This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

Hayvanları da içeren tüm prosedürler California, Davis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu yapıştırılır bulundu. 1. Hazırlık <ol><li> 4 ° C&#39;de önceden ve mağaza modifiye Tyrode çözeltisi iki konsantre edildi (25X) stokları hazırlayın: (1) Stok I (mM olarak: NaCl 3205, CaCl2 32.5, KCI 117.5, NaH 2 PO 4 29,75, MgCI2 26,25) ve (2) (mM olarak: 500 NaHCO 3) Stok II. <ol><li> (DI) NaCl 128.2, CaCl2 1.3, KCI 4.7, MgCl2 1.05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 ve deiyonize 1840 ml birleştirerek glikoz 11.1: Taze (mM olarak) aşağıdaki bileşime sahip 2 L&#39;lik Tyrode solüsyonu hazırlamak Su, 80 mi Hazır I Stok II 80 mi, ve glukoz, 4 g. Doğrudan Stok I ve II Stok karışmaz; eklemek1840 ml DI m çökmesini önlemek için. </li></ol></li><li> Önceden 10 mg susuz di-metilsülfoksit (DMSO) / ml uyanlma-kasılma uncoupler blebbistatin stok çözeltisi hazırlamak ve 4 ° C &#39;de stok solüsyonu saklayın. </li><li> Floresan boyalar stok çözelti hazırlayın: (1) voltaj duyarlı boya RH237 (DMSO içinde 1 mg / ml) ve (2) Düşük afiniteli kalsiyum göstergesi Fluo-5N AM, üreticinin tavsiyelerine göre (DMSO içinde 2 mg / ml). Yükleme kapasitesi kaybı sonucu ile, bozulmayı önlemek için, hemen hazırlıkları kullanın. </li><li> Prime oksijenli sahip çevrimli Langendorff perfüzyonu sistemi (% 95 O2,% 5 CO2), Tyrode çözeltisi. 7.4 ± 0.05 Tyrode çözümü pH tutmak için O 2 / CO 2 akışını ayarlayın. Sürekli perfüzyon filtre: bir in-line naylon dokuma ağ filtre (11 um gözenek boyutu) kullanın. <ol><li> Sonraki loadi olarak oda sıcaklığında Başbakan perfüzyon sistemi,Fluo-5N AM ng oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Fluo-5N AM yükleme için, çevrimli perfüzat küçük bir hacim (~ 150 ml) kullanın. Boya yüklemesinin ardından, perfüzat daha büyük bir hacim kullanımı (1-2 L, Şekil 1C bakınız). </li></ol></li><li> Veri toplama sistemi açın ve EKG ve perfüzyon basıncının sürekli izlenmesi için hazırlar. Basınç izleme sistemi hazırlayın: perfüzyon hattına bir basınç transdüktörü bağlayın ve bir transbridge amplifikatörü ile perfüzyon basıncını izlemek. Kalp perfüzyon sistemine bağlı değilken 0 mmHg bazal perfüzyon basıncını ayarlayın. </li><li> V m ve SR Ca 2 + sinyalleri arasındaki uzaysal uyum sağlamak için optik haritalama kameraları aynı hizaya getirin. <ol><li> İlk olarak, bir cetvel ya da perfüzyon çanak içine metin ile bir nesne yerleştirerek kameralar odaklanır. Canlı görünüm moduna haritalama kameraları açın ve metin canlı ve net olana kadar odağı ayarlamak. Her bir kamera tek bir kare görüntü elde edin. </li><li> YerleşimiHer iki resim görünür, böylece bu görüntülerin ve üst resmin saydamlığını ayarlamak. Görüntülerdeki metin tam üst üste gelmelidir. Mükemmel hizalanmış değilse iki görüntü aynı hizada kadar, dikroik ayna veya her kameranın konumunun açısını ayarlayın. </li></ol></li></ol> Tavşan Kalbin 2. Hasat, Perfüzyon ve Boya yükleme <ol><li> Onaylanmış bir tavşan süzgeç tavşan sabitleyin. Derin sodyum pentobarbital (50 mg / kg) ve heparin (1000 IU) bir intravenöz enjeksiyon (marjinal kulak daman) ile anestetize. <ol><li> Tavşan görüntüler nosiseptif reflekslerin eksikliği olduğunda, bir orta hat cilt kesi sternum ve kaburga maruz olun. Manubrium için