Questo lavoro è sostenuto da NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1.334.493 di CET. Ringraziamo i membri del laboratorio Turner per la lettura critica del manoscritto. Tutti i dati riportati nella presente relazione sono stati riprodotti da permesso da Wormer et al. 2014 11.

1. Preparazione di Durotaxis Chambers <ol><li> Per preparare un 6-pozzetti di coltura tissutale, tarare la bilancia con un tubo da 50 ml. Pesare circa 10 g della soluzione di base PDMS nel tubo da 50 ml (la soluzione è abbastanza viscoso). </li><li> Per 90: 1 substrato (Compliance di ~ 1 kPa), dividere il peso misurato della soluzione di base PDMS nel tubo 90 per determinare la corretta quantità di soluzione reticolante necessaria. Aggiungere la quantità calcolata di soluzione reticolante PDMS al tubo stesso. Esempio: 10 g / 90 = 0,11 g. Aggiungere 0,11 g della soluzione reticolante PDMS alla soluzione di base PDMS. NOTA: La base e reticolante soluzioni sono entrambi forniti nel kit PDMS. </li><li> Mescolare energicamente la miscela base / reticolante PDMS per 5 minuti a temperatura ambiente usando una piccola spatola. A questo punto la miscela contiene un gran numero di bolle d&#39;aria. </li><li> Centrifugare il substrato PDMS in una centrifuga da banco per 5 min a 50 xg a temperatura ambiente per rimuovere l&#39;bubbles. Se ci sono ancora bolle dopo 5 min, centrifuga di nuovo. </li><li> Pipettare 1 ml di 90: 1 PDMS substrato in ciascun pozzetto della coltura di tessuti trattati 6 pozzetti. Eventuali bolle d&#39;aria residue presenti nei PDMS possono essere eliminate in questa fase estraendo usando un ago 21 G. Lasciare le PDMS a diffondere per 30 minuti nel pozzo. </li><li> Bollire 12 millimetri di vetro # 1 coprioggetto in acqua distillata per 5 min. Ripetere due volte e memorizzare i coprioggetti in acqua distillata. </li><li> Mettere uno, coprioggetto secco in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale toccando delicatamente un lato del vetrino nella soluzione PDMS poi cadere il vetrino sui PDMS. Come il coprioggetto deposita, PDMS cominceranno ad invadere sui bordi del vetrino, ma non copre completamente. Questo genera un&#39;interfaccia tra le PDMS e vetro dopo la polimerizzazione (vedere Figura 1A, B). </li><li> Incubare la piastra a 70 ° C in un forno per 16 ore per curare (indurimento) PDMS. Posizionare il plate in una cappa di coltura cellulare e UV sterilizzare per 10 min. NOTA: E &#39;meglio per rendere le piastre entro un paio di giorni di utilizzo. Tuttavia, le piastre possono essere avvolte in Parafilm senza tampone e conservati a 4 ° C fino a 2 settimane senza alcuna diminuzione nella qualità. </li></ol> 2. Cella placcatura NOTA: Se studiare l&#39;effetto di knockdown siRNA-mediata, eseguire il colpo con le istruzioni del produttore o il protocollo ottimizzato per il tipo cellulare di scelta. <ol><li> Coat ogni durotaxis camera con 1 ml di 10 mg / ml in PBS fibronectina senza calcio e magnesio per 1 ora a 37 ° C. In alternativa, la fibronectina può essere applicato il giorno prima dell&#39;analisi incubando le PDMS con 10 ug / ml in PBS fibronectina per 16 ore a 4 ° C. Assicurarsi che l&#39;intera superficie è immersa nel fibronectina in soluzione PBS. </li><li> Preparare calore denaturato 1% di BSA. Pesare 0,5 g BSA e scioglierlo in 50 ml di PBS.Filtro sterilizzare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e riscaldare a 80 ° C per 12 min. Nota: Preparare questa soluzione il giorno prima cella di placcatura e conservare a 4 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione fibronectina e lavare 3 volte con PBS. Aggiungere 1 ml di calore denaturato BSA in PBS ad ogni pozzetto ed incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Trypsinize e contare le cellule di scelta, mentre le camere durotaxis stanno bloccando con il calore denaturato BSA. </li><li> Piastra 1 x 10 5 cellule in un volume di 2 ml in ciascun pozzetto della camera durotaxis, utilizzando il supporto desiderato per il particolare tipo di cellula di scelta. Permettono alle cellule di aderire e diffondere sul substrato per 4 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2. NOTA: cellule U2OS sono normalmente mantenute in DMEM con 10% FBS, supplementato con 2 mM L-glutammina, 1 mM sodio piruvato, e 10 UI / ml di penicillina, 10 mg / ml di streptomicina. NOTA: il numero di cellule usato in questo esempio è ottimizzato perCellule U2OS. Ottimizzazione per altri tipi di cellule può essere richiesto. Questa densità dà le cellule sufficiente per migrare senza interazioni significative con altre cellule. </li></ol> Imaging 3. Live-cell <ol><li> Eseguire l&#39;imaging cellulare dal vivo su un microscopio invertito, con contrasto di fase con un obiettivo 10X. Il microscopio deve essere dotato di un ambiente, camera umidificata chiusa, permettendo il controllo di temperatura a 37 ° C e 5% CO 2 durante l&#39;imaging a lungo termine. </li><li> Dopo che le cellule si sono diffuse per circa 3,5 ore, montare la placca nella camera microscopio. Lasciare il campione (s) per equilibrare nella camera per 30 min. </li><li> Impostare automatizzato, multi-punto in visita sul microscopio, se disponibile. Focus su l&#39;interfaccia tra le 90: 1 PDMS e il vetrino di vetro e scegliere i punti per l&#39;immagine in tutto l&#39;interfaccia con una media di 40 punti per durotaxis camera. Immagine le cellule ogni 10 min per un massimo di 16 ore. NOTA: Il regione di interesse apparirà come due linee, con la linea esterna corrispondente al bordo del vetrino e la linea interna corrispondente all&#39;interfaccia effettiva tra le PDMS e il vetrino. Vedere la Figura 1B. </li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Generare un foglio di calcolo come nella tabella 1. </li><li> Contare il numero di eventi di attraversamento dalle PDMS alla superficie di vetro e viceversa da ogni film generato. Registrare il numero di eventi di attraversamento nell&#39;apposita colonna nel foglio di calcolo Excel. NOTA: Un evento di crossing è definito come il nucleo cellulare passando sopra il confine tra le PDMS e vetro in entrambe le direzioni. </li><li> Per quantificare attraversare più, contare il numero di volte che la cella è transitato dall&#39;interfaccia. Tale numero deve essere registrato nella colonna di Excel corrispondente al substrato su cui la cella era situato alla fine del film. Ripetere l&#39;analisi per ogni cellula che attraversa l&#39;interfaccia in tfilm che. Escludere le cellule che migrano fuori dal campo visivo durante l&#39;imaging. NOTA: È anche importante verificare, da cellule contando all&#39;inizio dell&#39;esperimento, che le cellule sono in grado di aderire ugualmente ai PDMS fibronectina rivestite coprioggetto e superfici di vetro. </li><li> Calcolare la percentuale di cellule che migrato da PDMS alla superficie del vetro (cioè, durotaxis subito). Aggiungere il numero di attraversare gli eventi da morbido a duro e gli eventi di attraversamento più che si sono concluse sul disco e dividere per il numero totale di eventi di attraversamento. </li><li> Calcolare la percentuale di attraversare più dividendo il numero di attraversare più volte per il numero totale di incroci. </li></ol>

