Name: preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods at JoVE.com

Bu çalışma kısmen ERANET + Projeleri LUS BUBBLE ve BI-TRE çerçevesinde Regione Toscana ve Avrupa Topluluğu tarafından desteklenmiştir.

Not: Altın nanoçubuklar tüm konsantrasyonlar, nominal Au molarite cinsinden ifade edilmiştir. diğer eserlerle karşılaştırma için, 1 M Au kabaca bizim durumumuzda, 20 uM altın nanoçubuklar karşılık unutmayın. Katyonik altın nanorods hazırlanması 1. Not:.. Metodu ratto diğ 26 uyarınca Nikoobakht ve arkadaşları 25 tarafından ortaya uyarlanmış protokole göre, askorbik asit HAuCl 4 otokatalitik azaltılması ile setrimonyum bromür (CTAB) -kapaklı altın nanoçubuklar sentezi ile başlar. Daha sonra, bu altın nanorods polietilen glikol kombinasyonu ile, plazma membran daha fazla biyo-uyumluluk ve afinite elde etmek için modifiye edilmiş olan, 10, 11, 27, 28 iplik ve dörtlü amonyum bileşikleri, 22. <ol><li> Bir concentratio 24 mi CTAB-başlıklı altın nanorods saflaştırmakİki santrifüj devir (12.000 xg, 30 dakika) ve boşaltma ile 450 uM Au n. İlk hacmine ölü hacim oranı bu protokoldeki tüm santrifüj adımları için yaklaşık 1/200 veya daha düşük olduğundan emin olun. çamaşır çözeltisi olarak 500 uM, sulu CTAB kullanımı ve son olarak, 500 uM CTAB ve% 0.005 (h / h) polisorbat 20 ihtiva eden, pH 5 ve 6 ml 100 mM asetat tampon içine partiküller aktarırlar. </li><li> 30 ul 10 mM sulu a-metoksi-omega-merkapto-poli (etilen glikol) (MW ~ 5000) ekleyin ve 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca tepkimeye bırakın. </li><li> Dimetil sülfoksit, N, N, N-trimetilamonyum bromür ve 37 ° C&#39;de 24 saat süre ile geri kalanı bırakın - 30 ul 100 mM (11 Mercaptoundecyl) ekleyin. </li><li> Daha sonra, dört adet santrifüj devir (12.000 xg, 30 dakika) ve boşaltma ile bu parçacıkları su içinde 18 mL% 0.005 (h / h) polisorbat 20 ilave edilmesi ve saflaştırılması. Yıkama solüsyonu olarak suda% 0.005 (h / h) polisorbat 20 kullanımı ve son olarak pH 2.4 ml steril PBS içine partikülleri transferi7.4. altın nihai nominal konsantrasyonu 4.5 mM&#39;dir. </li></ol> Altın nanorods ile Fare Makrofagların 2. Yükleme <ol><li> J774a.1 DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 1 mM glutamin, 100 birim / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin gibi kültür ortamı ile takviye edilmiş monosit / makrofajik hücre çizgisi kullanarak. Levha 5 x 10 5 60 mm çapında dört Petri çanağında hücreleri ve ayrılma sırasında alt konfluent edilecek şekilde bunları 24 saat boyunca büyümeye izin (adım 2.2). <ol><li> Protokol boyunca, standart kültür koşulları (37 ° C,% 5 CO2,% 95 hava ve% 100 görece nem) altında hücreleri korumak. hücreleri manipüle etmek için bir laminer akış kabini ve uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın. </li></ol></li><li> 24 saat sonra, kitosan filmlerin içine gömülü katyonik altın nanoçubuklar hücreleri yük ve onları hazırlamak: <ol><li> partiküller hücreler tarafından alınır izin vermek üzere, 4.5 bir kısım ilaveHer bir Petri kabı içine PBS mM Au katyonik altın nanorods, 100 uM Au bir son konsantrasyon elde edecek şekilde. 24 saat inkübasyondan petri tabaklara bırakın. </li><li> Sonra, onların iyi koşullar ve yükleme onaylamak için bir optik mikroskop altında hücreleri gözlemlemek. Hücreler, normal morfoloji ve koyu hücre içi veziküller bir dizi sergilemesi gerekir. Aşağıdaki adımlardan (en az 2 x 10 6 hücre) için bir hücre, uygun bir miktarda elde etmek için, iki Petri tabaklarına gelenler birleştirme bir kazıyıcı hücreleri ayırın ve bir ortadan kaldırmak için bunların (120 xg, 6 dakika) santrifüj katyonik altın nanoçubuklar fazlalığı. Hücresel pelet neredeyse siyah bakmak gerekir. </li><li> 2 ml PBS içinde pelet askıya alma ve bir Bürker odasının kullanılmasıyla hücreleri sayın. Santrifüj 2 x 10 6 hücre (120 xg, 6 dakika) ve oda sıcaklığında on dakika süreyle PBS içinde formaldehid (w / v), 2 ml% 3.6 içindeki pelet tamir ihtiva eden bir süspansiyon. Son olarak, centrifugat bu pelet üç kez yıkayınİyon fiksatif çıkarmak için (120 xg, 6 dakika). yıkama çözeltisi olarak PBS kullanın. </li></ol></li></ol> Kitosan Films içine Makrofagların 3. yerleştirilmesinin Not: kitosan 26, 27, 28 kendine özgü özellikleri, 29 katyonik altın nanoçubuklar ile boyanmış makrofajlar içeren biomimetic hayaletleri üretmek için istismar edilmiştir. Örneğin agaroz gibi hidrojeller ile ilgili olarak, kitosan PA mikroskopi 6 için kritik olan daha kuvvetli ve daha ince olan filmler, sağlar. Bu fantomların imalat mi protokolleri 29, 30, aşağıda belirtilen 30 belirtilen bazı değişikliklerle, 31 uygun olarak gerçekleştirilir. <ol><li> Bir asidifiye (asetik asit ilave edilerek elde edilen pH değeri 4.5) ve yapışkan% 3 Hazırlama düşük molekül ağırlıklı çitosan (w / v) (ortalama MW 120 kDa) çözeltisi, iyice karıştırın ve40 ° C&#39;de 24 saat boyunca homojenize edilmiştir. </li><li> Daha