xiphoid gelen künt uçlu cerrahi makas ile sternum ile kesin. Sternumu açarken kalbi zarar vermemeye özen gösterin. Kalp maruz kaburga yayıldı. </li><li> Hızla hızla tüm damarları ve bağ dokusu kesim tarafından tüm kalp-akciğer bloğu tüketim. Immediately buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi içine kalp-akciğer bloğu yerleştirin. </li></ol></li><li> Retrograd perfüzyon için aorta bulun. Aortik arkın üç şubelerine sadece proksimal asendan aort kesin. Perfüzyon sistemine bağlı bir 8 G kanül aort kanüle. Kanül üzerine aorta güvenli USP 0 ipek sütür bir parça kullanın. </li><li> Dikkatle kalp trakea, akciğerler ve epikardiyal yağ teşrih. Keskin forseps ve diseksiyon makas ile, mitral kapak bulun ve dikkatle zarar veya sol ventrikül çözüm sıkışıklığını önlemek için tek broşür kaldırın. </li><li> Görüntüleme için yukarı bakacak şekilde kalbin ön yüzeyi ile yatay cam ceketli perfüzyon odasında kalbi Batmak. Haritalama (Şekil 1D) sırasında kalbin hareket etmesini önlemek için çanağın silikon alt üzerine U-şekilli pimlerle Sylgard parçasına kanül elde edin. İsterseniz, sta için kalbin tepesinde küçük bir böcek pin eklemekbilization. </li><li> Pozisyon elektrokardiyogram (EKG) kalbin sağ ve sol tarafında banyosunda elektrotlar. Tamamen banyosunda elektrotlar daldırın ve onlar Kurşun Ben yapılandırmasına bir hacim yapılan EKG benzer sağlamak için kalp yüzeyi ile temas halinde olmadığından emin olun. Normal Kurşun I EKG morfoloji doğrulayın. 70 mmHg - aort basıncı 60 muhafaza edilmesinin sağlanması için - (35 ml / dakika 25) akışını ayarlayın. </li><li> Oda ışıkları kapatın ve 0.3 eklemek - Perfüzat (- 20 uM son konsantrasyon 10) ile blebbistatin stok solüsyonu (adım 1.2) 0.6 ml. <ol><li> Blebbistatin bir photoinactivation önlemek için oda ışıkları kapatın. Gerekirse küçük bir spot ışığı veya far görevi aydınlatma sağlamak için kullanılabilir. Not: Blebbistatin bir miyozin ATPaz inhibitörü ve bir eksitasyon-kasılma uncoupler olduğunu. , Kardiyak enerji üretimi bozulabilir - Flu-5N yükleme genişletilmiş (60 dk) RT (hipotermi) koşulları gerektirdiğinden (2.10 adımları 2.8 bakınız). Therefore, Perfüzat önce içine blebbistatin eklenmesi enerji talebini azaltmak 16 ve sonraki optik kayıtları 17 sırasında hareket eserler ortadan kaldırabilir yükleme boya. </li></ol></li><li> Kalbin kasılması bittikten sonra (10 - aort basınç kayıt doğrulandı 15 dk), küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemi (adım 1.4.1 bakınız) geçmek. </li><li> Hazırlayın ve Fluo-5N AM yükleme çözüm yük: 0.25 ml ılık% 20 Pluronic F127 için Fluo-5N AM stok solüsyonu (adım 1.3) 0.25 ml ekleyin. , 0,5 ml karışımına sıcak Tyrode çözeltisi ekleyin, iyice karıştırılmakta ve küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemine ekleyin. </li><li> Sürekli perfüzyon basıncı ve EKG izlenmesi ve gerekirse akışını ayarlamak. Boya yükleme RT&#39;de yaklaşık 1 saat sürer. Yüklemeden sonra 45 dk 37 ° C perfüzyon sistemi ve perfüzyon ısınma başlamak için dolaşan su banyosu açın başladı. </li><li> Fluo-5N AM yükleme, swi 60 dakika sonraDaha büyük hacimli sirkülasyon perfüzyon sistemine perfüzyon Tch (adım 1.4). </li><li> Sıcak Tyrode çözeltisi 1 ml voltajı duyarlı boya RH237 stok çözeltisinin (adım 1.3) 50 ul seyreltilir ve kanül, bir enjeksiyon noktası proksimal içerisine (5 ~ dakika boyunca) yavaş yavaş ekleyin. </li></ol> 3. Optik Haritalama <ol><li> Boya yükleme son anlarında kalbi konumlandırmak ve deney için görüş uygun alanı sağlamak için optik haritalama kameraları odaklanır. </li><li> Eğer arzu edilirse, kalp atışı düzenleme epikardiyal yüzeyi üzerine yerleştirilen iki kutuplu bir elektrot ilerleme hızı yerleştirin. </li><li> Bağlı perfüzat devridaim mevcut olabilir, sıvı yüzeyi üzerinde hareket paraziti azaltmak perfüzyon odasına yüzeyi üzerinde bir plastik ya da cam kapak kayma yerleştirin. Not: Bir kapak kayma bir alternatif, temiz bir plastik 50 mm Petri kabı kapağı kullanmak gibi. </li><li> Üniform e kalbin yüzeyine aydınlatmak için ışık kılavuzları Odakxcitation ışığı. 495 nm bant geçiren filtre (Şekil 1A) - Mavi ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın ve daha bir 475 ile ışık filtresi. </li><li> Bir macroscope ve iki tamamlayıcı metal oksit-yarıiletken (CMOS) optik haritalama kameralar ile yayılan floresan toplayın. 545 nm&#39;de dikroik ayna ile yayılan ışığı bölün. <ol><li> Uzun pas 700 nm&#39;de, V m sinyalini içeren, uzun dalga boyu parçasını filtre. 534 nm (Şekil 1A) - Bant geçiren 502 den, SR Ca 2 + sinyalini içeren, kısa dalga boylu parçasını filtre. 1 kHz - 0.5 optik veri toplama sıklığını ayarlayın. </li></ol></li><li> Her optik kayıt için, ilk olarak, istenen düzenlemeyi başlatmak ikaz ışığı açmak ve 1 toplamak - veri 4 sn. İstenirse, ilerleme hızı protokolleri ve veri toplama senkronize. Not: mümkün değildir Fluo-5N AM, bu nedenle sinyal-gürültü oranını (SNR) re-load düflüfl olacakse SR sızıntıyı boya nedeniyle deney boyunca. Yüksek SNR değerleri sağlamak için 2 saat - 1 deneysel protokol sınırlayın. </li><li> Deney sonra, Dİ su ile tekrar DI su,% 70 reaktif alkol sırayla perfüzyon sistemi yıkama ve. </li><li> Üreticinin protokolüne göre ticari yazılım paketleri kullanılarak mekansal Gauss filtre (yarıçap 3 piksel) her veri kümesi Filtre. </li><li> Gerekirse, mekansal V m ve SR Ca 2 + veri setleri aynı hizaya getirin. Adım 1.6 olduğu gibi, her kamera görüntüleri kaplaması ve doğrulayın görünümü (yani, kanül, kalp pili elektrodu) alanında kalbin anatomik yapıları (yani., Koroner damar, kulakçıklar kenarlarına veya ventriküller) ya da diğer öğeleri tam olarak örtüşmektedir. Değilse, veri setlerinin mekânsal uyum gereklidir. </li><li> Piksel sayısı not ederek, tam örtüşme kadar x ve y-yönünde elde edilir üst saydam bir görüntü ShiftResim, her yönünde kaydırılabilir olmalıdır. Üst görüntüde (V m veya SR Ca 2+ ya) karşılık gelen tüm veri kümesi sonra V m ve SR Ca 2 + veri setleri arasındaki hassas hizalama sağlamak için her yönde piksel belirlenen sayısına göre kaydırılır gerekmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart.">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li><li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai(2+)+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology.">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , (2001).</li><li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes.">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle.">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions.">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li><li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans.">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li><li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++scraps:+local+depletions+of+free+[Ca2+]+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2++reserve.">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li><li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations.">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li><li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+determines+Ca2++alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology.">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++in+the+intact+heart:+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation.">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li><li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+Changes+During+Hypoxia,+Ischemia,+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations.">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li><li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li><li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia.">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li><li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure:+mechanisms+and+therapeutics.">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li><li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart.">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Başarılı Fluo-5N boya yükleme anahtarları boyanın büyük miktarda yükleme süresi (1 saat) uzunluğu gerek kalmadan yüksek Fluo-5N konsantrasyonu sağlar küçük hacimli çevrimli perfüzyon kurulum vardır ve yükleme gerçekleştirme oda sıcaklığında karıştırıldı. Yükleme hızla fizyolojik sıcaklıklarda, hücresel enzimatik aktivite böler boya sitozolde boya moleküllerini yakalama ve onları SR zarı geçmeye izin vermiyor, hücre zarı haçlar -AM etiketi gerçekleştirilir edin. Oda sıcaklığında, bununla birlikte, enzim aktivitesi yavaşlatılır ve -AM etiketi önce hücre membran ve membran SR hem çapraz bir boya yeterli miktarda, SR boya tutucu, yarılır. Hatta en uygun yükleme koşulları, Bununla birlikte, sinyal amplitüdleri ve bu yaklaşım ile fraksiyonel Floresan değişiklikleri, (kadar taşınmış / F) yüksek afiniteli boyalarla V m geleneksel optik haritalama ve hücre içi Ca2 + ile birlikte daha düşük olacaktır. Örneğin, LED uyarma ışığı, makroskopik amaçları, büyük filtre ve dikroik ayna (5 cm x 5 cm), ve CMOS kamera, fraksiyonel floresans değişimden oluşmaktadır Burada kullanılan optik kurulum ile (kadar taşınmış / F) ile 1 mertebesindedir RH237 sinyali 15% 3 - - Flu-5N sinyali ve 2 için% 2. Fraksiyonel floresans, tabii ki, belirli bir optik konfigürasyonunda, ışık kaynağı ve özel bir kurulum kameralar bağlıdır, ama daha uygun koşullar altında Fluo-5N sinyal, tipik olarak, hücre içi Ca kayıtları için gözlenenden önemli ölçüde daha düşük olduğunu 2+ Yüksek afiniteli boyalarla. Yeşil (545 ​​nm) uyarma ışık 18 kullanıldığında Rhod-2 için% 30 - Örneğin, aynı kurulum üzerinde, mesafe kadar taşınmış / F 20 mertebesinde olduğunu. % 5 - yeşil uyarım ışığı da RH237 uyarım zirvesine yakın olup bu nedenle RH237 bölgesinin kadar taşınmış / F yaklaşık 4, bu durumda da daha büyüktür. Böylece, bu laboratuvarlar zaten V m çift optik haritalama performans </sub&gt; ve Ca 2+ hücre içi, bakım maksimum mesafe kadar taşınmış sağlamak için optik kurulum tüm bileşenleri optimize etmek için alınması gereken / Fluo-5N sinyali F. Bu yaklaşımla, araştırmacılar tam olarak SR Ca 2 + dinamiklerini ve mevcut yaklaşımlarla mümkün olmayan yollarla V m üzerindeki etkilerini sonda olabilir. Örneğin, (Şekil 3A&#39;da gibi) SR Ca2 + sızıntının sayısal ölçümler ve SR Ca2 + kurtarma (SR Ca2 + -ATPase [SERCA] aktivitesinin tau -a ölçüsü) hassas zaman sabiti gerçekleştirilebilir. Yüksek afiniteli boyalar ile 2 + hücre içi Ca optik haritalama için mevcut yaklaşımları kullanarak, bu ölçümler (transmembran Ca 2 + akı ile &#39;kirlenmiş&#39; olabilir yani., L-tipi katkıları Ca 2 + kanalları ve Na + -Ca 2 + değiştirici). Ayrıca, yüksek afiniteli Ca 2 + göstergeleri doğal yavaş k varDüşük afiniteli göstergelerinin 5&#39;ten inetics, böylece Fluo-5N sinyalleri yüksek sadakat ve gerçek Ca 2+ değişiklikler ve floresan karşılık gelen değişiklikler arasında aslında hiçbir zaman gecikmesi ile hassas SR Ca 2 + hareketlere rapor bekleniyor. SR Ca 2 + bırakma ve geri alım aritmojenik olayların katkıda hangi detaylı mekanizmaların araştırılması yeteneği bu yaklaşımın bir başka avantajdır. Örneğin, bu metodolojiyi kullanarak, son zamanlarda SR Ca 2 + sürümü refrakterlik Ca 2 + alternans başlangıcından katkıda bulunur ve bu ventriküler fibrilasyon sırasında, SR Ca 2 + sürüm neredeyse sürekli refrakter 15 kalır ne bildirdi. Bu fibrilasyon sırasında SR Ca 2 + dinamiklerin ilk rapor ve sağlam kalbinde SR Ca 2+ görüntüleme anahtar avantajı vurgulamaktadır: Böyle uzaysal uyumsuz alternans ve f olarak uzamsal farklı ve karmaşık olgularıibrillation incelenebilir. Ne yazık ki, bu tip bilgiler fibrilasyon mümkün değildir ya da sadece dokunulmamış kalp 12 tek bir konumda kayıt yöntemlerle izole hücreler, panoda edilemez. Bundan başka, V, m ve sağlam merkezinde ücretsiz SR Ca2 + aynı anda optik haritalama anormal Ca 2+ değerlendirmek kalp yetmezliği de dahil patolojik koşullarda, işleme için yeni bir araç sağlayabilir. SR Ca 2 + sürümü, diyastolik SR Ca 2 + kaçak, ve Ca 2+ SR alımı aktivasyonu ve fesih dahil SR Ca 2 + yönetmelik, anormallikleri - Ca tüm önemli adımlar 2+ bisiklet ve potansiyel kalp yetmezliği değişmiş tüm - doğrudan ele alınabilir. Buna ek olarak, bu yöntem aynı zamanda RyR stabilizasyon 19 ve SERCA modülasyon 20 olarak yeni terapötik müdahalelerin etkilerini değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir. [Ca2 +], SR konsantrasyonları kesin için floresan değerleri kalibre yetersizlik de dahil olmak üzere, ancak, sınırlama olmadan değildir. Ne yazık ki, deney süresince SR ile ilgili kalp ve foto-ağartma ve boya sızıntının eğri yüzeyine boya yükleme, tek biçimli olmayan, uyarım ve emisyon ışığında değişkenliği son derece zor Fluo-5N sinyallerini ayarlamak yapmak sağlam kalbinde tam [Ca 2 +] SR. Fizyolojik tampon çözümleri Önceki in vitro çalışmalar ve geçirgen izole miyositler tür kalibrasyon bildirdi ve Fluo-5N floresan değişiklikler değişikliklere orantılı olduğunu göstermiştir [Ca 2 +] SR ve floresan fizyolojik doyurmak için beklenmemektedir [Ca 2 +] SR seviyeleri 11. Böylece araştırmacılar Ca 2+ ma yöntemini seçmelisinizkendi özel deneysel hedefleri ve fizyolojik araştırmalara dayalı pping (düşük veya yüksek afiniteli boya).

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S271-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">CaCl2 (2H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">C79-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S217-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MgCl2 (6H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">M33-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaH2PO4 (H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S369-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S233-3</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">D16-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">95% O2 5% CO2</td>
			<td style="width:167px;">AirGas</td>
			<td style="width:151px;">carbogen</td>
			<td style="width:423px;">For oxygenation and pH of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:167px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:151px;">1760</td>
			<td style="width:423px;">Excitation-contraction uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">RH237</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">61018</td>
			<td style="width:423px;">Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Fluo-5N AM</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">F-26915</td>
			<td style="width:423px;">Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pluronic F127</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">59004</td>
			<td style="width:423px;">For Ca2+ indicator loading; Warm until the solutiion is clear before use</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td style="width:423px;">For dissolving blebbistatin and dyes</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Filter</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:151px;">NY1104700</td>
			<td style="width:423px;">11um in-line filter</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">BLPR2</td>
			<td style="width:423px;">For measuring perfusion pressure</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:423px;">For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">PowerLab 26T</td>
			<td style="width:167px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">For continuous recording of pressure and ECG signals</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">THT Macroscope</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Macroscopic optical setup. Details: 0.63x objective (NA=0.31), 2x condensing objective, resultant field of view = 3.1x3.1 cm, depth of focus = ~1.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MiCam Ultima-L CMOS</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Optical mapping cameras</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Precision LED Spot Light</td>
			<td style="width:167px;">Mightex</td>
			<td style="width:151px;">PLS-0470-030-15-S</td>
			<td style="width:423px;">LED light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Şekil 1A, çift V m ve SR Ca2 + eşleme için optik konfigürasyonunda şematik bir diyagramını göstermektedir. Bu ayar ile, V m ve SR Ca 2 + sinyalleri (Şekil 1B) tam spektral ayrılık yoktur. Fluo-5N boya yüklemesinin için kullanılan çift döngü perfüzyon sistemin bir şeması Şekil 1C &#39;de gösterilmiştir. Şekil 1 D perfüzyon çanak kalp yatay yönünü gösterir. Örnek V m ve kalp epikardiyal yüzeyi üzerinde farklı konumlarda sürekli pacing sırasında SR Ca2 + optik izleri Şekil 2A&#39;da gösterilmektedir. Bu kurulum ile görüş optik alanı x 31 mm ve görüş alanı içinde kalp oryantasyon Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir 31 mm&#39;dir. Aktivasyon haritaları aynı zamanda Şekil 2B&#39;de de gösterilmiştir ve her bir piksel ve p aktivasyon süresi seçilerek oluşturulmuşturBir eş zaman harita üzerinde bu değeri lotting (- V m ve SR Ca 2 + aktivasyon haritalar arasında 10 msn ~ 8 tipik gecikme dikkat edin). Önemlisi, bu tür AP yükselme süresi gibi önemli aksiyon potansiyeli (AP) özellikleri% 80 repolarizasyon (APD 80) ve AP süresi (genlikli [Trise] 10% 90 den%), RH237 yüklü kalpleri arasında istatistiksel olarak farklı değildir 14.9 ± 1.9 msn msn vs 14.2 ± 1.2 msn msn ve APD 80: Flu-5N ve için 155,3 milisaniye ± 5.8 msn vs 156.9 milisaniye ± 5.7 msn ve Fluo-5N RH237 ve Rhod-2 (Trise yüklü kıyasla Rhod-2 sırasıyla; p hem de&gt; 0.05; n. = 8 / grup), en az Fluo-5N etkisi veya AP Şekil 2C&#39;de ilgili yükleme boya gösteren gözlemlemek ve diyastolik SR Ca bağıl değişiklikleri ölçmek için kabiliyetini gösterir 2+ Yük ve sistolik SR Ca 2 + sürüm çeşitli kalp pili döngüsü boylarda genlikleri. Bu parametreler Sadece rölatif değişimler qu edilebilirsağlam kalbinde sinyal antified, mutlak kalibrasyon ([Ca 2 +] SR) mümkün değildir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi bu yaklaşım, karakterize patolojik SR Ca2 + kullanım miktarının belirlenmesi için özellikle yararlıdır. Görülmektedir SR den β-adrenerjik reseptör agonisti, isoproterenol (100 nM), açık bir diastolik Ca 2 + sızıntının uygulama (aşağıdakı kırmızı oklar, Şekil 3A). Kaçak yeterince büyükse, Ca 2 + tetiklenen etkinliği (Şekil 3B) oluşabilir -kaynaklı. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig1.jpg" /> Çift V m Haritalama ve SR Ca 2+. Gerekli filtreler ve uygun spektral ayırma dikroik ayna dahil optik kurulum, (A) şeması. (Şekil 1. Sistem KurulumuYa Flu-5N, sadece (i) ya da RH237 yüklü kalplerin B) Görüntüleme, sadece (ii) V m tam bir spektral ayrılmanın ve SR Ca2 + floresan sinyalleri gösterir. Ör: uyarma, Em. Normal perfüzyon ve Fluo-5N boya yükleme için çift döngü perfüzyon sistemi emisyon (C) Diyagram (D) perfüzyon çanak bir kanüle kalp ve EKG elektrotları Image.. Paneller A ve B Wang ve ark. 15 izni ile yeniden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53166/53166fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53166/53166fig2.jpg" /> Şekil 2. V m ve SR Ca Sürekli ve Non-Sürekli Pacing sırasında 2 + Optik İzler. (A) Temsilcisi V m ve SR Ca 2 + optical 300 msn siklus uzunluğunda sürekli pacing sırasında izler. İşaretler (B) &#39;de gösterildiği münferit konumlardan gösterilmiştir. Normal eksitasyon-kasılma kenet için tipik olarak V m ve SR Ca 2 + aktivasyon süreleri arasında 10 ms - ~ 8 gecikme unutmayın. (B) görünümü haritalama alanı içinde kalp Görüntü V m ve SR Ca 2+. (C) diyastolik SR Ca 2 + yük değişiklikleri gösteren SR Ca 2 + optik izleri ve aktivasyon haritaları (beyaz ok ucu elektrotlar pace gösterir) ve SR Ca 2+ bülteninin genlik oranı kalp pili ani değişikliklerin ardından. Tüm izleri CL = 300 msn pacing ile başlar. Oranı Pacing sonra aniden CL = 500 ms: (i), CL için değiştirilir = 400 milisaniye (ii) ya da CL = 250 milisaniye (iii). Uzun CLs başlatılan zaman (i - ii) daha büyük bir SR Ca 2 + sürüm ilk ve diyastolik SR Ca (nedeniyle uzun diyastolik aralığı ve RyRs ve kurtarma) oluşur2+ yük hafifçe yeni kararlı durumda (yatay kesikli çizgi) azalır. Kısa CL başlatıldığında, ancak, daha küçük bir SR Ca 2 + bırakma genlik yeni bir kararlı durum (yatay kesikli çizgi) ve diyastolik SR Ca 2 + yük arttıkça (nedeniyle RyRs kısa diyastolik aralığı ve eksik kurtarma) oluşur . SR Ca 2 + bırakma genlik münavebe de CL = 250 msn oluşur. S: Küçük bırakma genlik, L: Büyük bırakma genlik. (CL: döngü uzunluğu) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53166/53166fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53166/53166fig3.jpg" /> Başlangıca (solda) ve aşağıdaki sırasında Şekil 3. Diastolik SR Ca 2 + Kaçak ve Müteakip Tetikleme aktivitesi. (A) EKG, V m ve SR Ca 2+ izleri100 nM isoproterenol (Iso, sağda) ile tedavi. Iso ile önemli diyastolik SR Ca 2 + kaçak (kırmızı oklar) görülmektedir. SR Ca 2+ sinyal amplitüdleri öncesi ve sonrasında normale Iso oylandı. Sino-atrial düğüm her iki durumda da CL = 300 msn pace sağlamak için ablasyon. (B) SR Ca 2 + kaçak yeterince büyük ise, odak aktiviteyi (prematüre ventriküler kompleksler, PVC) tetikleyebilir. Bu örnekte, VPS&#39;ler normal sinüs ritmi kesintiye vardır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53166/53166fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart at JoVE.com

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.2K Görüntüleme.  University of California Davis.  Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar. 

Video: Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biyoloji

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Küçük Kalpler Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.