The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi Etik Komitesi (Tahran, İran) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (NIH) için Kılavuzu&#39;nda belirtilen politikalara uygun olarak yürütülmüştür. 1. Hayvanlar, Cerrahi ve Numune Hazırlıklar NOT: 3D odaklı mikroskopik analiz için beyin dokusunu hazırlayın. <ol><li> Iki gruba rastgele Divide hayvanları: Aβ 1-40 -injection (n = 8) ve genistein, tedaviden Aβ 1-40 -injection (n = 8); ameliyat öncesi sonda 1 saat ile genistein (örneğin, polietoksile hint yağı gibi bir araç içerisinde seyreltilmiş 10 mg / kg) tatbik. </li><li> Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile anestezi. Ayak sıkıştırdıktan sonra geri çekme refleksi eksikliği ile doğru anestezi onaylayın. Kuruluğunu önlemek için ameliyat sırasında göze merhem kullanın. </li><li> Stereotaksik aparat ve tıraş baş hayvanları yerleştirin. IoD Uygulaine çözüm insizyon yapılmadan önce derisini temizlemek ve enfeksiyon riskini azaltmak için ameliyat sırasında steril operasyon siteyi tutmak için. Sıçan beyin atlas 8&#39;e göre, bregma -3.5 mm posterior, orta hatta kadar ± 2 mm lateral ve dura altında -2.8 mm hipokampus Aβ 1-40 stereotaxically (4 ul) enjekte edilir. Stereotaksik yöntem için bir önceki yayın 9 bakınız. </li><li> Hayvanlar hayvanların rahatı için tam bilinçli kadar post-operatif gözlem / bakım sağlar. Kurtarma sırasında sıcak hayvanları tutun ve tam iyileşme kadar diğer hayvanlarla bir kafese dönmelerini yok. Ameliyattan sonra hayvanlarda enfeksiyon belirtisi dikkat edin. </li><li> Üç hafta ameliyat sonrası ketamin (150 mg / kg) ile derin hayvanların anestezisi. 0.1 M PBS (pH = 7.4) içinde% 4 paraformaldehit ve ardından% 0.9 tuzlu su hayvanları perfüze transcardial tespit gerçekleştirmek, çıkarıp 10 de tarif edildiği gibi &lt;beyin tamir/ sup&gt;. </li><li> 4 ° C&#39;de 2-3 gün süreyle% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin. </li><li> Doku gömme ekipman kullanımı ile parafin blokları doku gömün ve doğru hizalama ya da kesit engel olabilir çünkü dolum-under veya aşırı doldurma kaseti kaçının. Parafin blok içinde doku yönüne dikkat edin. NOT: Sıçan hipokampus, örneğin, serebral hemisferin posterior kısmına yakındır. Böylece doku şekilde gömülü olmalıdır beynin posterior kısmında kesit başlar söyledi. Istenen anatomik yapıyı ulaşmak için bir rehber olarak Paxinos atlas 8 kullanın. </li><li> Hava hareketleri zor bölümlerden işlenmesini yapmak beri uzak, hava taslaklar veya kapı gelen mikrotom yerleştirin. </li><li> Bu derinlik gerekli olduğu gibi tam astrositlerin Z-Stack görüntüler üretmek için bir kalınlık ≥20 um ile bölümleri kullanın. Onlar istenmeyen kalınlığa sahip olabilir ısıl e, ilk çift bölümleri kullanmayınXpansion. </li><li> (5 ± 2 ˚C, parafin erime sıcaklığının altında) sadece yeterince uzun bölümler düzleştirmek için ılık su yüzeyinde bölümleri yerleştirin. NOT: bölümün genişleme yapısının morfoloji rahatsız edebilir Aşırı. Dikkatle bölümleri aktarmak için minik fırça kullanın. Her slaytta iki ya da üç bölümden toplayın. </li><li> Mağaza dik bir pozisyonda rafa slaytlar ve çeşitli saat veya O / N 37 ° C&#39;de kurumaya bırakın. </li></ol> 2. İmmünhistokimya <ol><li> Deparaffinize ksilen bölümler, 2 x 10 dakika, ve alkol gradyanı ile (99.8,% 95 ve% 70,% 10 dk) ve PBS rehidrate. </li><li> % 0.25 sığır serum albümini (BSA),% 0.25 Triton X-100 ve% 3.5 normal serum (4 ° C&#39;de O / N) içeren PBS içinde 1500: glial fibriler asidik protein (GFAP) yönelik antikorlar ile inkübe 1 seyreltilmiştir. </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. </li><li> İkincil alkalin fosfat ile konjüge edilmiş Antikorların kuluçkalayın1 saat s (PBS içerisinde 1: 100 seyreltilmiş, 21 ° C,). </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. NOT: Bu arka plan boyama en aza indirmek için ikincil antikorlar sonra düzgün bölümleri yıkamak önemlidir. </li><li> Sıvı Daimi Kırmızı kromojeni (15-20 dk) ile karanlıkta bölümleri inkübe edin. Not: Kullanımdan önce en fazla 30 dakika çözeltisi hazırlayın. </li><li> 3 x 5 dakika boyunca PBS bölümleri yıkayın. </li><li> Son olarak, 4-6-diamidino-2-fenilindol çekirdekleri leke (DAPI; PBS içerisinde 1: 500 seyreltilmiş), önceden kapak-kayma. Mikroskopi önce buzdolabı 24-48 saat slaytlar saklayın. </li></ol> 3. Konfokal Mikroskop NOT: kantitatif değerlendirme (aşağıya bakınız) için, hata riskini azaltmak için şube örtüşen minimum açıkça görülebilir DAPI lekeli çekirdeğe sahip bir astrosit seçin. Z-Stack görüntüler üreten zaman alıcıdır. Sabırlı olun ve işleme sırasında bitmiyor. Dik konfokal lazer tarama mikroskobu u olduğuastrositlerden 3D görüntüler oluşturmak için sed. <ol><li> Mikroskop-sahnede slayt yerleştirin ve 63X objektif seçin. </li><li> Görüntüleme yazılımı açın ve Start sisteminde tıklayın. Locate sekmesine tıklayın. Ata gidin ve uygun ışık ayarlamak için GFP seçin. </li><li> Işığı yansıtmak için Shutter açın. Shutter sağ tarafındaki Reflektör Revolver bulun ve astrositler (yeşil, kırmızı veya mor) tarafından yansıtılmalıdır rengi seçin; (FSet20 wf) kırmızı renk burada kullanıldı. NOT: mikroskobunun oküleri doğrudan resmi odaklanmak unutmayın. </li><li> En iyi Odağı bulmak için, tüm kapalı tıklayın ekran modunda mikroskop pimini koymak ve Toplama sekmesine tıklayın. </li><li> Toplama sekmesi altındaki Akıllı Kur tıklayın; Bir pencere açılır. Listeden (geçerli proje yani DAPI ve Alexa Fluor 555) uygun fluorofor seçin. Renk otomatik olarak seçilir. </li><li> En iyi sinyal üzerine tıklayın ve uygulayın, ardından Set Pozlama tıklayın; Daha sonra bilgisayar otomatik olarak pozlama parametrelerini ayarlamak olacaktır. </li><li> Görüntüyü optimize için Kanallar penceresine gidin. Kaldır Track2, Track1 vurgulayın ve canlı tıklayın. Gerekirse görüntü odaklanın. </li><li> Kanallar penceresinde aşağıdaki anahtarları ayarlamak; otomatik iğne deliği optimize etmek 1AU tıklayın. Aksi takdirde konfokal görüntüleri optimal olmayan olacaktır bu adımı yapmak çok önemlidir. En iyi yoğunluğunu (ekstra gürültüyü azaltmak için 800 altında bu ayarı tutmak) için Kazanç ayarlayın. Son olarak, 2 ve 3 arasında Dijital Kazanç ayarlayın. </li><li> Kaldır Track1 Track2 tıklayın ve Track2 için Adım 3.8 tekrarlayın. Sonra Canlı dur. </li><li> Toplama Modu penceresine gidin. Çerçeve Boyutu optimize ve Averaging görüntüyü geliştirin. Değiştirmek için çerçeve boyutu X * Y gidip x 1,024 1.024 seçin. Daha iyi bir görüntü oluşturmak için yavaş Speed ​​seçin. </li><li> Ortalaması gidin ve Numara ≥4 seçin. Bu ortalama değer özel üretmek için ortalama edilecek taramaların sayısını gösteriredinilen görüntüyü e. Şimdi Yapış düğmesini tıklatın ve yakalanan 2B görüntüyü kaydedin. </li><li> 3D görüntüleme için, Z-Stack penceresi açmak için neden Akıllı Kur kapsamında Z-Stack öğeyi işaretlemek. </li><li> Hücrenin derinliği, yani Z-Yığın için ilk ve son pozisyonları ayarlayın. İlk Canlı tıklayınız. Sonra Z-Stack başlatmak için dokuda astrosit en üst pozisyona odaklanmak için mikroskop odak sürücü kullanın. Set İlk tıklayın. Sonra Z-Stack tarama kesilmelidir dokuda astrosit en düşük pozisyona aşağı odaklanın. Set Son üzerine tıklayın. Sonra Canlı dur. </li><li> Aralığı Seçin; 1.01 mikron Bu çalışmada kullanılan; seçme aralığı dilim sayısını ayarlamak için Optimal tıklayarak yapılabilir. </li><li> Başlat Deneyi tıklayın. Tarama tamamlandığında görüntüleri kaydetme. Yüzey alanı ve astrosit topraklarının hacmi, tüm astrosit dahil sutyen: Bu görüntü aşağıdaki parametrelerin ölçümü için kullanılacaknches hücre gövdesi ve çekirdek. </li><li> Adımlar 3,6-3,11 de tarif edildiği gibi, bir 10X ya da 20X objektif kullanarak bir 2D görüntü elde. Bu görüntü ölçümü için antikorların floresan immüno ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 um 2) yoğunluğu kullanılabilir. </li></ol> 4. Astrosit yoğunluğu ve GFAP + Floresans yoğunluğu <ol><li> 20X 2B görüntü açın. Görüntü penceresinin sol tarafındaki Histo (Hisogram) tıklayın. </li><li> Astrosit yoğunluğunu hesaplamak için, 20X objektif altında arka arkaya üç görsel alanları seçin. Alanlarda şube örtüşen, minimum net soma sergileyen astrositlerde sayısını. </li><li> Floresan ölçmek için, görüntü penceresinin altbilgi üzerinde uygun bir alet (dikdörtgen veya daire) seçin ve ölçümü için bir alan seçin. Ortalama değer ve standart sapma görüntünün altında otomatik olarak görünür unutmayın. Str arasındaki mevcut çalışmada, 0.7 mm 2 dikdörtgen alaniatum ve dentat girusun medial bıçak kullanılmıştır. </li></ol> 5. Astrosit Şubeler <ol><li> Şube uzunluğu ve toplam sayısını ölçmek için, görüntü analiz yazılımı (20X ile kazanılmış) 3D görüntüler kullanın. Seçilen astrosit her dalının uzunluğu boyunca elle bir çizgi çizin. Sonra hat-uzunluk ölçmek için uzman ölçme-aracını seçin. Şube sayısını ölçmek için, işaretli öğelerin sayısını saymak için sayım aracını seçin. </li></ol> 6. Hacim ve Yüzey Alanı NOT: 3D görüntü analiz yazılımı elle bir yapıya işaretleme odak ve eğitim gerektirir. Bir deney başlamadan önce birkaç kez uygulayın. <ol><li> Astrosit çekirdeğinin, soma, hücre gövdesi ve toprak hacim ve yüzey alanı ölçmek için, örneğin Volocity 6.1 gibi 3D görüntü analiz yazılımı (Merdivenleri 3,1-3,16 elde) 3D görüntü aktarmak. </li><li> Yazılımını açın ve yeni bir oluşturmakkütüphane. Yeni kütüphanede sol gri sütuna tüm görüntüleri sürükleyin. Sonra bir 3D görüntü seçin. Sağda, farklı renklerde, farklı kanallar vardır. Çevrede bir kanalda açın; Örneğin DAPI için mavi kanal çekirdeğe ölçerken. Optimal kontrast elde etmek için elle parlaklığını değiştirin. </li><li> Araçlar menüsünü seçin, Ses yapın ve Z-yığın görüntüleri dışarı tek bir 3D görüntü üretmek için gidin. Düzen menüsünde Özellikler&#39;i tıklatın ve X, Y ve Z özellikleri sunulmaktadır emin olun; aksi takdirde 3D analizlerini yürütmek mümkün değildir. </li><li> Araç çubuğundaki Freehand RIO aracı simgesini tıklayın. Astrosit çekirdeğinin hacmi ve yüzey alanı ölçmek için DAPI etiketli çekirdeği etrafında bir çizgi çizin. </li><li> Astrosit hücre gövdesi hacmi ve yüzey alanı ölçmek için şubeler hariç soma etrafında bir çizgi çizin. </li><li> Tüm astrosit (şubeler dahil hücre gövdesi) hacmi ve yüzey alanı ölçmek için aşağıdaki soma etrafında bir çizgi çizintüm branşlarda yüzey. </li><li> Astrosit topraklarının hacmi ve yüzey alanı değerlendirmek için şube uçları arasına bir çizgi çizin. NOT: Basın istenmeyen çizimleri silmek için klavyedeki Delete. </li><li> Bir ölçüm protokolünü oluşturmak için görüntü penceresinin üst kısmında ölçümler menüsüne tıklayın; farklı araçlar içeren bir pencere açılır. </li><li> Sürükle penceresi (bölme) üstüne nesneleri bulun. Nüfus 1 açıklayıcı bir ad verin ilişkili rengi seçin ve Tedbir tıklayın. Başka bir pencere açılır. </li><li> Bir parametre, yani hacim veya yüzey alanı seçin. Tamam&#39;a tıklayın. Veriler tabloda görünecektir. </li><li> Ölçüm menüsünde veri tıklayınız kaydetmek ve Ölçüm Item seçeneğini belirleyin. </li><li> Açılan pencereden adlı yeni bir ölçüm öğesini seçin. Sonra verilere bir ad verin ve Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> Son olarak, Graph ped olarak istatistik yazılımı veri ihracat veya programı excel. Verileri analiz t-testi kullanın, ardından 2B gr arsaAPHS. </li></ol>

<ol>
	<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Pellerin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+energy+metabolism+by+astrocytes:+an+update.">Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update.</a> Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).</li><li>Pekny, M., Nilsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation+and+reactive+gliosis.">Astrocyte activation and reactive gliosis.</a> Glia. 50 (4), 427-434 (2005).</li><li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation.">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li><li>Anderova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death/proliferation+and+alterations+in+glial+morphology+contribute+to+changes+in+diffusivity+in+the+rat+hippocampus+after+hypoxia-ischemia.">Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).</li><li>Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+surgery+for+excitotoxic+lesion+of+specific+brain+areas+in+the+adult+rat.">Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat.</a> J Vis Exp. (65), e4079 (2012).</li><li>Bagheri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta(1-40)-induced+astrogliosis+and+the+effect+of+genistein+treatment+in+rat:+a+three-dimensional+confocal+morphometric+and+proteomic+study.">Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study.</a> PloS One. 8 (10), e76526 (2013).</li><li>Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+confocal+morphometry+-+a+new+approach+for+studying+dynamic+changes+in+cell+morphology+in+brain+slices.">Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices.</a> J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).</li><li>Kulkarni, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3-D+analysis+of+GFAP+labeled+astrocytes+from+fluorescence+confocal+images.">Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images.</a> J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).</li><li>Wagner, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object-based+analysis+of+astroglial+reaction+and+astrocyte+subtype+morphology+after+ischemic+brain+injury.">Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury.</a> Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).</li></ol>

Bu çalışma Tıp Bilimleri İran Üniversitesi (Tahran, İran) Östergötland County Konseyi (İsveç) ve Hücresel ve Moleküler Araştırma Merkezi hibe ile desteklenmiştir.

Geçerli protokol, astrosit morfolojisi ile ilişkili 12 farklı parametrelerini değerlendirmek için 3D konfokal morfometrisi kullandı. Bu amaçla, Aβ 1-40 olan sıçanların hipokamp dokusunda - ya da bir anti-enflamatuvar ajan olarak genistein, ön muamele olmaksızın uyarılan astrogliyozun kullanılmıştır. 3D görüntüler ve morfometrik yazılımını kullanarak, astrositlerde morfolojisi yani astrogliyozun üzerinde genistein etkisini göstermek başardık. Beyin dokusu içi ve hücre dışı ortamda değişiklikler hücre / doku hacmi ve / veya boyutu değiştirebilir. Bu değişiklikler, çeşitli beyin yaralanmalarında 3,11 patolojik işaretlerinden kabul edilir. Bu değişiklikler ölçmek için, bir takım teknikler kullanılır. Çoğu soruşturmalar sadece ce küçük bir kısmını hakkında bilgi vermek ışık veya elektron mikroskobu (EM) tarafından yakalanan 2D düşük çözünürlüklü görüntüleri kullanarak dayanmaktadırll. Bu sınırlamayı aşmak için, yüksek çözünürlüklü görüntüler 3D konfokal morfometrisi 11 geliştirilmiştir. Konfokal mikroskopi diğer bir avantajı, Z-yığın görüntüleme gerçekleştirilir ise birkaç ardışık 2D görüntüler elde edildiğinden, bir hücre mimarisi incelenebilir olmasıdır. Buna ek olarak, 3D konfokal mikroskopi arka plan gürültü 11 filtreleyerek resimlerin kalitesini artırmak için olasılığını yükseltir. Burada sunulan yöntem zaman alıcıdır; konfokal mikroskop ile Z-Stack görüntüleri alarak her bir hücre için birkaç dakika sürer. Buna ek olarak, elle yazılımda bir yapıyı işaret biraz pratik gerektirir ve araştırmacı yapısı doğru işaretlenmiş olduğundan emin olmak için çizim birkaç kez yinelemek gerekebilir. Böyle Volocity olarak 3D görüntü analiz yazılımı &#39;Magic&#39; sekmesi, otomatik olarak tek bir görüntüde tüm DAPI lekeli çekirdekleri işaretlemek için kullanılabilir belirtilmelidir. Bu seçenek kullanılabilenastrositler kültürlenir. Beyin kesitleri, ancak, aynı zamanda bu tür astrositleri mikroglia ve nöronlar gibi diğer birçok hücre da içermektedir. Bu DAPI lekeli çekirdeklerin birçok astrositlere ait değilsiniz demektir. Astrositlerde ile ilişkili çekirdekler elle DAPI etiketli çekirdek ve GFAP-immünoreaktif astrositler ikisine birden sahip olan görüntüleri kullanarak işaretlenmiş olmalıdır. Bu protokol, GFAP karşı antikorlar, parafin bölümlerinde astrositler görselleştirmek için kullanılmıştır. Astrositler da diğer antijenlere 12,13, veya transgenik farelerin kullanılması ile görselleştirilebilir. Araştırmacılar yöntemlerin sınırlamaları farkında olmak ve onların amaçlarına dayalı mümkün olan en iyi deneysel tasarım kullanmalısınız. GFAP karşı antikorlar kullanılarak sınırlama, örneğin, hücre iskeletinin sadece% 10-15 tespit edilebilir olmasıdır. Astrogliyozun çalışılırken Bu sınırlama, ancak, bir avantaj haline gelebilir; astrositlerde artış numarası ve olarak astrositler şubelerine yoğun bir ağtrogliosis hücresinin daha büyük bir alan tespit edilmesi durumunda zor bir tek hücre tespit etmek yapabilir. Bu protokol olmasına rağmen 12 farklı parametrelerin ölçümü tarif ama araştırmacı amaçlarına uygun olanları seçebilirsiniz. Deneyimlerimize göre, tüm parametrelerin ölçümleri anlamlı belli bir durumda ya da tedavi etkilenen parametreler hakkında değerli bilgiler verebilir. Konfokal mikroskop yakalanan 3D resim üzerinde gerçekleştirilen ölçme yöntemi aynı zamanda, donmuş bölümler üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu adımlar doku küçülmesi veya şişme yol açabilir çünkü mesele benzer bir şekilde örnekleri (tespit, dehidratasyon, gömme ve kesit) tedavi etmektir. Sonuç olarak, 3D konfokal görüntüleme, morfometrik yazılımı ile kombinasyon halinde, mümkün bir hücre morfolojisi ile bağlantılı çok sayıda parametre belirlenmesine olanak tanır. Burada sunulan protokol morfolojik chan değerlendirilmesi için kullanılabilirfarklı patolojik koşullarda ya da bir müdahale stratejisinin etkisi olarak, bir hücre görünür ges.

Sağlıklı, merkezi sinir sistemi (CNS) içinde, astrositler, kan akışı, enerji metabolizmasında, sinaptik fonksiyon ve plastisite ve hücre dışı iyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar ve nörotransmitter 1-3 homeostazı. Buna ek olarak, astrositler farklı zararlı uyaranlara ve hipertrofisi, çoğalması ve astrositler 4,5 fonksiyonel biçimlenme ile karakterizedir reaktif astrogliyozun yoluyla travma, enfeksiyon, iskemi veya nörodejenerasyon gibi anormal şartlarda cevap. Reaktif astrogliasis terapötik girişimlerin klinik sonuçlarını etkileyebilir, bu nedenle, dokuda inflamatuar yanıtı ve onarım sürecini mühendis ve olabilir. Buna göre, astrocytes MSS etkileyen hastalıkların çeşitli terapötik müdahaleler için potansiyel hedefler olarak son yıllarda nörobilimci dikkati aldık. Astrositler normalde iyi-d ile stellat şekli varsoma 6 çevresinde yayıldı efined dalları. Beyindeki hastalıklı durumda, astrosit dalları kıvrık hale gelir ve amiloid beta (Aβ) mevcudiyetinde, örneğin, şiş uçları 7 göstermektedir. Bu makale konfokal mikroskobu ile elde edilen astrositlerin 3D görüntüleri analiz etmek için bir protokol sunar. Her astrosit için on iki farklı sayısal parametreler ölçüldü: yüzey alanları ve astrosit topraklarında (bir astrosit kaplı dokusu), (şubeler dahil) tüm hücre, hücre gövdesi ve nükleus hacimleri; Toplam uzunluğu ve şube sayısının; astrosit tespiti için kullanılan antikorların flüoresan yoğunluğu; ve astrositlerde yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2). Bu amaçla, ya da bir anti-enflamatuvar madde olarak genistein muamelesi olmadan Aβ 1-40 enjeksiyon intrahipokampal maruz farelerin beyin bölümleri kullanılır. Açıklanan protokol morfometrik An için kullanılabilirin vitro veya farklı koşullar altında in vivo olarak farklı hücre tipleri Analizi.

<table><tbody><tr><td>Amyloid beta 1-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>79793</td><td>Keep in -70 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Genistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>446-72-0</td><td>keep in -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td><td>DAKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Permanent Chromogen</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td><td>DAKO</td><td>K0640</td><td></td></tr><tr><td>Cremophor EL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27963</td><td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td></tr><tr><td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Perkin Elmer Inc.,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis 2000</td><td>Tekno Optic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streotaxic apparatus</td><td>Stoelting</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graph pad Prism 5</td><td>Graph pad software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

Beyindeki glial hücreleri gibi, astrositler, merkezi sinir sistemindeki çeşitli işlevsel rolleri vardır. Zararlı uyaranların varlığında, astrositler işlevsel ve yapısal özellikler, reaktif astrogliasis denilen bir durum değiştirir. Burada, astrositler morfolojik özelliklerin değerlendirilmesi için protokol verilmektedir. Bu protokol şube yüzey alanı ve bir astrosit (astrosit topraklarında) kapsamında dokusu, şube, hücre gövdesi ve nukleus dahil olmak üzere tüm astrosit, hacmi, yani 12 farklı parametrelerin ölçümü yanı sıra toplam uzunluğu ve numarasını içeren, şiddeti astrosit tespiti için kullanılan antikorların floresan immünoreaktivitesinin ve astrosit yoğunluğu (sayı / 1000 mikron 2) evi. Volocity 6,3 ölçümleri için kullanılmıştır gibi, bu amaç için, üç boyutlu (3D) odaklı mikroskopik resimleri oluşturulur, ve 3 boyutlu görüntü analizi yazılımı gibi bulundu. Amiloid beta 1-40 maruz Sıçan beyin dokusu </ya da terapötik bir müdahale olmaksızın alt&gt; (Aβ 1-40) bir yöntem mevcut için kullanılmıştır. Bu protokol, aynı zamanda, in vivo ya da in vitro koşullarında ya da diğer hücre 3D morfometrik analizi için kullanılabilir.

