Name: viral-mediated labeling and transplantation of medial ganglionic eminence (mge) cells for in vivo studies
Uploaded: 2015-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies at JoVE.com

Bu çalışma dan JLRR hibe ile desteklenmiştir: Otizm Konuşuyor, Nina İrlanda, Weston Havens Vakfı, NIMH R01 MH081880 ve NIMH R37 MH049428. Prw Tayvan Ulusal Bilim Konseyi bir burs ile desteklenmiştir. SFS F32 (MH103003) tarafından desteklenmiştir.

Etik deyimi: Aşağıdaki prosedürleri kurum ve hayvan protokolü tarafından onaylanmıştır. Deneyler başlamadan önce hayatta kalma ameliyatları ile ilgili tüm işlemler için onay almak için emin olun ve tüm protokolleri güncel olduğunu doğrulamak. 1. lentivirüs Hazırlık (İsteğe bağlı Adım) <ol><li> 10 ml DMEM /% 10 FBS varlığında yapılabilir her lentivirüs için HEK293T hücrelerinin üç adet 10 cm&#39;lik tabak bölünmüş, ve •% 60-70 ortak akışa kadar büyümeye. % 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde hücreler büyür. </li><li> 1.2 ug pMD2.G (VSV-G kodlayan) 1,2 (Tablo 1 &#39;de verilen DNA vektörü sekansı), 6.4 ug CAG-Flex-GFP lentiviral vektör, aşağıdaki herhangi bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak her plaka, DNA plazmidleri (10 ug toplam) transfekte ug pRSV-Rev, ve 1.2 ug pMDLg / pRRE. Üç Lentiviral ambalaj vektörler piyasada mevcuttur (Tablo Not: Bu özel yaklaşım 3. nesil lentivir kullanırEl vektörleri ama 2. nesil vektörleri ve ilişkili plazmidler de çalışacaktır. </li><li> Temas veya lentivirüs içeren herhangi bir çözüm veya cihazları etkisiz hale getirmek için bir BSL2 sertifikalı kaput içinde% 10 çamaşır suyu çözeltisi içeren bir atık kabı hazırlayın. Sonraki tamamen, çamaşır suyu çözeltisi içine transfeksiyondan sonra Ortam 4-6 saat kaldırmak, yeni medyanın aynı hacimde ile değiştirin, ve hücrelerin büyümesine izin verir. </li><li> 15 dakika herhangi bir hücre yıkıntıları pelet haline getirildi için 4 gün sonra, 1000 x g&#39;de 50 ml konik tüp ve santrifüj Ortamı toplar. Daha sonra, bir 0.45 um membrandan filtre süpernatan. Herhangi bir düşük protein bağlama filtre, PVDF gibi, iyi çalışıyor. Dikkat: çamaşır suyu çözeltisi içine yer hem katı hem de sıvı viral atık. </li><li> Yük 30 ml&#39;lik bir ultra santrifüj tüpleri içine ve bir ultra santrifüj içine süpernatan süzülmüştür. 4 ° C &#39;de 2.5 saat boyunca 100.000 x g&#39;de santrifüjleyin. Bir BSL2 kaputu santrifüj tüplerine açın ve% 10 Bleach içine süpernatant kaldırmak. Pe PBS ~ 100 ul ekle1x10 ^ 7-8 enfeksiyöz birim / ml titreleri elde edilir LLET. -80 ºC aşağıdaki gün ve mağaza bölmeyin. Lentivirüs alikotları, en az altı ay boyunca -80 ° C &#39;de stabildir. </li><li> Önemli düşünce: Birçok kurum artık viral çekirdeğe sahip. En iyi sonuçlar için 1x10 7 enfeksiyöz birim / ml &#39;lik bir en az titresi, konsantre virüs elde edin. </li></ol> MGE Diseksiyon 2. Verici Fareler <ol><li> İlk olarak, ilgi Kre-ifade hattı ve bir vahşi tip (WT) fare ya da Kre-aracılı rekombinasyon sonra bir muhabir ifade edecek bir fare arasında bir zamanlanmış çiftleşme kurmak. Not: Birçok Kre-sürücü hatları transgenikler ve tutulan ve hemizigot devlet yetiştirilmektedir. Bu nedenle, embriyoların yarısı Cre transgeni içerecektir. DNA, hızlı bir şekilde Cre alel algılamak için kısa bir PCR için embriyo hazırlanabilir. İstenen genotip sadece MGE bir doku da kullanılabilir, böylece, Cre + embriyolar daha sonra hasat edilebilir. Alternatif, Cre-bağımlı haberci MGE diseksiyon ve nakli için embriyoları seçmek üzere, kullanılabilir. </li><li> E13.5 karşılık hangi gün hesaplayın. Hayvanlar akşam önce eşleşmiş olsaydı, fiş gün 0.5 olduğunu. Sipariş zamanlı gebe fareler ya da doğum sonrası (P) sahip zaman için P1 yavrular ile WT kadın donör doku E13.5 olacak gününde 1 fareler. Alternatif olarak, donör hayvanları eşleştirme önce bir hafta evinde bu çiftleşmesi kurmak. Not: E13.5 ve P1 embriyolar hem üreten eski strateji / Aynı gün yavrular güvenilir yapmak çoğu zaman zordur. </li></ol> Medya, Araçlar ve Ekipman 3. hazırlanması. <ol><li> MGE hücre preparasyonu (Tablo 2) için reaktifler ve araçları hazırlayın. <ol><li> Temiz bir yüzey hazırlayın ve yüzeyde temiz forseps, makas ve bir mikrocerrahi bıçak veya ince forseps ya (kesin doku diseksiyonu için) yerleştirin. </li><li> Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS), Hazırlama fdiseksiyon ve dönüşüm kesme işlemleri için,% 10 fetal sığır surem (FBS) ile Dulbeco değiştirilmiş kartal ortamı (DMEM) veya. </li><li> Yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde Kuluçkalama Öncesi, 20-30 mi, DMEM /% 10 FBS. Kapak ortamının gaz değişimi ve pH dengesini sağlamak için gevşetilmiş edilmelidir. Not: Medya preinkübasyon sadece diseksiyonu başlamadan önce hazırlanabilir. </li></ol></li></ol> 4. MGE Hücresinin Hazırlanması <ol><li> Onaylanmış hayvan protokolüne göre hamile bir fare kurban ve buzla soğutulmuş HBSS içeren 10 cm&#39;lik bir petri kabına embriyolar çıkarın. </li><li> (Bir seferde birini yapın buz gibi soğuk HBSS embriyoların kalanını bırakarak) diseksiyon kapsamı kullanarak her embriyo beyin çıkarın ve sonra MGE doku kesip devam edin. Aşağıda Ayrıntılı ve Şekil 1&#39;de, MGE kaldırmak için nasıl gösteren önemli adımlar şunlardır: Not. Buna ek olarak, Şekil 2, tüm diseksiyonu gösteren bir filmprosedür. <ol><li> (Şekil 1A, A &#39;) yukarı bakacak ventral tarafı beyin yerleştirin. Not: dorsal boy yukarı bakacak olması da iyidir. İki adet üretmek için saggital düzlemi boyunca yarısında beyin kesin. Bir örnek hemisected beyin (Şekil 1B, B &#39;), dorsal (üstte korteks) beyin kapak ventral açıdan fark ve ganglionik tepe (GE) doku çevreleyen gösterilmiştir. </li><li> Bir baskın olmayan elle tutulan forseps ile yarımkürede hareketsizleştirir ederken Sonraki, bir dominant elin ile, çok ince forseps veya stabknife (Tablo 2) basılı tutun. (Hemisphere en medial yukarı dönük olmalıdır). Altta yatan GE doku (Şekil 1C ve Şekil 1C &#39;de diagrammed) ortaya dorsal ve ventral doku forseps ile ve bir bıçak bıçak açın. Not: Diseksiyon petri bazı medya Çıkarma kolay pe ise doku stabilize yapabilirsinizMGE diseksiyonu rforming. </li><li> CGE, LGE&#39;yi ve septal dokuları ayırmak için stabknife veya ince forseps ile düz kesimler olun (kırmızı ile gösterilen bkz örnek keser kesikli çizgiler, &#39;1D ve D Rakamlar). Bu kesikler herhangi bir sırada yapılabilir. Not: çevreleyen doku kesip bir &#39;kutu&#39; olarak MGE düşünün. Bunu yapmak tekrarlanabilir, böylece doku disseksiyonlarında değişkenliği azaltarak, her diseksiyon için benzer kesim yapmak yardımcı olur. </li><li> Son olarak, yan MGE açmak ve alt (beynin yan yönü neydi) keserek. Bu MGE geri kalanından MGE manto bölgesini (Şekil 1E ve 1E&#39;de atmak &#39;) kaldırır. MGE kalan yönü öncelikle ventriküler bölge ve neredeyse tüm MGE progenitör hücreleri içeren MGE, subventrikuler bölge bölümlerini içeriyor. Bu doku ile devam edin. </li></ol></li><li> Önemli düşünce: Bir petri ca altına silikon jel eklenmesiBu forseps hassas ipuçları korur ve forseps ile doku çivileme için yumuşak bir yüzey temin n mükemmel bir diseksiyon yüzeyi olarak hizmet etmektedir. </li></ol> MGE Diseksiyon için 4.3 Ek stratejiler. <ol><li> Hızlı beyin kaldırmak için makas gibi forseps kullanarak embriyo cilt kesin. Embriyo yan bırakır gibi, doku demirlemek için kullanılan forseps ile baş dibinde doku tutun. İlk olarak, beyne beyne ve posterior ventral anterior ventral kesmek, ve sonra embriyonun kenarı boyunca iki kesim bağlayın. Sonra cilt kapağı kapmak ve beynin üstünden çekin. Beyin sonra hızla geriye kalan dokudan uzak disseke edilebilir. </li><li> Alternatif olarak, korteks arkasında bütün beynin posterior yönünü çapa. Bu arada, korteks en dorsal kaudal yönü her yarımkürede kavramak ve anterior yönde uzak demirlemiş dokudan korteksi gözyaşı. Bu şekilde, her iki Cortices çıkarılabilir ve ikili ganglion eminences hala orta yanal anatomisinin koruyucu dokunun geri kalanına bağlanmış, ortaya çıkar. </li><li> Delinmeye bıçak Switch, her yarımkürede MGE çevresindeki hassas kesimler yapmak. MGE veya büyük bir ucu olan bir pipet (yani., P1000) toplamak için forseps ayrı bir temiz seti kullanın. Not: MGE tahsil edildiğinde bazı medya kaçınılmaz transfer olarak, tüm diğer Diseke malzemeden uzak toplanan doku tutun. </li><li> MGE toplamak ve DMEM /% 10 FBS (500 ul kadar bir hacim MGES toplamak için yeterlidir) ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik bir tüp içine doku koydu. Aynı toplama tüpüne diğer yarımkürede ve yer tekrarlayın. Tüm doku toplanır kadar buz üzerinde örneklerin tutun. </li></ol> 5. Lentiviral etiketleme ve Transplantasyon <ol><li> Bir BSL2 sertifikalı kaput içine MGE doku tüpleri taşıyın ve ortamı çıkarın. Not:MGE doku gözle görünür olmasını ve soğuk medya kolayca ve nazikçe kaldırılır olması için izin tüpün dibine razı olacak kadar büyük. </li><li> , DMEM /% 10 FBS ortamı ~ 500 ul ekle, bir 37 ° C doku kültürü kuluçka makinesi içinde önceden inkübe edildi. Daha sonra, 8 ug / ml lik bir nihai konsantrasyonda her bir tüpe transdüksiyonunu kolaylaştırmak için polybrene ekleyin. P1000 pipet kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için MGE doku çiğnemek. Son olarak, her tüpe ~ konsantre lentivirüs 15-20 ul ekle. </li><li> Önemli değerlendirme: 10-12 kez bir toz haline getirme, tek bir embriyodan MGE doku parçalanması için yeterli olmakla birlikte, çok sayıda MGES bir araya toplanmış ise daha fazla toz haline getirilmesini gerekebilir. En iyi olanı belirlemek için farklı trituration koşullarını deneyin. </li><li> Güvenli bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde bir yerde daha karıştırmak için ters, tüm tüpler her tüp kapatın. En az 30 dakika ve 1 saat kadar lentivirüs hücreleri inkübe edin. Daha uzun kez de sonuçlandıkıvrımlı hücre canlılığı. Süre doluncaya kadar boruları her 10 dakikada bir ters çevirin. </li><li> Lentivirüs ile kuluçkalamadan sonra, hücreler topak haline getirilip, 3 dakika süreyle ~ 700 x g kuvöz ve santrifüj tüpleri çıkarın. BSL2 kaput, süpernatant kaldırmak ve% 10 çamaşır suyu içine atın. Daha sonra, 1 ml DMEM /% 10 FBS ekleyin ve daha sonra, yıkama, hücreleri topaklamak üzere aynı hızda yeniden santrifüj ile pelet 2-3 kez çiğnemek. Aşırı virüs kaldırmak için bu yıkama-adımı 2-3 kez daha tekrarlayın. Not: Kısa spin oda sıcaklığında gerçekleştirildiğinde, 4 ° C&#39;de santrifüj adımları Bununla birlikte, indirgenmiş canlılığı gözlenmemiştir. </li><li> Son yıkamadan sonra, mümkün olduğu kadar çok ortamını çıkarın ve buz üzerinde her tüp koydu. Nedeniyle tüp yanlarındaki artık medyaya, ~ medya 2-3 ul nakli prosedürü başladı zaman hücre pelet kapsayan sona erecek. </li></ol> 6. Nakli ve Doğrulama <ol><li> Ev sahibi P1 yavrular Edinme ve prosedürü hazırlamak% 70 etanol ile aşağı püskürtülerek alan. İşlem sırasında sterilite korumak için bir özel, temiz işlem odasında bu işlemleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Buna ek olarak, kullanmak ya da otoklavlanmış cerrahi aletler yavruların% 70 etanol ile temas halinde olacak yüzeylere sterilize edin. Nakli ve temsili prosedür alanı yapmak için gerekli olan temsili ekipmanın bir örneği, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li></ol> Not: Bu yordam bir küçük hacimli enjeksiyon, değil bir kesi, açık yara ya da sütür gerektirecek bir cerrahi işlem olmasına rağmen, hala her fare enjekte edilecek yeni bir mikropipet kullanılması tavsiye edilir. mikropipetler çekilmiş ve% 70 etanol, kapalı bir kap içinde depolanan püskürtüldü bir yüzey üzerinde eğimli zaman ısıyla sterilize edilmiş bulunmaktadır. <ol><li> 40-80 um arasında ucunda bir çapa sahip mikropipetler oluşturur. Bu boyutlar ardından optimum verecekSonuçlar. Isı çekildiğinde mikropipetler sterilize ve bir yüzey üzerinde kesik ve kapalı bir kapta mikropipetler saklamadan önce% 70 etanol ile sprey. Not: (Tablo 2), bu iğneler oluşturmak için gereken cihazlara erişimi sınırlama Alternatif olarak, başka bir enjeksiyon cihazı kullanın. Bununla birlikte, bu değişik çaplarına bağlı mikropipetler gibi uygun olmayabilir. </li><li> 1 ml şırınganın içine mineral yağ çizin, ve 30 1/2 G iğne ile, mineral yağ ile tamamen cam pipet doldurun. Sonraki, piston üzerine stereotaksik cihaz ve yük cam pipet eklemek sonra, stereotaksik cihaz üzerine monte pistonu. Hidrolik sürücü kullanarak, temiz temiz bir kağıt havlu ile saçılan mineral yağ çıkarma, cam pipet içine yarısına kadar pistonu hareket ettirin. <ol><li> Alternatif olarak, bir şırınga kullanarak, mineral yağ içinde pipet arka uç daldırın ve kapiler etkiyle doldurulmuştur. Pipett hava kabarcıklarını önlemek için,e, cam pipet tamamen kadar şırınga pozitif basıncı korumak. Not: Diğer cihazlar başarıyla MGE hücreleri 14 nakli kullanılabilir. Veya daha bu prosedür için de 100 nl eserler yakın bir hacim az sunabilen herhangi bir cihaz. </li></ol></li><li> Ince noktaya içine bükülmüş köşe ince MGE hücre pelet üzerinde aşırı ortamı çıkarmak