We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.

Aşağıda açıklanan tüm prosedürler gözden geçirilecek ve Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi tarafından onaylanmış ve steril koşullar altında yapılmıştır oylandı. Ateşböceği Lusiferaz ifade Reporter GL261 1. Hücre modifikasyonu Not: HİV-1 tabanlı bir lentiviral vektörler dalak odaklama oluşturucu virüsü (SFFV) promoterinin kontrolü altında ateşböceği lusiferaz (Fluc) ifade etmektedir. Optik haberci gen vektör plasmidinin pHRSIN-CSGW-dlNotI içine klonlanmıştır. <ol><li> 95 ihtiva eden nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş RPMI ortamında% 10 fetal bovin serumu (FBS) ve GL261 hücreleri ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 293-T hücrelerini korumak % hava ve% 5 karbon dioksit (CO2). </li><li> 293-T hücre kültürü, bir T-75 balon içinde% 80 konfluent ulaştığında, pH ile bir kez yıkama hücreleriosphate tamponlu salin Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın (PBS), bir şişe, hafif eğik tutarak, 5 ml pipet ile 5 dakika, öğüterek 37 ° C&#39;de tripsin (% 0.05) ve 3 ml hücreleri inkübe ve hücreleri toplamak şişenin tabanından. 15 ml konik bir tüp içine tripsinize hücre süspansiyonu 3 ml transferi ve eti RPMI ortamı (hücre süspansiyonu, 10 ml toplam), 7 ilave edin. </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipetten iyi bir hücre süspansiyonu karıştırın. Tüp hücre süspansiyonu 100 ul alın ve hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Bunu yapmak için, tripan mavisi çözeltisi 300 ul hücre süspansiyonu 100 ul karıştırın ve bir hemositometrede karışımın içine 2 ul yerleştirin. Mikroskop altında dört ayrı görünümler mavi lekelenme olmadan hücrelerin sayısını. Bu sayı 10 4 hücre / ml temsil gibi her görünümden hücre sayısını ortalama. </li><li> Bu arada, 30 ° C&#39;de bir hücre süspansiyonu ihtiva eden tüp santrifüj7 dakika için 0 xg. Ortamı aspire ve 1.0 x 10 6 / ml yoğunlukta GL261 hücre süspansiyonu yapmak için taze RPMI ortam maddesi ile hücre pelletleri tekrar süspansiyon. 27,5 ml DMEM (gün 1), bir T-175 şişesi içine RPMI ortamı 2,5 ml tohum 2.5 x 10 6 GL261 hücreleri. </li><li> 24 saat sonra, 20 ml taze DMEM (gün 2) ile orta değiştirin. </li><li> , Lentiviral vektör üretmek 5 dakika boyunca 2 ml serum serbest DMEM ile 54 ul transfeksiyon ayıracı karıştırmak için. Transfeksiyon reaktifi ile DMEM içinde Fluc (pSIN-Fluc) 3 gag-pol ug, veziküler stomatit virüsü G zarf (VSV-G) 3 ug ve 4.5 ug ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. 293-T şişeye (T-175), içine tüm bir DNA karışımı damla ve 48 saat (Gün 2)% 95 hava ve% 5 CO2 içeren nemli bir oda içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (3 gün) (yaklaşık 30 ml olmalıdır 293-T hücre kültür ortamında toplam hacmine) transfeksiyon sonrası 24 saat sonra, taze DMEM 10 ml ekleyin. </li><li> Bir içine GL261 hücreleri bölmek için24-çukurlu plaka, hafif eğik bir balon tutarak, 5 ml pipet ile 5 dakika, öğüterek 37 ° C&#39;de tripsin (% 0.05) ve 5 ml hücreleri inkübe Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın PBS ile bir kez yıkama hücreleri , şişenin dibine kadar tüm hücreleri toplamak ve adım 1.2 gibi hemasitometre yoluyla hücreleri saymak. Bu arada, 7 dakika boyunca 300 xg&#39;de tüp santrifüj. Ortamı aspire ve 2.5 x 10 4 / ml yoğunlukta GL261 hücre süspansiyonu yapmak için taze RPMI ortam maddesi ile hücre pelletleri tekrar süspansiyon. Tohum 24 oyuklu bir plaka içerisinde RPMI ortam 1 ​​ml (3 gün) 2.5 x 10 4 GL261 hücreleri. </li><li> 48 saat aşağıdaki transfeksiyonu 293-T şişesi (T-175) 10 ml pipet ile lentiviral süpernatant 30 ml toplayın ve 50 ml konik tüp içine süpernatant aktarın. Aspire 30 ml lentiviral 0.22 um&#39;lik bir şırınga filtreden geçirilerek 50 ml şırınga ile yüzer madde, ve 1 ml alikotları (gün 4), viral supernatant kısım. </li><li> R 1 ml değiştirinLentiviral süpernatan 1 ml ile GL261 hücre plakasına (24-çukurlu) PMI ortamı nemli bir bölmede (gün 4), 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Lentiviral enfeksiyonun 48 saat sonra, taze, RPMI 1 ml (gün 6) ile orta değiştirin. </li><li> 24 saat sonra, GL261 hücreleri (gün 7) lentiviral enfeksiyonu tekrarlanır. </li><li> Lentiviral enfeksiyonun 2. 48 saat sonra, taze, RPMI 1 ml (gün 9) ile orta değiştirin. </li><li> (GL261.luc hücreleri olarak ifade edilecek olan), lusiferaz değiştirilmiş GL261 hücrelerin büyümesine ve T-75 balonuna hücre kültürü genişletmek için devam edin. </li><li> GL261.luc hücre kültürü, bir T-75 balon içinde% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, tripsinizasyon ile hücreler hasat ve adım 1.2 olarak hemositometre ile sayılır. Mezun yoğunluklarda bir 24-yuvalı plaka içine GL261.luc hücre plakası (1.0 x 10 6 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 hücre / çukur) ve Bir humidi 37 ° C&#39;de inkübe3 saat boyunca bir% 95 hava ve% 5 CO2 içeren ğı odası. </li><li> Hücresel lusiferaz aktiviteye ölçün biyolüminesans görüntüleme (Şekil 1) kullanılarak, U-87 MG (U87.luc) hücreler modifiye edilmiş lusiferaz için. <ol><li> Görüntü yazılımı başlatın (masaüstünde simgesini tıklatın) ve görüntüleme sistemi başlatmak (tıklayın lütfen &quot;Başlatma&quot;). Başlatma otomatik olarak başlayacak ve sistem check-up ve -90 ° C&#39;ye kadar soğumasını kamera için birkaç dakika sürebilir. </li><li> Her kuyuya 25 ul luciferase (D-Lusiferin, potasyum tuzu, 150 mg / kg) ekleyin. </li><li> 10 sn için plaka, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca luciferase ve görüntü kuluçkaya bırakılır. Görüntüleme sistemi kurmak için, &quot;Lüminesans&quot;, &quot;10 sn&quot; maruz kalma süresi ve &quot;Orta&quot; binning seçin. Görüntüleme istasyonunda 24-plaka koyun ve görüntüyü başlatmak için &quot;Acquire&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> Görüntü başarıyla elde edildikten sonra, bir görüntü penceresi ve takım pa göreceksinizEkranda lette. &quot;ROI (ilgilenilen bölgeleri) Araçlar&quot; ı tıklayın ve yarık simgesinden 6 x 4 seçeneğini belirleyin. 24 plaka görüntü üzerinde sinyal alanı kapsayacak ve ölçümler sekmesini (kalem simgesi) tıklayın 6 x 4 yırtmaçlı oluşturun. Cm kare (fotonlar / sn / / sr cm2) başına steradyan&#39;dır saniyede fotonların birimi olarak ROI ölçümleri bir tablo ile bir pencere gözlemleyin. </li><li> Kullanım U87.luc hücreleri, daha önce kalıt GL261.luc hücrelerde lusiferaz aktivitesinin değerlendirilmesi için bir kontrol olarak, GL261 modifikasyonu 11 burada kullanılan aynı lentivirüs ile değiştiirlmiştir. </li></ol></li></ol> In Vitro Proliferasyon Tahlili 2. <ol><li> GL261 ve GL261.luc hücre kültürleri, bir T-75 balon içinde% 70 ortak akışkanlığa ulaştığında, tripsinizasyon ile hücre çizgileri, her iki hasat ve aşama 1.2&#39;de olarak kabul ve 1500 hücre yoğunluğunda bir 96-çukurlu plaka içinde plaka hücreleri iyi zaman ve pipetleme hataları en aza indirmek için çok kanallı pipet kullanarak başına RPMI ortamında 80 ul. Seed 20 kuyu toplam içine her bir hücre çizgisi. Hücreler tarafından doldurulan kuyularda buharlaşma sınırlamak için taze RPMI ortamında 100 ul ile boş kuyu doldurun. </li><li> Kolorimetrik hücre çoğalma analizi kullanılarak hücre çoğalmasını değerlendirin. Burada MTS hücre proliferasyon deneyi kullanmaktadır. Bir çok kanallı pipet kullanarak, hücreleri içeren 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, MTS reaktifi 20 ul ekle. </li><li> 3 saat boyunca bir% 95 hava ve% 5 CO2 içeren nemli bir oda içinde 37 ° C &#39;de plaka inkübe edin. Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak 490 nm&#39;de absorbansı ölçülür. Bu kaplama sonrası, 7 gün 1, 2, 4 tekrarlanan, ve. Absorbans değerlerini normalize etmek için, her gün değerleri günde 1 (Şekil 2) elde edilen karşılık gelen okumaları ile bölünür. </li></ol> 3. Tümör Hücre İmplantasyonu Not: Tüm ekipman Otoklav. Bir dezenfektan (% 2 klorheksidin solüsyonu) püskürtülerek cerrahi alan hazırlayın ve absorben ile kapakt perdeler. Steril koşullar korumak ameliyat sırasında steril cerrahi eldiven giyin ve renk bantla iki bölüme cerrahi alan bölmek için. Alan 1 &quot;Temiz&quot; etiketli ve sterilize malzemeleri içerir; Alan 2 &quot;Kirli&quot; etiketli ve malzemeler kullanılır içerir. <ol><li> Hayvan Ameliyat öncesinde, intrakranyal enjeksiyon için bir hücre süspansiyonu hazırlamak. % 70 birbirine bağlı T-75 şişe tripsinizasyon ile ve adım 1.2 olarak hemasitometre ile hücre sayımı ve Ca2 + olmadan Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi içinde 1.0 x 10 5 hücre / ul bir yoğunlukta bir hücrelik bir süspansiyon hazırlamak ve Hasat hücreleri Mg + 2 (HBSS). </li><li> % 0.9 salin içinde ksilazin ketamin 100 mg / kg ve 10 mg / kg ihtiva eden 200 ul karışımın peritoneal içi enjekte olan fareler anestezi. Uygun anesthetization onaylamak için, farenin ayak tutam. Fare tamamen anestezi altında, fare uyarıcıya cevap olmamalıdır. </li><li> 0.1 m yönetmederi altı enjeksiyon yoluyla g / kg buprenorfın post-operatif ağrı gidermek için. </li><li> % 2 klorheksidin solüsyonu batırılmış bir pamuk uçlu aplikatör ile makası ve temiz kullanan hayvanların başının üst Tıraş. Ameliyat sırasında yeterli yağlama sağlamak için göz merhemi sürün. </li><li> Steril bir neşter kullanılarak parieto-oksipital kemiğin üzerinde yaklaşık 1 cm uzunluğunda sagittal bir kesi yapılmalıdır. Bregma görselleştirmek için,% 3 hidrojen peroksit çözeltisi batırılmış bir pamuk uçlu aplikatör ile kafatası yüzeyi silin. </li><li> Bregma sağ ve sadece koronal sütür arkasında küçük bir delik 3 mm yapmak için steril 25-G iğne ile kafatası delin. </li><li> Intrakranial enjeksiyon sahası kafatası 3 mm&#39;lik bir derinliğe kadar olduğundan emin olmak için, makas kullanılarak 20 ul pipet ucu sivri ucunda 3 mm kesilmiş ve pipet bir şırınga içine yerleştirin. </li><li> Önceden oluşturulan deliğe dik şırınga takın ve yavaşça tümör hücresi enjekte sus1 dakikalık bir süre boyunca 3 ul HBSS 3.0 x 10 5 hücreleri içeren emeklilik. Bir dakika yerinde iğne bırakın ve sonra yavaşça iğneyi çekin. </li><li> % 3 hidrojen peroksit batırılmış pamuk uçlu aplikatörü ve% 2 klorheksidin çözeltisi ile kafatası bez. Pamuk uçlu aplikatör ile kafatası yüzeyi kurulayın. Boyutunda 3 yaklaşık 3 mm steril kemik mum kesip ve pamuk uçlu aplikatörü uç tarafındaki kemik mumu takın. Pamuk uçlu aplikatör ile deliği örtmek için kemik mumu uygulayın. </li><li> Forseps kullanarak kafatası üzerinde birlikte kafa derisinde her tarafını çizin ve zımba yarayı kapatmak için. % 2 klorheksidin solüsyonu batırılmış bir pamuk uçlu yara temizleyin. </li><li> Onlar ayakta hale gelene kadar ameliyat sonrası tüm fareleri Monitör ve normal aktiviteye saklayın. Tipik olarak, iyileşme süresi yaklaşık 30 dakikadır. Tam anestezi kurtarıldı kadar diğer hayvanlarla birlikte kafes fareler iade etmeyin. </li></ol><ol><li> Temiz bir kağıt havlu üzerine dezenfektan bol miktarda (% 0.05 dimetil amonyum klorür çözeltisi) püskürtün. İyice hayvanlar cihaz ile temas halinde olacak görüntüleme odasının içine siyah levha, burun konileri ve bölücü silmek için dezenfektan batırılmış kağıt havlu kullanın. İyice temiz, kuru bir kağıt havlu ile tüm yüzeyleri silin. Bu kez daha tekrarlayın ve 5 dakika bekleyin. </li><li> Adım 1.14.1 gibi görüntüleme istasyonu başlatılamıyor. </li><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile ketamin / ksilazin 200 ul ve 100 ul luciferase (D-Lusiferin, potasyum tuzu, 150 mg / kg) ihtiva eden bir 300 ul karışımı ile fare anestezisi. </li><li> Enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin ve fareler kuyruk kısma anestezi altında tamamen onaylamak. Görüntüleme sistemi kurmak için, &quot;Lüminesans&quot;, &quot;Otomatik&quot; maruz kalma süresi ve &quot;Orta&quot; binning seçin. Görüntüleme stati fareler yerleştirinve görüntüyü başlatmak için &quot;Acquire&quot; düğmesini tıklayın. Enjeksiyondan sonra zaman her görüntüleme oturumu ile tutarlı olduğundan emin olun. </li><li> Görüntü başarıyla elde edildikten sonra, bir görüntü penceresi ve araç paleti görünmelidir. &quot;ROI Araçlar&quot; tıklayın ve daire simgesinden &quot;auto&quot; seçeneğini seçin. İB&#39;leri tanımlamak için resmin üzerine sinyal alan kuşatmak ve daha sonra sr fotonlar / sn / / cm 2 birimi olarak ROI ölçümleri almak. </li><li> Görüntüleme odasının dışına fareler alın ve onlar ayakta olana kadar fareler izlemek ve normal aktiviteye saklayın. Genellikle iyileşme süresi yaklaşık 15 dakikadır. Tam anestezi kurtarıldı kadar diğer hayvanlarla birlikte kafes fareler iade etmeyin. </li><li> Hayvanlar, aşağıdaki semptomlar ile kadar haftada iki kez biyolüminesans görüntüleme tümör büyümesini izlemek: kilo kaybı (emplantasyondan önce ağırlık% 20&#39;den fazla göreli kaybı), iştahsızlık (24 saat süre ile tam bir anoreksi) ve sürekli purposefu eksikliğionlar ötenazi gerektiğini hangi zaman nazik uyaranlara (kalkmak zayıf girişimi), l tepki. Servikal dislokasyon bir CO2 odası kullanılarak, bu belirtileri olan hayvanlar öldürülür. <ol><li> Yer ötenazi odasına fareler (kalabalık odasına yapmak) ve girişi 5-6 dakika CO 2 sıkıştırılmış. Tüm hayvanlar bilinçsizlik ve sonra yaklaşık 5 dakika nefes olmadığını gözlemleyin. </li><li> Odasından dışarı fareler alın. Kalp Başparmak ve işaret parmağı arasında göğüs hissederek yenerek olmadığından emin olun ve hiçbir göz kırpma refleksi olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Düz bir yüzeye yüzükoyun pozisyonda fare kısıtlamaktadır ve baş parmağınız ve diğer yandan ilk parmağı ile kuyruk tek elle kafatası tabanındaki ensesini ve taban kavramak. </li><li> Kafa dizginlemek ve hızlı bir şekilde geriye kuyruk çekin. Bu kafatası başparmağınızı ve ilk parmak kullanarak ilk servikal omur ayrılır olun. </li></ol></li><li> Normadım 2.3 (Şekil 3A) olarak biyolüminesans görüntüleme ilk gününde elde edilen karşılık gelen okumaları karşı her gün için alize lüminesans değerleri. </li><li> İstatistiksel analiz için Kaplan-Meier tahmincisi 12 kullanılarak sağkalım eğrileri oluşturmak ve bir log-rank testi 13 kullanılarak sağkalım eğrileri arasındaki farklılıkları karşılaştırmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgical+management+and+prognosis+of+patients+with+glioblastoma+that+progresses+during+bevacizumab+treatment.">Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment.</a> Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Grossman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+treated+with+radiation+and+temozolomide+in+research+studies+in+the+United+States.">Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States.</a> Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).</li><li>Sughrue, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+considerations+of+modern+animal+models+of+malignant+primary+brain+tumors.">Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors.</a> J Transl Med. 7 (84), (2009).</li><li>Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemotherapy+of+experimental+brain+tumors:+development+of+an+experimental+model.">Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model.</a> Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).</li><li>Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+in+brain+tumors:+association+with+angiogenesis,+invasion,+and+progression.">Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression.</a> Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).</li><li>Cha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+contrast-enhanced+perfusion+MRI+in+mouse+gliomas:+correlation+with+histopathology.">Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology.</a> Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).</li><li>Ksendzovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+immunosuppressive+mechanisms+in+a+mouse+glioma+model.">Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model.</a> J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).</li><li>Biollaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+anti-tumor+immunity:+differences+in+DC+function,+TGF-beta+production+and+numbers+of+intratumoral+Foxp3++Treg.">Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg.</a> Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).</li><li>El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolongation+of+survival+following+depletion+of+CD4+++CD25++regulatory+T+cells+in+mice+with+experimental+brain+tumors.">Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors.</a> J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).</li><li>Dinca, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy.">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations.">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li><li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures.">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).</li><li>Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical Methods in Medical Research. , (2001).</li><li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+ionizing+radiation+and+peripheral+vaccination+produces+long-term+survival+of+mice+bearing+established+invasive+GL261+gliomas.">The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).</li><li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres+enriched+in+cancer+stem-like+cells+are+highly+effective+in+eliciting+a+dendritic+cell-mediated+immune+response+against+malignant+gliomas.">Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas.</a> Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+luciferase+expression+does+not+alter+immunologic+or+in+vivo+growth+properties+of+GL261+murine+glioma+cells.">Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells.</a> J Transl Med. 12, 345-34 (2014).</li><li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas.">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> J Vis Exp. (57), e3403 (2011).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging.">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme.">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li></ol>