sonra, çitosan solüsyonu 500 ul olan katyonik altın nanorods (2 x 10 6 hücre) içeren fare makrofajları karıştırın. </li><li> , ~ 50 mikron kalınlığında hayaletleri elde 1.91 cm2 polistiren kalıplara karışımından 250 mg dökün ve 24 saat süre ile bir azot akımı altında bırakmak için. Daha sonra, çapraz bağlama uyarmak için, 500 ul 1 M NaOH ile, bu örnekler tedavi ve ultra saf su ve 10 ml ile yıkayın. </li></ol> Foto akustik Dönüşüm stabilitesi 4. Test Not: PA dönüşüm stabilitesi ref 6&#39;da anlatılan ev yapımı kurulum PA deneyler vasıtasıyla incelenmiştir. <ol><li> plaka tabanından ~ 5 mm mesafe tutacak şekilde, bir Petri kutusu içine daldırılmış bir plastik tutucu kullanılması ile, örneğin DI su içinde makrofajlar içeren kitosan film askıya alınması. mikrometrik XY sahneye bu tabak koyduÖrnek pozisyonunu kontrol etmek için. </li><li> 2500 - 400 dalga boyu aralığında YAG lazer: Q-anahtarlı Nd üçüncü harmonik tarafından pompalanan bir optik parametrik osilatörden, örneğin altın nanoçubuklar (uzunlamasına plasmonik bant ile rezonans içinde ~ 5 NSEC darbe süresi ile lazer ışını Odak bir ~ 300 mikron nokta çapı film yüzeyine dik 5 nsaniye nm ve darbe süresi). <ol><li> Ayarlamak için lazer fluens lazer çıkış önünde bir zayıflatıcı yerleştirin ve akıcılık dalgalanmalarını bir enerji metre (örneğin, bir pyroelektrik dedektör) lazer ışınının bölümünü odaklanmak ve izlemek için bir ışın ayırıcı kullanabilirsiniz. Hizalama sırasında mJ / puls başına cm 2 1 ~ altında optik dozu koruyun. Lazer açık olduğunda uygun lazer güvenlik gözlük kullanın. </li></ol></li><li> film yüzeyinin kapalı Petri kabı ~ 2 mm içine ve mikrometrik çeviriler kullanarak kendi konumunu ayarlamak - bir ultrason transdüser (20 MHz 1 frekans aralığını) Dipve dönme aşamaları filmden yayılan PA sinyali maksimize etmek. </li><li> Örnek 6 zarar vermez bir prob fluens F LO belirleyin: <ol><li> 1 mJ / en az 500 atım için puls başına cm 2 civarında bir akıcılığa numunenin rastgele nokta ışın tedavisi. Her darbe, bir osiloskop ile enerji metre ultrason dönüştürücü ve lazer akıcılığa karşılık gelen PA sinyalini kazanır. F LO deneme olarak ortalama dozu adlandırın. </li><li> Darbe sayısının bir fonksiyonu olarak tepe-tepe genlik olarak PA sinyalin şiddetini hesaplayın. Lazer yoğunluk iniş-çıkışlarını dengelemek için amacıyla, K LO deneme kendi akıcılığa oranı için her bir PA sinyalinin genliğini normalleştirmek. nabız sayısının bir fonksiyonu olarak normalize PA yoğunluğunun eğilimi analiz ve zamanla istikrarı doğrulayın. </li><li> Kararsızlığı durumunda tekrar F LO düşük bir değere sahip 4.4.3 4.4.1 adımları <s&gt; deneme kadar. Stabilite kaybı ortaya kadar denge durumunda, yüksek ~% 10 F LO deneme bir değerle tekrarlayın. Istikrarı sağlayan F LO davasının ikinci en yüksek değer olarak prob akıcılık F LO ayarlayın. </li></ol></li><li> Bir şekillendirme eşik fluens ölçün: <ol><li> Numunenin başka bir rasgele nokta seçin ve F LO 500 atım üzerinde bir ortalama PA yoğunluğunu (I LO a) prob. </li><li> F LO daha yüksek bir nominal dozu ayarlamak ve 50 darbe teslim. F exc olarak ortalama dozu adlandırın. </li><li> Bir kez daha F LO 500 atım üzerinde bir ortalama PA yoğunluğunu (I LO b) prob. Oranı R = I LO b / I LO hesaplayın. birlik altında R değeri numunenin optik özelliklerinin geri dönüşü olmayan bir değişim kanıtlar verir. </li><li> filmi taşımak için mikrometrik XY sahne kullanın ve poin değiştirmekrastgele numune t. Tekrarlayın ve çevresinde birlik üstünde, altında R birkaç değerlerini almak üzere, F exc farklı değerlerle 4.5.4 için 4.5.1 adımları. 15 puan makul. </li><li> F exc bir fonksiyonu olarak arsa R ve R istatistiksel belirsizlik ötesinde birinden farklı başladığında değer olarak inci yeniden şekillendirilmesi eşik akıcılık F tespit. 6 </li></ol></li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Tümör ilişkili makrofajlar hedef kavramı kanseri 34, 35, 36 mücadelede güçlü bir kavram olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, bunun yerine kendi imha, bu hücreler kendi tropizm sömürü ile, bir tümör içine altın nanorods getirmek için hücresel araçlar olarak alınırlar. Bu perspektif parçacıkların düşünceli tasarım, hücreler ve karakterizasyonu onların entegrasyonunu gerektirir. Katyonik altın nanoçubuklar yüklü fare makrofaj fotostabilitesi bunların plasmonik birleştirme ve çapraz ısınma kritik değildir olduğunu ima endositik keseler içinde parçacıkların hapsi, zarar vermez bulmuşlardır. Biz PEG teller ve altın nanokürecikler olarak off-rezonans olan şekiller, sıklığı, etrafında (çapları 17 (nm 10 civarında) ve bir termal difüzyon uzunluğu yaklaşık çok sıkı temas içine almak partiküllerin önlemek varsayımında 30 nMsırasıyla plasmonik bağlantı ve çapraz aşırı ısınma, 5 nsaniye) içinde. protokol parçacıkların tasarımında ve Fotostabilitesi araştırılması mevcut yöntemlere göre yenilikçi. Aşama 1 &#39;e