için sonraki, bir steril kağıt havlu, ya da herhangi bir emici malzeme kullanın. Bu adım, daha küçük enjeksiyon hacimleri elde edilebilir, böylece hücre yoğunluğu yoğunlaşmaktadır. Sonraki, yavaş yavaş hücre pelet hazırlamak ve bir hidrofobik yüzeye hücre süspansiyonu geçmeden önce 1-2 kez çiğnemek için (P2 tercih edilir) pipet düşük hacim kullanın. hacim hemen altında 1 ul olmalıdır. Hücre süspansiyonu içine iğne ucu hareket ettirin ve hidrolik sürücü kullanarak, pipet içine hücre süspansiyonu hazırlamak. </li><li> Hipotermi yoluyla P1 yavru uyuşturan (bir lateks eldiven sarın ve ~ buz üzerinde 2-4 dakika koymak).Bir zararlı uyaran ile anestezi etkinliği için kontrol edin. Ince forseps ile ayak parmakları arasında cilt Pinch: sıkışmak durumunda yavru tepkisiz olmalıdır. Sonraki, enjeksiyon cihazının altında bir kalıp üzerine yavru koyun, sonra kafasına cilt geri çekerek ve standart laboratuar bant ile güvence gergin cilt yapmak. Not: hipotermi yenidoğan farelerde ve düşük mortalite oranı sonuçları çok etkili iken yavrular 10 dakika altında kurtarmak için başlayacak gibi, prosedürler, çabuk yapılmalıdır. Buna ek olarak, buz üzerinde 4 dakika tolere edilebilir ne bir üst sının teşkil eder. Uzun bir zaman enjeksiyonlar için gerekli ise, sadece bir kez hipotermi ikna etmek için çalışın. Bir yavru erken kurtarır Ancak, ilk yavru tekrar tam hipotermi oluşturulmadan önce kurtarmak için izin verir. Ayrıca, sadece hipotermi bir enjeksiyonları gerçekleştirmek için daha fazla zaman neden. Yavrular hipotermi 5-10 dakika içinde iyileşir. Bu çöp ve anne ile yavrular yerleştirerek veya sıcak bir yüzeye uygulamaktadır üzerinde yavru koyarak kolaylaştırılabilirE kurtarmak için. </li><li> Bir stereotaksik cihazı kullanarak, baş yüzeyine dik, yavru kafasına yüzeyinde cam pipet ucu yerleştirin. Pipet kafası ile temas halinde olduğu zaman, &quot;0&quot; olarak düşünün. Sonraki eklemek sonra, korteks içine deri ve kafatası yüzeyi ile pipet itin ve durdurmadan önce ~ 2 kez pipet geri çekin. Mikropipet 0.1 mm&#39;lik bir derinlikte olduğu zaman neokorteks içine hücre hedefleme optimum için enjeksiyonlar yapılmaktadır. Ancak, bu kullanıcı tarafından optimize edilmelidir (aşağıdaki nota bakınız). Not: Bu derinlik güvenilir, yukarıda tarif edilen cihazları ile derin neokortikal katmanları hedef ise, birkaç derinlikleri ampirik bir şekilde tespit test edilmelidir. Buna ek olarak, farklı postero-kaudal ve iç-dış pozisyonda derinliklerinde bir dizi her yerinde en iyi ne derinlik belirlemek için test edilmelidir. Neokorteks içine yavaş nüfuz c yeteneği azalır olarak da, ilk delinme, hızlı olmalıleanly dokuya nüfuz. Birinci en iyi olanı bulmak için bu prosedürü başlatırken farklı hızlarda deneyin. Boyalar pozisyon belirtmek için güvenilmez olmuştur Buna ek olarak, test koordinatlar için, etiketli hücreleri kullanarak gerçek yerini yoktur. </li><li> İğne pozisyonunda sonra, korteks içine hücre süspansiyonu bir dizi hacmi iterek, cam pipet içine pistonu ilerlemek için hidrolik cihazı döndürün. Site başına 50-70 NLS enjekte edilir. Gol neokorteksin boyunca hücrelerin geniş bir dağılım elde etmek ise farklı rostral-kaudal seviyelerde 3-6 farklı sitelerde bu işlemi tekrarlayın. Not: 100 nl veya daha büyük birimler lezyonlara neden ve verimli bir şekilde enjeksiyon yerinde dışarı göç başarısız enjekte edilen hücrelerin büyük topaklar yol açabilir. Böylece, küçük enjeksiyon hacimleri (~ 70 nl veya daha az) zaman yeterse daha fazla siteler üzerinde, optimal. </li><li> Enjeksiyonlar tamamlandığında, ayak kırpma s tanımlamak için güvenilir bir yoludur (aşamasından yavru çıkarmak ve onu işaretleyinups sonra). Yavru kurtarıldı ve kendi başına hareket edebilir sonra, anne ve çöp ile geri koymak (bu aşamada onları kaldırma dakika içinde ortaya çıkar). Not: Bu minimal invaziv bir işlem olduğundan yavru serbestçe hareket ve ısıtılır sonra hiçbir cerrahi sonrası prosedürler vardır. Ancak, yavrular sadece prosedür değil, aynı zamanda sağlamak için ertesi gün sonra onlar sağlığı bozulan emaresi var kontrol edilmelidir. </li><li> Bir sonraki yavru prosedürü başlamadan önce, steril çalışma alanı korumak için% 70 etanol ile bölgeyi sprey. Enjekte yavrular geliştirmek ve daha sonra uygun gelişim aşamasında (ler) de doku değerlendirmek için izin verin. </li></ol>

