Biz FIM kurulum yapımında yardım için bu projeyi başlattı S. Thomas J. Hermann ve U. Burgbacher müteşekkiriz. Bu çalışma DFG (SFB 629 B6) tarafından finanse edildi.

NOT: Burada, FIM kullanımı serbest hareketli koşullarında ve ısı uyaran etkisi altında tarama için larva lokomosyon kullanışlı yüksek verimlilik analizi için sunulmuştur. Böyle koku uyaranlara bağımlı hareket veya talep üzerine temin edilir protokol, ince değişiklikler gerekebilir haddeleme veya diğer davranışların yüksek çözünürlüklü görüntüleme analizi gibi diğer uygulamalar. Deney 1. Set-up <ol style="margin-left: 40px;"><li> Istatistiksel olarak anlamlı değerler elde toplam (gerekli 1 saat süre) genotip başına yaklaşık 100 larva kullanın. NOT: Birkaç genotipleri karşılaştırılmış ve farklı günlerde kaydedilen gereken durumda, günde genotip başına larva aynı sayıda kaydedin. </li><li> Çoğu uygulama için, parametre analizi için, 10 Hz, kaydı. Gerekirse yüksek çözünürlüklü görüntüleme uygulamaları için, görüntüleme hızı değişir. </li><li> Üçüncü evre larvaları, yumurtlama sonrasında 120 saat hakkında davranış deneyleri izleme için. Sur yapKültürler deney süresi (4.3 bakınız) yeterli larvaları elde e. </li><li> Olmayan teşvik uygulamalar için, yarı saydam agar ihtiva eden bir tarama yüzeyinin hazırlanması (bölüm 2). Isı degrade uygulama için uyaran aralığında larvaları ihtiva etmek, caydırıcı bir tuz agar engeli (bkz bölüm 3) ile görüş alanını kuşatır. NOT: Diğer uygulamalar farklı yüzeyler gerektirebilir. </li><li> Sabit çevre koşullarında (sıcaklık, ışık, hava akımı, hava nem vb) ile bir oda kullandığınızdan emin olun. </li></ol> 2. Crawling Yüzey Hazırlama (Saydam Agar) Not: FIM ayarda bir agar yüzeyinin nemli bir tarama yüzey temin etmek üzere ilave edilir. Buna ek olarak, aynı zamanda aydınlatma özelliklerini iyileştirir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Deiyonize ultra saf su içinde% 0.8 gıda sınıfı agar kaynatın. Tarama uygulaması için 400 ml hazırlamak. </li><li> Ayrı bir 33 cm x 33 cm ac 50 ° C (el-sıcak) de ağar dökünasirilik-cam levha. agar yüzey gerilimi ve böylece sıcaklık, agar kütüğün kalınlığını belirleyecektir. 50 ° C&#39;de, 2 mm kalınlığında, agar levhalar elde edilmiştir. Kaynadıktan sonra ajitasyon ve kabarcıkları önlemek için sürekli dökmeyin. Yaklaşık 4 saat her görüntüleme süre taze ağar döşeme hazırlayın. </li><li> Temiz, sıralamak ve deney öncesinde (genotip başına 1 tabak) ile larva alıştırarak kalan% 0.8 agar solüsyonu ile standart 6 cm petri kapları doldurun. </li><li> Caydırıcı bir ağar bariyer uygulaması için gerekli olan durumda, bölüm 3 geçin. </li><li> Kayıt için bir düzlem kare yüzey elde etmek ağar levhanın çevresinin yaklaşık 2 cm keserek. Fazla agar çıkarın. NOT: büyüklüğü uygulamaya bağlıdır. </li><li> Doğrudan hafifçe akrilik cam levhanın kenarına kayma agar iterek soğutulduktan sonra FIM kurulum agar slab aktarın. </li></ol> 3. İsteğe bağlı: kursak bir Caydırıcı Agar Bariyer eklemeling Yüzey (Tuz Agar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Deiyonize ultra saf su içinde 3 M NaCl ile% 2.5 agar gıda sınıfı kaynatın. Bir ısı degrade tarama için 200 ml hazırlamak. NOT: hacim uygulamaya bağlıdır. </li><li> Daha önce de 2 cm genişliğinde bir çentik kesin görünüm (22 x 22 cm) alanını çevreleyen emekleme yüzey döktü. Not: Farklı bir bariyer meydana getirmektedir ve bakış alanları uygulamaya bağlı olarak gerekli olabilir. </li><li> Izleme yüzeyinden daha 0,1-0,3 cm daha yüksek tuz ağarı ile çentik doldurun. </li></ol> 4. Fly Taşıma <ol style="margin-left: 40px;"><li> Arka% 65 hava nemi standart sinek gıda denemenin zaman ayarlandı 12 saat ışık / karanlık döngüsü ile 25 ° C inkübatör uçar. </li><li> Haçlar için, CO 2 ile 30 bakire kadın sinekler ve 8 erkek uyutmak ve 35 ml gıda ile 130 ml kültür şişeleri onları çapraz. Not: 35 mi gıda ile bir 130 ml kültür şişesi yaklaşık 20-30 l verecektir4 saat görüntüleme aralığı içinde üçüncü evre larvaları yedik. Tüm larva evrelerinde Görüntüleme ve izleme çalışmaları. </li><li> Geç Üçüncü dönem larva hareketi sürücü ve küçük bir fırça kullanarak flakon duvarlardan en büyük larvaların toplamak için kültür şişeleri biraz su bırakın. </li><li> Kayıt öncesinde 2-5 dakika, alıştırarak ve bunları temizlemek için deiyonize ultra saf su içinde% 0.8 gıda sınıfı agar içeren bir Petri-çanak bir video için transfer larvaları. </li></ol> 5. Kayıtlar için FIM Görüntüleme Kur (Non Teşvik Şartları) ayarlanması <ol style="margin-left: 40px;"><li> Gerekirse kamera lensi odak ve diyafram ayarlayın. İlgili kamera için pozlama süresini ayarlayın. NOT: Bu ayarlar bir deney sırasında değiştirilmesi gerekmez. </li><li> Bir larva görüntüleme ile iyi kontrast elde etmek için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Kayıtları sırasında oda sabiti çevre koşulları tutun. Yönlü ışık ile larva rahatsız değil oda karartmak. </li></ol> 6. İsteğe bağlı: Kayıtlar için FIM Görüntüleme Kur (Kademeli Sıcaklık Uyarıcı Koşullar) ayarlanması NOT: Isı degrade cihazı üst sitede bir mat siyah boya ve yalıtım malzemesi ile 42 x 42 x 0.2 cm 3 alüminyum plaka. Plaka iki ucunda kalorifer / soğutucular ve pompalara bağlı iki farklı devreler su ile perfüze (Şekil 1B bakınız). sıcaklıklar -5 den +50 ° C ayarlanabilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Deneyler öncesinde ısı degrade cihazı 1 saat açın ve dengelenmeye istenen sıcaklık profili ve bileşenleri kuran izin kurulum üzerine yerleştirin. </li><li> Kurulum için bir tuz bariyeri ile tarama yüzeyi agar aktarın. </li><li> Agar üzerinde radyatör plakasını yerleştirin ve (~ larvaları üzerinde 1 mm) plakası ve 2 mm tarama yüzeyi arasındaki mesafeyi ayarlayın. </li><li> Arasındaki bir doğrusal eğimi oluşturulmasıen az 0.8 ° C ile 34 ° C (yaklaşık. görüş alanında bir engel 2 cm) ile 18 ° C (yaklaşık. görüş alanında karşı yerinde bariyerden 2 cm) ile ayarlanarak / cm 1 ° C ve 45 ° C su devresi sıcaklığı. NOT: metal plaka Farklı degrade özellikleri ampirik tespit edilmesi gereken farklı sıcaklıklar gerektirir. Bu ayarlar deneyler sırasında değiştirilmesi gerekmez. </li><li> 5. bölümünde açıklandığı gibi ayarları yapın. </li><li> Tarama yüzeyi 20 dakika için deney öncesinde gradyanı dengelenmeye bırakın. Bir sıcaklık ölçer ile sıcaklık değişimini test edin. </li><li> Bölüm 8 ile devam edin. </li></ol> 7. FIM Görüntüleme (Non Uyarıcı Koşullar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Yavaşça alışkanlık petri 15 larva toplamak ve izleme yüzeyinin merkezine aktarmak için küçük bir ıslak fırça kullanın. Gıda kalır ya da çok fazla havale etmeyinsu (7.8 bakınız). </li><li> Kayıt 1 - 22 cm x 22 cm izleme alanında 50 larva. (Istatistiksel nedenler genotip başına en az 100 birey kullanmak için), en tarama uygulamaları için video başına 15 hayvan kullanın. </li><li> Yavaşça larvaları ayrı ve tüm larvalar kayıt önce düz hareket başlayana kadar yaklaşık 10-20 saniye bekleyin. </li><li> Olmayan uyaran koşulları için saniyede 10 kare 2 dakika larva lokomosyon kaydedin. Çıkış biçimi olarak sıkıştırılmamış tif görüntüleri kullanın. </li><li> Kayıt sırasında, onları alıştırmak için şişeleri sonraki video için larvaları toplamak Kritik:. Işık kaydedilen larvaları rahatsız etmeyin. </li><li> Kayıttan sonra, büyük bir fırça ile larva kaldırmak ve yerel güvenlik ve mevzuat kurallarına uygun olarak atın. </li><li> Larvaları çıkardıktan sonra, temiz ve ultra saf deiyonize su ile tarama yüzeyini nemlendirmek için fırça kullanın. </li><li> Kritik: her zaman nemli yüzeye tutun, ancak aşırı mo önlemekhaleler veya kayıtları larva çevreleyen damla ve rahatsız izleme gibi görülebilir isture. </li></ol> 8. İsteğe bağlı: FIM Görüntüleme (Kademeli Sıcaklık Uyarıcı Koşullar) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Sıcaklık gradyanı (bkz bölüm 6) kurulduktan sonra, (8.2), örneğin tarama yüzeyinde larvaları yerleştirdikten sonra 20 saniye içinde kayıt anlık kayıt yazılımı hazırlamak, video başına kare sayısını ayarlamak ve tasarruf yolunu tanımlar. </li><li> Biraz radyatör plakasını kaldırın ve tuz bariyer 33 ° C 2 cm larva yerleştirin. Daha fazla genel talimatlar için 6. ve 7. bakın. Tekrar radyatör plakasını indirin ve larva düz hareket etmeye başladı hemen sonra 3-4 dakika kaydetmeye başlayın. </li><li> Kayıttan sonra, doğrudan temiz larvaları kaldırmak ve yüzey nemlendirir. NaCl yayılmasını önlemek için tuz agar dokunmayın. </li><li> Kritik: her zaman nemli yüzeye tutun ama kaçınınhaleler veya kayıtları larva çevreleyen damla ve rahatsız izleme gibi görülebilir aşırı nem,. </li><li> Görüntüleri kaydetme ve sonraki video için hazırlamadan önce yeni hayvan toplarken, ağar yüzey 1-2 dakika nemlendirici sonra yeniden dengelenmeye izin verin. Bir pyrometer her 5 videoları kullanarak sıcaklık değişimini kontrol ve gerekirse (izleme yüzeyine göre su sıcaklığını, yükseklik ve xy yönlendirme) sıcaklık cihazı ayarlayın. </li></ol> Larvaların Locomotion 9. İzleme NOT: Daha fazla detay FIMTrack (ek) için ekli kılavuzuna bakın. Bir program akış şeması için Şekil 2&#39;ye bakınız. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Önizleme seçeneği kullanılarak ilgili deneyler için izleme parametrelerini ayarlayın. <ol><li> Kamera ve görüş alanına göre cm başına piksel ayarlayın. </li><li> Kamera ayarlarına bağlı olarak saniyede kare ayarlayın. </li><li> Inci böylece parlaklık eşikleri ayarlayınTüm hayvanlarda (geribildirim önizleme verilmiştir) doğru tespit edilir. </li><li> Larva alan boyutu eşikleri ayarlayın. Önizleme geribildirim seçeneği Not: Tek hayvanlar kırmızı vurgulanır ve her hayvanın alan mavi verilmektedir larvaların çarpışan, sarı vurgulanır. </li></ol></li><li> Sağ alt düğmesini kullanarak izleme başlayın. NOT: Başarılı izleme sonra, larva parçaları ve hesaplanan hareket ve duruş özelliklerini içeren bir csv dosyası içeren bir görüntü, görüntü dizininde saklanır. </li><li> Izleme sonuçlarını gözden elle ayarlamak için FIM Sonuçları izleyici modülü (Düzen&gt; Sonuçları Görüntüleyici ...) kullanın. Gerekirse, bir odorant kaynağına ısı gradyanı veya mesafe açısından yönünü emekleme, uyaran rejimi örneğin bakımından verileri değerlendirmek için teşvik bölgeleri tanımlamak. Daha fazla ayrıntılı bilgi için manuel (ek) kullanın lütfen. </li></ol> Verilerin Değerlendirilmesi 10. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Excel, Matlab içine CSV dosyası veya ileri istatistiksel analizler için başka bir program aktarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Vision-Based+Algorithm+for+Decision+Making+in+Flying+Drosophila.">A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila.</a> Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closing+the+loop+between+neurobiology+and+flight+behavior+in+Drosophila.">Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).</li><li>Fry, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aerodynamics+of+Free-Flight+Maneuvers+in+Drosophila.">The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila.</a> Science. 300 (5618), 495-498 (2003).</li><li>Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+3D+tracking+paradigms+for+freely+flying+insects.">Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects.</a> EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57 (2013).</li><li>Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Object+tracking:+A+Survey.">Object tracking: A Survey.</a> ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).</li><li>Pistori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+and+larvae+tracking+using+a+particle+filter+with+an+auto-adjustable+observation+model.">Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model.</a> Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PloS one. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+high-resolution+on-chip+optofluidic+microscopes+for+Caenorhabditis+elegans+and+cell+imaging.">Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).</li><li>Heng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+Microscopy+-+a+Method+for+Implementing+a+High+Resolution+Optical+Microscope+on+a+Chip.">Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip.</a> Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).</li><li>Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-electro-fluidic+grids+for+nematodes:+a+lens-less,+image-sensor-less+approach+for+on-chip+tracking+of+nematode+locomotion.">Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion.</a> Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).</li><li>Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EthoVision+video+tracking+system--a+tool+for+behavioral+phenotyping+of+transgenic+mice.">The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice.</a> Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li><li>Yu, C. -. C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Track-A-Worm,+An+Open-Source+System+for+Quantitative+Assessment+of+C.+elegans+Locomotory+and+Bending+Behavior.">Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior.</a> PloS one. 8 (7), e69653 (2013).</li><li>Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sampling+and+decision+making+in+Drosophila+chemotaxis.">Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis.</a> Nature communications. 2, 441 (2011).</li><li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis.">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis.">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li><li>Risse, B., Thomas, S., Otto, N., L&#246;pmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIM,+a+Novel+FTIR-Based+Imaging+Method+for+High+Throughput+Locomotion+Analysis.">FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis.</a> PLoS one. 8 (1), e53963 (2013).</li><li>Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+subtle+locomotion+phenotypes+of+Drosophila+larvae+using+internal+structures+based+on+FIM+images.">Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images.</a> Comput Biol Med. 14, (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

Davranışsal nörobilim kantitatif karmaşık davranışsal özellikleri deşifre zorunludur. Bu nedenle, çok sayıda insanın, yüksek çözünürlükte görülen ve otomatik gereken işlemler istatistiksel analiz için ihtiyaç vardır. Burada, FIM görüntüleme, hayvanların geniş bir hareketlilik izlemek için araçlar temin eden bir yeni, basit ve sağlam bir görüntü kurulumu tarif edilmektedir. FIM görüntüleme kurulum etkinliği Drosophila larvaları, planarian flatworms ve C kullanılarak test edilmiştir elegans solucanlar. FIM teknoloji, beyin, trakea, bağırsak veya proventriculus gibi hayvanların bile iç yapılarını tespit etmek özünde yüksek kontrast sağlar. Otomatik hayvan 19 yönünü belirlemek için hizmet edebilir, böylece önemlisi, bu iç yapılar sağlam tanımlanır. filmlerin kalitesi tarama yüzeyi üzerinde suyun aşırı miktarı ile etkilenebilir. Bu nedenle, çok önemlidiragar nem kontrolü. Yüzeyde Çok eski agar veya çok fazla su eserler neden olabilir. Benzer şekilde, herhangi bir hava kabarcığı tarama yüzey dahil olduğundan emin olun. Genel olarak, iyi hazırlanmış agar yüzeyi 4 saat film kaydı sağlar. Nedeniyle yatan fiziksel ilkelere FIM görüntüleme mükemmel bir görüntü kalitesi elde, neredeyse gürültü ücretsiz resim kayıtları üretir. Bu da, daha sonra, bilgisayar tabanlı imaj analizi kolaylaştırır ve yüksek verim sağlar. Ancak, bu yöntemin doğrudan agar yüzeyine temas hayvanları analiz sınırlıdır. izleme yazılımı çörek şekli oluşturan hayvanlar tarafından meydan. Ikili gösterge çörek şekli tanır rağmen, yanlış omurga hesaplanır olabilir. Nedeniyle izleme tablosu ikili ve üçlü renk görüntüleme modüler inşaat ulaşmak olduğunu. Ayrıca, ek uyaranlar (ışık, koku verme maddeleri, elektrik veya mekanik uyarıcılar) kolayca olabilir delYukarıda ivered. FIM görüntüleme gücünü maç için tasarlanmış FIMTrack programı kolayca Drosophila larvaları, C izlemek için kabul edilebilir elegans veya planarya. Böylece nedeniyle onun basit ve ucuz inşaat (http://FIM.uni-muenster.de bakınız), FIM görüntüleme biyomedikal uygulamalarda geniş bir yelpazede için uygun olan ve özellikle acilen yüksek verimli çalışmaları gereklidir sağlar.

Çoğu hayvanlar son derece sofistike ve kontrollü bir şekilde hareket yeteneğine sahip. Genetik temeli altta yatan hareket kontrolünden deşifre kantitatif farklı davranış kalıpları değerlendirmek zorunludur. Bu bağlamda, Drosophila ideal bir model olarak hizmet edebilir. Özgürce uçan Drosophila Takip vermeyen 1-4 ama oluşur nispeten düşük hızda iki boyutta Drosophila larva tarama ve böylece kolayca izlenebilir edilir. Uygun aydınlatma ile birlikte kamera tabanlı kurulumları görüntüleri 5 elde etmek için kullanılır. Olay veya iletilen ışık ikisi de davranışsal deneyler 6,7 istihdam edilmektedir. Ancak, larva ve larva hareketlerin tarama yüzeyi sadık kayıt olası ışık yansımaları yarı-saydam vücut için zor olabilir. Bu tür sorunların üstesinden gelmek için bazı karmaşık yöntemler geliştirilmiştir. Son zamanlarda, karanlık alan aydınlatma ön / arka cont geliştirmek tanıtıldırast 8. Kamera tabanlı kayıt, lens daha az optik görüntüleme ve alternatif olarak görüntü sensörü-az on-chip satın alma teknikleri 9-11 tanıtıldı. Çeşitli izleme programları piyasada mevcut yazılım 12 ve özel çözümler de dahil olmak üzere, son zamanlarda getirilmiştir. Yüksek verimli izleme programları için örnekler Çok Worm Tracker (MWT) olan 13 ve Multianimal Yürüme Ve Parça (MAGAT) 8. Çarpışan hayvanlar çok sayıda yeni hayvan kimlikleri yol böylece ikisi de ortak, birden fazla hayvan, tek bir açık alan arenada izlenebilir var. Bu sınırlamayı aşmak için, bir çok iyi Kur bireysel kuyuların 14 içine 12 hayvan ayıran tanıtıldı. Tek tek bireylerin lokomosyon kesin miktar mikroskop 15 ile birlikte hareketli bir izleme aşaması kullanılarak elde edilebilir. Ancak, tüm bu yaklaşımlar, ya maliyet verimsiz, eksikliği yeterli yenidençözüm veya yüksek verimli fenotipleme için alıcı çok zaman. Sinirli Toplam İç Yansıma (FTIR) 16 (Şekil 1) dayalı, yukarıda belirtilen sınırlamaları aşmak için, biz geliştirdik FIM (FTIR-tabanlı Görüntüleme Yöntemi). Bu yeni görüntüleme yaklaşımı benzeri görülmemiş bir yüksek kontrast sağlar ve hatta hayvanların 16 emekleme çok renkli kaydedilmesini sağlar. Bu kullanışlı ve etkili bir yöntem yatan prensibi kolaydır. Akrilik cam plaka ışığı ile sular altında (örneğin, 875 kızılötesi nm). Nedeniyle akrilik cam ve hava farklı kırılma endekslerine göre, ışık tamamen cam / hava sınırında yansıtılır. Akrilik cam Isıtma yok 16 olduğunu kaydetti. Daha yüksek bir kırılma indeksine sahip nesneler aydınlık bir tablo dokunmayın Sadece eğer, bu nesneleri girebilirsiniz ışık olabilir. Hayvanlar yüzeye dokunursanız, ışık yansır ve (Şekil 1) aşağıdan yakalanabilir. Sonuç olarak, sadece kontakHayvanların alan genel bir siyah arka plan ile ayrıntılı görüntüleme sağlayan bir parlak nokta olarak görünür. Böylece, FIM-görüntüleme, bilgisayar görme algoritmaları için mükemmel filmler kaydetmenize olanak verir. FIM basit ve sağlam kullanımı artık erişemeyeceği içine karmaşık hayvan davranışları ayrıntılı yüksek kapasiteli analizini getiriyor ve işleme bilgisini çalışmak için kullanılabilir: örneğin, koku alma duyusunu 8, 16; vizyon 17 veya thermosensation 18. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" width="650" /> Isı-uyaran entegrasyonu ve altta yatan fiziksel ilkeler 1. FIM kurulum Şekil. (A) FIM kurulum. Aydınlatma yoğunluğu ön panelde kontrol edilebilir. (B), bir ısı uyaran sunmak için, siyah, alüminyum levha boyalı her iki yanında sıcak ve soğuk su ile perfüze agar yüzeyi üzerinde 2 mm yerleştirildiğikendisi 2 mm kalınlığındadır. gradyan sıcaklık farkları ile radyatör plaka ve agar üzerine kurulmuştur (C) sinirli toplam iç yansıma fiziksel prensibi:. Bir akrilik cam plaka kızılötesi ışık ile aydınlatılıyor. θ 1, θ 2, θ ve 3 ışık yansıması açıları göstermektedir. n, A, 1, n = 2 ve n = 3 n, sırasıyla hava, akrilik cam, agar ve larva kırılma indislerine gösterir ve eşitsizliği n A &lt;n, 1 &lt;n, 2 &lt;n, 3 yerine getirmektedir. Nedeniyle kırılma için, yansıma açısı geçişi sırasında değişir. Açı kritik açı altında ise, ışık artık yansıtılmamıştır katmanları geçebilir ve aşağıdan yakalanabilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> spFIM ile analiz edilebilir işlemlerin ectrum geniştir. Başka ayarlamalar olmadan FIM görüntüleme Drosophila (Şekil 5B) tüm larva evreleri izlemek için kullanılabilir veya Drosophila 19 yetişkin taban izlerine takip etmek için kullanılabilir. C. Aynı şekilde, yörüngeleri elegans veya planarian flatworms hareketi kolayca (Şekil 5C) kaydedilebilir. Mantar hif veya kök saç büyüme bile analizi mümkün 19 belirir. Mevcut FIM kurulumunda, 4 x 16 kızılötesi ışık yayan diyotlar (LED&#39;ler IR) (Şekil 1) izleme tablosu olarak adlandırılan, 32 x 32 cm 2 akrilik cam plaka içine entegre edilmiştir. IR LED yoğunluğu kolaylıkla darbe genişlik modülasyonu (PWM) ile devresine bağlı bir mikro kontrol cihazı tarafından yapılabilir izleme masanın üzerine yerleştirilmiş, ağırlığına bağlı olarak ayarlanır. FIM aydınlatma şiddetleri geniş bir yelpazede üzerinde çok yüksek kontrastlı görüntüler verir. Önemlisi, bu genzaten düşük toplam kızılötesi irridation mükemmel sonuçlar, kalkış sırasında. Kızılötesi filtre ile bir kamera kurulum içine ek uyaranların entegrasyonunu sağlayan izleme masası, aşağıda yer almaktadır. Isı uyarıcı kolayca radyatör plakası ile uygulanabilir ve hafif uyaran bir LCD projektör tarafından uygulanır. Ayrıca odorants basit kapak 8 ile geçişlerini bulunan edilebilir. Isı gradyanı deneyleri için, radyatör plaka, sırasıyla her iki tarafında, sıcak ve soğuk su ile perfüze edildi ve larvaları (Şekil 1B) 2 mm yukarısında, yerleştirilir. yüksek kontrast, yüksek kaliteli filmleri nesil gelişmiş bilgisayar tabanlı görüntü analizi için olasılığını açar, böylece biz görüntülerden özellikleri büyük bir set ayıklamak için (Şekil 2) FIMTrack yazılımını uyguladı. İlk altı temel özellikleri hayvanın (Şekil 3A) ve konturdan tanımlanmıştır. Bu özellikler temel sağlarBelirli bir zaman noktasında (Şekil 3B) de hayvanlar şekil ve bazı uyaranlar onun konumunu tanımlayan altı ikincil özellikleri daha hesaplanması için. Şu anda, dokuz üçüncül özellikleri zamansal yönlerini entegre ve dolayısıyla birincil ve ikincil özellikleri (Şekil 3C) ile birlikte hayvan lokomosyon karakterize olduğu hesaplanmaktadır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" width="650" /> Şekil 2. FIMTrack genel bakış, algoritmik iş akışı ve larva gösterimi. (A) Nasıl FIMTrack kullanmak için. görüntüleri yüklenir. Gri değer eşik ve tek larvaları tanımlayan larva boyut eşikleri ayarlanması gerekir. larva alan [min-boyutu, maksimum boyut] olmalıdır. Takip Vurgulanan düğme ile başlatılır. (B) İzleme iş akışı. Start düğmesine tıkladıktan sonra, arka plan görüntüsü cayeniden hesaplanır (zaman içinde en az yoğunlukları). Sürece sol kare olduğu gibi, larva gri eşik ve min- ve maksimum boyutu eşiğine göre segmentlere ayrılmıştır. Larva temsiller hesaplanır tüm segmentlerinin için ((C) karşılaştırmak). Her yeni model geçerli parça mevcut ise, belirli bir yörünge için ilişkilidir. Son kare ulaşılırsa, sonuçlandırılması sonrası işleme çıkış kuşak tarafından takip yapilir. (C) Larva temsil. Hayvan bir baş ve kuyruk noktası (h t) oluşur. Bu noktalar arasında omurga noktaları s keyfi bir tek sayı i r yarıçaplı i ayarlanabilir. Ayrıca, kütle m ve açı γ bükme ana gövdenin merkez hesaplanır. Birkaç hareket ile ilgili parametreler mor çizgilerle çizilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52207/52207fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> FIMTrack tarafından hesaplanan 3. Özellikler Şekil. Hayvanların kontur dayalı (A) Birincil özellikleri. (B) İkincil özellikleri, birincil özelliklere dayalı. (C) Tersiyer özellikleri, ardışık çerçeve ve ek girişler birincil özelliklerine göre <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52207/52207fig3highres.jpg" target="_blank">bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Source</td>
			<td style="width:191px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">FIM setup</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">details for construction or purchase of setups is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylic glass plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Additional for agar pouring</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Heat radiator plate</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Water calorifier/cooling pumps and hoses</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard Camera (4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Basler</td>
			<td style="width:191px;">acA2040-25gm</td>
			<td style="width:251px;">Camera defaultly used for the FIM setup</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (1.4 MP)</td>
			<td style="width:191px;">QImaging</td>
			<td style="width:191px;">&#160;1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Test Camera (0.8 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Point Grey</td>
			<td style="width:191px;">Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Test Camera (0.3 MP)</td>
			<td style="width:191px;">Sony</td>
			<td style="width:191px;">PS Eye USB2.0 camera</td>
			<td style="width:251px;">Camera used for comparison</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:191px;">Computer</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;">equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [&#62;1TB]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Standard Fly food</td>
			<td style="width:191px;">Custom&#160;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">Standard Fly vials 135 ml</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">78,895</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes 9cm</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt AG&#38;Co, N&#252;mbrecht, Germany</td>
			<td style="width:191px;">821,473</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ultrapure deionized water</td>
			<td style="width:191px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">Synergy&#160;</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td>
			<td style="width:191px;">3957.2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Food grade agar</td>
			<td style="width:191px;">AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:191px;">A0917,5000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paintbrush (small and large)</td>
			<td style="width:191px;">Milan</td>
			<td style="width:191px;">Aquarell 310 Size 0 and 2</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:191px;">Pyrometer</td>
			<td style="width:191px;">Trotec</td>
			<td style="width:191px;">BP20</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fim imaging and fimtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis

nöronal ağ fonksiyonu analizi davranışsal özelliklerinin güvenilir bir ölçüm gerektirir. Serbest hareket eden hayvanlar arasında, belirli bir zaman bir dereceye kadar değişken olduğu için, pek çok hayvan istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için, analiz edilmesi gerekir. Bu da hareket desenleri bir bilgisayar destekli otomatik ölçümü gerektirir. Neredeyse saydam ve küçük hareketli nesnelerin yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için, FIM denilen sinirli toplam iç yansıma dayalı yeni bir görüntüleme tekniği geliştirilmiştir. Bu ayarda, hayvanlar sadece altta yatan tarama yüzeyi ile temas çok özel konumda kızılötesi ışık ile aydınlatılmış. Bu metodoloji çok yüksek kontrastlı görüntüler elde edilir. Daha sonra, bu yüksek kontrastlı görüntüler kurulan kontur izleme algoritmaları kullanılarak işlenir. Buna göre, kantitatif hareket yeteneği büyük bir çeşitlilik tanımlamak için gerekli olan bir dizi özellik elde etmek için karşılık vermektedir FIMTrack yazılımı geliştirmiştirözellikleri. Bu yazılım paketinin geliştirilmesi sırasında, biz daha fazla modüllerin kolay eklenmesini sağlayan bir açık kaynak mimarlık bizim çabaları yoğunlaşmıştır. Program platform bağımsız çalışır ve veri analizi ile kullanıcıya rehberlik sezgisel bir kullanıcı arayüzü eşlik ediyor. Tüm hareket parametre değerlerinin daha fazla veri analizleri izin csv dosyaları şeklinde verilmiştir. Buna ek olarak, izleme yazılımına entegre bir Sonuçları Görüntüleyici etkileşimli gözden ve uyarıcı entegrasyonu sırasında gerekebilecek gibi, çıkışını ayarlamak için fırsat sağlar. FIM ve FIMTrack gücü Drosophila larvalarının lokomosyon inceleyerek gösterilmiştir.

Farklı çözünürlük özelliklerine sahip birkaç farklı kamera görüntüleme için (Şekil 4) test edilmiştir. Uygun bir IR filtresi ile donatılmış tüm kameralar. Bu testte en düşük fiyatlı kamera düşük çözünürlükte göre, görüş alanı 10 cm x 10 cm ile sınırlıdır. En iyi sonuçlar, bir 4 megapiksel (MP), kamera kullanılarak elde edildi. Bu üçüncü evre larva uzunluk başına 100 piksel çözünürlüğe yol açar ve kolayca iç yapıları tanımak için izin verdi. Buna ek olarak, hayvan peristalsis kolayca (Şekil 4A) elde edilebilir. Ancak, hala da FIMTrack tarafından analiz edilebilir az pahalı kameralar kullanarak yüksek kontrast filmleri elde edebilirsiniz. 8 bit derinliği ve 1.392 x 1,040 piksel çözünürlüğe sahip 1.4 MP kamera kullanarak yaklaşık yarı fiyatına ve görüş alanında Üçüncü dönem larva uzunluk başına 45 piksel çözünürlüğe izin verir. Baş ama diğer iç yapılar kabul edilebilir (Şekil 4B). İzleme ve peristaltizm tespiti mümkün ama doğruluk (Şekil 4B) azalır. 1.4 MP kamera ile karşılaştırılabilir bir mekansal çözünürlüğe sahip daha ucuz 0.8 MP kamera ile, larva kafa (Şekil 4C) artık sadakatle kabul edilemez. İzleme ve peristaltizmin analizi mümkün ancak artan gürültü dayalı daha fazla titremeleri dahil. Şaşırtıcı, hatta düşük çözünürlüklü USB web kamerası (20 €, Şekil 4D altında, 0.3 MP kamera) larva yörüngeleri hesaplamak için yeterli kalitede filmler sağlar. peristaltizmin alanından hesaplanabilir ancak ölçümler çok gürültülü. Bizim kurulum biz rutin 4 MP kamera kullanın. Tarama için, bu kamera besbelli yüksek kapasiteli analizi mümkün olduğunu böylece aynı anda hayvanların çok sayıda analiz fırsatı sağlayan 22 cm x 22 cm arena, izleme sağlar. Bu ayarı kullanarak, larva uzunluk iHala kayıt ve peristaltizm analizine olanak 40 piksel tarafından temsil s. Bir ısı derecesinde 15 larva yörüngeleri örnek bir görüntü Şekil 5A&#39;da verilmiştir. Buna ek olarak, bir makro lens kullanımı birçok iç organlar görünür hale gelir ve baş tanıma ayrıca (Şekil 5B) artırıldı çok yüksek çözünürlüklü görüntü larvaları sağlar. Ayrıca, bu geniş bir aralıkta 20 davranışlarının daha detaylı bir analizi için kullanılabilir. Aynı kurulumu kolay görüntü C tarama için de kullanılabilir elegans solucanlar (Şekil 5C). <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" width="650" /> Şekil farklı kameralar için 4. FIM görüntüleme ve izleme sonuçları. Sol (A): 10 fps ile 4 MP kamera kullanılarak çekilen bir 10 cm x 10 cm izleme sahnede tarama üç larva FIM görüntüleme. Orta:Kırpma ve bir tek larva kütle yörünge merkezi. hayvanın alanı gösterilir. Sağ: larva Alan 100 kare üzerinde çizilen. (A) eşdeğer ancak 0.8 MP kamera kullanılarak çekilen kırmızı ok kısaltıldı görüntünün zaman noktasını gösterir. (A) Eşdeğer ama 1.4 MP kamera kullanılarak çekilen (B). (C). (D) Eşdeğer ( A) ama 0.3 MP kamera kullanılarak çekilen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52207/52207fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52207/52207fig5highres.jpg" width="650" /> Şekil 5. Isı uyaran ve yüksek çözünürlüklü uygulamalar. (A), ısı uyaran uygulaması (Şekil 1 ile karşılaştırınız). Yörüngeler FI üzerinden hesaplananMTrack. (B) makro lens kullanarak, üçüncü, ikinci ve birinci evre larva Yüksek çözünürlüklü görüntü uygulaması. Üçüncü evre larva uzunluğunda ve 2.5 x 2.5 cm bir görüş alanı 400 pikseller ile temsil edilmektedir. (C) C elegans solucan FIM görüntüleme kullanarak ele geçirdi. Ölçek çubukları gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52207/52207fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis at JoVE.com

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM C gibi küçük hareketli nesneleri izlemek için tasarlanmış bir roman, maliyet etkin bir görüntüleme sistemi elegans, planaria veya Drosophila larvaları. Ekteki FIMTrack programı hızlı ve verimli veri analizi sunmak için tasarlanmıştır. Birlikte, bu araçlar davranışsal özelliklerin yüksek verim analizi sağlar.

FIM Görüntüleme ve FIMtrack: Yüksek verim ve Maliyet Etkili Hareket Analizi izin İki Yeni Araçlar

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

fim-imaging-fimtrack-two-new-tools-allowing-high-throughput-cost

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Görüntüleme.  Westfälische Wilhelms-Universität Münster.  FIM C gibi küçük hareketli nesneleri izlemek için tasarlanmış bir roman, maliyet etkin bir görüntüleme sistemi elegans, planaria veya Drosophila larvaları. Ekteki FIMTrack programı hızlı ve verimli veri analizi sunmak için tasarlanmıştır. Birlikte, bu araçlar davranışsal özelliklerin yüksek verim analizi sağlar. 

Video: FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

Design and Construction of a Cost Effective Headstage for Simultaneous Neural Stimulation and Recording in the Water Maze

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial products are often expensive, not easily customized, and not submersible. Here we describe a method to design and build a customized, integrated circuit headstage for simultaneous 4-channel neural recording and 2-channel simulation in awake, behaving animals. The headstage is designed using a free, commercially available CAD-type design package, and can be modified easily to accommodate different scales (e.g. to add channels). A customized printed circuit board is built using surface mount resistors, capacitors and operational amplifiers to construct the unity gain source follower circuit. The headstage is made water-proof with a combination of epoxy, parafilm and a synthetic rubber putty. We have successfully used this device to record local field potentials and stimulate different brain regions simultaneously via independent channels in rats swimming in a water maze. The total cost is &lt; $30/unit and can be manufactured readily.

We present a low-cost method to design and construct a light headstage pre-amplifier system with simultaneous neural recording and stimulation capability. This device can be waterproofed for use in swimming animals.

Eşzamanlı Sinir Uyarım ve Su Maze Kayıt için Tasarım ve İnşaat Maliyet Etkin headstage

Headstage preamplifiers and source followers are commonly used to study neural activity in behavioral neurophysiology experiments. Available commercial ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors to recognize thousands of odorants. Odorant ligands have been published for fewer than 6% of human receptors1-11. This lack of data is due in part to difficulties functionally expressing these receptors in heterologous systems. Here, we describe a method for expressing the majority of the olfactory receptor family in Hana3A cells, followed by high-throughput assessment of olfactory receptor activation using a luciferase reporter assay. This assay can be used to (1) screen panels of odorants against panels of olfactory receptors; (2) confirm odorant/receptor interaction via dose response curves; and (3) compare receptor activation levels among receptor variants. In our sample data, 328 olfactory receptors were screened against 26 odorants. Odorant/receptor pairs with varying response scores were selected and tested in dose response. These data indicate that a screen is an effective method to enrich for odorant/receptor pairs that will pass a dose response experiment, i.e. receptors that have a bona fide response to an odorant. Therefore, this high-throughput luciferase assay is an effective method to characterize olfactory receptors&#8212;an essential step toward a model of odor coding in the mammalian olfactory system.

Olfactory receptor activation patterns encode odor identity, but the lack of published data identifying odorant ligands for mammalian olfactory receptors hinders the development of a comprehensive model of odor coding. This protocol describes a method to facilitate high-throughput identification of olfactory receptor ligands and quantification of receptor activation.

Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a physiological barrier preventing large molecules (&#62;500 Da) from entering the brain tissue. Microbubble-mediated focused ultrasound (FUS) can be used to induce a transient local BBB opening, allowing larger drugs to enter the brain parenchyma.
In addition to large-scale clinical devices for clinical translation, preclinical research for therapy response assessment of drug candidates requires dedicated small animal ultrasound setups for targeted BBB opening. Preferably, these systems allow high-throughput workflows with both high-spatial precision as well as integrated cavitation monitoring, while still being cost effective in both initial investment and running costs.
Here, we present a bioluminescence and X-ray guided stereotactic small animal FUS system that is based on commercially available components and fulfills the aforementioned requirements. A particular emphasis has been placed on a high degree of automation facilitating the challenges typically encountered in high-volume preclinical drug evaluation studies. Examples of these challenges are the need for standardization in order to ensure data reproducibility, reduce intra-group variability, reduce sample size and thus comply with ethical requirements and decrease unnecessary workload. The proposed BBB system has been validated in the scope of BBB opening facilitated drug delivery trials on patient-derived xenograft models of glioblastoma multiforme and diffuse midline glioma.

The blood-brain barrier (BBB) can be temporarily disrupted with microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). Here, we describe a step-by-step protocol for high-throughput BBB opening in vivo using a modular FUS system accessible for non-ultrasound experts.

Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...