göre, altın nanoçubuklar tasarımı Vigderman ve ark., Amonyum bileşikleri endositik vezikülleri içine altın nanoçubuklar büyük bir alımı ve hücre, bir katyonik profili 24 maddeler nüfuz nosyonunu sürücü yeteneğine sahip kuaterner 22 37 ile gözlem birleştiren olabilir bir PEG içinde gömülü 38 kabuk ve kolloidal istikrar ve biyouyumluluk 28 kazanıyor süre, işlevsel kalır. Nitekim 1. adım küçük ve daha ucuz kuaterner amonyum bileşikleri ile hücre delici peptidler değiştirilmesi ile, Yuan ve ark., 38 yöntemini andırıyor. Bu değişikliklerle, katyonik altın nanorods çok fonksiyonlu ve sürdürülebilir. Bu particl yanaes PA görüntüleme için kontrast ajanları olarak tasarlanmıştır, bir PA sonda fonksiyonel özelliklerini test etmek için idealdir. Adım 4&#39;te, bir yeniden şekillendirilmesi eşik tanımının PA dönüşüm stabilitesi ölçümü bilimsel literatürde çerçevesinde benzersiz özellikleri olan, nicel ve tekrarlanabilir. Ayrıca, bu yöntemin PA ekipman kalibrasyon gerektirmez unutmayın. protokol içindeki kritik adım kitosan filmlerin üretimini PA görüntüleme için kontrast ajanları olarak etkinlik açısından, hücresel araçlar incelemek için bulunmaktadır. Kitosan glukozamin ve N-asetil glukosamin artıkları 1,4-glikosidik bağlarla birleştirilen içeren bir doğrusal zincirli biyopolimerdir. Bu gözenek boyutu, gözeneklilik ve mekanik özellikleri, hem de çok yönlülüğü ve beceriklilik Chitosan bazı fizikokimyasal özellikleri, ince filmler veya gözenekli membranlar 2 şeklinde hidrojellerin üretimi için ideal bir seçenek haline getirmektedir9, 39, 40. Ayrıca, kitosan polisakarit omurgası glikozaminoglikanlar yapısal olarak benzer, mühendislik Biomimetic ve hücre destekleyici iskeleler 41 için kullanımı teşvik etmiştir bağ dokuların hücre dışı matrisin ana bileşeni. Genel olarak, kitosan hidrojeller PA testleri için ideal olan bağ dokusu 29, 41, 42, temsili olarak ısı ve elastik modülü gösterir. Bakım uygun kalınlıkta (50 mikron), düşük optik bulanıklık ve iyi homojenlik ile filmler elde etmek için önlemler alınmalıdır. 3. adımda verilen dozlar optimize edilmiştir unutmayın. 3.2 adıma göre çitosan murin makrofaj yapışkan süspansiyonu titizlikle karıştırılmalıdır. Bu talimatlar, bu filmlerin daha önce farklı bir boyutta 6 altın nanoçubuklar PA dönüşüm stabilitesini için kullanılmıştır. Possiprotokol ks değişiklikler, hücre nüfuz maddenin yerine ya da PEG uzunluğu adım 1&#39;de tanımlanan yöntem, örneğin artan iyileştirmeler tabi olabilir 1 ve 2 adımda, katyonik altın nanoçubuklar ve hücresel araç hazırlanmasını içerir vb amacıyla ip kolları, tümörle ilişkili makrofaj fizyolojisi toplanmasındaki engelin en aza indirir. Makrofajlar için spesifik olan ligandların kullanımı, bir seçenek 43 olabilir. Parçacıkların alımını etkileyen diğer parametreler boyutunu ve şeklini 33 ve bunların inorganik kaplama içerir. Örneğin, bir silis kabuk daha sofistike ve daha yabancı madde pahasına, yüksek içselleştirilmesi 44, toplama 17 ve PA istikrar 7 karşı optik istikrar bir arada verebilir. Biz içselleştirme endozomal yolu, 44 ortak etkisi 33, 43 olabilir varsayım <sup&gt; 45. Aşama 2 hücreleri kritik bir incelemesi devam etmektedir ve in vitro ve in vivo olarak, optik kontrast, canlılığı ve kemotaktik aktivite en iyi düzenleme de konsantrasyon ve kuluçkalama süresi açısından plasmonik parçacıkların dozunu ayarlamak gerekebilir. hücreleri ve bizim elimizde ön kanıt morfolojisi düşük sitotoksisite göstermesine rağmen, bu parametrelerin incelenmesi bu çalışmanın kapsamı dışındadır. Başka bir bakış açısı bir vaka ile ayrı ayrı seçilebilir bağışıklık sistemi 46 ve birincil hücre diğer hücrelerle birlikte adım 2 çoğaltmak olacaktır. Nitekim, biz kavramı onların elektrokinetik potansiyeli olan parçacıkların alımı çok yönlü olduğunu modüle spekülasyon. 3. adımda reçete cel korunması ile uyumsuz olduğundan protokol sınırlamaları, sabit hücrelerin yerine, canlı hücreleri kullanma ihtiyacı bulunmaktadırlular mevcudiyetini göstermektedir. Diğer kısıtlamalar optik absorbans ve film foto-yeterli bir kombinasyonu çevirir adım 4.4 bir prob akıcılığa belirlenmesinde yeterli SNR ihtiyacı, ile ilgilidir. Sonuç olarak, yenilikçi bir protokol hazırlamak ve foto akustik görüntüleme için kontrast ajanları olarak uygun olan, hücresel araç fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek için tarif edilmiştir. Bu altın giriş olumsuz yönde foto-etkilemez sıçangil makrofajlara nanorods bulmuşlardır. Mevcut çalışmanın odak noktası kendi canlılığı ve kemotaktik aktivite için özel bir dikkat ile, bu hücrelerin fizyolojisi üzerinde. Gelecekte, bu yöntem, bir optik kontrast ajanlarının farklı çözümler ihtiva eden farklı hücresel araç hazırlanmasını araştırmak için test edilir. PA sonda, in vitro olarak malign hücrelerin optik kontrast ajanlarının hedeflendirilebilme test etmek için hizmet edebilirHücresel araçların kullanımı olmadan.

