Bu çalışma NIH R01 GM47607, CA163296 ve CET NSF 1334493 tarafından desteklenmektedir. Biz yazının eleştirel okuma Turner laboratuar üyelerine teşekkür ediyorum. Bu raporda gösterilen tüm veriler Wormer ve ark., 2014 11 izni ile yeniden üretildi.

Durotaxis Chambers hazırlanması 1. <ol><li> Bir 6-yuvalı doku kültürü plakası hazırlanması için, 50 ml konik tüp ile denge dara. 50-ml tüp PDMS baz çözeltisi yaklaşık 10 gr tartılır (çözüm oldukça viskoz). </li><li> 90: 1 substrat (~ 1 kPa Uyum), gerekli çapraz bağlayıcı çözeltisinin doğru miktarını belirlemek için 90 ile tüp içinde PDMS baz çözeltisi ölçülen kilo bölün. Aynı tüp PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi hesaplanan miktar ekleyin. Örnek: 10 g / 90 = 0.11 g. PDMS baz çözeltisine PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi 0.11 g ekleyin. NOT: Baz ve çapraz bağlayıcı çözümleri hem PDMS kit sağlanmaktadır. </li><li> Şiddetle küçük bir spatula kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PDMS baz / çapraz bağlayıcı karışımı karıştırın. Bu aşamada kanşım hava kabarcıkları çok sayıda içerir. </li><li> Bub çıkarmak için oda sıcaklığında 50 x g&#39;de 5 dakika boyunca, bir tezgah üstü santrifüj içinde PDMS substratı santrifüjbles. Varsa hala tekrar 5 dakika, santrifüj sonra kabarcıklar. </li><li> 90 pipetle 1 ml: Doku kültürü her oyuğuna 1 PDMS alt-tabaka 6 oyuklu plaka işlemden geçirildi. PDMS mevcut olan herhangi bir geri kalan hava kabarcıkları, bir 21 G iğnesi kullanılarak bunları haşhaş bu aşamada elimine edilebilir. PDMS oyuk 30 dakika boyunca yaymak için izin verir. </li><li> Kaynama 12 mm cam # 5 dakika için damıtılmış su içinde 1 lamelleri. Iki kez tekrarlanır ve damıtılmış su içinde lamelleri saklayın. </li><li> Yavaşça PDMS üzerine lamel damla PDMS çözeltisi içine lamel bir tarafını dokunarak doku kültür plakasının her bir oyuğuna, bir kurutulmuş, lamel yerleştirin. Lamel yerleşir gibi, PDMS lamel kenarları boyunca tecâvüz başlayacak, ama tamamen kapsayacak olmaz. Bu (B Şekil 1A bakınız) sertleştikten sonra PDMS ve cam arasında bir arayüz oluşturur. </li><li> PDMS tedavi (sertleşmesine) 16 saat için bir fırın içinde 70 ° C &#39;de plaka inkübe edin. Plat yerleştirinBir hücre kültürü kaputu ve UV e 10 dakika süreyle sterilize edin. NOT: Bu kullanım bir kaç gün içinde plakaları yapmak en iyisidir. Bununla birlikte, levha Herhangi bir tampon maddesi olmadan Parafilm ile sarılmış ve kalitede herhangi bir fark azalma olmadan, 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 2. Hücre Ekimi NOT: siRNA aracılı demonte etkisini inceleyerek varsa, üreticinin talimatlarına veya seçim hücre tipi için optimize edilmiş protokolü kullanılarak demonte gerçekleştirin. <ol><li> Kaplama, her 37 ° C &#39;de 1 saat süre ile, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın / ml fibronektin PBS içinde 10 ug 1 ml bölmeyi durotaxis. Seçenek olarak ise, fibronektin, 4 ° C&#39;de 16 saat boyunca / ml fibronektin PBS içinde 10 ug PDMS inkübe ile analizden önce gün tatbik edilebilir. Tüm yüzey PBS çözüm fibronektin batmış olduğundan emin olun. </li><li> Isı ile denatüre edilmiş,% 1 BSA hazırlayın. 0,5 g BSA tartılır ve 50 ml PBS içinde çözülür.Filtre 12 dakika boyunca 80 ° C &#39;de, 0.22 um&#39;lik bir filtreden ve ısı yoluyla çözüm sterilize edin. Not: Bu çözüme 4 ° C&#39;de kaplama ve mağaza hücre öncesinde güne hazırlayın. </li><li> Fibronektin solüsyonu aspire edildi ve PBS ile 3 kez yıkayın. Her bir oyuğa, PBS içinde ısı ile denatüre BSA 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Durotaxis odaları ısı denatüre BSA ile bloke ederken Trypsinize ve seçim hücreleri saymak. </li><li> Levha seçim, belirli bir hücre tipi için gerekli ortam kullanılarak durotaxis bölmesinin her bir kuyunun içine 2 ml lik bir hacim içinde, 1 x 10 5 hücre. Hücreler uygun ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 4 saat süre ile alt-tabaka üzerinde yayılmasına izin verir. Not: U2OS hücreleri rutin 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 10 lU / ml penisilin, 10 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş,% 10 FBS bulunan DMEM içerisinde muhafaza edilir. NOT: Bu örnekte kullanılan hücre sayısı için optimize edilmiştirU2OS hücreleri. Diğer hücre türleri için optimizasyon gerekebilir. Bu yoğunluk hücreleri, diğer hücrelerle önemli etkileşimler olmadan geçirmek için yeterli oda verir. </li></ol> 3. Canlı hücre Görüntüleme <ol><li> 10X amacı ile faz kontrast kullanarak, ters bir mikroskop canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Mikroskop, uzun vadeli görüntüleme sırasında 37 ° C sıcaklığın kontrol edilmesi ve% 5 CO2 sağlayan kapalı bir çevre, nemli bir bölmede ile donatılmış olmalıdır. </li><li> Hücreler yaklaşık 3.5 saat boyunca yayıldı sonra, mikroskop odasında plaka monte edin. Örnek (ler) 30 dakika boyunca oda içinde dengelenmeye bırakın. </li><li> Varsa mikroskop ziyaret otomatik, çok noktalı ayarlayın. 90 arasındaki arayüze odaklanın: 1 PDMS ve cam lamel ve tüm durotaxis odasına başına 40 sayılık bir ortalama ile arayüzü etrafında görüntü noktaları seçin. Resim hücreleri kadar 16 saat boyunca her 10 dakikada bir. NOT: Yenidenilgi gion lamel kenarı ve PDMS ve kapak arasında fiili bir arayüz karşılık gelen iç hat karşılık gelen dış hat ile, iki çizgi olarak görünür. Şekil 1B bakınız. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Tablo 1 deki gibi bir elektronik tablo oluşturur. </li><li> Üretilen her film cam yüzey ve tersi PDMS gelen geçiş olaylarının sayısını. Excel uygun sütununda geçiş olaylarının numarasını kaydedin. NOT: Bir geçiş olayı her iki yönde PDMS ile cam arasındaki sınır üzerinden geçen hücre çekirdeğinde olarak tanımlanır. </li><li> Birden geçişleri ölçmek için, hücre arayüzü geçti sayısını saymak. Bu sayı, hücre filmin sonunda yer edildiği yüzeye karşılık gelen excel sütunda kayıt altına alınmalıdır. T arayüzü haçlar her hücre için analiz tekrarlayınO film. Görüntüleme sırasında görüş alanının dışına göç hücreleri hariç. NOT: Bu hücrelerin fibronektin kaplı PDMS ve cam lamel yüzeylerine eşit olarak yapışır mümkün olduğunu, denemenin başında sayma hücre tarafından, doğrulamak için de önemlidir. </li><li> Cam yüzey (yani, durotaxis yapıldı) için PDMS göç hücrelerinin yüzdesini hesaplayın. Yumuşak sert ve geçiş olaylarının toplam sayısına göre sert ve bölmek tarihinde sona eren birden geçiş olaylara olayları kapısı sayısını ekleyin. </li><li> Geçitlerin toplam sayısına göre birden geçişleri sayısına bölünmesiyle birden geçişleri yüzdesini hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+cell+migration+by+tugging.">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+focal+adhesion+assembly:+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates.">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li><li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing.">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li><li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis.">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).</li><li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness.">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li><li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

Bu yazıda hücrelerin taşınmasıyla durotaxis incelemek için basit bir tahlil açıklar. Bu deneyde önemli bir gücü PDMS kullanarak durotaxis odaları hazırlamak kolaylığıdır. Alt-tabakaların sertliği, kolayca deneyinde, çeşitli katılıklarının bir çalışma sağlamak için bir çapraz bağlayıcı PDMS baz çözeltisi oranı değiştirilerek kontrol edilebilir. Ancak, sistemin bir potansiyel sınırlama daha sofistike sistemlerin 4 tarafından sağlanan bir sertlik degrade yaşandığı karşıt olarak hücreler sadece alt tabaka sertlik tek bir değişime maruz olmasıdır. Önemli olarak, poliakrilamid alt tabakalar farklı olarak, ECM bileşenleri kimyasal olarak çapraz-bağlanmış PDMS olmak zorunda değildir. Fibronektin 11 özel bir antikor ile lekelenmesi ile saptandığı haliyle Gerçekten de, fibronektin kaplama PDMS ve cam yüzeylerde hem eşdeğerdir. Önceki çalışmalar hücreler ya PDMS veya poliakrilamid yüzeylerde, kullanım o aynı davrandığını göstermiştir beriyüzeyler f PDMS hücrelerinde 10,12 yılında mekanotransdüksiyonu incelemek için ile çok daha kolay bir model sunmaktadır. PDMS substratların hazırlanmasında en önemli adımı taban ve çapraz bağlayıcı solüsyonlar iyice karıştırılır sağlamaktır. Onlar yeterince karışık değilse, o zaman yüzeyler tamamen ısıl işlemden sonra tedavi olmaz. Bu lamel PDMS içine çok batıyor veya lamel görüntüleme sırasında PDMS sürüklenen neden olacaktır. Santrifüj kuvveti çok yüksek ise, taban ve çapraz bağlayıcı solüsyonlar tüp içinde ayrılabilir. Bu santrifüjleme hızı azaltarak veya bir vakum odacığı kullanılarak 30 dakika boyunca karışımın gazının giderilmesi çözülebilir. Son olarak, hücre yoğunluğu çok fazla hücre yeteneğini tamamen yaymak için ve komşu hücrelerle temas yoluyla engelsiz durotax için etkileyecektir gibi kritik öneme sahiptir. Burada rapor yoğunluğu U2OS hücreleri için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, diğer hücre tipleri kullanıldığında, uygun cell numaraları ampirik olarak tespit edilmesi gerekecektir. Biz son zamanlarda protein cdGAP sinyalizasyon fokal adezyon mechanosensing düzenler ve 11 durotaxis nasıl incelemek için bu testte kullandık. 15 - Açıkça, bu tür, aynı zamanda durotaxis 13 düzenlenmesine katkıda bulunabilir ve böylece, mekanik sinyal dahil olur ve hücre iskeletinin protein ticareti bileşenleri ve iyon kanalları gibi fokal yapışmalarda, ek olarak, çok sayıda hücre bileşenleri bulunmaktadır. Bu bileşenlerin her biri kolaylıkla içindeki RNAi yaklaşımları kullanarak sistemde değerlendirilebilir. Ek olarak, bu deney, çeşitli farmakolojik aktivatör ya da inhibitör tanıtılması çok müsait. Deney, aynı zamanda, protein dinamikleri ve uzay-zaman aktivasyonu çalışma, FRET veya sıkı bağlamak yaklaşımlar ile kombinasyon halinde bu gibi floresan etiketli proteinler dahil edilmesi gibi analiz daha karmaşık formlar, izin vermek için adapte edilebilir.

Hücre dışı matris (ECM), kolajen, fibronektin ve laminin gibi yapısal ve çapraz bağlama proteinlerinin karmaşık bir dizi oluşur. De ECM hücre dokular için önemli bir yapısal destek sağlar tespit edilmesine rağmen, hücreler aktif olarak, hücre hayatta kalması, farklılaşma ve hücre göçü de dahil olmak üzere çok çeşitli hücresel işlemleri düzenleyen kendi ECM ortamında fiziksel değişikliklere yanıt olduğunu belirtmek için artan kanıtlar vardır. Sert (~ 25 kPa) yüzeyler osteojenik farklılaşma 1 teşvik Örneğin, ECM sertlik farklılıklar yumuşak yüzeylerde (~ 1 kPa) nörojenik soy teşvik ile, farklı soy karşı mezenkimal kök hücrelerin sürebilirim. Benzer şekilde, stromal matrisi katılıkta bir artış çevre doku 2,3 halinde meme epitelyal hücre tümörogenez ve işgali teşvik ettiği gösterilmiştir. Bu mechanosign için özellikle ilginç bir yönüHücreler daha sert bir alt-tabaka 4,5 doğru tercihli olarak göç ettiği durotaxis olarak bilinen bir işlemde aling etki gösterir. Hücreler sürekli ECM bağlanarak integrin reseptörü yoluyla hücre dışı ortamın fiziksel özelliklerini hissederler. Bu da, fokal yapışmalarda ve fokal temas 6,7 olarak bilinen yapıştırma yapıların oluşumunu sürücü sitoplazmik alanlarında çok sayıda yapısal ve sinyal proteinlerinin birikimi teşvik eder. Integrinlerinin hiçbir doğasında enzimatik aktiviteye sahip olduğundan, sinyaller değişen çevre 8 hücrenin yanıtı koordine etmek, bu aksesuar proteinleri aracılığıyla ECM&#39;den aktarılmaktadır. Buna göre, mechanosignaling ve durotaxis düzenleyen kilit rol oynayan proteinlerin belirlenmesi ve karakterizasyonu araştırılması gereken önemli bir alandır. Çeşitli model sistemler durotaxis in vitro incelemek için geliştirilmiştir, ancak çoğu varkullanılan kollajen kaplı poliakrilamid yüzeyler 4. Bununla birlikte, poliakrilamid substratlar hazırlanması teknik olarak zor olabilir ve bu deneylerde kullanılan kollajen alt-tabaka 9 kimyasal olarak çapraz bağlanmış olması gerekir. Polidimetilsiloksan (PDMS) alt-tabakalar poliakrilamid alt tabakalar 10 için karşılaştırılabilir mekanik özellikler göstermektedir gösterilmiştir. Bununla birlikte, alt-tabakalar, sadece çapraz bağlayıcı madde PDMS bazın bir karıştırma oranı ile hazırlanabilir ve bu alt-tabakalar bu şekilde PDMS hücre davranışı üzerindeki sertlik etkilerini incelemek için daha kolay bir araç yapan kimyasal çapraz bağlama için gerek kalmadan ECM proteinleri ile kaplanabilir. Bu yazıda, yumuşak bir PDMS substrat sert cam lamel ile entegre edildiği bir basit durotaxis odasını nasıl hazırlanacağını açıklar. Deney aşağıda açıklandığı gibi, durotaxis incelemek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir. Bu çalışma için siRNA aracılı ile birlikte, insan osteosarkoma hücreleri kullanılır U2OScdGAP demonte durotaxis 11 bu fokal yapışma proteininin rolünü araştırmak için. Önemli olarak, bu protokol, kolaylıkla kişisel gereksinimlere uyarlanabilir. Diğer hücre tipleri U2OS hücreleri için ikame edilebilir ve herhangi bir protein düşürülmüş olup durotaxis sırasında hücre davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek için aşırı ifade edilebilir. Ayrıca, bu protokol dinamiklerini ve davranışları kullanılarak sıkı bağlamak ya da yaklaşımlar FRET analizi, floresan etiketli proteinler dahil adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td></tr><tr><td>#1 Cover glass 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

Ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mekanik özellikleri, doku tipleri arasında oldukça değişkendir. Bu bağ dokusu stroma ölçüde çeşitlilik etkileri, hücre davranış hücre çoğalması, farklılaşması, yapışma sinyalizasyon ve yön göç de dahil olmak üzere, normal ve patolojik süreçleri düzenler. Bu bağlamda, bazı hücre tiplerinin doğal yeteneğini durotaxis olarak ifade edilir, bir katı ya da daha az uyumlu bir matriks substrat tabakasına doğru göç. Bu olgu, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi ve kanser hücresi yayılımını tamamen sırasında önemli bir rol oynar. Burada, polidimetilsiloksan (PDMS) alt tabakalar kullanarak, in vitro olarak durotaxis çalışma için basit bir deney tarif eder. Odaları durotaxis tarif hazırlanması nispeten yumuşak PDMS jel ve katı bir cam lamel arasında bir sertlik arabirimi oluşturur. Verilen örnekte, cdc42 bir rol göstermek için bu durotaxis odaları kullandık / Rac1 GTPaz aktive protecdGAP bölgesi, mechanosensing ve insan U2OS osteosarkoma hücrelerinde durotaxis düzenlenmesinde. Bu deney, mechanosignaling ve durotaxis bunların rollerini araştırmak için başka hücre tipleri ve / veya önemli diğer proteinlerin demonte kolaylıkla uyarlanabilir.

