozulma neden olmakla birlikte, bu sistem ile yapılan mekanik parçalanma deri, DED ve dermis tüm örneklerde% 30 hücre canlılığının bir ortalama değerini korumak için görünmektedir 22 OD / gr ila 7 OD / gram FO, sağlam doku (Şekil 3B) ile ilgili olarak farklı zamanlarda (Şekil 3A), değerlendirildi (bozulmamış deri dokusunun 92 OD / gr ve 29 OD / gram ayrıştırma sonrası ortalamar bozulmamış ayrıştırma ve nihayet ayrıştırma açısından sağlam dermis) 2.7 OD / gr 16 OD / gr dan saygı ile ded. Bu nedenle, bu ilk sonuçlar, bu sistem, acil ayrıştırma sonra hücre canlılığı kayda değer seviyesini korumak mümkün olduğunu göstermektedir. hücre canlılığı üzerindeki ayrıştırma etkisi de gözlenmiştir 24 saat ya da 7 gün ve değişken sonuçlar için kültürlendi doku örnekleri üzerinde araştırıldı. Özel olarak, cilt dokusu örneklerinde hücre canlılığının esaslı bir değişiklik başlangıç ​​zamanı (T 0) (Şekil 4A) ile karşılaştırıldığında homojenizasyon ve kültür zaman bağımsız olarak gözlenmiştir. Öte yandan, Ded örnekleri azaltılmış canlılığı kültür 24 saat gözlendi ama şaşırtıcı hücre canlılığı 7 günlük bir kültürden (Şekil 4B) sonra restore süresi (t 0) başlayan kıyasla sonra. Benzer sonuçlar, Şekil 4C (dermis örnekleri gözlenmiştir). Her bir numune, yinelenen ve Tablo 2&#39;de gösterilen değerleri değerlendirildi. Hücre canlılığı ile birlikte, Tablo 3&#39;te belirtildiği gibi, bu sonuçlar temelinde, cilt dokusuna üç tip hücre canlılığını korumak için ayrıştırma uygun bir zaman tespit kültürlenmiş hücresel süspansiyon morfolojik kısmı da, tek hücreler, belirleme değerlendirilmiştir doku ayrıştırma 24 saat sonra, orada 7 gün ve deri dokusu ve Ded / dermis örneklerinde lif kalıntıları gözlenmiştir süre sonra (Şekil 5 AB). Buna ek olarak, akış sitometri analizi ile hücre karakterizasyonu ve homojenizasyon sonrasında dermiş numunesinde gerçekleştirildi: endotel hücreleri ve mezenkimal kök hücreleri dahil olmak üzere birçok hücre tipi tarafından oluşan hücre heterojen havuzu (Şekil 6) tespit edilmiştir. Ayrıca, bakteriyel büyüme olmaması i tanımlandı<html> n tüm ayrıştırılmış örnekler vaktinde deneysel prosedür (Şekil 7) steril kanıtlayan, Ağar yemekleri numaralı seribaşı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53579/53579fig1.jpg" /> Şekil 1. Bio-kompleksleri Bina Doku Doku bozucular ile Ardından Ayrıştırılmış. Biyo-kompleksleri kollajen sünger mikro greft birleştirerek elde edildi oldu Hastanın Lezyon Alanı&#39;ndan Derma bir küçük Piece Bozucu Sistemi (A) ve Koleksiyon lezyon onarımı (C) için kullanılacak insan yamalar hazır elde etmek. (D) Hematoksilen &amp; eozin (H &amp; E) boyama temsili biyo-kompleks DMEM ortamında üç gün boyunca kültüre ve mikroskop gözlenen <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53579/53579fig1large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.</a> içerik &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53579/53579fig2.jpg" /> C (Bacak Lezyonu kollajen ve hastadan elde edilen mikro-greft oluşan biyo-Kompleksi Şekil 2. Biyo-Kompleksi uygulama ayağı lezyon (A) uygulanmış ve yara, 30 gün (B) ve 5 ay sonra değerlendirildi ). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53579/53579fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig3.jpg" /> Şekil 3. C ell Canlılık hemen Bozulmamış deri Dokular (B). Cilt bakımından deri Dokuların (A) Üç Türü Farklı Times parçalanma sonra, dört farklı donörlerden elde edilen Ded ve dermis dokular doku disru ile ayrıştırılmış edildiolarak ptors metinde uygun bölümünde göstermektedir. Hücre canlılığı, her doku numunesi için iki kopya halinde yapılan MTT testi ile değerlendirildi. Grafik, her numune için iki kopya halinde yapılan dört ayrı deneyi temsil etmektedir. Sonuçlar optik yoğunluk (OD) ve doku gram (gr) arasındaki oran olarak ifade edilmiştir; standart sapma dokusunun Optik yoğunluğun (OD) ve gram (gr) arasındaki oran hesaplandı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53579/53579fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig4.jpg" /> Cilt Doku (A) Ayrıştırılmış Numunenin Şekil 4. C ell Canlılık Düzeyleri, Ded (B) ve Zaman (T 0) Başlama dermis (C) ve 24 saat ve 7 gün için alt kültürden sonra. Dokular doku ile homojenize edildi indica olarak bozucularMetinde uygun bölümünde te. ayrıştırılmış örnekleri ayrıştırma 24 saat sonra, 7 gün süre ile, daha sonra kültürlendi ve RPMI 1640 ortamında muhafaza,% 5 CO2 / hava atmosferinde 37 ° C &#39;de% 10 fetal bovin serumu ve antibiyotiklerin ile takviye edilmiştir. daha önce tarif edildiği gibi hücre canlılığı MTT ile değerlendirildi. Grafik, tek bir donörden türetilmiş deri dokusu, DED ve dermis her bir örnek için iki kopya halinde yapılan bir deneyin temsilcisidir. Sonuçlar doku Optik yoğunluğun (OD) ve gram (gr) arasındaki oran olarak ifade edilmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53579/53579fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig5.jpg" /> Ayrıştırılmış Cilt Doku Şekil 5. Morfolojik Analizi (A) ve Ded / dermis (B) sonra 24 saat ve Kültü 7 Gün<html> ure. Morfolojik analiz 24 saat ve cilt dokusu ve Ded / dermis dokularda RPMI ortamında varlığında kültür 7 gün sonra ışık mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53579/53579fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53579/53579fig6.jpg" /> Sitometrisi Analizi ile Şekil 6. Hücre Karakterizasyonu. Mekanik ayrıştırma sonra, dermis ile elde edilen mikro greftler kültürde koymak ve 7 gün CD146, CD34 ve CD45 antijenleri de dahil olmak üzere mezenşimal ve hematopoetik hücre belirteci, için pozitiflik için analiz edildikten sonra. Edildi <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53579/53579fig6large.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> les / ftp_upload / 53579 / 53579fig7.jpg &quot;/&gt; Ayrıştırılmış deri dokusu, aşınmıştır ve dermis Örneklerinde Şekil 7. Mikrobiyolojik analizi. Ayrıştırılmış doku örneklerinin küçük fragmanları laminer akış başlığı altında,% 5 koyun kanı (BioMerieux Company) ilave Columbia agar üzerine ekilmiş ve üç gün boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edildi prosedürün sterilite mikrobiyolojik analizi gerçekleştirmek ve değerlendirmek. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53579/53579fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> DOKU ÖRNEKLERİ </td><td> Ayrıştırma TIMES (sn / dk) </td></tr><tr><td> cilt </td><td> 30 sn </td></tr><tr><td></td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> ded </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 10 dakika </td></tr><tr><td> alt deri </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 2 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td></td><td> 10 dakika </td></tr></tbody></table> Cilt ayrıştırılması için kullanılan dört farklı Times Tablo 1. şematik Temsil, Ded ve Deri Dermis. Sekiz, dört ve üç punch biyopsi, Ded ve dermis sırasıyla biyolojik özelliklerine göre, dört farklı zamanlarda ayrıştırılmış bulundu. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="6"> cilt dokusu </td></tr><tr><td colspan="2"> için </td><td colspan="2"> 24 saat </td><td colspan="2"> 7 gün </td></tr><tr><td> 2 </strong&gt; &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 5 &#39; </td></tr><tr><td> 37.1 </td><td> 41,07143 </td><td> 41,07143 </td><td> 65,78571 </td><td> 41,14286 </td><td> 37,42857 </td></tr><tr><td> 35.8 </td><td> 43,82143 </td><td> 36,60714 </td><td> 66.5 </td><td> 41,46429 </td><td> 38,67857 </td></tr><tr><td colspan="6"> ded </td></tr><tr><td colspan="2"> T 0 </td><td colspan="2"> 24 saat </td><td colspan="2"> 7 gün </td></tr><tr><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td&gt; <td> 10 &#39; </td></tr><tr><td> 6,649485 </td><td> 8.237113 </td><td> 5.463918 </td><td> 5.731959 </td><td> 7.835052 </td><td> 7,85567 </td></tr><tr><td> 6,845361 </td><td> 8,360825 </td><td> 5.257732 </td><td> 5.989691 </td><td> 8 </td><td> 7.938144 </td></tr><tr><td colspan="6"> alt deri </td></tr><tr><td colspan="2"> için </td><td colspan="2"> 24 saat </td><td colspan="2"> 7 gün </td></tr><tr><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td> 5 &#39; </td><td> 10 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> 1.690909 </td><td> 2,77193 </td><td> 0.293898 </td><td> 0.786704 </td><td> 2.880952 </td><td> 2.869048 </td></tr><tr><td> 1.736364 </td><td> 2.830409 </td><td> 0.306351 </td><td> 0.814404 </td><td> 2.940476 </td&gt; <td> 2.928571 </td></tr></tbody></table> Bir Biyolojik Replicate OD / gr olarak ifade Değerleri Tablo 2. Range. Deri dokusundan hücre canlılığı değerleri, Ded ve dermis başlangıç ​​zamanı ve belirtilen sürelerde mekanik ayrıştırma sonra değerlendirilir. sonuçlar, bir deney iki kopya halinde yapıldı ve doku optik yoğunluk (OD) ve gram (gr) arasındaki oran olarak ifade temsilidir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> Çarpma zamanının </td></tr><tr><td> cilt dokusu </td><td> 5 dakika </td></tr><tr><td> ded </td><td> 1 dakika </td></tr><tr><td> derma </td><td> 2 dakika </td></tr></tbody></table> Ayrıştırma iyi Zaman Tablo 3. şematik Temsil differe İyi hücre canlılığını korumak içinnt doku örnekleri alındı. Cilt aşınmıştır ve dermis doku örnekleri optimum hücre canlılığı, sırasıyla, ayrıştırma 5, 1 ve 2 dakika sonra.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation at JoVE.com

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur.

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

tissue-characterization-after-new-disaggregation-method-for-skin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

21.5K Görüntüleme.  Burns Centre and Emilia Romagna Regional Skin Bank.  protokol yeni bir yöntem, insan doku ayrıştırmak ve kollajen sünger ile birlikte, deri lezyonlarının tedavisinde kullanıma hazır insan biyo-kompleksleri doğuran otolog mikro greft oluşturmak açıklar. Bundan başka, bu sistem, mekanik ayrıştırma sonra farklı zamanlarda mikro greft hücre canlılığı korur. 

Video: Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, and persistent nerve and muscle impairments after hospital discharge.1-6 Using an explicit protocol with a structured approach to training and quality assurance of research staff, manual muscle testing (MMT) is a highly reliable method for assessing strength, using a standardized clinical examination, for patients following ARDS, and can be completed with mechanically ventilated patients who can tolerate sitting upright in bed and are able to follow two-step commands. 7, 8 
This video demonstrates a protocol for MMT, which has been taught to &ge;43 research staff who have performed &gt;800 assessments on &gt;280 ARDS survivors. Modifications for the bedridden patient are included. Each muscle is tested with specific techniques for positioning, stabilization, resistance, and palpation for each score of the 6-point ordinal Medical Research Council scale.7,9-11 Three upper and three lower extremity muscles are graded in this protocol: shoulder abduction, elbow flexion, wrist extension, hip flexion, knee extension, and ankle dorsiflexion. These muscles were chosen based on the standard approach for evaluating patients for ICU-acquired weakness used in prior publications. 1,2.

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and critical illness frequently develop long-lasting muscle weakness. Manual muscle testing (MMT) is a standardized clinical examination commonly used to measure strength of peripheral skeletal muscle groups. This video demonstrates MMT using the 6-point Medical Research Council scale.

Kritik Hastalarda Uygulanan Manuel Kas Testi: Ekstremite Kas Kuvveti Ölçme Yöntemi

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Tıp

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Tam Kan Stimülasyon Testi kullanarak Pro-inflamatuar sitokin IL-1β Doğru ve Basit Ölçme

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into a &#8216;recipient&#8217; block and then used for a variety of biomarker applications. The construction of conventional TMAs is labor intensive, imprecise, and time-consuming. Here, a protocol using next-generation Tissue Microarrays (ngTMA) is outlined. ngTMA is based on TMA planning and design, digital pathology, and automated tissue microarraying. The protocol is illustrated using an example of 134 metastatic colorectal cancer patients. Histological, statistical and logistical aspects are considered, such as the tissue type, specific histological regions, and cell types for inclusion in the TMA, the number of tissue spots, sample size, statistical analysis, and number of TMA copies. Histological slides for each patient are scanned and uploaded onto a web-based digital platform. There, they are viewed and annotated (marked) using a 0.6-2.0 mm diameter tool, multiple times using various colors to distinguish tissue areas. Donor blocks and 12 &#8216;recipient&#8217; blocks are loaded into the instrument. Digital slides are retrieved and matched to donor block images. Repeated arraying of annotated regions is automatically performed resulting in an ngTMA. In this example, six ngTMAs are planned containing six different tissue types/histological zones. Two copies of the ngTMAs are desired. Three to four slides for each patient are scanned; 3 scan runs are necessary and performed overnight. All slides are annotated; different colors are used to represent the different tissues/zones, namely tumor center, invasion front, tumor/stroma, lymph node metastases, liver metastases, and normal tissue. 17 annotations/case are made; time for annotation is 2-3 min/case. 12 ngTMAs are produced containing 4,556 spots. Arraying time is 15-20 hr. Due to its precision, flexibility and speed, ngTMA is a powerful tool to further improve the quality of TMAs used in clinical and translational research.

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

The protocol aims at optimizing the construction and quality of tissue microarrays for biomarker research. It includes aspects of planning and design, digital pathology, virtual slide annotation, and automated tissue arraying.

Biyomarker Çalışmaları için bir sonraki nesil Doku Mikrodizi (ngTMA) Protokol

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are still occurring, particularly in reconstructive flap surgery. Multiple experimental flap models have been developed to analyze underlying causes and mechanisms and to investigate treatment strategies to prevent ischemic complications. The limiting factor of most models is the lacking possibility to directly and repetitively visualize microvascular architecture and hemodynamics. The goal of the protocol was to present a well-established mouse model affiliating these before mentioned lacking elements. Harder et al. have developed a model of a musculocutaneous flap with a random perfusion pattern that undergoes acute persistent ischemia and results in ~50% necrosis after 10 days if kept untreated. With the aid of intravital epi-fluorescence microscopy, this chamber model allows repetitive visualization of morphology and hemodynamics in different regions of interest over time. Associated processes such as apoptosis, inflammation, microvascular leakage and angiogenesis can be investigated and correlated to immunohistochemical and molecular protein assays. To date, the model has proven feasibility and reproducibility in several published experimental studies investigating the effect of pre-, peri- and postconditioning of ischemically challenged tissue.

The window of the murine dorsal skinfold chamber presented visualizes a zone of acute persistent ischemia of a musculocutaneous flap. Intravital epi-fluorescence microscopy permits for direct and repetitive assessment of the microvasculature and quantification of hemodynamics. Morphologic and hemodynamic results can further be correlated with histological and molecular analyses.

Mouse Dorsal Skinfold Odası&#39;nda İskemik Doku Yaralanması: Bir Cilt Flap Model Akut Kalıcı iskemisi Araştırma

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Bir<em&gt; In Vitro</em&gt; Kemik İliği östrojen duyarlı Meme Kanseri Dormansi Model: Moleküler Mekanizması Çalışmaları ve Hipotez Üretimi için A Takım

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Deri Cerrahi denervasyon: Cilt Hastalıkları Fare modelleri Sinirler için Gereği Test Bir Yöntem

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To obtain subcutaneous adipose tissue biopsies in the abdominal area, researchers and physicians use either a surgical or a needle-based technique. However, surgical subcutaneous fat biopsies can offer tissue samples that may provide a more comprehensive overview of the complexities of biological indices in white adipose tissue. Usually, a surgical adipose tissue biopsy includes a diathermy treatment for cauterizing blood vessels to prevent excessive bleeding. Nevertheless, side effects, such as flash fires and skin lesions in the tissue, have been reported after diathermy. Therefore, we aimed to standardize a surgical abdominal adipose tissue biopsy performed under local anesthesia using a non-diathermy method. We conducted 115 subcutaneous adipose tissue biopsies in healthy men using a non-diathermy abdominal surgical biopsy method. Our results showed three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%).In conclusion, our standardized subcutaneous abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men at the bedside, with minimal side effects.

We standardized an abdominal adipose tissue biopsy using a non-diathermy method performed under local anesthesia. Three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%) occurred.We conclude that an abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men.

Bir teknik subkutan karın yağ doku biyopsisi diyatermi sigara yöntemi ile için

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...