<ol>
	<li>Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GABA+innervation+in+the+cerebral+and+cerebellar+cortices.">Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).</li><li>Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+of+autism:+increased+ratio+of+excitation/inhibition+in+key+neural+systems.">Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems.</a> Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).</li><li>Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuron+migration+from+basal+forebrain+to+neocortex:+dependence+on+Dlx+genes.">Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes.</a> Science. 278 (5337), 474-476 (1997).</li><li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons.">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).</li><li>Gelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wide+Diversity+of+Cortical+GABAergic+Interneurons+Derives+from+the+Embryonic+Preoptic+Area.">A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area.</a> J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).</li><li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons.">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).</li><li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network.">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).</li><li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Bias+in+the+Mitotic+Origins+of+Somatostatin.">Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin.</a> and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).</li><li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Resource+of+Cre+Driver+Lines+for+Genetic+Targeting+of+GABAergic+Neurons+in+Cerebral+Cortex.">A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex.</a> Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Bio. 3 (5), e159 (2005).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622 (2014).</li><li>Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+progenitors+grafted+into+the+adult+epileptic+brain+control+seizures+and+abnormal.">GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal.</a> Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).</li><li>Braz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+GABAergic+Neuron+Precursors+Integrate+into+Adult+Spinal+Cord+and+Reduce+Injury-Induced+Neuropathic+Pain.">Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain.</a> Neuron. 74, 663-675 (2012).</li><li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+Directly+Regulates+Arx+and+CXCR7+to+Determine+Cortical+Interneuron+Fate+and+Laminar+Position.">Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position.</a> Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).</li><li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain.">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).</li><li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6.">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).</li><li>Arguello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dapper+Antagonist+of+Catenin-1+Cooperates+with+Dishevelled-1+during+Postsynaptic+Development+in+Mouse+Forebrain+GABAergic+Interneurons.">Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67679 (2013).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition.">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li><li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+&#8220;MGE+Enhancers&#8221;+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+(MGE)+Progenitors+and+Neurons.">Use of &#8220;MGE Enhancers&#8221; for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956 (2013).</li><li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex.">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hücre bazlı tedaviler için embriyonik ganglion eminences (GEs) den GABAerjik kortikal interneuron öncülerinin kullanımı birçok koşulları 12 -1 4 için umut gösteriyor. Hassas moleküler teknikler etiket ve belirli interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için ihtiyaç vardır. Burada transplantasyonundan önce lentivirüsler embriyonik MGE hücrelerin etiketlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar ve bu yöntem, in vivo analiz için özel kortikal interneuron alt ilgi genleri ifade etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Burada tarif edilen protokol güvenilir süre, optimal olarak yeniden üretilebilirlik için birkaç kritik aşamalara dikkate alınmalıdır, kullanılabilir. Viral transdüksiyon verimli olması için ilk, fizyolojik sıcaklık ve pH gereklidir. Bu parametreler yerine getirilmesi MGE&#39;ye hücreler, 30 dakika içinde kalıt edilebilir. İkincisi, devam etmeden önce yoğun bir MGE pelet olduğundan emin olunBir nakli yapmak. Sadece sınırlı bir hacim zarar neden olmadan her yerinde küçük neonatal bir fare beyin içine enjekte edilebilir ve hücreler, uzak enjeksiyon bölgesinden geçirmek, böylece nakli sırasında yoğunlukları olabilir daha az bir endişe nedeni, bu önemlidir beklenen. Son olarak, derinlikleri optimum ne enjeksiyon belirlemek için bir floresan muhabiri ifade MGE hücreleri ile bazı test koşullarını çalıştırın. Bu protokol MGE hücreleri kullanılır iken, CGE hücreler de aynı şekilde kullanılabilir. Tek dezavantajı, tüm CGE veya CGE-türetilmiş internöronlar belirli alt gruplara ifade özgürlüğünü kısıtlamaya birçok Kre-sürücü hatları yoktur olmasıdır. Bununla birlikte, vazoaktif intestinal peptid (VIP) 9 CGE türetilen bu hücre alt-grubunu ayırmak için kullanılabilir güvenilir Cre hattıdır. Yeni hatlar kullanılabilir hale gibi, daha genetik hassasiyet ile bu protokolü kullanılması mümkün olacaktır. Daha önce, ve diğerleri göstermiştirBu teknikler, in vivo analiz için genlerin katılmasıyla etkili iken. elektroporasyon ile ya da lentivirüs 15, 17, transplantasyon öncesi MGE hücreler arasında gen aktarımı faydası, MGE doku heterojen olup, birden fazla interneuron alt yol olarak nöronal-olmayan hücreleri verir 4. Ayrıca, sadece belirli bir interneuron alt ilgi konusu bir geni ifade etmek zor olmuştur. Büyük adımlar dahil olmak üzere birçok kortikal interneuron alt, salgılanma modellerini özetlemek transgenik hatları oluşturmak için yapılan, ancak bir d VIP-Cre 9 SST-IRES-Cre, PV-IRES-Cre, PV-2A-Cre, bunlarla sınırlı olmamak edilmiştir -11 ve yeni hatların gelişi gelecekte ek olası popülasyonları aydınlatmak yardımcı olacaktır. Ayrıca, Kre-bağımlı muhabir ve burada kullanılan Kre-bağımlı haberci vektörleri de dahil olmak üzere ekspresyon vektörlerinin üretimi ile, ilgi konusu gen, daha kesin bir anlatım elde edilebilir. <p ckız = &quot;jove_content&quot;&gt; sınırlı hücrelerde Cre ifade eden farelerde beyinlerine Kre-bağımlı haberci virüslerinin enjeksiyon güçlü bir yöntem olmasına rağmen, virüs enjeksiyon mahallerinden itibaren kadar yayılmaz. Bu zor bağımsız bir şekilde veya uzak enjeksiyon mahallerinden itibaren transduse hücreleri incelemek için yapıcı hücrelerin üst üste yoğun bir alana yol açar. Bunun aksine, MGE hücreleri bireysel hücrelerin özelliklerinin daha temiz bir değerlendirme için izin uzak enjeksiyon bölgesinden geçirmek için eşsiz bir yeteneği vardır. Neokorteks hücre enjekte bir mahzuru, normal, teğetsel geçiş yolları hareket olmayacak olmasıdır. Bir seçenek aynı şekilde hücreleri hazırlamak ancak WT ev sahibi embriyo yerine bir yenidoğan yavru bir yaştaki MGE içine enjekte bu testte kullanılarak teğet göç keşfetmek için. Bu deneyde, nakledilen hücrelerin normal teğet yolları uğrayacaktı. Mekansal kısıtlı, Kre-bağımlı olan MGE nakli birleştirerekBir muhabirin ifadesi, biz de morfolojik çalışmalar için uygundur kendileri hücrelerin belirli bir alt içinde faiz veya muhabir bir geni ifade uygulanabilirliğini göstermek. Bu tekniğe bir sınırlama, bir güvenilir bir lentiviral vektör içine paketi olabilir fragmanın büyüklüğü olabilir. Ayrıca, bu yaklaşım henüz AAVS ile test edilmemiştir. Bu teknik, bir birey tarafından optimum bir kez, ancak bu yaklaşım çok varyasyon kullanılabilir. İlk olarak, yaklaşım, araştırmacılar, belirli Cre sürücü hatları MGE donör hücreleri ile birlikte bir Kre-bağımlı haberci lentivirüs kullanarak raportörleri eksprese sağlayacak anlatılacaktır. Bu teknik, tek tek MGE hücrelerin morfolojisi değerlendirmek için kullanılabilir ya da ikinci bir gen vektörü içine klonlanır, potansiyel olarak farklı alt ilgi konusu bir geni ifade etmek. İkinci olarak, aynı zamanda, raportör MGE verici hücreleri veya potentia Kre-bağımlı bir Cre ifade virüs için uygun olabilirlly oluşan heterojen bir topluluk hücrelerin farklı popülasyonlarda ekspresyonunu tahrik etmek için korunan DNA elemanları, promotör ve arttırıcılar, gelişen kullanmaktadır. Insan kaynaklı uyarılmış pluripotent kök hücreleri ya da embriyonik kök hücreleri etiketlenmesi olacak aşmak için bir gelecek engel potansiyel arındırmak ve / veya belirli bir hücre grubu çalışma. İlginç bir şekilde, korunan DNA arttırıcı maddeler aynı zamanda, korteks içine enjeksiyondan sonra, primer kültürlerinde GABAerjik nöronlar hedef viral ekspresyon sistemleri kullanılabilir, ve MGE hücrelerinin transplantasyonundan önce 15, 18, ​​19. Güçlendiriciler Bu engel bir cevap olabilir ve olacaktır Yeni teknikler tedavide bu hücrelerin kullanımını incelemek için gerekli olan moleküler araçları gibi ilgi. Nitekim, keşfetme arttırıcılar için yayılmakta potansiyel glutamaterjik nöronlar 21 olmak üzere, GABAerjik internöronlardan 20 veya diğer nöronal alt tipi ya etiket olabilir, sürüyor. Bu buluşta, viral etiketleme yöntemi kullanarak,transplantasyondan önce ve in vivo analizlerde ilgi farklı hücreleri etiketlemek için, hücre tipi özel güçlendiriciler ile farklılaştırılmış insandan türetilmiş kök hücreleri nakletmek için mümkün olabilir.