Bu bölüm 3B morfometrik analizi ile üretilen, nicel ve nitel gözlemlere ilişkin bazı örnekler verilmektedir. Daha önce de belirttiğimiz 12 parametrelerin tam sonuçlar için, önceki yayın 10 bakın. Nitel Gözlemler Astrositler Aβ 1-40 enjekte sıçanlar (Şekil 1) genellikle uzun olan ince veya kalın dalları sergiledi. Kısa dalları ile birkaç küçük stellat şeklindeki astrositler serebral korteks gözlendi ve astrositlerde kompakt bir ağ korpus kallosum oluştu. Genistein tedavi takip Aβ 1-40 -injection hayvanların beyin dokularında Astrositler (Şekil 2) 10 kısa ve ince dalları ile bir stellat formu sergiledi. Birkaç astrositler atrofik çıktığını gösterdi. Astrosit yoğunluğu ve GFAP +Floresans yoğunluğu Astrositlerde ortalama sayısı / 1000 mikron 2 Aβ 1-40 -injection hayvanlara ve genistein tedavi grubunda (p &lt;0.0001) ile karşılaştırıldığında Aβ 1-40 -injection ile sıçanlarda anlamlı olarak yüksek bulundu. Buna ek olarak, GFAP + floresan yoğunluğu hayvanlar (Şekil 3), işlem görmemiş Aβ 1-40 um olan mikrokürecikler kıyasla genistein tedavi beyin kısmında önemli ölçüde daha düşük enjekte edilmiştir. Astrositler Hacminin MORFOMETRİK Analizi Astrosit çekirdeği, hücre gövdesi, tüm astrosit ve astrosit topraklarının hacmi tedavi edilmeyen hayvanlara kıyasla genistein tedavi grubunda önemli ölçüde azalmıştır. Bu sonuç genistein amiloid varlığında (- D Şekil 4A) neden astrogliyozun ıslah düşündürmektedir. Bir astrosit Şekil 1. Konfokal görüntü. Aβ 1-40 hipokampal enjeksiyonu tabi bir sıçan beyninde kalın ve uzun dalları (ok başı) ve DAPI etiketli çekirdeğe (ok) ile bir birey astrosit. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53113/53113fig1large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53113/53113fig2.jpg" /> Bir astrosit 2. Konfokal görüntüsünü Şekil. Kısa dalları (ok başı) ile bir astrosit. Aβ 1-40 -injection ve besleme yoluyla uygulanan genistein ön işleme tabi hipokampal sıçan beyninde. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53113/53113fig2large.jpg" target="_blank">P</a><html> kira bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53113/53113fig3.jpg" /> Şekil 3. GFAP + floresan yoğunluğu bir β 1-40 hayvanlarda önemli ölçüde azalmıştır -. Genistein öncesi tedavi enjeksiyon Değerler ortalama ± SEM bulunmaktadır. Hayvan başına elli astrositler 0.05 anlamlı olarak kabul edildi &lt;p. Değerlendirildi ve T-testi ile veya tedavi olmadan gruplar arasındaki verileri karşılaştırmak için kullanıldı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53113/53113fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> g &quot;/&gt; Şekil 4. ortalama dallar dahil olmak üzere, çekirdeğin (A), hücre gövdesi (B), astrosit (hacmi ile birlikte veya olmadan, Aβ 1-40 -injection tabi sıçanlardan alınan beyin örneklerinde (C), ve bölge (D) genistein ön arıtma. genistein anlamlı nükleus, hücre gövdesi, tüm astrosit ve astrosit topraklarında (ref 10). Değerler hayvan başına ± SEM. Elli astrositler değerlendirildi ortalamasıdır. p &lt;0.05 genişlemesi iyileştirilebilir anlamlı kabul edildi T-testi öncesi ve tedavi sonrası gruplar arasında verileri karşılaştırmak için kullanıldı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53113/53113fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes at JoVE.com

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Görüntüleme.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Video: Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Nörobilim

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biyoloji

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Boyut, şekil ve yön ağlar yönetim eşleşmiş Astrocytes analiz

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at adult stages. Thus far, no immunostaining strategy can single them out and segment their morphology in mature animals and over the course of corticogenesis. Cortical PrA originate from progenitors located in the dorsal pallium and can easily be targeted using in utero electroporation of integrative vectors. A protocol is presented here to label these cells with the multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) Markers strategy, which relies on piggyBac/Tol2 transposition and Cre/lox recombination to stochastically express distinct fluorescent proteins (blue, cyan, yellow, and red) addressed to specific subcellular compartments. This multicolor fate mapping strategy enables to mark in situ nearby cortical progenitors with combinations of color markers prior to the start of gliogenesis and to track their descendants, including astrocytes, from embryonic to adult stages at the individual cell level. Semi-sparse labeling achieved by adjusting the concentration of electroporated vectors and color contrasts provided by the Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers or MM) enable to individualize astrocytes and single out their territory and complex morphology despite their dense anatomical arrangement. Presented here is a comprehensive experimental workflow including the details of the electroporation procedure, multichannel image stacks acquisition by confocal microscopy, and computer-assisted three-dimensional segmentation that will enable the experimenter to assess individual PrA volume and morphology. In summary, electroporation of MAGIC Markers provides a convenient method to individually label numerous astrocytes and gain access to their anatomical features at different developmental stages. This technique will be useful to analyze cortical astrocyte morphological properties in various mouse models without resorting to complex crosses with transgenic reporter lines.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytes tile the cerebral cortex uniformly, making the analysis of their complex morphology challenging at the cellular level. The protocol provided here uses multicolor labeling based on in utero electroporation to single out cortical astrocytes and analyze their volume and morphology with a user-friendly image analysis pipeline.

Kortikal Fare Astrositlerini Bireyselleştirmek için Çok Elbiseli Genom Bütünleştirici Renk (MAGIC) İşaretçilerinin Utero Elektroporasyonunda

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the brain. Through these interactions, astrocytes actively regulate many critical brain functions, including synapse formation, neurotransmission, and ion homeostasis. In the rodent brain, astrocytes grow in size and complexity during the first three postnatal weeks and establish distinct, non-overlapping territories to tile the brain. This protocol provides an established method for analyzing astrocyte territory volume and astrocyte tiling using free-floating tissue sections from the mouse brain. First, this protocol describes the steps for tissue collection, cryosectioning, and immunostaining of free-floating tissue sections. Second, this protocol describes image acquisition and analysis of astrocyte territory volume and territory overlap volume, using commercially available image analysis software. Lastly, this manuscript discusses the advantages, important considerations, common pitfalls, and limitations of these methods. This protocol requires brain tissue with sparse or mosaic fluorescent labeling of astrocytes, and is designed to be used with common lab equipment, confocal microscopy, and commercially available image analysis software.

This protocol describes methods for sectioning, staining, and imaging free-floating tissue sections of the mouse brain, followed by a detailed description of the analysis of astrocyte territory volume and astrocyte territory overlap or tiling.

Astrosit Bölgesi Hacminin Analizi ve Kalın Serbest Yüzen Doku Kesitlerinde Döşeme

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

Immunostaining of Fluorescently Labeled Astrocytes in a Mouse Brain Tissue Section

Source: Eaker, A. R., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63804">Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for immunostaining a fixed mouse brain tissue section with fluorescently labeled astrocytes using primary and secondary antibodies and capture the images of the stained astrocytes through confocal microscopy.

Source: Eaker, A. R., et al. Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (2022)
This video ...