Yazarlar kritik tartışmalar W. Sun ve K. Jansen teşekkür ve Singapur Ulusal Üniversitesi Nano Biyomekanik Lab tarafından destek kabul. NAK Marie Curie IIF Bursu ile destek kabul eder.

1. Hücre Hasat <ol><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe MD-MBA-231 hücreleri elde edilir. % 0.5 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak doku kültürü hücreleri plakadan ayırın. Bir T25 şişesi içinde kültürlenmiş bir hücre için Tripsin-EDTA solüsyonu, 1 ml kullanın. </li><li> 4 dakika için 200 x g&#39;da santrifüjleme ile 15 ml konik bir tüp içinde Pelet hücreleri, süpernatanı havalandırın, ve tekrar süspansiyon hücreleri kültür ortamı, 5 ml. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak, ρ, hücre yoğunluğu sayısı. Not: Hücre numaralı seribaşı iç jel hazırlamak için, hücre süspansiyonu daha sonra 10 × nihai hücre tohumlama yoğunluğu ulaşmak için seyreltilmiş edilecektir. Bu nedenle, 10 x konsantre hücre süspansiyonu gereklidir. </li><li> 10 x hücre konsantrasyonunu elde etmek için gerekli ortamın miktarı hesaplanır: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> Not: nihai hücre tohum yoğunluğu son C, yaklaşık 215; 10 6 hücre / ml MD-MBA-231 hücreleri için tavsiye edilir ve bu protokol kullanılır. Diğer tohumlama yoğunlukları da diğer hücre tipleri için keşfedilebilir. </li><li> Pelet hücreleri bir kez daha, 4 dakika için 200 x g&#39;da santrifüjleme ile 15 ml konik bir tüp içinde süresi ve süpernatan aspire. </li><li> Hücre topaklanma en aza indirmek için iyice serumsuz hücre kültür ortamının (adım 1.3 hesaplanan V ortam) gerekli miktarda tekrar süspansiyon hücreleri. Not: Fenol kırmızı otomatik floresan ve floresan / yansıma görüntüleme engelleyebilir. Fenol kırmızı içermeyen ortamda kullanılması en iyi görüntü kalitesini elde etmek için kabul edilebilir. </li></ol> Kollajen Çözümleri 2. Hazırlık <ol><li> Stok kolajen çözeltisi, 10 x PBS tampon, Milli-Q, H2, O, 0.1 M NaOH ve çeşitli mikrosantrifüj tüpleri elde edilir. Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm tutun, ve steril durumunu korumak. </li><li> Steril cam-dengeye37 ° C inkübatör içinde ön ısıtmaya göre alt yemek. Not: Bu protokol tüm birimleri de 12 mm cam alt çanak için optimize edilmiştir. Diğer çanak tipi kullanılırsa, buna hacimleri ayarlayın. </li><li> Kollajen stok konsantrasyonuna bağlı olarak, iç jeli (çözelti l) 2.4 mg / ml kolajen çözeltisi 50 ul hazırlanması için ihtiyaç duyulan gerekli hacmi hesaplanır. Not: İç jeli diğer kollajen konsantrasyonları da kullanılabilir. </li><li> Steril bir ortamda (tipik olarak bir biyo-güvenlik kapağı) &#39;de yavaş yavaş hafif döndürme ile (adım 2.3 olarak hesaplanmıştır) kollajen stok çözeltisi gerekli miktarda 10 x PBS tamponu 5 ul ilave edin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkat edin. </li><li> Kalibre pH metre kullanılarak 0.1 M NaOH ile 7.4&#39;e karışımın pH ayarlayın. Bir kaba bir kılavuz olarak, (miktar stok konsantrasyonu ve pH değerine bağlı olarak değişir) 7.4 pH yakın getirmek için yaklaşık 5 ul kullanın. Not: hacimleri bu işin unutmayınadım standart bir pH metre kullanımı için çok küçüktür. Aşağıdaki hileler birini kullanın: <ol><li> Birden çok numune için kolajen solüsyonları hazırlayın. Standart pH metre kullanılarak toplu pH ayarlayın ve numuneler arasında kollajen çözümleri dağıtmak. </li><li> Seçenek olarak ise, daha büyük bir hacimde