Dinlenme, glutamaterjik temel nöronlar uyarıcı karşılık ise GABAerjik kortikal internöron, memeli neokorteks nöronların ~% 20-30 içermektedir. Internöron elektrofizyolojik özellikleri, akson ve dendrit morfolojisi ve 1 hedefleme sinaptik oldukça çeşitlidir, ve uyarıcı / inhibitör tonda dengesizlikler otizm, şizofreni ve epilepsi gibi nörolojik 2 / nöropsikiyatrik bozuklukların bazı fenotipleri altında yatan varsayılmaktadır. Burada açıklanan protokol genel amacı verimli genetik in vivo analizler için transplantasyon öncesi GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır değiştirmek için bir araç sağlamaktır. Kortikal GABAerjik internöron medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve sırasıyla CGE) 3,4 yanı sıra preoptik alanda 5 doğarlar. Kortikal interneuron atalarıdır uzun mesafe teğet göç takip geçmesiradyal göç ederek nihai hedeflerine ulaşmak için. Hedeflerine varışta, bu kortikal internöron doğru mevcut nöronal ağ içine entegre olmalı, ve her benzersiz interneuron alt grup belirli şekillerde kortikal devre katkıda bulunacaktır. Dört ana alt gruplar moleküler belirteçlerin tarafından ayırt edilebilir: MGE-türetilmiş somatostatin (SST) + ve parvalbumin (PV) + alt gruplar ve CGE-türetilmiş vazoaktif intestinal peptid (VIP) + ve Reelin +; SST - alt grupları 6. Farklı kortikal interneuron alt grupları MGE ve CGE 7, 8 embriyonik gelişimi sırasında değişik zamanlarda doğar. Bu ve diğer kortikal GABAerjik interneuron işaretleri bu alt 9-11 çok özel Cre sürücü soyları meydana getirmek için kullanıldı. MGE progenitörlerin nakli dengesizliklerinin neden olabilir bozuklukları tedavi etmek için potansiyel bir hücre bazlı terapi olarak ortaya çıkmıştır12-24 uyarma / inhibisyonu. Bunlar, tedavi edici yararları çok peri-somatik önleyici PV + hücreleri MGE elde edilir (ayırt etmek ve bir konakçı beyin entegre dağıtmak için), ya da potansiyel nedeniyle MGE progenitörlerinin eşsiz kabiliyetlerine bağlı olabilir. MGE hücreleri aynı zamanda genetik olarak in vitro olarak modifiye edilmiş hücreler, in vivo olarak incelenmesi gereken sağlayan hızlı ve verimli bir şekilde nakli 15 önce lentivirüsler ile transduse olabilir. Bu yaklaşım geliştirmek için gerekçe GABAerjik kortikal interneuron gelişimini ve olgunlaşmasını okuyan barikatlar üstesinden oldu. Özellikle, MGE transplantasyonu mutant fare başka türlü erken zaman noktasında öldü ne zaman araştırmacılar, in vivo, mutant hücrelerinin gelişimini çalışmalarına izin vermiştir. Ayrıca, transplantasyon öncesinde ilgi genlerin katılmasıyla, bir mutant fenotipe spesifik genlerin etkileri, eff olarak değerlendirilebiliricient şekilde. Burada, biz transplantasyon öncesinde lentivirüsler MGE hücreleri nakletmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Buna ek olarak, bu teknik, Kre-bağlı sentezleme lentivirüsler ve veriler Cre sürücü fare hatları bir kombinasyonu kullanılarak, kortikal interneuron ön ait heterojen bir gruba belirli interneuron alt ilgi konusu bir geni ifade etmek üzere adapte edilebilir göstermektedir. Genetik benzersiz bir şekilde in vivo çalışmalar için GABAerjik kortikal interneuron öncülerini değiştirmek Üstelik, bu protokol teknikleri ve araştırmacılar için bir platform sunuyor. Diğer güncel yaklaşımlar üzerinde bu tekniğin bir avantajı nakledilen MGE hücreleri uzak enjeksiyon yerinde dağıtmak olacaktır. Ayrıca, fokal, viral enjeksiyondan farklı MGE hücreleri dağıtmak sonra morfoloji değerlendirmek kolaydır. Bu yaklaşım, belirli bir hücre tipi sokulması, vahşi tip veya mutant hücrelerine ilgi genleri verme etkisini incelemek için kullanılabilirmuhabir in vivo hastalık alel etkisini incelemek için potansiyel morfoloji değerlendirmek, ya da.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents and equipment for MGE cell transplantation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>30 1/2 G needle</td><td>305106</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>Precision bore to deliver 5 &amp;micro;l (comes with plunger)</td><td>5-000-1005</td><td>Drummond scientific company</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope with boomstand **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Digital just for mice stereotaxic instrument **</td><td>51725D</td><td>Stoelting company</td><td></td></tr><tr><td>Single-axis oil hydraulic fine micromanipulator **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Diamond coated rotary beveler</td><td></td><td>made in house</td><td></td></tr><tr><td>Needle pipette puller</td><td>730</td><td>Kopf instruments</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td>Any drug store or pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Any pipette and tips that can reliaby measure 1 &amp;micro;l of volume</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** These are the particular models we use, but many other setups should work</td></tr><tr><td colspan="4">Optional Reagents (for making Lentiviruses)</td></tr><tr><td>25 mm, 0.45 &amp;micro;m filter</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes (25 x 89 mm)</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&amp;reg;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine &lt;sup&gt;2000 &lt;/sup&gt;(1.5 ml size)</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Other commercially available supplies</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE plasmid encoding gag/pol</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev plasmid encoding Rev</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmid encoding VSVG</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgene</td><td></td></tr></tbody></table>

viral-mediated labeling and transplantation of medial ganglionic eminence (mge) cells for in vivo studies

Embriyonik medial ve kaudal ganglion eminences (MGE ve CGE) türetilen GABAerjik kortikal internöron, işlevsel ve morfolojik çeşitlidir. Yayılmakta farklı kortikal interneuron alt rollerini anlamada yapılmış, ancak, GABA farklı hücre tiplerinin gelişmesi ve olgunlaşması için katkıda bulunabilir çalışılması gerektiğini hala birçok mekanizma vardır. Ayrıca, değiştirilmiş GABA sinyal, otizm, şizofreni ve epilepsi fenotipleri katkıda bulunabilir. Spesifik Kre-sürücü hatları eşsiz interneuron alt fonksiyonlarını dışarı parsel başladı. Fare modellerinde ilerlemelere rağmen, verimli in vivo moleküler yaklaşımlar GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır çalışma genellikle zordur. Bu hücrelerin hücre özerk programlama incelemek için kullanılan önemli bir tekniktir konak korteks içine MGE hücrelerinin nakli olduğunu. Bu nakledilen hücrelerin ayırt, yoğun göç, birnd işlevsel entegre. Buna ek olarak, MGE hücreleri verimli bir şekilde moleküler yaklaşımlar çok sayıda imkan veren, transplantasyondan hemen önce lentivirüs ile transduse edilebilir. Burada mevcut Kre-sürücü hatları ve Kre-bağımlı ifade vektörleri kullanılarak, detay verimli in vivo analiz için transplantasyon öncesi MGE hücreleri nakletmek için bir protokol biz. Bu, in vivo olarak daha büyük bir hücre türüne özgü çözünürlüğe izin verecek şekilde nakli sonrası dağıtmak için bu hücrelerin yeteneği ile kesin genetik işleme birleştirir, bu yaklaşım, avantaj sağlamaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies at JoVE.com