<ol>
	<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hitchhiker&#8217;s+guide+to+mechanobiology.">A hitchhiker&#8217;s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li><li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+ion+channels:+molecules+of+mechanotransduction.">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li><li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec15,+a+component+of+the+exocyst,+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors.">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li></ol>

The authors have no conflicts to disclose.

Qui descriviamo un semplice test per studiare durotaxis in migrazione delle cellule. Un punto di forza di questo saggio è la facilità di preparazione delle camere durotaxis con PDMS. La rigidità dei substrati può essere facilmente manipolata modificando il rapporto di soluzione di base PDMS a reticolante per consentire lo studio di varie rigidità nel test. Tuttavia, una potenziale limitazione del sistema è che le cellule sono esposte a un solo cambiamento di rigidità del substrato rispetto a sperimentare un gradiente rigidità che viene fornito da sistemi più sofisticati 4. È importante sottolineare che, a differenza di substrati poliacrilammide, i componenti ECM non devono essere chimicamente reticolato a PDMS. Infatti, il rivestimento fibronectina è approssimativamente equivalente su entrambi i PDMS e le superfici di vetro, come determinato mediante colorazione con un anticorpo specifico per la fibronectina 11. Da studi precedenti hanno dimostrato che le cellule si comportano allo stesso su entrambi PDMS o substrati poliacrilammide, l&#39;uso of PDMS substrati fornisce un modello molto più facile con cui studiare meccanotrasduzione nelle cellule 10,12. Il passo più importante nella preparazione dei substrati PDMS è quello di garantire che il reticolante soluzioni base e vengono accuratamente miscelati. Se non sono mescolati abbastanza bene, poi i substrati non saranno completamente curare in seguito al trattamento termico. Ciò comporterà il vetrino affondare troppo nei PDMS o il vetrino alla deriva nei PDMS durante l&#39;imaging. Se la forza centrifuga è troppo alta, le soluzioni basiche e reticolante possono separare nel tubo. Questo può essere risolto riducendo la velocità di centrifugazione o mediante degasaggio della miscela per 30 minuti usando una camera a vuoto. Infine, la densità delle cellule è un fattore critico, come troppe cellule influenzano la loro capacità di diffondersi pienamente e per durotax indisturbato dal contatto con le cellule vicine. La densità qui riportate è stato ottimizzato per le cellule U2OS. Tuttavia, se si utilizzano altri tipi di cellule, cel ottimalenumeri l dovranno essere determinati empiricamente. Abbiamo recentemente usato questo test per studiare come l&#39;adesione focale segnalazione proteina cdGAP regola mechanosensing e durotaxis 11. Chiaramente, ci sono numerosi componenti cellulari in aggiunta alle adesioni focali, come elementi del citoscheletro, componenti di traffico di proteine ​​e canali ionici che sono coinvolti nella segnalazione meccanica e quindi può anche contribuire alla regolazione di durotaxis 13-15. Ciascuno di questi componenti potrebbero essere prontamente valutata nel nostro sistema utilizzando approcci simili RNAi. Inoltre, questo test è molto suscettibile all&#39;introduzione di vari attivatori o inibitori farmacologici. Il test può essere adattato anche per consentire forme più sofisticate di analisi, come l&#39;incorporazione di proteine ​​fluorescenti-taggato, in combinazione con approcci FRET o FRAP, per studiare la dinamica delle proteine ​​e l&#39;attivazione spazio-temporale.

La matrice extracellulare (ECM) è costituito da una serie complessa di proteine ​​strutturali e reticolazione compreso collagene, fibronectina e laminina. Anche se è noto che l&#39;ECM fornisce un importante supporto strutturale per tessuti cellulari, ci sono sempre più prove per indicare che le cellule rispondono attivamente ai cambiamenti fisici nel loro ambiente ECM per regolare i processi cellulari diversi, tra cui la sopravvivenza cellulare, la differenziazione e la migrazione delle cellule. Ad esempio, le differenze nella rigidità della ECM può guidare le cellule staminali mesenchimali verso differenti linee, con i substrati molli (~ 1 kPa) promuovono lignaggi neurogene mentre rigidi (~ 25 kPa) substrati di promuovere la differenziazione osteogenica 1. Analogamente, un aumento della rigidità matrice stromale ha dimostrato di promuovere la tumorigenesi mammaria cellule epiteliali ed invasione nel 2,3 tessuto circostante. Un aspetto particolarmente interessante di questo mechanosignrisultati dell&#39;attività aling in un processo noto come durotaxis, in cui le cellule migrano preferenzialmente verso un substrato più rigido 4,5. Le cellule rilevano costantemente le caratteristiche fisiche del loro ambiente extracellulare attraverso recettore integrina legame alla ECM. Questo, a sua volta, promuove l&#39;accumulo di numerose proteine ​​strutturali e segnalazione ai loro domini citoplasmatici per guidare la formazione di strutture adesive note come adesioni focali o contatti focali 6,7. Dal momento che le integrine non hanno attività enzimatica intrinseca, i segnali vengono inoltrati dal ECM attraverso queste proteine ​​accessorie per coordinare la risposta delle cellule al loro ambiente mutevole 8. Di conseguenza, l&#39;identificazione e la caratterizzazione delle proteine ​​chiave coinvolte nella regolazione mechanosignaling e durotaxis è un&#39;importante area di ricerca. Vari sistemi modello sono stati sviluppati per studiare durotaxis in vitro, ma la maggior parte hannoutilizzati collagene rivestite poliacrilammide substrati 4. Tuttavia, la preparazione dei substrati di poliacrilammide può essere tecnicamente impegnativo e il collagene utilizzato in questi saggi deve essere chimicamente reticolato al substrato 9. Polidimetilsilossano (PDMS) substrati hanno dimostrato di presentare proprietà meccaniche paragonabili ai substrati di poliacrilammide 10. Tuttavia, substrati PDMS vengono preparate semplicemente miscelando un rapporto della base di reticolante e questi substrati possono essere rivestiti con proteine ​​ECM senza la necessità di reticolazione chimica, rendendo così più facile PDMS uno strumento per studiare gli effetti di rigidità sul comportamento cellulare. Qui, si descrive come preparare una semplice camera di durotaxis in cui un substrato morbido PDMS è integrato con un coprioggetto vetro rigido. Il saggio, come indicato di seguito, fornisce un metodo rapido e semplice per lo studio durotaxis. Per questo studio abbiamo utilizzato cellule di osteosarcoma U2OS umane combinate con siRNA-mediataatterramento di cdGAP per studiare il ruolo di questa proteina di adesione focale durotaxis 11. È importante sottolineare che questo protocollo può essere facilmente adattato alle esigenze individuali. Altri tipi cellulari possono essere sostituiti per le cellule U2OS e qualsiasi proteina possono essere abbassati o overexpressed per determinare gli effetti sul comportamento cellulare durante durotaxis. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per incorporare le proteine ​​fluorescenti tag per analizzare le loro dinamiche e comportamento utilizzando FRAP o preoccuparsi approcci.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#1 Cover glass 12mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>15-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified system for evaluating cell mechanosensing and durotaxis in vitro

Le proprietà meccaniche e composizione della matrice extracellulare sono molto variabili tra i tipi di tessuto. Questo connettivo diversità stroma del tessuto notevolmente comportamento impatti cella per regolare i processi normali e patologiche tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la segnalazione di adesione e la migrazione direzionale. A questo proposito, la capacità innata di certi tipi di cellule a migrare verso un substrato matrice rigida, o meno compatibile è indicato come durotaxis. Questo fenomeno ha un ruolo importante durante lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l&#39;invasione delle cellule tumorali. Qui, descriviamo un test semplice per studiare durotaxis, in vitro, utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) substrati. Preparazione del descritto durotaxis camere crea un&#39;interfaccia tra la rigidità relativamente morbido gel PDMS e un vetrino di vetro rigida. Nell&#39;esempio fornito, abbiamo usato queste durotaxis alloggiamenti per dimostrare un ruolo per il Cdc42 / Rac1 GTPasi prote attivazionein, cdGAP, in mechanosensing e durotaxis regolazione nelle cellule umane U2OS osteosarcoma. Questo test è facilmente adattabile ad altri tipi e / o atterramento di altre proteine ​​di interesse cellulari per esplorare i loro rispettivi ruoli nel mechanosignaling e durotaxis.

Uno schema della camera durotaxis è mostrato nella Figura 1A. Substrato PDMS molle (90: 1 miscela di base di PDMS a reticolante soluzioni) si sviluppa in un piatto 6 pozzo e un vetrino di vetro è posto sulla parte superiore delle PDMS, che poi ricopre parzialmente la superficie superiore del vetrino, creando un&#39;interfaccia tra i due substrati di conformità diverso. La rigidità del substrato PDMS morbido è ~ 1 kPa, che è paragonabile alla conformità tipica del tessuto cerebrale, mentre la rigidità del vetro è di circa 1-2 GPa 1. Un contrasto di fase dell&#39;interfaccia tra le PDMS e vetro è indicata dalle frecce bianche in Figura 1B. Gli asterischi indicano due celle controllo RNAi migrazione verso il substrato più duro. Il bordo frastagliato che può essere visto (freccia nera) corrisponde al bordo del vetrino. Per quantificare i dati, un foglio elettronico Microsoft Excel dovrebbe essere generato come in Tabella 1 &lt;/ strong&gt;. Il numero di eventi di attraversamento deve essere contato e organizzata nella colonna corrispondente. Alcuni dei film generati non possono essere utilizzati per la quantificazione. Un film può essere omesso dalla quantificazione se c&#39;è una bolla nelle PDMS che interferisce con un progresso cellule o se le cellule sono troppo densamente imballati, causando collisioni che possono influenzare drasticamente direzionalità cellule. La divisione cellulare dovrebbe essere monitorata, in quanto questo può anche influenzare apertamente il movimento delle cellule. In genere, tipi di cellule più aderenti saranno preferenzialmente migrare verso un substrato rigido 2,4,12. Per cominciare a capire il meccanismo molecolare con cui le cellule rispondono agli stimoli meccanici nel loro ambiente, proteine ​​specifiche possono essere abbattuti con siRNA. Nel nostro esempio, circa il 70% delle cellule trattate con siRNA controllo esposto durotaxis 2A Figura. In stridente contrasto, quando cdGAP è stato abbattuto con RNAi, le cellule avevano preferenzasul fatto che la migrazione sul duro o morbido substrato figura 2A. Inoltre, le cellule knockdown cdGAP attraversato le più volte di confine, mentre le cellule trattate controllo siRNA in genere solo attraversato il confine una volta, la figura 2B. Brani rappresentativi di cellule siRNA di controllo mostrano che le cellule in generale migrano attraverso il confine una volta e preferenzialmente rimasti sulla superficie più rigida rispetto alle cellule cdGAP siRNA-trattati che non hanno dimostrato una preferenza per uno dei due rigidità e hanno attraversato il confine più volte la figura 2C. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949fig1.jpg" /> Figura 1. Schema della camera Durotaxis impostato. (A) morbido PDMS si sviluppa in ciascun pozzetto di un piatto 6 pozzetti e vetrino coprioggetti è posto sulla parte superiore delle PDMS. I PDMS si invadere sopra i lati della parte superiore del vetrino, befdi minerale che indurisce per formare un&#39;interfaccia tra i due substrati. Durotaxis è determinata notando la direzionalità delle cellule che attraversano l&#39;interfaccia PDMS / vetro. (B) contrasto di fase immagine rappresentante che mostra l&#39;interfaccia tra i PDMS molli e substrato di vetro rigida. Gli asterischi indicano controllo RNAi trattato con cellule U2OS sottoposti durotaxis. Le frecce bianche indicano l&#39;interfaccia tra i PDMS e coprioggetto di vetro e la freccia indica il bordo del vetrino di vetro sotto il PDMS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52949/52949fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52949/52949table1.jpg" /> Tabella 1. Schema di Microsoft Excel foglio di calcolo istituito. Le colonne sono stabiliti per includere il numero di film, siRNA usato, il numero di cellule che la migrazione dalle PDMS morbideal supporto rigido vetro o viceversa, così come il numero totale di cellule analizzate. Le colonne sono anche istituito per le cellule che attraversano l&#39;interfaccia più volte e finiscono su entrambi i PDMS molli o il substrato di vetro. Se una cella migra attraverso le più volte al contorno, il numero di eventi multipli attraversamento di queste cellule viene registrato nella colonna del substrato su cui la cella era situato alla fine del film. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52949/52949fig2.jpg" /> Figura 2. Knockdown di cdGAP in cellule U2OS causa una perdita di durotaxis. (A), le cellule di controllo siRNA trattate migrano preferenzialmente sul substrato di vetro rigida, mentre le cellule trattate cdGAP siRNA non mostrano alcuna preferenza. Cellule trattate (B) Controllo siRNA attraversato il confine tra i PDMS e vetro una volta. Tuttavia, le cellule cdGAP RNAi trattate migrati avanti e indietro attraverso la boundary più volte. (C) Le tracce di cellule rappresentative trattati con il controllo, o cdGAP siRNA sono stati generati utilizzando il plugin di monitoraggio Manuale in ImageJ. I valori di p sono stati determinati utilizzando test t di uno studente e errori barre rappresentano l&#39;intervallo di confidenza del 95%. Riprodotto con il permesso da Wormer et al. 2014 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52949/52949fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

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A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

8.1K Views.  SUNY Upstate Medical University. Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Video: A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

Mosaico Transgenesi Zebrafish per la valutazione sequenze Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

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Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Un sistema semplificato per la valutazione delle cellule Mechanosensing e Durotaxis

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Mosaico Transgenesi Zebrafish per la valutazione sequenze Enhancer

Derivazione efficiente dei diritti dell'uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali

Un protocollo per laboratorio Housing di turchese Killifish (Nothobranchius furzeri)