bir kolajen çözeltisi pH&#39;ın ayarlanması, (i. E., Standart bir pH metre kullanımına izin hacmi). Nihai pH, pH getirmek için gereken NaOH miktarını not edin. Hacimleri küçültün ve deney için NaOH uygun miktarda kullanın. Turnusol kağıdı kullanılarak pH değeri onaylayın. </li><li> Aksi takdirde, daha doğru bir şekilde az miktarda pH değerini ayarlamak için bir mikro pH elektrodu kullanın. </li></ol></li><li> O. H 2 kullanarak ul 45 bir hacme çözüm getir Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm adımları uygulayın. </li></ol> Konsantrik Jel Kültür 3. Oluşumu <ol><li> Önceden ısıtılmış cam alt çanak alın th (adım 2.2 bakınız)E inkübatör. </li><li> Çözelti I yeniden askıya almak için (adım 1.5 hazırlandı) 10 x konsantre hücre süspansiyonu 5 ul iyice ekleyin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkat edin. Karışım, hemen 50 ul arasında değişen bir hacme sahip ve (nihai = 2 x 10 6 hücre / ml c) Nihai kollajen konsantrasyonu (2.4 mg / ml) ve hücre yoğunluğu içerir. </li><li> Bu kubbe şeklinde bir damla (Şekil 1A) oluşturan bu yüzden de merkezine yavaş hücre içeren bir çözeltinin 20 ul ekle. Bu aşamada kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat edin. Bir kabarcık formları ise, dikkatli ama hızlı bir şekilde çalışın ya da kopma veya pipet kullanarak dışarı emmek. Yavaşça iç jel 45 dakika süreyle polimerize izin geri inkübatör çanak koyun. </li><li> (Dış, aselüler kollajen jel için) çözüm O bu inkübasyon adımı bitmeden yaklaşık 15 dakika hazırlayın. Not: dış jel durumu kollajen konsantrasyonu ve polimerizasyon pH koşullarını değişik olabilirFarklı mikroyapılanna 10 ile ağları edinin. 7.4 arasında bir pH değerinde polimerize 4.0 mg / ml kolajen jel - Bu protokolde, 1.5 odaklanır. <ol><li> Kollajen stok konsantrasyonuna dayalı olarak, nihai konsantrasyonda kolajen çözeltisi O 200 ul hazırlanması için ihtiyaç duyulan gerekli hacmi hesaplanır. </li></ol></li><li> 10 x PBS içinde 20 ul yumuşak döndürme ile (adım 3.4 olarak hesaplanmıştır) kollajen stok çözeltisi gerekli miktarda yavaş yavaş tampon ekleyin. Kalibre pH metre kullanımı ile, 0.1 M NaOH ile son pH karışımın pH ayarlayın. PH ayarlaması ile ilgili 2,5 adıma nota bakınız. </li><li> O H2 kullanılarak ul 200 ul son hacme çözüm getirmek Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm adımları uygulayın. </li><li> İç jel 45 dakika polimerizasyondan sonra inkübatör çanak alın (adım 3.3). Çözelti tamamen iç kaplayacak şekilde yavaşça iç jelinin üzerine çözelti, O 180 uljel ve kuyu (Şekil 1B) doldurur. <ol><li> Dış jelde homojen olmayan bir lif yönelimleri yol açabilir çözeltisi, karıştırma olmadan dikkatlice adımı gerçekleştirir. Bir pipet ile iç jel dokunmaktan kaçınmak için özen ve kabarcıkları veya hava ceplerinin oluşumunu önlemek için. Bir kabarcık formları ise, dikkatli ama hızlı bir şekilde çalışın ya da kopma veya pipet kullanarak dışarı emmek. Yavaşça dış jel, polimerik maddelerin izin inkübatör çanak geri yerleştirin. </li></ol></li><li> Polimerizasyon 45 dakika sonra inkübatör çanak alın. yaklaşık olarak kullanıldığı takdirde yine alt yüzeyinden ayırmak, ancak jel zaten oldukça, bu noktada katılaşan olmalıdır. <ol><li> Yavaşça çanak (Şekil 1C) ısıtıldı hücre kültür ortamının 2 ml dökün. Jel tamamen ortamında batık emin olun. Kültür süresi boyunca 3 gün - her 2 orta yenileyin. </li></ol></li></ol> 4. Canlı hücre Görüntüleme <ol><li> Uzun vadeli canlı hücre görüntüleme yeteneği ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin. Dahil dahili bir sıcaklığa (37 ° C) ve CO2 (% 5), kontrol ile inkübasyon odası. Mikroskop açın ve deneye başlamadan önce evre en az 1 saat ısıtın. Not: Uzun çalışma mesafesi ile kullanın objektif 3D jellerin hücrelerin gözlem ve lokalizasyonu optimize etmek. </li><li> 3D sistemindeki hücrelerin doğru belirlenmesine olanak tanımaktadır, 30 dakika için floresan hücre izleyici boya 5 ul ihtiva eden bir ortam içinde jel inkübe edin. Daha sonra, 1 x PBS ile yıkanarak üç kez bağlanmamış boya çıkarın. Daha sonra, çanak hücre kültür ortamı ilave edin. </li><li> Inkübatör çanak alın ve mikroskop aşamasında (Şekil 1D) üzerine yerleştirin. Not: Canlı hücre görüntüleme sağ dış jel polimerizasyon sonrası prensip olarak başlayabilirsiniz. Bununla birlikte bu noktada, hücreler in iç jel henüz yayılmış değil. Dış jel, canlı hücre görüntüleme kültürünün başlatılmasından sonra (hücre tipine göre) 24 saat başlayabilir işgal ilk hücrelerinin göçünü incelemek. Bir kaba bir kılavuz olarak, yaklaşık 12 - kültür 14 gün dış jel girmek iç jel hücrelerin çoğu için gereklidir. </li><li> İç jel çevreleyen dış jel bölgelerde Manzaralı (VoV en) Seç Birimleri. Kuluçkadan 24 saat, hücre popülasyonu, yayılmış olur sonra, iç ve dış jel arasındaki ara yüzü geçti ve dış jel işgal başladı. <ol><li> VoV en için, hemen yanındaki dış jel 7, olay yakın jel arayüzü, ara bölgeler ve bölgelere jel bölgelerini içerir. Mümkün olan kenar etkileri önlemek için, jel üst hem de daha yakın bir alt ve yan yüzeyler ile 50 um den bölge hariç. Her VoV tipik x (647 × 647 × 100 mm 3 ölçerZ -stack 5 um aralığında olan, sırasıyla, y ve z, tarifi). </li></ol></li><li> Emin olun görüntüleme modları, kanallar / filtreler, pozlama süreleri ve görüntü çözünürlükleri doğru seçilir. Kollajen ağının etiketi ücretsiz görüntüleme için, zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme sırasında eş zamanlı olarak konfokal yansıma mikroskopi kullanın. </li><li> Örnek görüntüleri alın yoğunluk histogramlar arsa ve yeterli sinyal gözlemlemek ve histogram sıfır ve maksimum yoğunluğu arasında yatıyor sağlayarak doygunluk önlemek için kazanç ve uzaklıklar ayarlayın. Deney süresi boyunca bir daha bu ayarları değiştirmeyin. </li><li> 8 saat (veya gerekirse daha uzun) için 10 dakika, bir zaman aralığı, Δ t ile, seçilen VoV yılların zaman atlamalı görüntüleri çekin. </li></ol> 5. Hücre İzleme ve Veri Analizi <ol><li> ÖDENEK kullanarak z -stack görüntülerden kantitatif görüntü post-processing yürütmek<html> te görüntü işleme yazılımı. <ol><li> Segment time-lapse görüntüleri otomatik olarak (x, y, z, t) 3D hücre pozisyonları seçin. </li><li> Her çerçeve için, elle lokalizasyon doğruluğunu kontrol ve hücreler için yanılmış olabilir hücre artıkları ve hücresel çıkıntılar nedeniyle yanlış pozitif kaldırın. Farklı nesnelere analiz ve bölünmüş örtüşen veya bağlı hücreleri çoğalma hücreleri çıkarmak. </li></ol></li><li> Zaman dizisi her hücrenin yerini bağlayarak önceki aşamada elde edilen hücre koordinatları (x, y, z, t), 3D hızlandırılmış hücre parçaları üretir. </li><li> Bir eşik hat uzunluğu (genellikle 20 dk) daha kısa parçaları kaldırarak rastgele ve sistem gürültüsünü ortadan kaldırın. </li><li> Gerekirse parça gelen toplam net değiştirmeleri çıkarılarak örnek sürüklenme için düzeltin. </li><li> Hücre deplasman hesaplayın,iles / ftp_upload / 52.735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt; ve hücre göçü mesafesi, <img alt="Denklem 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> Gözlenen hücre yörüngeleri, burada zaman, bir hücrenin 3D konumunu temsil eden bir vektördür ve zaman noktalarının toplam sayısıdır. <ol><li> Δ t kare arasındaki zaman aralığı S d = / (n • Δ t) gibi hücre hızı, hesaplayın. P = Δd / d kullanarak hücre göçü yönlülük (veya sebat) hesaplayın. Sebat Bu basit önlem P = 0 net deplasman sıfır ve p = 1 için yörünge düz yönlü çizgi olduğunu ima eder. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+three-dimensional+collagen+matrices+to+provide+contact+guidance+during+3D+cell+migration.">Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3D cell migration.</a> Curr. Prot. Cell Biol. 10, 10-17 (2010).</li><li>Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dimensions+in+cell+migration.">New dimensions in cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 743-747 (2012).</li><li>Grinnell, F., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2010).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Sun, W., Kurniawan, N. A., Kumar, A. P., Rajagopalan, R., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices.">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li><li>Mouw, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been largely limited to 2D assays14, while at the same time observing the behavior of the individual cell within the population. For cells that do not naturally migrate in groups or clusters, the assay offers a way to analyze the migratory properties in detail from a large number of cells with diverse local microenvironment, which can provide important insights into the biophysical origins of migration efficiency and directional persistence7,15.
Second, by modifying the gel conditions of the inner and outer gels, one can directly study the effect of matrix mechanics and microstructure on 3D cell migration behavior10. This is especially important, as it is known that cell migration and cancer invasion are highly influenced by matrix mechanics and porosity16,17, and that soft tissues in our body have a very diverse topology18. Moreover, the method is readily adaptable for matrices other than collagen. This is advantageous, as not all cell lines can spread and migrate in collagen-based matrices. A critical step that must be noted is that, to ensure physical connectivity of the gel interface, the formation of the outer gel must be initiated before complete polymerization of the inner gel. Since this is strongly dependent on the specific polymerization kinetics of the gels (also for collagen prepared under different conditions, e.g., concentration, polymerization pH, temperature, cross-linking8), an optimal polymerization duration should first be systematically identified. Imperfections in the interfacial connectivity between the inner and outer gel usually results in a gap and collection of the spreading cell population in the interface. Note, however, that perfect interfacial connectivity can introduce a practical problem: the boundary between the inner and outer gels becomes less obvious when imaging. If necessary, sparse fiducial markers, such as inert beads, can be used to distinguish the inner and outer gels.
Third, the possibility of long-term 3D culture (up to 3 weeks in our laboratory) and live-cell imaging allows a wide application of the assay. It is now possible to obtain spatially-resolved viscoelastic measurements of the local matrices surrounding the cells using microrheological approaches19. Furthermore, our recent study10 reveals that the efficacy of various anti-migratory drugs (administered on the 7th day of the experiment) can be strongly affected by the architecture and stiffness of the matrix (i.e., outer gel). In the future, we plan to use these experimental frameworks to further understand how such effects can arise from the basic molecular mechanisms of cell migration (e.g., cytoskeletal contractility20, extracellular matrix reorganization21, and pericellular proteolysis22).
One limitation of this assay is the asymmetry of the mechanical support: the top surface of the gel is not attached to any solid surface, while the bottom surface adheres to the glass surface of the dish. While edge effects can be avoided simply by excluding cells near the edges, the lack of mechanical support at the top surface can potentially lead to in-plane preferential migration and therefore introduce artificial flattening of the 3D cell trajectories7. One way to solve this issue while still maintaining oxygen and nutrition supply to the cells is by topping the gel with holed glass plate23. Additionally, to further suppress any wall effect, a thin layer of collagen gel can be first made on the glass surfaces, before the formation of the inner and outer gels. This ensures complete geometrical encapsulation of the gels.
To obtain meaningful and accurate description of cell migration behavior, it is important to consider the time scale and the nature of migration, which can vary considerably between cell lines. Preliminary experiments must be systematically performed to understand these factors, and then the interval time between image captures and live-cell imaging duration can be adjusted. The interval time should be no larger than the characteristic time scale of cell turning. It is also important to consider that cell migration behavior may change both spatially and temporally, depending on the biophysical conditions of the local microenvironment7. It is always a good idea to simultaneously visualize the cells and the fibrous matrix, for example using multi-color confocal fluorescence or multimodal (e.g., reflectance, second harmonic generation) imaging. After imaging, post-processing of the time-lapse 3D image, construction of the cell tracks, and analysis of the trajectories can in principle be done with any image processing software.
In conclusion, the concentric gel assay described here provides a simple and useful experimental system for quantitatively studying 3D cell migration, mechanosensing and mechanotransduction in diverse microenvironments.

Hücrelerin göç embriyonik gelişme, hemostaz ve bağışıklık tepkisi gibi gibi vasküler hastalıklar, enflamasyon ve kanser 1 gibi patolojik süreçlerde çeşitli fizyolojik tepkiler içindeki önemli bir rol oynar. Hücre göçü temel biyokimyasal ve biyofiziksel faktörleri Kesme hücresel fonksiyonların temel ilkelerini anlamak için değil, aynı zamanda böyle bir doku mühendisliği anti-metastaz ve anti-enflamatuar ilaç geliştirme gibi çeşitli biyomedikal uygulamalar ilerletmek için, sadece bu nedenle temel olarak önemlidir. In vivo gözlem teknik açıdan zor olduğundan, çabalarının bir sürü hücre göçü in vitro recapitulation odaklanmıştır. Hücre göçü incelemek için in vitro yöntemler büyük ölçüde en önemlisi, iki boyutlu (2D) yüzeylerde deneyleri için çizik olarak tasarlanmış veya tahlil 2 yara iyileşmesi edilmiştir. Bu tür deneyler basit deney düzeneği sunuyoruz, kolay yaşanılırhücre görüntüleme ve hücre göçü yatan çeşitli biyokimyasal mekanizmaların yararlı açılımlar sağlamaktadır. Bununla birlikte, bu deneyler, in vivo göç anlaşılmasında kritik yönleri olan hücre dışı matris (ECM), mimari ve yeniden modellenmesi hesaba katmaz. Son zamanlarda, giderek artan bir şekilde 3B kültürü modeli, genellikle kolajen-esaslı matrisler 3, daha iyi in vivo durum benzer bir platform temin ettiği takdir edilecektir. Nitekim, hücreler nedeniyle özellikle çevre 4 farklı boyutluluk için, 2B yüzeylerde olanlardan farklıdır Göçmen dinamikleri sergilerler. Ayrıca, matris biyo-fiziksel ve mekanik özellikleri, hassas tümör hücre istilası 6 bağlamında da dahil olmak üzere, hücre göçünü 5 etkiler. Burada, biz hazırlık koşulları ile kolayca çeşitli olabilir biyofiziksel özellikleri ile ECM 3D hücre göçü davranışlarını incelemek için bir yöntem mevcut. hücrelerdirBir &quot;iç gel&quot; numaralı seribaşı ve içine kaçmak ve başlangıçta Aselüler &quot;dış jel&quot; işgal izin verilir. yöntem yakından hücre 7 mechanosensing bağlantılı dış jel, hücre-serbest bölgelere, göç hücrenin varlığını tanımak yeteneği ve eğilimine dayanır. Bu çalışmada, biz son derece invaziv meme kanseri hücrelerinin, MD-MBA-231 tarafından işgal ECMs olarak kollajen ağları kullanır. mekanik özellikler ve hem iç hem de dış jellerin mikro 8 olarak ayarlanmış ve fizyolojik olarak uygun koşulları elde etmek için 9 karakterize edilebilir. Hücre parça İmar ve analiz nüfus düzeyi ve bireysel hücre düzeyinde hem de uzaysal göç davranışının ayrıntılı nicel incelenmesine olanak. Önemlisi, konsantrik jel sistemi kurulumu ve böylece önemli anlayışlar sunarak, özellikle kanser hücrelerini istila, hücreler göç ile karşı karşıya in vivo doku topolojisini taklitHücre göçü ve metastaz fiziksel mekanizmaları.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

göç hücrelerin yeteneği tümör ve kanser metastazı embriyonik gelişim yaşamın ve yara iyileşmesi süresince hücre fonksiyonları geniş bir yelpazede çok önemlidir. Yoğun araştırma çabalarına rağmen, hücre göçü temel biyokimyasal ve biyofiziksel prensipler hala tam özellikle fizyolojik ilgili üç boyutlu (3D) mikroçevrelerde, anlaşılmış değildir. Burada, 3B hücre göçü davranışları kantitatif olarak incelenmesini sağlamak için tasarlanmış bir in vitro testi. yöntemi daha önce boş hücre dışı matriks (ECM) göç etmek hücrenin mechanosensing yeteneği ve eğilimi patlatır. Bir model sistem olarak kollajen jel oldukça invazif göğüs kanseri hücrelerinin invazyonu, MDA-MB-231 kullanımı. kültür hafta boyunca hücre popülasyonunun yayılması ve tek tek hücrelerin göç dinamikleri canlı hücre görüntüleme kullanılarak izlenir ve spatiotemporally çözülmüş verilerin çıkarılması için analiz edilebilir. AyrıcaYöntem böylece hücre göçü üzerinde mikroçevresinin biyofiziksel faktörlerin rolünü araştırmak için basit ama güçlü bir şekilde sunan, çeşitli hücre dışı matrisler için kolayca uyarlanabilir.

Burada yer alan eş-merkezli jel tahlili, yüksek oranda istilacı meme kanseri hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi, MDA-MB-231, 2.4 mg / ml&#39;lik bir iç kollajen jel ve bir örnek olarak = 2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir hücre tohumlama yoğunluğuna sahip. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, tipik olarak kültür birkaç gün sonra, hücreler, iç-dış jel arayüzü ihlal ve dış jel işgal başladı. hücre popülasyonu radyal olarak dışarı doğru ağırlıklı olarak yayıldı. Dış jel polimerizasyon koşulları hücre göçü özelliklerine matrisinin yoğunluğu ve mekanik özelliklerin rolünü incelemek için modifiye edilebilir. 3 1.5 mg dış jel içinde bulunan hücrelerin hareketleri göstermektedir / ml, 2.4 mg / ml ve 4.0 mg / ml kolajen, pH 7.4 ile polimerize edilir. Konfokal zaman atlamalı görüntüler 8 saat süre ile, iç ve dış jel arasındaki sınırda elde edilen ve üç farklı kolajen konsantrasyonunda hücre değiştirme edildiyerel yönetim bu beyaz oklarla belirtilmiştir. Hücre tohum yoğunluğu ve proliferasyon oranına bağlı olarak, yaklaşık 200 tek tek hücre yörüngeleri tipik olarak elde edilebilir ve her bir numune içinde analiz edilmiştir. Biz kantitatif ortalama net deplasman açısından, katedilen mesafe, yön sebat 3 farklı kollajen konsantrasyonları hücre yörüngeleri analiz ve görüntüleme 8 saat (Şekil 4) üzerinde hız demek. Hücreler arasında yer değiştirmesi ve mesafe anlamlı bir fark 2.4 mg / ml ile 4.0 mg / ml jellerde olmasına rağmen bu, yer değiştirme ve mesafe sırasıyla 58 um ve 141.5 um, de 4.0 mg / ml arasında bir konsantrasyonda en yüksek olduğu anlamına gözlenmiştir . 1.5 mg / ml jel, deplasman ve mesafe küçük olduğunu anlamına gelir. Bu gözlem işgal verimliliği kollajen konsantrasyonu 11,12 artan jeller azaldığı gösteriyor son raporlar çelişiyor gibi görünebilir. Ancak, unutmayın ki deplasmanları vetahlilimizde mesafeler esas olarak radyal olarak dışarı doğru göç nüfus içinde tüm bireysel hücre parçaları ölçülür. Bu parametreler, bu nedenle daha az duyarlı hızlı hareket hücre alt popülasyonuna ve tamamen stokastik hareketler hakim değildir. Her durumda, (Şekil 4B) katedilen toplam mesafe net deplasman (Şekil 4A) daha büyüktü. Sadece mesafeye yerinden arasındaki oran olarak sebat tanımlanması, hepimiz jel koşullarında (Şekil 4C) arasında 0.4 ~ ısrarını aldı. Bu nispeten düşük kalıcılık bizim deneyde hücrelerin özünde zayıf yönlü göç yansıtır. Biz yönlü kemotaktik uyaranlara veya biyokimyasal geçişlerini varlığı potansiyel kollajen konsantrasyonu-bağımlı bir şekilde, sebat artacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca, biz de hücre göçü ortalama hızı önemli ölçüde wi değişmedi görülmektedirçünkü (kolajen konsantrasyonu ile artar), matris sertliği ve 10, hem de hücre popülasyonunun 7 içinde göç özelliklerine uzaysal değişim (kollajen konsantrasyonu düşer) gözenek büyüklüğü arasındaki etkileşim olasılığı inci kollajen konsantrasyonu (Şekil 4D). ortalama hız, 7 um / saat en az tek tek hücre hızı ve 114 mm / saatlik bir maksimum tek hücre hızı, 31 mm / saat ve 37.5 um / s arasında değişmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52735/52735fig1.jpg" /> Konsantrik jel 3D göç tahlil kurma alan adımları Şekil 1. şematik. (A) cam alt çanak iyi merkezinde iç kollajen jel oluşumu, hücreleri içeren. (B) oluşumu (aselüler) iç kapsülleme dış kollajen jeljel. (C) hücre kültür ortamı içinde jellerin daldırma. Hücreler daha sonra dengeye ve çevreleyen lifli matris bağlanmasına izin verilir. Bu adım jel polimerizasyon başlandıktan sonra 1 gün öncesine kadar bir kaç saat sürebilir. (D) Canlı hücre görüntüleme, dış jel içine hücre popülasyonunun yayılmasını izlemek. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52735/52735fig2.jpg" /> Şekil 2. hücre popülasyonunun yayılması. (A) kültür 12 gün sonra, MDA-MB-231 hücreleri iç-dış jel arayüzü ihlal ettiğini (yeşil kesikli çizgi) ve başlangıçta aselüler dış jel (ölçek çubuğu = 200 mikron) içine dışa işgal. koyu alanlar bu faz kontrast görüntüsündeki hücre içermeyen bölgeler ise parlak alanları, hücrelerin kapladığı bölgelerdir. Sarı dikdörtgenler 3D kanser hücresi invazyonu izlendi ilgi, bir VoV &#39;s temsil eder. ceoklarla gösterildiği gibi LLS, radyal olarak dışarı doğru ağırlıklı olarak göç göç, MDA-MB-231 hücrelerinin konfokal floresan görüntü (kırmızı, yeşil sözde renkli kolajen ile kaplanmış sarı) (B) Kaplama. Kolajen matrisin ve yansıtma görüntü ( yeşil). Oklar 5 saatlik bir süre içinde tek tek hücrelerin göç yönüne işaret etmektedir. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Time-lapse görüntüleri Gönderen (C), hücrelerin izleri elde edilebilir. İşte hücre parçaları renk kodlu renk çubuğu (timescale = 8 saat) tarafından belirtildiği gibi, zaman içindir. Güneş ve ark 7,10 den uyarlanmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52735/52735fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52735/52735fig3.jpg" /> Farklı kollajen jel yoğunlukları Şekil 3. Hücre hareketi. </stRong&gt; üç ​​farklı dış kollajen konsantrasyonları ile dış jellerde, MDA-MB-231 hücrelerinin hareketi: 1,5 mg / ml, 2.4 mg / ml ve 4.0 mg / ml. Hücreler, canlı hücre izleyici CMTMR (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Beyaz oklar görüntüleme 8 saat içinde, tek tek hücrelerin net değiştirmesini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52735/52735fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52735/52735fig4.jpg" /> Analiz hücre göçü yörüngeleri Şekil 4.. 8 üzerinde saat (A) net deplasman, (B) mesafe açısından ölçüldü bireysel MD-MBA-231 hücrelerinin göç yörüngeleri, (C) sebat ve (D) demek Farklı dış jel kolajen konsantrasyonları hızı: 1.5 mg / ml, 2.4 mg / ml ve 4.0 mg /mi. Time-lapse görüntüleri iç ve dış jellerin arabiriminin yanında satın alındı. Veriler ortalama ± her durumda 3 bağımsız deneyde 200&#39;ün hücre yörüngeleri elde edilen ortalama (SEM) standart hatasını ifade etmektedirler. Yıldız (*) istatistiksel olarak anlamlı fark (p-değeri &lt;0.01) belirtmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration at JoVE.com

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Görüntüleme.  FOM Institute AMOLF.  Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir. 

Video: Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Biyomühendislik

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Hücresel Elektrik Mikroçevriminin Sonlu Eleman Modellemesi

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, structures, phenotypes, and performance depending on each specific perfused tissue. The field of tissue engineering, which aims to repair or replace damaged or missing body tissues, relies on controlled angiogenesis to create a proper vascularization within the engineered tissues. Without a vascular system, thick engineered constructs cannot be sufficiently nourished, which may result in cell death, poor engraftment, and ultimately failure. Thus, understanding and controlling the behavior of engineered blood vessels is an outstanding challenge in the field. This work presents a high-throughput system that allows for the creation of organized and repeatable vessel networks for studying vessel behavior in a 3D scaffold environment. This two-step seeding protocol shows that vessels within the system react to the scaffold topography, presenting distinctive sprouting behaviors depending on the compartment geometry in which the vessels reside. The obtained results and understanding from this high throughput system can be applied in order to inform better 3D bioprinted scaffold construct designs, wherein fabrication of various 3D geometries cannot be rapidly assessed when using 3D printing as the basis for cellularized biological environments. Furthermore, the understanding from this high throughput system may be utilized for the improvement of rapid drug screening, the rapid development of co-cultures models, and the investigation of mechanical stimuli on blood vessel formation to deepen the knowledge of the vascular system.

Engineered tissues heavily rely on proper vascular networks to provide vital nutrients and gases and remove metabolic waste. In this work, a stepwise seeding protocol of endothelial cells and support cells creates highly organized vascular networks in a high-throughput platform for studying developing vessel behavior in a controlled 3D environment.

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...