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor.

Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Çalışmalar

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

11.4K Görüntüleme.  University of California San Francisco.  GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor. 

Video: Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence MGE Cells for In Vivo Studies

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Nörobilim

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Gelişim Biyolojisi

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in vivo gene control of neocortical projection neuron morphology. This method is based on (1) in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors as "test" and "control" cells, (2) their co-transplantation into wild-type brains, and (3) paired morphometric evaluation of their neuronal derivatives. Specifically, E12.5 pallial precursors from panneuronal, genetically labeled donors, are employed for this purpose. They are engineered to take advantage of selected promoters and tetON/OFF technology, and they are free-hand transplanted into neonatal lateral ventricles. Later, upon immunofluorescence profiling of recipient brains, silhouettes of transplanted neurons are fed into NeurphologyJ open source software, their morphometric parameters are extracted, and average length and branching index are calculated. Compared to other methods, this one offers three main advantages: it permits achieving of fine control of transgene expression at affordable costs, it only requires basic surgical skills, and it provides statistically reliable results upon analysis of a limited number of animals. Because of its design, however, it is not adequate to address non cell-autonomous control of neuroarchitecture. Moreover, it should be preferably used to investigate neurite morphology control after completion of neuronal migration. In its present formulation, this method is exquisitely tuned to investigate gene control of glutamatergic neocortical neuron architecture. Taking advantage of transgenic lines expressing EGFP in other specific neural cell types, it can be re-purposed to address gene control of their architecture.

Based on in vitro lentiviral engineering of neuronal precursors, their co-transplantation into wild-type brains and paired morphometric evaluation of "test" and "control" derivatives, this method allows accurate modeling of in vivo gene control of neocortical neuron morphology in a simple and affordable way.

In vivo Nöromimarlık çalışmaları için tasarlanan nöronal öncülerin intraventriküler nakli

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Genetik

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point measurements and can therefore only evaluate longitudinal changes of cell migration and survival to a limited extent. This paper provides a reliable, minimally invasive protocol to transplant and longitudinally track neural progenitor cells (NPCs) in the adult mouse brain. Before transplantation, cells are transduced with a lentiviral vector comprising a bioluminescent (firefly-luciferase) and fluorescent (green fluorescent protein [GFP]) reporter. The NPCs are transplanted into the right cortical hemisphere using stereotaxic injections in the sensorimotor cortex. Following transplantation, grafted cells were detected through the intact skull for up to five weeks (at days 0, 3, 14, 21, 35) with a resolution limit of 6,000 cells using in vivo bioluminescence imaging. Subsequently, the transplanted cells are identified in histological brain sections and further characterized with immunofluorescence. Thus, this protocol provides a valuable tool to transplant, track, quantify, and characterize cells in the mouse brain.

Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

We describe the intraparenchymal transplantation of human neural progenitor cells transduced with a dual reporter vector expressing luciferase-green fluorescent protein (GFP) in the mouse brain. After transplantation, the luciferase signal is repeatedly measured using in vivo bioluminescence and GFP-expressing grafted cells identified in brain sections using fluorescence microscopy.

İntraserebral Transplantasyon ve Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İnVivo Biyolüminesans İzlenmesi

Cell therapy has long been an emerging treatment paradigm in experimental neurobiology. However, cell transplantation studies often rely on end-point ...

Sıçan trigeminal ganglionunun kalsiyum göstergeleri ile in vivo görselleştirilmesi

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their large signal-to-noise ratio makes GECIs a powerful tool for detecting stimulus-evoked activity in sensory neurons. GECIs facilitate population-level analysis of stimulus encoding with the number of neurons that can be studied simultaneously. This population encoding is most appropriately done in vivo. Dorsal root ganglia (DRG), which house the soma of sensory neurons innervating somatic and visceral structures below the neck, are used most extensively for in vivo imaging because these structures are accessed relatively easily. More recently, this technique was used in mice to study sensory neurons in the trigeminal ganglion (TG) that innervate oral and craniofacial structures. There are many reasons to study TG in addition to DRG, including the long list of pain syndromes specific to oral and craniofacial structures that appear to reflect changes in sensory neuron activity, such as trigeminal neuralgia. Mice are used most extensively in the study of DRG and TG neurons because of the availability of genetic tools. However, with differences in size, ease of handling, and potentially important species differences, there are reasons to study rat rather than mouse TG neurons. Thus, we developed an approach for imaging rat TG neurons in vivo. We injected neonatal pups (p2) intraperitoneally with an AAV encoding GCaMP6s, resulting in &gt;90% infection of both TG and DRG neurons. TG was visualized in the adult following craniotomy and decortication, and changes in GCaMP6s fluorescence were monitored in TG neurons following stimulation of mandibular and maxillary regions of the face. We confirmed that increases in fluorescence were stimulus-evoked with peripheral nerve block. While this approach has many potential uses, we are using it to characterize the subpopulation(s) of TG neurons changed following peripheral nerve injury.

Yazar Spotlight: Trigeminal Sinir Hasarında Nöropatik Ağrının Periferik Mekanizmalarının Araştırılması 

Genetically encoded calcium indicators (GECI) enable a robust, population-level analysis of sensory neuron signaling. Here, we have developed a novel approach that allows for in vivo GECI visualization of rat trigeminal ganglia neuron activity.

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Genetically encoded calcium indicators (GECIs) enable imaging techniques to monitor changes in intracellular calcium in targeted cell populations. Their ...

Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler