The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

NOT: Tüm deneyler yerel kurumsal etik kurallarına uygun olarak yapılmıştır. 1. Kan Alma <ol><li> Antekubital damardan aracılığıyla yeşil kapaklı (heparinize edilmiş) tüplere sağlıklı gönüllü kan 14 tüpleri toplamak ve buz üzerinde yerleşmeden önce, her tüp ters. Optimal nötrofil verimi sağlamak için deney 15 dakika - 10 içinde kan toplayın. </li></ol> Tüm Blood 2. Nötrofil İzolasyon <ol><li> Kan sulandırmak için Ca ve Mg olmadan 5 ml PBS ile yapılan her bir kan yeşil kapaklı tüp yıkayın. 4 x 50 ml konik boruların her birinde, oda sıcaklığında, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), 15 ml ekleyin. Keskin LSM-kan arayüzü oluştururken, dikkatle LSM üzerine seyreltilmiş kan katman, 60 ml şırınga üzerine monte edilmiş bir 18 G iğne kullanarak. Not: mümkün olduğu kadar tabakalar karıştırma kaçının. </li><li> Ara vermeden, 21 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 800 x g&#39;de santrifüjleyin. NOT: Ani sonları canFarklı katmanların karıştırma neden olur. </li><li> Altındaki eritrositler ve nötrofiller tortu gözlemleyin. Aspire ve sadece alt kırmızı tabaka bırakarak, lenfositler ve mononükleer hücreleri içeren bu katmanlar arasındaki arayüzü kurtulmak için emin üst 2 katmanları (plazma ve EKK) yapım atın. </li><li> Her bir tüpe, fosfat tamponlu salin (PBS) ve 20 ml 6% Dekstran çözeltisine 20 ml ekleyin. Yavaşça eritrosit ve nötrofillerin tabakası ile karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmasına olanak sağlamak için her bir tüp ters. NOT: Bu kırmızı kan hücreleri (eritrositler) alt sediment sağlayacaktır. </li><li> 30 dakika sonra, taze tüp içine nötrofil zengin süpernatant aktarmak ve RBC pelet atın. 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de santrifüjleyin yüzer. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır. pelet çoğunlukla nötrofil ve birkaç eritrositlerde içerecektir. </li><li> Steril su, 4.5 ml tampon lize 0.5 ml ilave etmek suretiyle, bir yokedici çözelti hazırlayın. Lyse t RBC kalano bir tüp içine tüm yeniden süspanse pelet transfer, çözüm parçalama 5 ml hazırlanmış. 10 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında erimesini izin verir. </li><li> 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve kalan yokedici çözeltisi kurtulmak için 4 ° C&#39;de 450 x g hızında tekrar Ca ve Mg ve santrifüj olmadan 5 ml PBS ile yıkayın pelet. bu noktada elde edilen topak nötrofilleri içerir. Soğuk% 3 RPMI 30 ml pelletini tekrar ve buz koymak. Not:% 3 RPMI RPMI ortamı ilave etmek suretiyle yapılır% 3 fetal sığır serumu (FBS) </li><li> Metilen mavisi boyama kullanılarak numunenin saflığını doğrulayın. &gt; Hücrelerin% 95 çok-lober çekirdekleri ile granülositler olmalıdır. &gt; Doğrulamak hücrelerin% 95 canlılığı ve son nötrofil verimi saymak Trypan mavi boyama kullanın. 5 x 10 6 nötrofil / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için buz gibi soğuk% 3 RPMI nötrofilleri seyreltin. </li></ol> 3. Nesil NET&#39;ler <ol><li> 500 n nötrofillerin teşvikPMA M (nötrofil çözeltisi, 30 ml için) ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de 4 saat süre ile, 20 mm ızgara ile bir 150 x 25 mm, düz doku kültürü çanağı üzerinde inkübe edin. Bu NETosis sağlayacaktır. </li><li> Stimülasyon 4 saat sonra, yavaşça alt yapıştırılmış NET&#39;ler ve nötrofillerin tabakası bırakarak aspire ve ortam atılır. Bu katmanı bozabilir etmeyin. </li><li> Tabak başına Ca ve Mg olmadan soğuk PBS, 15 ml toplam kullanarak, alt kısmında bulunan tüm yapışkan malzemeyi kaldırmak üzere çanak alt PBS 15 ml pipetle her çanağın tabanı yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de 10 dakika boyunca 15 ml konik bir tüp ve santrifüj her çanak (adım 3.3) yıkama elde edilen çözelti toplayın. Nötrofiller ve kalan hücreler, hücre içermeyen bir NET-zengin yüzer bırakarak alt pelet olacaktır. </li><li> Bölme 1.5 mi mikro santrifüj tüplerine süpernatan 4 ° C&#39;de 18000 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj. Bu, tüm DNA pelleti, izin verir. NOT: Büyük tu Santrifüjbes aksi yüksek hızlı mikro-santrifüj kullanmak için küçük tüplerde Süpernatantlar bölmek gerekir, yüksek hızları normal santrifüj ulaşılabilir olup olmadığını tüketen kolay ve daha az zaman. </li><li> 100 ul PBS başına 2 x 10 7 nötrofil tekabül eden bir konsantrasyona kadar buz soğukluğunda PBS içinde, elde edilen bütün topaklar Süpernatant atılır ve yeniden süspanse edin. Bu, daha sonraki deneyler için kullanılan hücre içermeyen NET stok verecektir. </li><li> Spektrofotometri veya alternatif DNA miktar aracını kullanarak elde edilen numune DNA konsantrasyonu ölçün. 180 ng / ul - numune içinde yeterli bir konsantrasyonu 140 arasında olmalıdır. </li></ol> 4. NET-Kanser Hücre Statik Yapışma Deneyi <ol><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;de kaplama kuyu O / N 96 gözenekli düz tabanlı plaka içinde gözenek başına daha önce elde edilen NET stokunun 100 ul ilave edin ve izin verir. </li><li> Daha sonra saat 12 ila 20, hücrenin düzgün bir tek tabaka oluşumunu doğrulamakmikroskop altında oyuklara altındaki serbest fileler (Şekil 1). Bu noktada, hafifçe alt NET tek tabaka bozmaya değil emin yapma, kuyuların dışında tüm yapışmayan malzeme aspire. </li><li> Her bir% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) ile bloke çözeltisinin 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> % 0.25 tripsin solüsyonu 2 ml kullanılarak bir T-75 balonuna A549 kanser hücrelerini ayırın. Bir kez, bağımsız 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de tripsinize edilmiş hücre ve santrifüj A549 ortam 10 ml ekleyin. 100 ul ortam başına 2 x 10 4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri atın. Not: A549 hücreleri, ayrıca büyütülmüştür. Kısaca, hücreler kültürlendi ve tekrar% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile inkübe içeren DMEM F12 ortamında muhafaza edilmiştir. 70 kere -% 80 hücre birleşme elde edildi, bunlar,% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak ayınlmış ve aynı ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştirYukarıda tarif edilen. </li><li> Ortam ml&#39;si başına CFSE 1 ul ilave edilmesi ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında leke bırakın tarafından CFSE ile Leke kanser hücreleridir. 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 450 x g&#39;de boyama, santrifüj aşağı sonra daha sonra 100 ul ortam başına 2 x 10 4, kanser hücrelerinin bir konsantrasyonu elde etmek üzere ortam başlangıç ​​hacminin supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atmak. </li><li> Yavaşça aspire bloke etme çözeltisi ve oyuk başına NET tek tabaka üzerinde, 100 ul eş bir ortam, 2 x10 4, kanser hücreleri eklemek ve 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile 90 dakika süreyle yapışmaya izin bloke NET&#39;ler 1 saat sonra. Yavaşça hücreler aspire ve herhangi bir bitişik olmayan Hücreleri yıkamak için her bir oyuğa 100 ul PBS ilave edin. </li><li> Bazı kuyularda, ağlar indirgeme yıkamadan önce 10 dakika boyunca oyuk başına DNAse1 bölgesinin 1000U ekleyin. Bu gibi negatif kontrol görev yapacak. Kuyu, araç kontrolü (VC) olarak görev yapacak 10 dakika boyunca oyuk başına steril su, 100 ul ilave edin. NOT: 3 conditio başına çoğaltırn genellikle numune boyutunu artırmak için yapılır. </li><li> Aspire kuyuları altındaki tek Nets ve yapışık kanser hücrelerini bırakarak tüm çözüm atmak ve. (Şekil 1) AĞLARINDA yapışık kanser hücreleri düzeltmek ve flöresanlı mikroskop altında tahlil okuma oyuk başına% 4 formaldehid çözeltisi 100 ul ekle. Arsa ve sonuçları analiz (Şekil 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

Bu videoda gösterildiği Nötrofil Ekstrasellüler Tuzak izolasyon protokolü nötrofil izolasyonu ve NET oluşumu için literatürde kullanılan farklı teknikler birleştirir. Bu oldukça karmaşık ve değişken sürecini basitleştiren ve diğer protokoller daha az adımlarla saflaştırılmış hücre-serbest Nets izole etmek çok güvenilir ve tekrarlanabilir bir yol sunar. Ayrıca, hazır reaktifler protokolleri basitlik ekleyerek istihdam edilmekte ve önemli ölçüde maliyetini azaltmak. statik yapışma deneyinde karşı NET&#39;ler uygulama NET konsantrasyonu, belirli bir hedefe (17) göre manipüle edilebilir, bu izolasyon tekniği ile elde esneklik ortaya koymaya hizmet etmektedir. Bu duruma göre, gösterilen bir teknikle izole NET&#39;ler akış sitometri gibi geleneksel Western blot, dinamik yapışma deneyleri, geçiş deneyleri, çoğalma tahlilleri, bağışıklık ve konfokal görüntüleme, elektron mikroskobu da dahil olmak üzere deneylerin türleri için de kullanılabilir. </p&gt; Onun başarısı için kritik olan bu protokol adımlar vardır. İlk olarak, nötrofiller yanlışlıkla apoptoza neden olan izolasyon işlemi sırasında aktif hale getirilebilir. Bu adımlar arasında uzun bekleme süreleri, davlumbaz altında steril koşullar altında tüm izolasyon adımları gerçekleştirin tüplerin agresif karışmasını önlemek, RBC parçalama aşamasından sonra buz üzerinde tüm örnekleri tutmak, ve önlemek için önemlidir. Testin amacı yapışmasını değerlendirmek amacıyla kat kuyulara ise İkincisi, bu daha da sağlayacak gibi &quot;NET stokta&quot; önerilen nihai DNA konsantrasyonu yanı sıra kuyu başına önerilen NET konsantrasyonunu saygı önemlidir NET&#39;ler ve tutarlı bir tek tabaka. Alt konsantrasyonunun, sadece yama kaplama ve bu nedenle daha az güvenilir sonuçlar doğurabilir. Son olarak, onun bir aksamanın meydana gelmemesi için Çalışma sırasında çok dikkatli bir şekilde NET tek tabaka işlemek için de önemlidir. Bu ayarlama ile kolaylaştırılabilirkuyuların tarafta emme ve pipetleme yoğunluğu. Bu tekniğin sınırlamaları hala çoğunlukla 4 saat PMA stimülasyon adım neden ağlar, üretmek için zaman önemli miktarda gerektirir gerçeğini içerir. Buna ek olarak, belirli bir kan önemli miktarda bir deney için gerekli olan nötrofil yeterli sayıda izole edilmesi için gereklidir. Kesinlikle ilk santrifüj aşamasında NET&#39;ler önemli miktarda kaybı vardır (adım 3.4.) Nötrofillerin atarak zaman. Değişiklikler önemli ölçüde nihai NET verimi artırabilir bu noktada NET kaybını en aza indirmek için. Dikkatli deney planlama ve zaman yönetimi gerektirir onların izolasyon, 24 saat - Ayrıca, izole NET&#39;ler 12 içinde kullanılmalıdır.

Nötrofil hücre dışı trans (NET) yeni protein ve histon yüzlerce edilmiş hücre dışı DNA kordonlarından teşekkül nötrofil türevi elemanların keşfedilir. Onlar belirli uyaranlara aşağıdaki enfeksiyon ve inflamasyon bağlamında nötrofiller tarafından salgılanan ve onlar başlangıçta enfeksiyonlara karşı nötrofil savunma mekanizmalarının bir parçası olarak kabul edilmiştir. İlk bakteriler, virüsler ve mantarlar 1-3 dahil olmak üzere çeşitli mikrobik işgalciler yakalama teşvik gösterilmiştir. Mikrop Yakalama sonra kendi yıkımına hem doğrudan NET-ilişkili proteinler 3,4 ile ve dolaylı fagositik hücrelerin 5,6 yerel istihdam yoluyla yol açacak. NET&#39;ler rolü ancak savunma barındırmak için sınırlı görünmüyor. Daha yakın zamanda, bu, 9 trombozu, otoimmün hastalıklar 7,8 önemli bir rol oynadığı için, gebelik ile ilgili bozukluklar 10 ve hatta kanser ilerlemesinin gösterilmiştir11,12. Bu duruma göre, bu NET&#39;ler çeşitli fizyolojik süreçlerin bir çok sayıda çok önemli bir rol oynar gibi görünmektedir. Ancak, bu tür araştırmaların yeni doğası göz önüne alındığında, çok NET&#39;ler etkilerini gösterirler hangi mekanizmalar ile ilgili olarak aydınlatılamamıştır gerekmektedir. Burada, nötrofillerin yokluğunda NET&#39;ler izolasyonu için basit bir yöntem sunulmaktadır. Aşağıdaki videoda, insan tam kandan Nets izole etmek basitleştirilmiş ve kolay bir tekniği göstermek. Hücresiz NET&#39;ler daha sonra yapışma, çoğalma ve yer değiştirme gibi bir takım tahlillerin yanısıra kurutma, boyama, imuunofluorescence da dahil olmak üzere, in vitro deneylerde, bir dizi kullanılabilir. Diğer protokoller ancak onlar genelde, uzun, karmaşık, pahalı ve sık sık, düşük verim 13 olan, 13, 19 var. Bu basitleştirilmiş protokol nedenle procedu uzunluğunu minimize, temel reaktifler kullanır ve nötrofillerin izole etmek için gerekli adımların sayısını azaltırverimi en üst düzeye çıkarırken yeniden. Aşağıdaki yöntem, nötrofil izolasyonu için farklı teknikler, daha önce, canlı nötrofil çok saf bir örnek elde edildi basit bir protokol elde etmek için literatürde tarif edilen bir araya getirir. Literatürde önerildiği gibi, venöz kan EDTA tüplerde toplandı ve nötrofil aktivasyonunu 14 önlemek için 10 dakika içinde kullanılır. Bu heparinize tam kan, ilk boyum ve ark 15 ile tarif Ficoll yoğunluk santrifüj tekniği adapte edilmiş bir metot ile ilgili granülositleri ve kırmızı kan hücreleri izole etmek için, Limfosit Ayırma Ortamı (LSM), yoğunluk gradyanlı santrifüj kullanır. LSM sodyum metrizoat sodyum Diatrizoate yerine ve nötrofillerin 16-18 izole etmek birçok çalışmada başarıyla kullanılmaktadır Boyum formülasyonun bir değişiklik. Farklı yoğunluklu santrifüjleme, monositler ve lenfositler atılır tarafta; kırmızı kan hücreleri daha sonra çöktürülür% 6 Dekstran çözeltisi 14 kullanılarak ve kalan kırmızı kan Tripan mavisi ve metilen mavisi boyaması ile kontrol edilir saf nötrofil, bir popülasyon elde etmek için eritilir. Çok sayıda maddeler lipopolisakarit (LPS) ve forbol miristat asetat (PMA) ve interlökinler (IL-8), 3,5,6 de dahil olmak üzere, in vitro ve in vivo olarak NETosis uyarılması için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokol, izole edilmiş nötrofiller apoptozu 19,20 teşvik etmeden, tutarlı ve güvenilir bir .NET oluşumuna imkan vermek üzere yeterli bir konsantrasyonu gösterilmiştir 4 saat için 500 nM PMA ile uyarılır. Izole edildikten sonra, bu protokolden elde edilen hücre içermeyen NET&#39;ler bir yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir. DNAse1 sindirilmesi ve daha önce tarif edildiği gibi ağları ile indirgeme için kullanılır ve bu nedenle, bir kontrol 2,3,11 olarak hizmet eder. Diğer seçenekler NET Formatı inhibe etmek için Nötrofil elastaz inhibitörü (NEi) kullanımını içeriramaç NET oluşumunu inhibe ziyade bozulmasını 11 gerçekleştirmek için kabul edilebilir bir alternatif olan, üzerinde. NEi çeşitli fonksiyonları bir dizi olmasına rağmen, daha önce NET yerleştirme kromatin yoğunlaşması, nükleer degranülasyonunu ve nötrofıl ölüm 12 blokajı yoluyla NEi ile inhibe edilebilir olduğu gösterilmiştir

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) son zamanlarda nötrofil en antimikrobiyal araçlara parçası olarak tespit edilmiştir. Apart enfeksiyonları mücadele onların rolü, son araştırmalar da kanser ilerlemesi de dahil olmak üzere diğer birçok hastalık süreçlerinde, yer olabileceğini göstermiştir. Arıtılmış Nets Yalıtımlı bu fonksiyonların çalışma izin çok önemli bir unsurdur. Bu video, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından hücresiz .NET izolasyon basit bir yöntem ortaya koymaktadır. İzole NET&#39;ler sonra immünofloresan boyama, kurutma veya çeşitli fonksiyonel deneyleri için de kullanılabilir. Bu nötrofillerin kendileri potansiyel karıştırıcı etkileri yokluğunda onların biyolojik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar. Bir yoğunluk gradyan ayırma tekniği sağlıklı donor bütün kandan nötrofilleri izole etmek için kullanılır. İzole edilmiş nötrofiller sonra forbol 12-myr tarafından uyarılıriState 13-asetat (PMA) NETosis tetiklemek için karıştırılabilir. Aktive edilen nötrofiller, daha sonra atılır ve hücre içermeyen bir .NET hazır elde edilir. Daha sonra A549 insan akciğer kanser hücreleri ile bir yapışma deneyinde kullanılabilir nasıl izole NET&#39;ler göstermektedir. NET hazır kat ilave edilir, 96 gözlü bir hücre kültürü plakası O / N, ve çukurlara altındaki uygun bir .NET tek tabaka oluşumuna katkıda sonra CFSE etiketli A549 hücrelerinin kuyu kullanılır. Yapışık hücreler Nikon TE300 floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir edilir. Bazı kuyularda, 1000U DNAse1 Nets aşağılamak için saymadan önce 10 dakika ilave edilir

NET&#39;ler ile statik yapışma deneyi başarılı olması kanser hücrelerinin ilave edilmesinden önce NET&#39;ler bir tek tabaka (Şekil 1) ile birlikte kuyu yeterli bir kaplama gerektirir. Tüm sonraki basamaklar bu katmanı bozmaya değil dikkatle yapılmalıdır. NET&#39;ler yeterli bir tabaka oluşturulur, bu Şekil 2A ve 2C&#39;de görüldüğü gibi NET&#39;ler önemli kanser hücrelerinin yapışmasını etmesi beklenmektedir. Bu etki Şekil 2B ve 2D görüldüğü gibi Nets alçaltır DNAse1 ilavesi ile yürürlükten kaldırılmıştır. Bunun aksine, araç kontrolü (Şekil 3) mevcudiyetinde ağlarına A549 yapışma belirgin bir azalma olacaktır. Yüksek güç alan (HPF) başına ortalama kanser hücre yapışmasının iyi bir tahmin elde etmek için, oyuk başına en az 4, rasgele HPFS saymak için tavsiye edilir. Iyi teknik sorunlar nedeniyle NET&#39;ler kaplı olmayan alanlar ülkeleri dikkate alınmamalıdırBu gibi ting sonuçları tahrif olabilir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52687/52687fig1.jpg" /> Şekil 1. Tek tabakalı NET. TÜLLER (A) homojen tek tabaka yok boyunca iyi NET&#39;ler kesintiye uğramış bir tabaka ile de (B) vasat kaplamaya karşı ile kaplanmış 96 oyuklu plaka havuzları bir ışık mikroskobu ve görüntüler. Ölçek çubukları 40 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52687/52687fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52687/52687fig2.jpg" /> In Vitro NET&#39;ler Şekil 2. A549 Kanser Hücre Adezyon. (A) A549 kanser hücreleri (oklar) in vitro NET&#39;ler tek tabaka uygun. (B) &#39;AdditiDNAse1 olarak kanser hücre yapışmasının seviyesini düşürür on; (C) (C) önce ve DNAse1 (D) ilave edildikten sonra, floresan mikroskobu (Nikon TE300) altında floresan ışığı altında NET&#39;ler kanser hücre yapışmasının bir temsili görüntüsünü göstermektedir. Ölçek çubukları 40 mikron temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52687/52687fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52687/52687fig3.jpg" /> İn Vitro Yapışma Deneyi., GraphPad yazılımı Şekil 3. Sonuçlar ağlarına A549 kanser hücre yapışma deneyinde elde edilen sonuçlar çizmek ve analiz etmek için kullanıldı. DNAz varlığında, yapışma muamele edilmemiş ağları ile karşılaştırıldığında 13.90% idi. Araç kontrol (VC) varlığında, yapışma muamele edilmemiş NET&#39;ler göre 77,26% idi. Veriler ortalama olarak sunulmuştur +/-SEM&#39;i olarak gösterilmektedir. Önemi ** p &lt;0.001 ile Kruskal Wallis testi kullanılarak tespit edilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET&#39;ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir.

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.7K Görüntüleme.  McGill University.  Aşağıdaki protokol, piyasada kolayca bulunabilen ayıraçları kullanarak, insan tüm kanından Nötrofil Ekstrasellüler tuzakları (NET) izole etmek için çok basit bir şekilde tarif eder. Daha sonra izole edilmiş NET'ler kanser hücreleri bir in vitro yapışma deneyinde kullanılabilir gösterilmektedir. 

Video: Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Yalıtım ve nötrofil kaynaklı Microparticles karakterizasyonu için fonksiyonel çalışmalar

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...