There are no conflicts of interest to disclose.

Singeneik, immunokompetan C57BL / 6 farelerine intrakranial yerleştirilmiş olduğunda, GL261, murin glioma hücreleri, İnsan gliyom ksenograft hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında pek çok avantaja sahiptir. Ksenogreflenmiş tümörlerin çoğu doğru invaziv insan hastalığı özetlemek yok kapsüllü lezyonlar olarak büyür. Buna karşılık, GL261 tümör sadece komşu beyin içine işgali gösteriyor, ama aynı zamanda neovaskülarizasyon, mitoz ve derin nekroz 7. En önemlisi, tümör immünolojisini veya immünoterapötik stratejiler 15, 16, C57BL / 6 fare, bozulmamış bir bağışıklık sistemi 8 korur incelenirken. Daha önceki çalışmalar, immün baskılayıcı sitokin TGF-p sağlam ekspresyonunu göstermiştir ve intrakranyal tümörler İnsan glioblastoma 9, 10 benzer bir bağışıklık bastırıcı T-düzenleyici hücreler içerir. Burada tarif edilen basit bir teknik GL261 hücreleri tarafından lusiferaz stabil ekspresyonu sağlar. Son zamanlarda Simi&#39;yi bildirmiştirin vitro ve in GL261 hücreleri ile karşılaştırıldığında GL261.luc hücrelerinin in vivo büyüme lar, içindeki tümör histolojik özellikleri ve bağışıklık hücresi ilave olarak 17 sızmaya. GL261.luc hücreleri stabil fotonların ve bu nedenle algılanabilir ışık kimyasal enerjiyi dönüştürerek substrat luciferase oksidasyonunu katalize lusiferazı ifade eder. Luciferase güvenli bir şekilde hayvanlara tatbik ve intraperitoneal ya da damar içine enjeksiyondan sonra kan beyin bariyerini geçer edilebilir. Fare gibi küçük araştırma hayvanlarda biyoluminesans invaziv olmayan bir şekilde 11 dışarıdan tespit edilebilir. Bu nedenle, tümör büyümesi seri hayvan kurban veya maliyetli MRI veya BT görüntüleme gerek kalmadan tespit edilebilir. Protokolde kritik adımlar bir in vivo deney başlamadan önce in vitro olarak, lentiviral transdüksiyon, aynı zamanda lusiferaz kararlı ifade doğrulama sadece içerir. Transdüksiyon kaybı requi olabilirTekrar lentivirüs enfeksiyon yeniden. Sentezleme vektörü içine, bir antibiyotik direnç geninin Giriş, aynı zamanda lusiferaz ifadesi için seçmek için kullanılabilir. Titiz tekniği tekrarlanabilir, farklı tedavi gruplarının karşılaştırılması izin vermek için kesin bir anatomik bölgeye hücrelerin istikrarlı bir sayıda yer intrakranial implantasyon için gereklidir. Bu çalışmada ve lusiferaz sentezleyen GL261 hücrelerin çalışmalar arasında büyük bir fark, bir stereotaktik çerçeve 18 kullanımı ile karşılaştırıldığında hücrelerin ekilmesi için serbest el tekniği kullanılmasıdır. Biz daha önce serbest el tekniği 19 ile tutarlı implantasyon sonuçlar ortaya koymuştur. Serbest el tekniği avantajı farklı tedavi ajanlarının yüksek kapasiteli analizleri yapmak için yeteneğidir. Bizim ellerde, biz 1 saat yaklaşık 60 hayvan implante edilebilir. Tekniği mastering sonra, tekniğin gelecekteki uygulamalar sınırsızdır. GL261 demonstr olarakAteş yüksek mitoz ve insan glioblastoma benzer hızlı tümör büyümesi, anti-proliferatif tedaviler değerlendirilebilir. GL261 tümörler, istilacı ve anjiyojenik olarak Benzer şekilde, anti-invasif ve anti-anjiyogenik terapiler kullanılabilir. İnsan hedeflere yönelik kemoterapötik maddelerin etkisini değerlendirmek Dikkat kullanılmalıdır. Lusiferazı 20 ifade insan glioblastoma xenografts kullanan önceki çalışmalara kıyasla bu modelimizin bir sınırlama olarak düşünülebilir. Aynı zamanda, tümör büyümesinin immünoterapötik stratejilerinin etkisi GL261 ksenogreflenmiş modelinde incelenebilir.

Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4. 
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10. 
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.

<table><tbody><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Gold Biotechonology</td><td>LUCK-100</td><td>Store away from light</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>24-well; Standard tissue culture; flat-bottom</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>none</td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>none</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Control substance</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>none</td></tr><tr><td>28G Needle (with syringe)&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>AKA Insulin Syringe</td></tr><tr><td>2% Chlorhexidine</td><td>Fisher</td><td>NC9756995</td><td>AKA &amp;ldquo;Nolvasan&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>3% Hydrogen Peroxide</td><td>Fisher</td><td>H312P-4</td><td>Store away from light</td></tr><tr><td>Ophthalmic Ointment</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>AKA &amp;ldquo;Akwa Tears&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 needle</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>none</td></tr><tr><td>Disposable Scalpels</td><td>Feather</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisher</td><td>22028563</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>none</td></tr><tr><td>Skin Stapler, Staples, Remover</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>none</td></tr><tr><td>PDI Alchol Prep Pads</td><td>Fisher</td><td>23-501-711</td><td>none</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clips 100 pack</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Applier</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Remover</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>none</td></tr><tr><td>Single Ended Round Tip Swab with Wood handle</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>none</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>none</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>none</td></tr><tr><td>Bone Wax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>599864</td><td>none</td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging of an immunocompetent animal model for glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 hücreleri 1. In vitro biyoışıldama görüntüleme insan glioblastoma hücre çizgisi U87.luc pozitif kontrol seviyelere benzer güçlü bir lusiferaz ekspresyonu (Şekil 1) gösterilmiştir adımda yukarıda tarif edildiği gibi lusiferaz lentivirüs ihtiva ile enfekte edilmiştir. Beklendiği gibi, enfekte olmamış GL261 hücreler arka plan lusiferaz ifadesini göstermektedir. Bu adım henüz önce kararlı lusiferaz ifadesini teyit etmek için enfekte hücre hattı kullanarak ileri çalışmalar gerçekleştirmek için kritik basittir. Intrakranial implantasyondan sonra lüsiferaz ifadesi. Intrakranial implantasyon önce, GL261 hücreleri (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında GL261.luc in vitro büyüme hızında herhangi bir fark gösterdi. Intrakranial büyüme ve hayatta kalma analizi için, hücreler, br enjekte edilmiştirGL261.luc tümörleri taşıyan farelerde 3. adımda Tümör büyümesi protokole uygun olarak, C57BL / 6 farelerinin ains seri protokolünü adım 4 kullanılarak biyoışıldama görüntüleme için analiz edilmiş ve tümör büyümesi tespit (Şekil 3A) gösterilmiştir. Hızlı ve sürekli olarak GL261.luc tümörleri taşıyan fareler, Can çekişme durumuna gelen ve kurban edilmiştir. Önemlisi, GL261.luc ve hayvanları taşıyan GL261 tümör (Şekil 3B) arasındaki genel sağkalım açısından fark yoktur. In vivo biyoparlaklık görüntüleme nedenle deneysel glioblastoma tedavilere yanıtı izlemek için de kullanılabilir. Hızlı, güvenilir tümör büyümesi ve kısa genel sağkalım süresi nispeten kısa bir miktarda büyük miktarda veri sağlayabilir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> GL261.luc hücrelerinde Şekil 1. Lusiferaz aktivitesi. U87.luc, GL261.luc ve GL261 (negatif kontrol) hücreleri yoğunluklarda kaplandıX 10 6 1.0, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 hücre / çukur soldan sağa doğru. Işıma (foton / sn / / sr cm2) lumina görüntüleme istasyonu tarafından ölçüldü. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> Şekil 2. Lusiferaz ekspresyonu GL261 hücre çoğalmasını etkilemez. GL261.luc hücreleri neden olmayan çoğalmasında farkı MTS hücre proliferasyon deneyinde gösterildiği gibi. Ortalama absorbans değerinin karşılaştırılmasıyla belirlenen şekilde grafik gün 1 &#39;e göre kat artış gösterir (gün 1 ortalama değere thespecified zaman noktasında karşılaştırmalar için t-testi değerleri (ortalama ± SEM)her bir hücre hattı arasında: P = 0,7796) 14. Hata çubukları ortalama değerler her gün dörtlü örneklerinden (ortalama ± SEM) temsil etmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> Şekil 3. Lusiferaz tanımı, in vivo tümör büyümesinin ve hayvan hayatta kalma etkilemez doz. (A) Biyoparlaklık izleme C57BL / 6 farelerde intrakranial GL261.luc tümörünün büyümesini ilerici gösterir. (B) Kaplan-Meier sağkalım analizi ya GL261 (düz çizgi) veya GL261.luc hücreleri ile intrakranial yerleştirilmiş farelerin genel sağkalım açısından fark gösterir (kesik çizgi).Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma at JoVE.com

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Glioblastoma&#39;nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

bioluminescence-imaging-an-immunocompetent-animal-model-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

14.7K Görüntüleme.  University of California San Francisco. GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Video: Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most commonly used procedure for human tumor xenograft establishment consisted of the collection of cells from culture flasks, followed by the subcutaneous injection of the collected cells in immunocompromised mice. Whereas this approach still sees frequent use in many laboratories, there has been a significant shift in emphasis over the past decade towards orthotopic xenograft establishment, which, in the instance of brain tumors, requires tumor cell injection into appropriate neuroanatomical structures. Because intracranial xenograft establishment eliminates the ability to monitor tumor growth through direct measurement, such as by use of calipers, the shift in emphasis towards orthotopic brain tumor xenograft models has necessitated the utilization of non-invasive imaging for assessing tumor burden in host animals. Of the currently available imaging methods, bioluminescence monitoring is generally considered to offer the best combination of sensitivity, expediency, and cost. Here, we will demonstrate procedures for orthotopic brain tumor establishment, and for monitoring tumor growth and response to treatment when testing experimental therapies.

Luciferase-modified human brain tumor xenografts can be established intracranially in athymic mice, with subsequent monitoring of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. In combination with survival analysis, bioluminescence monitoring is an essential research tool for pre-clinical testing of therapies being considered for treating brain tumors.

Biyoparlaklık Görüntüleme kullanarak Tümör Büyüme ve Terapi yanıt sonraki Analizi ile İntrakranial Beyin Tümörü Xenografts kurulması

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

Nörobilim

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Tıp

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting immunodeficient mice subcutaneously with cancer cells and measuring the tumor mass after it becomes visible and palpable. Orthotopic injections of cancer cells aim to introduce the xenograft in the microenvironment that most closely resembles the tissue of origin of the tumor being studied. Brain cancer research requires intracranial injection of cancer cells to allow the tumor formation and analysis in the unique microenvironment of the brain. The in vivo imaging of intracranial xenografts monitors instantaneously the tumor mass of orthotopically engrafted mice. Here we report the use of fluorescence molecular tomography (FMT) of brain tumor xenografts. The cancer cells are first transduced with near infrared fluorescent proteins and then injected in the brain of immunocompromised mice. The animals are then scanned to obtain quantitative information about the tumor mass over an extended period of time. Cell pre-labeling allows for cost effective, reproducible, and reliable quantification of the tumor burden within each mouse. We eliminated the need for injecting imaging substrates, and thus reduced the stress on the animals. A limitation of this approach is represented by the inability to detect very small masses; however, it has better resolution for larger masses than other techniques. It can be applied to evaluate the efficacy of a drug treatment or genetic alterations of glioma cell lines and patient-derived samples.

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Orthotopic intracranial injection of tumor cells has been used in cancer research to study brain tumor biology, progression, evolution, and therapeutic response. Here we present fluorescence molecular tomography of tumor xenografts, which provides real-time intravital imaging and quantification of a tumor mass in preclinical glioblastoma models.

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Kanser Araştırmaları

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Müteakip 3D ile İntrakranial İmplantasyonu In Vivo Murin Gliomlar Bioluminescent Görüntüleme

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktik intrakranial implantasyon ve<em&gt; In vivo</emGlioblastoma Multiforme bir Mouse Model Sistemde Tümör Xenografts arasında&gt; Bioluminescent Görüntüleme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Glioblastomunda Görüntü Kılavuzluğunda Tedavi Uygulaması için Demir Oksit Nanopartikülleri

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Glioblastoma Tedavisi için Demir Oksit Nanopartikülleri ile Yenilikçi Kanser Tedavileri

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

Glioblastoma'nın için bir Immünkompetan Hayvan Modeli Biyoparlaklık Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Biyoparlaklık Görüntüleme kullanarak Tümör Büyüme ve Terapi yanıt sonraki Analizi ile İntrakranial Beyin Tümörü Xenografts kurulması

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Floresans moleküler tomografi Glioblastoma Xenografts in Vivo içinde görüntüleme için

Müteakip 3D ile İntrakranial İmplantasyonu In Vivo Murin Gliomlar Bioluminescent Görüntüleme

Stereotaktik intrakranial implantasyon ve

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi

Bir Glioblastoma Multiforme Hayvan Modelinde Bir Oligonükleotid Yükünün Nanopartikül Teslimi