Durotaxis bölmesinin şematik Şekil 1A &#39;de gösterilmiştir. Yumuşak PDMS alt-tabaka (90: çözüm çapraz bağlayıcı PDMS baz 1 karışımı) 6 iyi bir çanak içinde yayılır ve bir cam lamel böylece bir ara yüzey oluşturarak, daha sonra kısmen lamel üst yüzeyini kaplayan PDMS, üst üste yerleştirilir Farklı uyum iki alt tabaka arasında yer almaktadır. Yumuşak PDMS alt-tabakanın sertliği cam sertliği yaklaşık GPa&#39;dır 01-02 Ocak iken, beyin dokusu tipik bir uyum ile karşılaştırılabilir ~ 1 kPa vardır. PDMS ve cam arasındaki ara bir faz kontrast görüntüsü Şekil 1B beyaz ok başları ile gösterilmiştir. Yıldız sert alt tabaka doğru göç iki kontrol RNAi hücrelerini ifade etmektedir. Görülebileceği düzensiz kenar (siyah ok) lamel kenarına gelir. Veri ölçmek için, bir Microsoft Excel elektronik tablo, Tablo 1&#39;deki gibi oluşturulmalıdır &lt;/ strong&gt;. Geçiş olaylarının sayısı sayılır ve ilgili sütuna organize edilmelidir. Oluşturulan filmler bazı ölçümü için kullanılamaz. Bir hücreler ilerleme müdahale veya PDMS bir kabarcık varsa bir film miktarının ihmal edilebilir hücreleri çok yoğun dolu ise, büyük ölçüde hücre yönlülük etkileyebilecek çarpışmalarda ortaya çıkan. Bu, aynı zamanda açık bir şekilde, hücre hareketini etkileyen gibi hücre bölünmesi, aynı zamanda, takip edilmelidir. Tipik olarak, en yapışık hücre tipleri tercihen bir sert yüzeye 2,4,12 doğru göç edecek. Hücreler kendi ortamında mekanik ipuçlarına cevap hangi moleküler mekanizmayı anlamaya başlamak için, spesifik proteinlerin siRNA kullanılarak yere serdi edilebilir. Örneğimizde, kontrol siRNA ile muamele edilmiş hücrelerin yaklaşık% 70 durotaxis Şekil 2A sergiledi. CdGAP RNAi kullanarak yere serdi zaman, kontrast çarpıcı hücreler hiçbir tercih vardıolmadığı konusunda sert veya yumuşak tabaka Şekil 2A üzerine göç. Kontrol siRNA&#39;nın tedavi hücreler genellikle sadece bir kez sınır, Şekil 2B geçti oysa Dahası, cdGAP demonte hücreleri, sınır birden çok kez geçti. Kontrol siRNA hücrelerin temsili parça hücreleri genellikle, ya sertlik için tercih arzeder ve sınır birden çok kez Şekil 2C çapraz değil cdGAP siRNA ile muamele edilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında bir kez ve tercihen daha bükülmez bir yüzeye kaldı sınır boyunca göç ettiğini göstermektedir. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949fig1.jpg" /> Ayarlamak Durotaxis odasının Şekil 1 şematik (A). Yumuşak PDMS 6 oyuklu çanak her çukuruna yayılır ve bir cam lamel PDMS üstüne yerleştirilir. PDMS bef, lamel üst kenarlarında üzerinde tecavüz edecekBu, sertleşen iki alt tabaka arasında bir ara yüzey oluşturmak için maden cevheri. Durotaxis PDMS / cam arayüzü geçen hücrelerin yönünü puanlama ile tespit edilir. (B) yumuşak PDMS ve sert cam alt tabaka arasındaki arayüzü gösteren Temsili faz kontrastlı görüntü. Yıldız durotaxis geçiren kontrol RNAi ile muamele U2OS hücreleri göstermektedir. Beyaz ok uçları PDMS ve cam lamel ve ok arasındaki arayüz PDMS altında cam lamel kenarına gösterir göstermek. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52949/52949fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949table1.jpg" /> Tablo 1. Microsoft Excel elektronik şematik kurdu. Sütunlar film sayısı içerecek şekilde kurulan, siRNA, kullanılan yumuşak PDMS göç hücrelerin sayısıkatı cam alt-tabaka ya da tam tersi, hem de analiz hücrelerin toplam sayısı. Sütunlar da arayüzü birden çok kez çapraz ve yumuşak PDMS veya cam alt tabaka ya sona hücreleri için ayarlanır. Hücre sınır birden çok kez boyunca göç ederse, bu hücrelerin birden çok geçiş olaylarının sayısı, hücre filmin sonunda bulunan, bunun üzerine alt-tabaka sütununda kaydedilmiştir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52949/52949fig2.jpg" /> U2OS hücrelerinde cdGAP Şekil 2. demonte durotaxis bir kaybına yol açar. CdGAP siRNA ile muamele görmüş hücreler herhangi bir tercih arzetmemiştir ise (A) Kontrol siRNA ile muamele görmüş hücreler, sert cam alt tabaka üzerine tercihli olarak yer değiştirmektedir. (B) Kontrol siRNA&#39;nın tedavi hücreler bir kez PDMS ve cam arasındaki sınırı geçti. Bununla birlikte, cdGAP RNAi ile muamele edilmiş hücreler, ileri ve geri b boyunca göçoundary birden çok kez. Temsili hücreler (C) parçalar, ya kontrol ile muamele edilmiş ya da cdGAP siRNA ImageJ El izleme eklentisi kullanarak üretilmiştir. P-değerleri, bir öğrenci t-testi kullanılarak tespit edilmiştir ve hatalar çubukları,% 95&#39;lik güven aralığını temsil eder. Wormer ve ark., 2014 11 izni ile çoğaltılmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52949/52949fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro at JoVE.com