Geçtiğimiz on yıl içinde, bu tür altın nanoçubuklar, nanoshells ve nanocages gibi çeşitli plasmonik parçacıklar, biyomedikal optik 1, 2, 3, 4 uygulamaları için önemli bir ilgi görmüştür. Standart altın nanokürecikler uymayacak, bu yeni parçacıklar vücuda derin optik penetrasyon ve endojen bileşenler üzerinde 1 yüksek optik kontrast sağlar yakın kızılötesi (NIR) penceresinde yankı. Bu özellik, foto akustik (PA) görüntüleme ve kanser fototermal ablasyonu gibi yenilikçi uygulamalar için ilgi uyandırdı. Ancak, çeşitli konularda bu parçacıkların klinik nüfuz dizginlemek. Örneğin, optik aktivasyonu, 8 aşırı ısınma indükleme ve foto-5, 6, 7 sürücüler daha küresel profilleri karşı işlevsel şekilleri değiştirme eğilimi </sup&gt;, 9. Bilimsel tartışma hakim bir başka konu tümörlerinde sistemik teslim olduğunu. Özellikle, altın nanorods gelişmiş geçirgenliği ve tutma ve malign belirteçlerinin spesifik problar ile konjugasyon kolaylığı göstermek tümörleri yayılmak için ideal boyutları birleştirir. Bu nedenle, kan akışına direkt enjeksiyon için bunların hazırlanması uygun bir şema 10, 11, 12, 13 olarak görülmektedir. Partiküllerin en mononükleer fagosit sisteminin 10, 11, 12 tarafından yakalanan olma ile Bununla birlikte, bu yol, bir problem teşkil etmektedir. Buna ek olarak, başka bir sorun gövdesi 14 boyunca dolaşım sonra parçacıkların, optik ve biyokimyasal stabilitesidir. Parçacıklar kolloidal kararlılık ve agrega kaybetmek, onların plasmonik özellikleri ve ısı transferi dinamikleri plasmonik kavrama 15 muzdarip olabilir, </s&gt; 16, 17 ve yukarı 18 çapraz aşırı ısınma. Daha yakın zamanlarda, tümör ile ilişkili makrofaj tropizminin yararlanmaya kavramı akıllı alternatif 19, 20, 21 olarak ortaya çıkmıştır. Bu hücreler tespit etmek ve yüksek özgüllük ile tümörlerin yayılmak için doğuştan gelen bir yetenek tutun. Bu nedenle, bir perspektif, bir hastadan alınan bu hücreleri izole in vitro altın nanoçubuklar ile onlara yük ve daha sonra teslim sorumlu hücresel araçlar olarak kullanmak amacı ile, hastaya geri enjekte etmek olabilir. Diğer bir avantajı biyolojik arayüz in vitro inşa edilecek, çünkü parçacıkların optik ve biyokimyasal istikrar üzerinde daha fazla kontrol sahibi olacaktır. Yine, optik kontrast ajanları olarak bu hücresel araçların performansları kritik bir ihtiyaç analizi. Bu çalışmada, hazırlık ve cellul kritik sorunlar anlatılmaktadırkanser PA görüntüleme altın nanorods AR içeren araçlar. PEG&#39;lenmiş altın nanorods plazma membranları 23, 24 ile etkileşimi teşvik etmek için beklenen bir katyonik profilini elde etmek için, dördüncü derece amonyum bileşikleri 22 ile modifiye edilmiştir. Bu parçacıklar, umarım onların biyolojik fonksiyonları ile çok engel olmadan, en hücresel türlü verimli ve belirsiz alımını tabi. Murin makrofajlar kadar sıkı endositik veziküller içinde sınırlı hale hücre başına kadar 000, 200 gibi katyonik altın nanoçubuklar e yüklenir. Bu yapılandırma nedeniyle bu veziküller içinde plasmonik bağlantı ve çapraz aşırı ısınma tehdidi, endişe ortaya olmalıdır. Bu nedenle, makrofajlar parçacıkların PA dönüşüm stabilitesi en endositik vesiküller büyüme ortamından transfer muhafaza olduğunu doğrulamak için, biyolojik dokuların taklit biyopolimer hidrojeller gömülür. effective ölçüm kriterleri PA görüntüleme için acil ilgi koşullarında PA dönüşüm istikrarı ölçmek amacıyla dışarı işlenmiştir. Şekillendirme eşiği 10 Hz tipik tekrarlama oranı 50 lazer puls dizileri sonra optik instabilite ait başlangıç ​​ayarlanır. Biz bu sonuçları tümörlere plasmonik parçacıklar sunmak için yeni stratejilerin geliştirilmesi için ivme sağlayabilir eminiz.

<table><tbody><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Gold(III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Silver nitrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>To synthesize gold nanorods</td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>To synthesize gold nanoseeds</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da.</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>To PEGylate gold nanorods</td></tr><tr><td>(11-Mercaptoundecyl)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-trimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>To solubilize (11-mercaptoundecyl)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-trimethylammonium bromide</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>To centrifuge PEGylated gold nanorods</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Monocyte/macrophage murine cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>To be added to cell culture medium</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Cell culture dish</td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>To detach cells</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>To fix cells</td></tr><tr><td>Chitosan, low molecular weight</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da.</td></tr><tr><td>Sodium hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td></tr><tr><td>Polystyrene cell culture plates</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td></tr><tr><td>Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td><td>Continuum, Santa Clara, USA</td><td>Surelite OPO plus</td><td>Source of optical excitation for photoacoustic tests</td></tr><tr><td>Pyroelectric detector&amp;nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Canada</td><td>QE8SP</td><td>To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td></tr><tr><td>Pre amplified needle hydrophone</td><td>Precision Acoustic, Dorset, UK</td><td>Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td><td>To measure photoacoustic signals</td></tr></tbody></table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

Altın nanorods, tümörlere eve yakın kızıl ötesi pencere, düşük sitotoksisite ve potansiyeline yönelik yoğun optik absorbans sayesinde bu tür fototermal ablasyon ve kanser foto akustik görüntüleme gibi biyomedikal uygulamalarda, bir dizi için caziptir. Ancak, tümörlere onların teslim hala bir sorun olmaya devam etmektedir. Yenilikçi bir yaklaşım, in vitro olarak, altın nanoçubuklar ile yüklenebilir tümörle ilişkili makrofaj tropizm yararlanılmasının oluşur. Burada, hazırlık ve altın nanorods içeren hücresel araçların foto akustik muayene açıklar. PEG&#39;lenmiş altın nanorods bir katyonik profilini elde etmek için, dördüncü derece amonyum bileşikleri ile modifiye edilir. Sıradan Petri tabaklarında sıçangil makrofaj ile temas, bu parçacıklar endositik vezikülleri içine büyük alımını uğradıkları bulunmuştur. Daha sonra, bu hücreler, doğrulamak için kullanılır biyopolimer hidrojeller, gömülü olduğu foto akustik dönüşüm stabilitesiparçacıkların hücre araç içine dahil edilmesi de muhafaza edilir. Biz bu sonuçları tümörlere plasmonik parçacıklar sunmak için yeni stratejilerin geliştirilmesi için yeni ilham sağlayabilir eminiz.

Burada, kanser PA görüntüleme için altın nanorods içeren hücresel araçların fizibilite protokolü tipik sonuçları ile birlikte gösterilmiştir. Şekil 1 &#39;de TEM resim 2. adımda parçacıkların ve TEM görüntüleme için hücrelerin hazırlanması başka 17 anlatılan sonra, adım 1 sonra parçacıkların ve hücresel araç normal görünümünü gösterir. Katyonik altın nanorods normal morfoloji korumak makrofajlarda büyük bir birikimi, tabi. Parçacıklar sıkı endositik veziküller içinde sınırlı olduğu tespit edilmiştir. Şekil 2a, katyonik altın nanorods içeren makrofajların bir optik iletim görüntüyü gösterir ve mikrograftaki gösterdiği gibi 3. adımdan sonra bir çitosan hayali olarak dağılmış, çitosan hidrojel dahil edilmesi değilffect hücresel morfoloji. Hücreler, numune boyunca dağıtılır. Hücreleri olmadan altın nanorods ihtiva eden kitosan filmlerin kontrol eder olan homojen. Şekil 2b, parçacıklar önceki çalışmaları 14, 32 ile uyumlu olarak, makrofajlar tarafından alınır, altın nanoçubuklar tipik plasmonik bandı muhafaza edildiğini göstermektedir. Bu nedenle, bu tür endositik veziküller içinde ayrışma ve dağılımlı bir kolloid 28 arada farklı boyut ve şekli ile parçacıkların bir diferansiyel alımı üzerinde plasmonik bağlantı olarak etkiler, 33. Bu protokollerin önemli bir rol oynamaktadır 2b de chitosanın fizibilitesini kanıtlamaktadır Şekil yok optik fantom olarak. Şekil 3, Adım 4&#39;e göre ölçülen F exc bir fonksiyonu olarak R eğiliminde olduğu ve unsurlar için gerekli olan verileri ve analiz bir fikir verirAdım 4.5.5 uyarınca F th e. F TH (11 ± 1) mJ / bu örnekte cm2 olduğu bulunmuştur. Hücresel araçlardan PA dönüşüm istikrar soruşturma için yüksek oranda doğruluk sağlar birkaç mJ / cm2, 500 atım üzerinde ortalama zaman bu numune üzerinde PA ölçümleri 20&#39;den büyük gürültü oranı (SNR) sinyal ile sinyaller verdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53328/53328fig1.jpg" /> Şekil 1. Katyonik altın nanorods ve makrofajlar karakterizasyonu: olarak sentezlenmiş altın nanoçubuklar arasında (650 x 500) mil 2 TEM görüntüsü, b, c ve d., Sırasıyla (13 x 8.6) 2 um (2.3 x 1.7) mikron 2 ve katyonik altın nanoçubuklar ile tedavi makrofajların (870 × 650) nm 2 TEM görüntüleri. görünümünüPanel d parçacıklar hücrede kendi eğim etkilenir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53328/53328fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53328/53328fig2.jpg" /> Şekil 2. Kitosan Film karakterizasyonu. Katyonik altın nanorods içeren makrofajların optik iletim görüntü ve kitosan fantom dağılmış b:. Kitosan hücreler olmadan altın nanorods içeren fantomlardan (katı siyah çizgi, kontrol numunesi) ve altın içeren makrofajların Optik söndürme spektrumları nanorods (kırmızı çizgi kırık). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53328/53328fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> &lt;img alt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53328 / 53328fig3highres.jpg&quot; width = &quot;350&quot; /&gt; Şekil 3. Hücresel araçlar fotostabilite. Sonra ve her F exc karşı F exc de ışınlama önce alınan I LO yoğunlukları oranı R. Hata çubukları F LO sinyal dalgalanmalardan kaynaklanmaktadır. R birlik altına düştüğü şekillendirme eşiği bu veriler elde edilir. Kırmızı düz çizgi göz için bir rehber olarak hizmet vermektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53328/53328fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods at JoVE.com

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Altın nanorods İçeren Hücresel Araçların Hazırlama ve foto akustik Analizi

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

preparation-photoacoustic-analysis-cellular-vehicles-containing-gold

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K Görüntüleme.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Video: Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gümüş Tohum aracılığı Büyüme Yöntemi ile Altın Nanostar Sentezi

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Biyomühendislik

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like oligomeric clusters of these yellow nanoparticles of narrow size distribution are synthesized under ambient conditions via two methods. The delay-time method controls the number of subunits in the oligoclusters by varying the time between the addition of HAuCl4 to alkaline solution and the subsequent addition of reducing agent, NaSCN. The yellow oligoclusters produced range in size from ~3 to ~25 nm. This size range can be further extended by an add-on method utilizing hydroxylated gold chloride (Na+[Au(OH4-x)Clx]-) to auto-catalytically increase the number of subunits in the as-synthesized oligocluster nanoparticles, providing a total range of 3 nm to 70 nm. The crude oligocluster preparations display narrow size distributions and do not require further fractionation for most purposes. The oligoclusters formed can be concentrated &#62;300 fold without aggregation and the crude reaction mixtures remain stable for weeks without further processing. Because these oligomeric clusters can be concentrated before derivatization they allow expensive derivatizing agents to be used economically. In addition, we present two models by which predictions of particle size can be made with great accuracy.

We describe a simple method for producing highly stable oligomeric clusters of gold nanoparticles via the reduction of chloroauric acid (HAuCl4) with sodium thiocyanate (NaSCN). The oligoclusters have a narrow size distribution and can be produced with a wide range of sizes and surface coats.

Ortam Koşullarında Altın Nanopartiküller Kararlı Oligomerik Kümeleri Boyut Kontrollü Sentezi için Basit Bir Yöntem

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Kimya

Hydroquinone Based Synthesis of Gold Nanorods

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the synthetic methods for the preparation of gold nanorods are still not fully optimized. In this paper we describe a new, highly efficient, two-step protocol based on the use of hydroquinone as a mild reducing agent. Our approach allows the preparation of nanorods with a good control of size and aspect ratio (AR) simply by varying the amount of hexadecyl trimethylammonium bromide (CTAB) and silver ions (Ag+) present in the "growth solution". By using this method, it is possible to markedly reduce the amount of CTAB, an expensive and cytotoxic reagent, necessary to obtain the elongated shape. Gold nanorods with an aspect ratio of about 3 can be obtained in the presence of just 50 mM of CTAB (versus 100 mM used in the standard protocol based on the use of ascorbic acid), while shorter gold nanorods are obtained using a concentration as low as 10 mM.

This paper describes a protocol for the synthesis of gold nanorods, based on the use of hydroquinone as reducing agent, plus the different mechanisms for controlling their size and aspect ratio.

Altın nanorods hidrokinon Esaslı Sentezi

Gold nanorods are an important kind of nanoparticles characterized by peculiar plasmonic properties. Despite their widespread use in nanotechnology, the ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Hücre-malzeme Etkileşim Araştırmalar Nanogözenekli Altın Patterns mikroimalat

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Construction and Operation of a Light-driven Gold Nanorod Rotary Motor System

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and artificial nanomotors and may provide new routes towards single cell analysis, studies of non-equilibrium thermodynamics, and mechanical actuation of nanoscale systems. A facile way to drive rotation is to use focused circularly polarized laser light in optical tweezers. Using this approach, metallic nanoparticles can be operated as highly efficient scattering-driven rotary motors spinning at unprecedented rotation frequencies in water.
In this protocol, we outline the construction and operation of circularly-polarized optical tweezers for nanoparticle rotation and describe the instrumentation needed for recording the Brownian dynamics and Rayleigh scattering of the trapped particle. The rotational motion and the scattering spectra provides independent information on the properties of the nanoparticle and its immediate environment. The experimental platform has proven useful as a nanoscopic gauge of viscosity and local temperature, for tracking morphological changes of nanorods and molecular coatings, and as a transducer and probe of photothermal and thermodynamic processes.

Plasmonic gold nanorods can be trapped in liquids and rotated at kHz frequencies using circularly-polarized optical tweezers. Introducing tools for Brownian dynamics analysis and light scatteringspectroscopy leads to a powerful system for research and application in numerous fields of science.

İnşaat ve ışık tahrik altın Nanorod Rotary Motor sistemi

The possibility to generate and measure rotation and torque at the nanoscale is of fundamental interest to the study and application of biological and ...

Mühendislik

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and provides a theoretical basis for the rational design of nano-medicine delivery. Single particle tracking (SPT) analysis could probe the position and orientation of individual nanoparticles on cell membrane, and reveal their translational and rotational states. Here, we show how to use traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on live cell membrane. We also show how to extract the location and orientation of AuNRs using ImageJ and MATLAB, and how to characterize the diffusive states of AuNRs. Statistical analysis of hundreds of particles show that single AuNRs perform Brownian motion on the surface of U87 MG cell membrane. However, individual long trajectory analysis shows that AuNRs have two distinctly different types of motion states on the membrane, namely long-range transport and limited-area confinement. Our SPT methods can be potentially used to study the surface or intracellular particle diffusion in different biological cells and can become a powerful tool for investigations of complex cellular mechanisms.

Here, we show the use of traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on cell membrane. The location and orientation of single AuNRs are detected using ImageJ and MATLAB, and the diffusive states of AuNRs are characterized by single particle tracking analysis.

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Biyokimya

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Darbe Lazer Tahrik olma üzerine Altın Nanopartikül Entegre Fotoğraf duyarlı lipozomlar ve Bunların Mikro-kabarcık Kavitasyon Ölçülmesi Sentezi

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Altın Nöronal Hücrelerde optik Uyarım Nanorod destekli

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Nörobilim

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Biyolojik Uygulamalar için Yakın Kızılötesi Yayan Altın Nanokümelerin Sentezi

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Protein Lokalizasyon Analizi için Altın Nanopartiküllerin Doğrudan Sentezi

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various physiological or pathological processes in all living organisms. Therefore, the development of clonable tags that can be used as electron microscopy probes is of great value, just as fluorescent proteins have played a crucial role in the field of optical imaging. The autonucleation suppression mechanism (ANSM) was recently uncovered, which allows for the specific synthesis of gold nanoparticles (AuNPs) on cysteine-rich tags, such as metallothionein (MT) and antifreeze protein (AFP).
Based on the ANSM, an electron microscopy labeling technology was developed, which enables the specific detection of tagged proteins in prokaryotic and eukaryotic cells with an unprecedented labeling efficiency. This study illustrates a protocol for the detection of MTn (an engineered MT variant lacking aldehyde-reactive residues) fusion proteins in mammalian cells with well-preserved ultrastructure. In this protocol, high-pressure freezing and freeze-substitution fixation were performed using non-aldehyde fixatives (such as tannic acid, uranyl acetate) to preserve near-native ultrastructure and avoid damage to the tag activity caused by aldehyde crosslinking.
A simple one-step rehydration was used prior to the ANSM-based AuNP synthesis. The results showed that the tagged proteins targeted various organelles, including the membranes and the lumen of the endoplasmic reticulum (ER), and mitochondrial matrices were detected with high efficiency and specificity. This research provides biologists with a robust protocol to address an enormous range of biological questions at the single-molecule level in cellular ultrastructural contexts.

Yazar Spotlight: İyi Korunmuş Ultrastructure ile Protein Lokalizasyon Analizi için Hücrelerde EM-Görünür Altın Nanopartiküllerin Doğrudan Sentezi  

The present protocol describes a clonable electron microscopy labeling technology for detecting metallothionein-tagged proteins in cells using a novel autonucleation suppression mechanism-based gold nanoparticle synthesis technique.