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi<em&gt; İn Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.2K Görüntüleme.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Video: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Hücre mekanik ile boncuk-Alerjik Optik cımbız Drosophila embriyo sondalama

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Gelişim Biyolojisi

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila larvae, customized metal nickel-titanium alloy (nitinol) filaments. These mechanical probes are similar to the von Frey filaments used in vertebrates to measure mechanical nociception. Here, we demonstrate how to make and calibrate these mechanical probes and how to generate a full behavioral dose-response from subthreshold (innocuous or non-noxious range) to suprathreshold (low to high noxious range) stimuli. To demonstrate the utility of the probes, we investigated tissue damage-induced hypersensitivity in Drosophila larvae. Mechanical allodynia (hypersensitivity to a normally innocuous mechanical stimulus) and hyperalgesia (exaggerated responsiveness to a noxious mechanical stimulus) have not yet been established in Drosophila larvae. Using mechanical probes that are normally innocuous or probes that typically elicit an aversive behavior, we found that Drosophila larvae develop mechanical hypersensitization (both allodynia and hyperalgesia) after tissue damage. Thus, the mechanical probes and assay that we illustrate here will likely be important tools to dissect the fundamental molecular/genetic mechanisms of mechanical hypersensitivity.

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

The goal of this protocol is to show how to perform an improved assay for mechanical nociception in Drosophila larvae. We use the assay here to demonstrate that mechanical hypersensitivity (allodynia and hyperalgesia) exists in Drosophila larvae.

Drosophila Larvalarında Mekanik Nosiception Ölçümü için Geliştirilmiş Bir Tahlil ve Araçlar

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

Davranış

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Biyoloji

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Nörobilim

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

ECIS / Taksiler ile Hücresel Kemotaksis Ölçümü

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Biyomühendislik

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such as aspiration or coverslip compression have been used to mechanically stimulate whole embryos. These approaches limit experimental design as they are imprecise, require manual handling, and can process only a couple of embryos simultaneously. Microfluidic systems have great potential for automating such experimental tasks while increasing throughput and precision. This article describes a microfluidic system developed to precisely compress whole Drosophila melanogaster (fruit fly) embryos. This system features microchannels with pneumatically actuated deformable sidewalls and enables embryo alignment, immobilization, compression, and post-stimulation collection. By parallelizing these microchannels into seven lanes, steady or dynamic compression patterns can be applied to hundreds of Drosophila embryos simultaneously. Fabricating this system on a glass coverslip facilitates the simultaneous mechanical stimulation and imaging of samples with high-resolution microscopes. Moreover, the utilization of biocompatible materials, like PDMS, and the ability to flow fluid through the system make this device capable of long-term experiments with media-dependent samples. This approach also eliminates the requirement for manual mounting which mechanically stresses samples. Furthermore, the ability to quickly collect samples from the microchannels enables post-stimulation analyses, including -omics assays which require large sample numbers unattainable using traditional mechanical stimulation approaches. The geometry of this system is readily scalable to different biological systems, enabling numerous fields to benefit from the functional features described herein including high sample throughput, mechanical stimulation or immobilization, and automated alignment.

The present protocol describes the design, fabrication, and characterization of a microfluidic system capable of aligning, immobilizing, and precisely compressing hundreds of Drosophila melanogaster embryos with minimal user intervention. This system enables high-resolution imaging and recovery of samples for post-stimulation analysis and can be scaled to accommodate other multicellular biological systems.

Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler